KR100852944B1

KR100852944B1 - 화학적으로 가교된 히알루론산 하이드로겔 나노입자의제조방법

Info

Publication number: KR100852944B1
Application number: KR1020070015864A
Authority: KR
Inventors: 임형준; 조은철; 이지해; 김준오
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2007-02-15
Filing date: 2007-02-15
Publication date: 2008-08-19
Also published as: WO2008100044A1; CN101626754A; CN101626754B

Abstract

본 발명은 화학적으로 가교된 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 방법에 따라 계면활성제가 용해된 오일상 및 염기성 수용액에 히알루론산과 수용성 가교제가 용해된 수상을 혼합함으로써 w/o 에멀젼을 형성시켜 가교반응을 진행하여 제조된 화학적으로 가교된 히알루론산 하이드로겔 나노입자는 피부에 도포시 각질층에 고르게 침투하여 분산됨으로써 높은 피부흡수능을 나타내고, 물에 분산시키면 빠르고 높은 수팽윤 거동을 나타낸다.

히알루론산, 비스에폭시드, 하이드로겔, 나노입자, 팽윤도, 피부흡수

Description

화학적으로 가교된 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 제조방법{Preparation method of chemically cross-linked hyaluronic acid hydrogel nanoparticles}

도 1은 광학현미경을 이용하여 관찰한 히알루론산과 가교제가 내수상에 존재하는 w/o 에멀젼 사진이다(A:실시예 12, B:실시예 13, C:비교예 5, D:비교예 6).

도 2는 주사전자현미경을 이용하여 관찰한 건조된 히알루론산 하이드로겔 입자 사진이다(A: 실시예 13, B: 비교예 5).

도 3은 주사전자현미경을 이용하여 관찰한 건조된 히알루론산 하이드로겔 입자 사진이다(실시예 11).

도 4는 투과전자현미경을 이용하여 관찰한 건조된 히알루론산 하이드로겔 입자 사진이다(실시예 11).

도 5는 광학현미경을 이용하여 관찰한 수용액 상의 팽윤된 히알루론산 하이드로겔 입자 사진이다(A:실시예 12, B:실시예 13, C:비교예 5, D:비교예 6).

도 6은 공초점 레이저 주사현미경을 이용하여 관찰한 형광물질이 공유결합된 히알루론산 하이드로겔 입자의 피부흡수도 사진이다.

히알루론산은 β-D-N-아세틸글루코사민과 β-D-글루쿠론산이 교대로 결합된 직쇄상의 고분자 다당이다. 히알루론산은 포유동물의 피하조직과 연골조직 같은 결합조직에 분포되는 것 외에, 눈의 초자체나 탯줄 등에 존재하며 연쇄구균이나 간균류의 협막 등에도 존재하는 것이 알려져 있다. 히알루론산을 얻기 위한 일반적인 방법으로는 닭 벼슬, 탯줄 등에서 추출하는 방법과, 연쇄구군, 간균을 배양한 후 이것으로부터 추출 정제하는 방법 등이 있다.

우수한 생체적합성을 가지는 천연 히알루론산은 종간 특이성을 갖지 않고 조직이나 장기특이성을 갖지 않으며 피부의 보습력 증진, 피부 탄력 유지 및 피부 손상 시에 피부 하층부의 손상을 줄여주고 피부의 주요구성 성분인 콜라겐이 세포 사이로의 움직임을 원활하게 하도록 윤활유와 같은 역할도 한다. 그러나 천연 히알루론산을 본연 그대로 사용하게 되면 기계적 물성이 좋지 않을 뿐만 아니라 체내에 존재하는 히알루로니다아제라는 효소에 의해 쉽게 분해되어 제거되기 때문에 다양 한 응용에 있어 제한이 따르게 된다. 이와 같은 천연 히알루론산의 단점을 보완하기 위하여 화학적 수식이나 다양한 가교제를 사용한 가교를 통하여 하이드로겔을 형성하는 연구들이 많이 이루어지고 있다.

히알루론산의 화학적 수식과 가교를 통한 하이드로겔 형성은 일반적으로 히알루론산 주쇄에 존재하는 알코올 그룹과 카르복시산 그룹을 통하여 이루어진다. 히알루론산 주쇄의 카르복시산 그룹은 에스테르화(esterification)에 의한 화학적 수식(D. Campoccia et al., Biomaterials, 19, 1998, 2101-2127)이 주를 이루며, 하이드로겔 형성을 위한 가교반응은 디히드라지드(K. P. Vercruysse et al., Bioconjug. Chem., 8, 1997, 686-694), 디알데히드(Y. Luo et al., J. Control. Release, 69, 2000, 169-184), 또는 디술파이드(X. Z. Shu et al., Biomacromolecules, 3, 2002, 1304-1311)를 이용한 연구가 진행되었다. 또한, 카르복시산 그룹에 메타크릴아미드를 도입하여 광가교를 통한 하이드로겔을 제조하는 연구도 진행되었다(Y. D. Park et al., Biomaterials, 24, 2003, 893-900). 한편으로 히알루론산 주쇄의 알코올 그룹은 디비닐술폰(A. Ramamurthi et al., J. Biomed. Master Res., 60, 2002, 195-205) 또는 디글리시딜 에테르(T. Segura et al., Biomaterials, 26, 2005, 359-371)를 이용한 연구가 진행되었다.

한편, 1980년대 후반에서 1990년대까지 하이드로겔 입자에 관한 연구는 고분자 재료를 마이크로 크기로 입자화하고 표면 및 내부를 화학적으로 개질함으로써 색전술(embolization), 효소고정화(enzyme immobilization), 약물전달(drug delivery) 등의 분야에 응용되어 왔다. 2000년대에 진입하면서는 나노기술의 발달 과 더불어 수용성 고분자를 이용한 나노크기의 입자 제조 및 응용에 관한 연구가 진행되고 있다. 현재까지 하이드로겔 입자에 관한 대부분의 연구는 바이오신약 및 바이오장기 분야에 응용을 목적으로 하여 생분해성 고분자를 사용하며, 비침습적(non-invasive) 시술을 위해 주입가능형(injectable) 구조로 제조하는 것에 집중되고 있다. 상기 분야는 약물전달시스템, 색전술, 조직공학용 스캐폴드, 벌킹 에이전트(bulking agent) 및 임플란트(implant) 등을 포함한다. 이밖에 단백질의 분리, 농축 및 안정화, 면역검정(immunoassay), 바이오리액터(bioeactor), 센서, 바이오스페시픽(biospecific) 크로마토그래피, 화장품 충진제(cosmetic filler) 등의 분야에도 폭넓게 사용되고 있다. 이러한 하이드로겔 입자는 에멀젼화, 코아세르베이션, 분무 건조 등의 물리적 방법 및 불균일계 중합과 같은 화학적 방법으로 만들어진다. 그 한가지 예로 w/o 에멀젼을 이용하여 계면에서 일어나는 가교반응을 통하여 다당류로 구성된 벽을 가지는 마이크로캡슐이 제조될 수 있다(M. C. Levy et al., Int . J. Pharm ., 62, 1990, 27-35; PCT/FR93/00237). 상기 방법은 w/o 에멀젼에서 가교제를 함유하는 유기상과 다당류를 함유하는 수성상이 접촉하는 계면에서 발생하는 계면가교 반응을 통해서 계면부분만이 가교된 수 마이크론 이상의 크기를 가지는 마이크로캡슐을 얻는 방법이다.

이와 같이 여러 분야에서 응용 가능한 하이드로겔 입자 제조기술의 발전과 더불어 다양한 장점들을 가지는 히알루론산을 이용하여 하이드로겔 입자를 제조하는 연구들도 진행되고 있으며, 화학적 가교를 통해 제조되는 대부분의 히알루론산 하이드로겔 입자들이 상기 예를 들어 설명한 바와 같이 w/o 에멀젼을 통하여 제조 되어 왔다(V. Dulong et al., Carbohydrate Polymers, 57, 2004, 1-6; Y. H. Yun et al., Biomaterials, 25, 2004, 147-157). 하지만 상기 연구들을 비롯한 대부분의 히알루론산 하이드로겔 입자의 제조에 있어서 히알루론산 하이드로겔 입자들의 크기는 수 마이크론부터 수십 마이크론에 이르고, 히알루론산 하이드로겔 나노입자들이 형성되도록 하지는 못하였다. 친수성 천연고분자이면서 생체적합성이 우수한 생분해성 고분자인 히알루론산을 이용하여 화학적 가교를 통한 하이드로겔 나노입자의 제조가 가능하게 되면, 히알루론산 하이드로겔의 장점과 나노입자의 특성을 동시에 가지는 소재를 제공할 수 있다. 하이드로겔 나노입자는 물의 확산길이가 짧고 표면적이 넓기 때문에 수팽윤 속도가 매우 빠른 특징을 가질 수 있으며, 입자크기가 작아짐에 따라 피부흡수 측면에서 하이드로겔 마이크로입자들에 비해 향상된 피부흡수능을 보일 수 있다. 또한, 상기 특징을 보이는 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 표면에 반응기를 도입하여 표적인자, 생리활성 물질 등을 결합시킨다면 외부 자극에 매우 빠르게 반응할 수 있는 기능소재를 개발할 수 있다.

따라서, 화학적으로 가교된 히알루론산 하이드로겔 입자 시스템이 다양한 분야에서 응용되기 위해서는 기존의 히알루론산 하이드로겔 마이크로입자보다 작은 입자크기를 가지는 히알루론산 하이드로겔 나노입자 시스템 개발이 절실히 필요하다.

이에, 본 발명자들은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 제조상의 여러 변수 들을 조절해가면서 유중수형(w/o) 에멀젼의 염기성 수용액 상에 존재하는 히알루론산을 화학적으로 가교시켜 히알루론산 하이드로겔 나노입자를 제조하는 연구를 진행하였다.

구체적으로 오일의 종류, w/o 에멀젼의 오일상과 수상의 비율, 계면활성제의 종류 및 농도, 가교제의 종류 및 농도, 수용액상의 히알루론산의 농도 등을 제조상의 변수들로 정하고 이러한 변수들을 조절함에 따라 히알루론산 하이드로겔 나노입자를 제조하였으며, 상기 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 크기는 수십 나노미터까지 작아질 수 있음을 투과전자현미경과 주사전자현미경을 통해 확인하였다.

또한, 건조된 히알루론산 하이드로겔 나노입자들을 물에 분산시킬 경우, 하이드로겔 나노입자들이 물에 의해 팽윤되어 수 마이크로미터 이상으로 입자크기가 커지는 것을 광학현미경을 통해 관찰하였으며, 형광물질을 도입한 히알루론산 하이드로겔 나노입자들을 오일에 분산시키고 이를 기니픽(albino guinea pig)에서 적출한 피부에 도포하여 프란츠-셀(Franz-cell) 기기를 이용하여 피부흡수 실험을 진행한 결과, 히알루론산 하이드로겔 나노입자가 피부조직의 각질층에 고르게 침투하여 분산되어 있는 것을 공초점 레이저 주사현미경을 통해 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 높은 피부 흡수능과 빠르고 높은 수팽윤도를 나타내는 화학적으로 가교된 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 히알루론산을 가교시켜 입자를 제조하는 방법에 있어서, i)계면활성제가 용해된 오일상 및 ii)염기성 수용액에 히알루론산과 수용성 가교제가 용해된 수상을 혼합함으로써 w/o 에멀전을 형성시켜 가교반응을 진행하는 것을 특징으로 하는 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 i)계면활성제가 용해된 오일상 및 ii)염기성 수용액에 히알루론산과 수용성 가교제가 용해된 수상이 혼합된 w/o 에멀전에서 가교된 것을 특징으로 하는 히알루론산 하이드로겔 나노입자를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 화학적으로 가교된 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 제조방법으로서 i)계면활성제가 용해된 오일상 및 ii)염기성 수용액에 히알루론산과 수용성 가교제가 용해된 수상을 혼합함으로써 w/o 에멀전을 형성시켜 가교반응을 진행하는 것을 특징으로 한다.

이때, 상기 w/o 에멀젼을 구성하는데 사용되는 계면활성제가 용해된 오일상 및 염기성 수용액에 히알루론산과 수용성 가교제가 용해된 수상의 혼합비율은 중량기준으로 오일상:수상이 1:1 ~ 7:3인 것을 특징으로 한다. 물과 오일상의 비율은 w/o 에멀젼의 입자크기와 안정도에 영향을 미치는 요인으로 오일상에 비해 물상의 비율이 너무 올라가면 크고 불안정한 w/o 에멀젼이 형성되고, 따라서 최종적으로 얻어지는 건조된 입자의 크기가 커지게 된다. 반면 물상의 비율이 낮아지면 w/o 에 멀젼의 입자크기는 작아지고 안정해지기는 하지만 한번에 얻을 수 있는 최종 히알루론산 입자의 양이 적어지게 되므로 효율성의 측면에서 좋지 않다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 화학적으로 가교된 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 제조방법은

a) 오일성분에 계면활성제를 용해시키는 단계;

b) 염기성 수용액에 히알루론산 및 수용성 가교제를 용해시키는 단계;

c) 상기 a)의 혼합액에 상기 b)의 수용액을 투입하여 w/o 에멀젼을 형성하는 단계;

d) 상기 c)의 w/o 에멀젼을 60℃로 가열하면서 수용액 상의 가교제와 히알루론산의 가교반응을 진행시키는 단계;

e) 상기 d)의 w/o 에멀젼의 온도를 상온으로 유지하면서 수용액을 산으로 중화시키고 수용액상의 가교제와 히알루론산의 가교반응을 완료하는 단계; 및

f) 상기 e)의 w/o 에멀젼으로부터 히알루론산 하이드로겔 나노입자를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 f)의 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 회수는 유기용매를 이용하여 상기 e)의 w/o 에멀젼을 세척하여 수용액상의 히알루론산 하이드로겔 나노입자를 취득하고, 이를 70~90℃에서 진공 건조하여 잔류 유기용매를 제거하는 단계를 포함한다.

본 발명의 히알루론산 하이드로겔 나노입자를 제조하는데 사용되는 상기 히알루론산의 분자량은 w/o 에멀젼의 수용액상의 점도에 영향을 미치며, 본 발명에 사용되는 히알루론산의 분자량은 수평균 분자량 기준 300,000~10,000,000이고, 바람직하게는 700,000~2,000,000이다.

본 발명의 히알루론산 하이드로겔 나노입자를 제조하는데 사용되는 상기 오일상으로는 식물성, 광물성, 실리콘유 및 합성유로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 세틸 에틸헥사노에이트(Cetyl ethylhexanoate;CEH), 도데칸(dodecane), 헵탄(heptane)이다.

본 발명의 히알루론산 하이드로겔 나노입자를 제조하는데 사용되는 상기 계면활성제로는 일반적으로 w/o 에멀젼을 안정화시킬 수 있는 계면활성제들 중에서 1종 이상 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 세틸 PEG/PPG-10/1 디메치콘(cetyl PEG/PPG-10/1 dimethicone (ABIL EM-90)), 소르비탄 세스퀴올레이트(sorbitan sesquioleate (ARLACEL 83)), 폴리에틸렌 글리콜 (30) 디폴리히드록시 스테아레이트(polyethylene glycol (30) dipolyhydroxy stearate (ARLACEL P135))가 계면활성제로 사용될 수 있다.

본 발명의 히알루론산 하이드로겔 나노입자를 제조하는데 사용되는 상기 수용성 가교제로는 천연고분자 다당류와 가교결합을 형성하는 특징을 가지는 가교제들로부터 1 종 이상 선택하여 사용할 수 있다. 가교제로서 비스에포시드를 사용하면 기존에 에스터화반응(esterfication)을 통해 많이 사용되던 가교결합인 에스터(ester)결합이 아닌 에테르(ether)결합을 형성하게 된다. 또한 가교된 구조가 물에 분산되었을 경우 가교구조를 이루는 성분들이 물과 좀 더 친한 성격을 가지게 하기 위하여 PEG 체인(chain)을 가교제의 주쇄로 사용하는 것을 고려하였으며, 특 히 부틸렌 글리콜 디글리시딜에테르(buthylene glycol diglycidyl ether, BDG) 또는 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르(polyethylene glycol diglycidyl ether, PEGDG, 친수성의 PEG 체인의 양 말단에 에폭시드기가 하나씩 달려있는 구조)가 바람직하며, 상기 BDG 또는 PEGDG로 가교된 히알루론산 하이드로겔 나노입자는 수상에서 빠르고 높은 팽윤도를 보인다.

본 발명의 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 제조방법에 있어서, 상기 히알루론산과 가교제의 수용액 상에서의 가교반응이 진행되기 위해서는 히알루론산의 수산화기의 반응성을 높이기 위해 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산수소나트륨, 암모니아 등과 같은 염기를 이용하여 히알루론산과 가교제가 용해되어 있는 염기성 수용액의 pH를 12~14로 높여주는 것이 필요하며, 본 발명의 실시예에서는 0.1N 수산화나트륨 수용액을 사용하였다.

또한, 염기상태의 수용액에 히알루론산이 오래 방치되면 가수분해가 일어날 가능성이 높아지게 되므로 히알루론산과 가교제를 염기성 수용액에 용해시킬 때는 가능한 빠른 시간 내에 완전히 용해되도록 하는 것이 바람직하며, 상기 수용액을 오일에 투입하여 w/o 에멀젼을 제조하고 60℃에서의 초기 가교반응을 종료한 후, 반응온도를 상온으로 내려 아세트산, 염산, 황산, 질산, 시트릭산과 같은 산으로 상기 염기상태의 수용액을 중화시켜주는 것이 바람직하다.

본 발명의 히알루론산 하이드로겔 나노입자를 제조하는데 사용되는 히알루론산의 함량은 염기성 수용액에 대하여 1~10 중량%, 바람직하게는 2~5 중량%이다. 이는 히알루론산의 수용액상의 농도가 상기 범위 미만이면 고분자 사슬들간의 얽 힘(entanglment)이 줄어들게 되고 이로인해 서로 다른 사슬들 간의 가교보다 동일 사슬 내에서의 가교가 일어나므로, 여러 히알루론산 주쇄들로 이루어지는 3차원 망상구조가 제대로 얻어질 수 없기 때문이다. 반면 히알루론산의 수용액상의 농도가 상기 범위 초과로 높아지면 수용액상의 점도가 너무 높아지므로 작고 안정한 w/o 에멀젼 입자가 형성되기 힘들므로, 2~5중량%의 농도가 원하는 결과를 얻기에 적절한 농도이다.

또한 히알루론산 하이드로겔 나노입자를 제조하는데 필요한 w/o 에멀젼을 안정하게 유지시켜주는 역할을 하는 계면활성제의 함량은 w/o 에멀젼의 오일상과 수상의 혼합액 총 중량에 대하여 1~10 중량%이며, 바람직하게는 2~6 중량%를 함유한다. 계면활성제의 농도는 w/o 에멀젼의 크기와 안정도에 영향을 주는 요인으로, 상기 농도범위 미만이면 입자들의 크기가 증가하고 입자의 안정도가 불안정해지며, 상기 농도범위 초과이면 w/o 에멀젼 입자는 안정화 시키지만 계면활성제는 최종적으로 얻어지는 입자에서는 필요없는 불순물인 성분이 되게 되므로 순도의 측면에서 볼때는 계면활성제의 사용량은 낮게 사용될 수 있으면 좋다. 하지만 w/o 에멀젼의 안정성의 측면과 함께 고려해 보면, 상기 2~6중량%의 계면활성제가 사용되는 것이 바람직하다.

한편, w/o 에멀젼의 수용액 상에서 가교반응이 완료된 히알루론산 하이드로겔 나노입자들을 취득하고 세척하기 위하여 사용되는, 물에 혼합가능한 유기용매는 제한되지는 않지만, 에탄올, 메탄올, 아이소프로필알콜, 아세톤, 테트라하이드로퓨란으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 유기용매를 이용하여 세척된 히알루론산 하 이드로겔 나노입자들에 존재할 수 있는 오일, 계면활성제, 미반응 가교제 등의 불순물을 완벽하게 제거하기 위하여 세척된 히알루론산 하이드로겔 나노입자 수용액을 만들어 유기용매를 이용하여 세척하는 단계가 더 포함될 수 있다.

상기의 제조방법을 통해 얻어지는 본 발명의 화학적으로 가교된 히알루론산 하이드로겔 나노입자는 w/o 에멀젼의 수용액상의 히알루론산 농도, 가교제의 종류 및 농도, w/o 에멀젼의 수상과 오일상의 비율, w/o 에멀젼에 사용되는 오일의 종류, 계면활성제의 종류 및 농도 등의 제조상의 변수들을 조절함에 따라 건조한 상태에서 수십에서 수백 나노미터의 입자크기를 가질 수 있으며, 히알루론산 하이드로겔 나노입자들이 물에 의해 팽윤이 되면 빠른 시간 내에 수 마이크로미터 이상으로 입자크기가 증가하는 특징을 가진다. 상기 제조상의 변수들을 적절하게 조절하지 못하면 w/o 에멀젼이 불안정해지거나 w/o 에멀젼의 입자크기가 증가하고, 결과적으로 얻어진 화학적으로 가교된 히알루론산 하이드로겔 입자크기가 증가하여 건조한 상태에서 나노크기의 입자크기를 가지기 힘들어진다.

한편, 본 발명에서는 i)계면활성제가 용해된 오일상 및 ii)염기성 수용액에 히알루론산과 수용성 가교제가 용해된 수상이 혼합된 w/o 에멀전에서 가교된 히알루론산 하이드로겔 나노입자를 제공함을 특징으로 한다.

상기 w/o 에멀젼을 구성하는데 사용되는 계면활성제가 용해된 오일상 및 염기성 수용액에 히알루론산과 수용성 가교제가 용해된 수상의 혼합비율은 중량기준으로 오일상:수상이 1:1 ~ 7:3인 것이 바람직하다.

또한, 상기 수용성 가교제는 비스에폭시드로서 부틸렌 글리콜 디글리시딜에 테르(BDG) 또는 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜에테르(PEGDG)임을 특징으로 한다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예에서 다음과 같은 약어들이 사용된다.

HA: 히알루론산

CEH: 세틸 에틸헥사노에이트

ARLACEL 83: A-83

ARLACEL P135: A-P135

ABIL EM-90: AE-90

BDG: 부틸렌 글리콜 디글리시딜에테르

PEGDG: 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜에테르

LYD: 루시퍼 옐로우 에틸렌디아민

[실시예 1~6] 도데칸을 w/o 에멀젼의 오일상으로 사용하여 제조된 HA 하이드로겔 입자

실시예 1~6의 경우 하기 표 1에 나타난 무게조성비율로 도데칸(dodecane)에 계면활성제인 A-83 또는 A-P135를 교반기를 통해 용해시키는 것과 동시에 0.1 N 수산화나트륨 수용액에 HA(수평균분자량 1,500,000)와 가교제인 BDG 또는 PEGDG를 교반기를 통해 용해시켰다. 상기의 HA와 가교제가 용해된 0.1 N 수산화나트륨 수용액 을 계면활성제가 용해된 도데칸에 천천히 첨가하면서 유화기로 7000 rpm의 속도로 10분간 혼합교반시켜 w/o 에멀젼을 제조하고, 이를 반응기에 옮기고 60℃로 가열하여 w/o 에멀젼이 유지되도록 교반을 시키면서 초기 가교반응을 진행하였다. 계속적으로 교반을 하면서 반응기의 온도를 상온으로 조절함과 동시에 w/o 에멀젼의 수용액상을 중화시키기 위하여 아세트산을 첨가하고, 2일 동안 상온에서 w/o 에멀젼을 교반시키면서 가교반응을 진행시켰다. 상기 w/o 에멀젼의 수용액 상에서 가교반응이 완료된 히알루론산 하이드로겔 나노입자들을 취득하고 세척하기 위하여 반응을 마친 w/o 에멀젼을 아세톤, 에탄올 또는 테트라하이드로퓨란에 침전을 시키고 오일, 계면활성제, 미반응 가교제 등의 불순물을 완벽하게 제거하기 위하여 1차 침전된 HA 하이드로겔 나노입자가 분산된 수용액을 만들어 다시 아세톤이나 테트라하이드로퓨란에 침전시켰다. 상기 과정들을 통해 취득한 가교된 HA 하이드로겔 입자들은 90℃에서 24시간 동안 진공건조를 시킴으로써 잔류용매들을 완벽하게 제거하였다.

HA 하이드로겔 입자제조를 위하여 도데칸을 오일상으로 사용하는 w/o 에멀젼의 구성 성분 및 조성

	도데칸	계면활성제	0.1N 수산화나트륨 수용액	HA	가교제	아세트산
실시예 1	105 g	A-P135 4.5 g	45 g	1.35 g	BDG 1.3 g	0.26 ml
실시예 2	105 g	A-83 4.5	45 g	1.35 g	BDG 1.3 g	0.26 ml
실시예 3	105 g	A-P135 4.5 g	45 g	1.35 g	PEGDG 3.17 g	0.26 ml
실시예 4	105 g	A-P135 4.5 g	45 g	1.35 g	PEGDG 1.59 g	0.26 ml
실시예 5	105 g	A-P135 9 g	45 g	1.35 g	PEGDG 3.17 g	0.26 ml
실시예 6	75 g	A-P135 9 g	75 g	2.25 g	PEGDG 5.28 g	0.43 ml

[실시예 7~13] 헵탄을 w/o 에멀젼의 오일상으로 사용하여 제조된 히알루론산 하이드로겔 입자

실시예 7~13의 경우 하기 표 2에 나타난 무게조성비율로 헵탄(heptane)에 계면활성제인 A-P135를 교반기를 통해 용해시키는 것과 동시에 0.1 N 수산화나트륨 수용액에 HA (수평균분자량 1,500,000)와 가교제인 PEGDG를 교반기를 통해 용해시켰다. 상기의 HA와 PEGDG가 용해된 0.1 N 수산화나트륨 수용액을 A-P135가 용해된 헵탄에 천천히 첨가하면서 유화기로 7000 rpm의 속도로 10분간 혼합교반시켜 w/o 에멀젼을 제조하고, 이를 반응기에 옮기고 60℃로 가열하여 w/o 에멀젼이 유지되도록 교반을 시키면서 초기 가교반응을 진행하였다. 계속적인 교반을 하면서 반응기의 온도를 상온으로 조절함과 동시에 w/o 에멀젼의 수용액상을 중화시키기 위하여 아세트산을 첨가하고, 2일 동안 상온에서 w/o 에멀젼을 교반 시키면서 가교반응을 진행시켰다. 상기 w/o 에멀젼의 수용액 상에서 가교반응이 완료된 히알루론산 하이드로겔 나노입자들을 취득하고 세척하기 위하여 반응을 마친 w/o 에멀젼을 아세톤, 에탄올 또는 테트라하이드로퓨란에 침전을 시키고 오일, 계면활성제, 미반응 가교제 등의 불순물을 완벽하게 제거하기 위하여 1차 침전된 HA 하이드로겔 나노입자가 분산된 수용액을 만들어 다시 아세톤이나 테트라하이드로퓨란에 침전시켰다. 상기 과정들을 통해 취득한 가교된 HA 하이드로겔 입자들은 90℃에서 24시간 동안 진공건조를 시킴으로써 잔류용매들을 완벽하게 제거하였다.

HA 하이드로겔 입자제조를 위하여 헵탄을 오일상으로 사용하는 w/o 에멀젼의 구성 성분 및 조성

	헵탄	A-P135	0.1N 수산화나트륨 수용액	HA	PEGDG	아세트산
실시예 7	105 g	4.5 g	45 g	1.35 g	3.17 g	0.26 ml
실시예 8	105 g	9 g	45 g	1.35 g	1.59 g	0.26 ml
실시예 9	75 g	9 g	75 g	2.25 g	2.64 g	0.43 ml
실시예 10	105 g	9 g	45 g	2.25 g	2.64 g	0.26 ml
실시예 11	500 g	60 g	500 g	15 g	20.1 g	2.86 ml
실시예 12	75 g	9 g	75 g	2.25 g	6 g	0.43 ml
실시예 13	113 g	9 g	37.5 g	1.13 g	1.51 g	0.22 ml

[실시예 14] 형광물질인 LYD가 공유결합된 히알루론산 하이드로겔 입자제조

실시예 14의 경우 하기 표 3에 나타난 무게조성비율로 헵탄에 계면활성제인 A-P135를 교반기를 통해 용해시키는 것과 동시에 0.1 N 수산화나트륨 수용액에 HA (수평균분자량 1,500,000), 가교제인 PEGDG 및 형광물질인 LYD를 교반기를 통해 용해시켰다. 상기의 HA, PEGDG 및 LYD가 용해된 0.1 N 수산화나트륨 수용액을 A-P135가 용해된 헵탄에 천천히 첨가하면서 유화기로 7000 rpm의 속도로 10분간 혼합교반시켜 w/o 에멀젼을 제조하고, 이를 반응기에 옮기고 60℃로 가열하여 w/o 에멀젼이 유지되도록 교반을 시키면서 초기 가교반응을 진행하였다. 계속적인 교반을 하면서 반응기의 온도를 상온으로 조절함과 동시에 w/o 에멀젼의 수용액상을 중화시키기 위하여 아세트산을 첨가하고, 2일 동안 상온에서 w/o 에멀젼을 교반 시키면서 가교반응을 진행시켰다. 상기 w/o 에멀젼의 수용액 상에서 가교반응이 완료된 히알루론산 하이드로겔 나노입자들을 취득하고 세척하기 위하여 반응을 마친 w/o 에멀젼을 아세톤, 에탄올 또는 테트라하이드로퓨란에 침전을 시키고 오일, 계면활성제, 미반응 가교제 및 미반응 형광물질 등의 불순물을 완벽하게 제거하기 위하여 1차 침전된 HA 하이드로겔 나노입자가 분산된 수용액을 만들어 다시 아세톤이나 테트라하이드로퓨란에 침전을 시켰다. 상기 과정들을 통해 취득한 가교된 HA 하이드로겔 입자들은 90℃에서 24시간 동안 진공건조를 시킴으로써 잔류용매들을 완벽하게 제거하였다.

LYD가 공유결합된 HA 하이드로겔 입자제조를 위한 w/o 에멀젼의 구성 성분 및 조성

	헵탄	A-P135	0.1N 수산화나트륨 수용액	HA	PEGDG	LYD	아세트산
실시예 14	105 g	9 g	45 g	1.35 g	2.8 g	20 mg	0.26 ml

[비교예 1~2] CEH를 w/o 에멀젼의 오일상으로 사용하여 제조된 히알루론산 하이드로겔 입자

비교예 1~2의 경우 하기 표 4에 나타난 무게조성비율로 CEH에 계면활성제인 AE-90을 교반기를 통해 용해시키는 것과 동시에 0.1 N 수산화나트륨 수용액에 HA (수평균분자량 1,500,000)와 가교제인 BDG를 교반기를 통해 용해시켰다. 상기의 HA와 BDG가 용해된 0.1 N 수산화나트륨 수용액을 AE-90이 용해된 CEH에 천천히 첨가하면서 유화기로 7000 rpm의 속도로 10분간 혼합교반시켜 w/o 에멀젼을 제조하고, 이를 반응기에 옮기고 60℃로 가열하여 w/o 에멀젼이 유지되도록 교반을 시키면서 초기 가교반응을 진행하였다. 계속적인 교반을 하면서 반응기의 온도를 상온으로 조절함과 동시에 w/o 에멀젼의 수용액상을 중화시키기 위하여 아세트산을 첨가하고, 2일 동안 상온에서 w/o 에멀젼을 교반 시키면서 가교반응을 진행시켰다. 상기 w/o 에멀젼의 수용액 상에서 가교반응이 완료된 히알루론산 하이드로겔 나노입자들을 취득하고 세척하기 위하여 반응을 마친 w/o 에멀젼을 아세톤, 에탄올 또는 테트라하이드로퓨란에 침전을 시키고 오일, 계면활성제, 미반응 가교제 등의 불순물을 완벽하게 제거하기 위하여 1차 침전된 HA 하이드로겔 나노입자가 분산된 수용액을 만들어 다시 아세톤이나 테트라하이드로퓨란에 침전을 시켰다. 상기 과정들을 통해 취득한 가교된 HA 하이드로겔 입자들은 90℃에서 24시간 동안 진공건조를 시킴으로써 잔류용매들을 완벽하게 제거하였다.

HA 하이드로겔 입자제조를 위하여 CEH를 오일상으로 사용하는 w/o 에멀젼의 구성 성분 및 조성

	CEH	AE-90	0.1N 수산화나트륨 수용액	HA	BDG	아세트산
비교예 1	140 g	10 g	60 g	1.8 g	1.84 g	0.35 ml
비교예 2	140 g	10 g	60 g	1.2 g	1.22 g	0.35 ml

[비교예 3~7] 헵탄을 w/o 에멀젼의 오일상으로 사용하여 제조된 히알루론산 하이드로겔 입자

비교예 3~6의 경우 하기 표 5에 나타난 무게조성비율로 헵탄에 계면활성제인 A-P135을 교반기를 통해 용해시키는 것과 동시에 0.1 N 수산화나트륨 수용액에 HA (수평균분자량 1,500,000)와 가교제인 PEGDG를 교반기를 통해 용해시켰다. 상기의 HA와 PEGDG가 용해된 0.1 N 수산화나트륨 수용액을 A-P135이 용해된 헵탄에 천천히 첨가하면서 유화기로 7000 rpm의 속도로 10분간 혼합교반시켜 w/o 에멀젼을 제조하고, 이를 반응기에 옮기고 60℃로 가열하여 w/o 에멀젼이 유지되도록 교반을 시키면서 초기 가교반응을 진행하였다. 계속적인 교반을 하면서 반응기의 온도를 상온으로 조절함과 동시에 w/o 에멀젼의 수용액상을 중화시키기 위하여 아세트산을 첨가하고, 2일 동안 상온에서 w/o 에멀젼을 교반 시키면서 가교반응을 진행시켰다. 상기 w/o 에멀젼의 수용액 상에서 가교반응이 완료된 히알루론산 하이드로겔 나노입자들을 취득하고 세척하기 위하여 반응을 마친 w/o 에멀젼을 아세톤, 에탄올 또는 테트라하이드로퓨란에 침전을 시키고 오일, 계면활성제, 미반응 가교제 등의 불순물을 완벽하게 제거하기 위하여 1차 침전된 HA 하이드로겔 나노입자가 분산된 수용액을 만들어 다시 아세톤이나 테트라하이드로퓨란에 침전을 시켰다. 상기 과정들을 통해 취득한 가교된 HA 하이드로겔 입자들은 90℃에서 24시간 동안 진공건조를 시킴으로써 잔류용매들을 완벽하게 제거하였다.

비교예 7의 경우 아세트산으로 중화시키는 과정이 없는 것 이외에는 상기 비교예 3~6과 동일한 방법으로 가교된 HA 하이드로겔 입자를 제조하였다.

	헵탄	A-P135	0.1N 수산화나트륨 수용액	HA	PEGDG	아세트산
비교예 3	45 g	9 g	105 g	3.15 g	3.71 g	0.61 ml
비교예 4	75 g	9 g	75 g	2.25 g	1.32 g	0.43 ml
비교예 5	75 g	3 g	75 g	2.25 g	3.01 g	0.43 ml
비교예 6	37.5 g	9 g	113 g	3.38 g	4.52 g	0.65 ml
비교예 7	500 g	60 g	500 g	15 g	20.1 g	-

[실험예 1] 광학현미경을 통한 HA와 가교제가 내수상에 존재하는 w/o 에멀젼 크기 관찰

상기 실시예 1~14와 비교예 1~7에서 얻어진 HA와 가교제가 내수상에 존재하는 w/o 에멀젼의 크기와 형태를 광학현미경을 이용하여 측정하였다. 상기 실시예 1~14에서 얻어진 w/o 에멀젼의 크기와 형태를 관찰해보면 1μm ~ 20μm 정도의 뚜렷한 구형의 에멀젼 입자크기를 가졌으며, 비교예 1~7에서 10μm ~ 60μm 정도의 에멀젼 입자크기를 가지는 w/o 에멀젼과 비교해서 뚜렷한 에멀젼의 경계면을 확인할 수 있을 뿐만 아니라 상대적으로 작은 w/o 에멀젼 입자크기를 관찰할 수 있었다.

도 1은 실시예 12~13 및 비교예 5~6에서 얻어진 w/o 에멀젼 입자의 광학현미경 사진이며, 이를 통해 알 수 있듯이 w/o 에멀젼의 안정도와 에멀젼입자 크기를 결정하는 인자로는 사용하는 오일과 계면활성제의 종류, 오일상과 수용액상의 비율, 계면활성제의 농도 등을 들 수 있다. 사용되는 오일이 도데칸과 헵탄일 경우 상대적으로 w/o 에멀젼이 작고 경계면이 뚜렷하였으며, 오일상에 비해 수용액상의 비율이 높아질수록 w/o 에멀젼의 크기가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 계면활성제는 A-83과 A-P135를 사용하였을 경우가 좀 더 안정한 w/o 에멀젼을 얻을 수 있었으며, 계면활성제를 w/o 에멀젼의 오일과 수산화나트륨 수용액 총 중량에 대하여 3% 이상 사용할 경우에 작고 안정한 w/o 에멀젼을 얻을 수 있었다. w/o 에멀젼의 안정적인 입자형태와 입자크기가 중요한 이유는 w/o 에멀젼이 최종적으로 얻어지는 HA 하이드로겔 입자의 수용액상에서의 팽윤된 입자형태와 입자크기에 큰 영향을 미칠 뿐만 아니라 건조된 HA 하이드로겔 나노입자를 얻기 위해서는 w/o 에멀젼의 입자가 작을수록 유리하기 때문이기도 하다.

[실험예 2] 주사전자현미경과 투과전자현미경을 통한 건조된 HA 하이드로겔 입자크기 관찰

상기 실시예 1~14와 비교예 1~7에서 얻어진 건조된 HA 하이드로겔 입자의 1 중량% 수용액을 만들어 각각 주사전자현미경과 투과전자현미경을 이용하여 건조된 HA 하이드로겔 입자의 입자크기를 관찰하였다. 상기 실시예 1~14로부터 얻어진 건조된 HA 하이드로겔 입자의 경우 50nm ~ 400nm 정도의 입자크기를 가지는 것을 확인할 수 있었으며, 반면에 비교예 1~7에서 얻어진 건조된 HA 하이드로겔 입자의 경우 나노크기의 입자들도 관찰되지만 1μm가 넘는 입자크기를 가지는 입자들도 함께 관찰되었다.

도 2는 실시예 13과 비교예 5에서 얻어진 건조된 HA 하이드로겔 입자를 주사전자현미경으로 관찰한 사진으로써 비교예 5에 비해서 실시예 13에서 얻어진 건조된 하이드로겔 입자들이 훨씬 작교 균일한 입자크기를 가지는 것을 확인할 수 있다.

또한 도 3과 도 4는 실시예 11에서 얻어진 건조된 HA 하이드로겔 입자를 각각 주사전자현미경과 투과전자현미경으로 관찰한 사진들로써 건조된 HA 하이드로겔 입자들이 20nm ~ 400nm의 입자크기를 가지는 것을 확인할 수 있으며, 상기 결과들을 토대로 건조된 HA 하이드로겔 입자의 크기를 결정하는 인자들로는 가교과정이 일어나는 w/o 에멀젼의 크기에 영향을 주는 인자들을 비롯하여, 가교정도, w/o 에멀젼의 수용액상에 존재하는 HA의 농도, 중화과정의 유무 등을 들 수 있다. 주사전자현미경과 투과전자현미경을 통해 관찰한 입자크기들의 결과들을 통해서는 w/o 에멀젼의 크기가 최종적으로 건조된 HA 하이드로겔 입자의 크기를 결정하는 가장 중요한 인자로 생각된다.

[실험예 3] 광학현미경을 통한 수용액 상의 평윤된 HA 하이드로겔 입자크기 관찰

상기 실시예 1~14와 비교예 1~7에서 얻어진 건조된 HA 하이드로겔 입자의 1 중량% 수앵액을 만들어 광학현미경을 이용하여 팽윤된 HA 하이드로겔 입자의 입자크기를 관찰하였다. 상기 실시예 1~14로부터 얻어진 팽윤된 HA 하이드로겔 입자들의 경우 최대 50μm 미만의 입자크기를 가지는 것을 확인하였으며, 반면에 비교예 1~7에서 얻어진 팽윤된 HA 하이드로겔 입자들은 50μm가 넘는 실시예에 비해 상대적으로 큰 팽윤된 HA 하이드로겔 입자들을 관찰할 수 있었다.

도 5는 실시예 12~13 및 비교예 5~6에서 얻어진 팽윤된 HA 하이드로겔 입자들을 광학현미경으로 관찰한 사진들로써, 상기 결과들은 앞에서도 설명한 바와 같이 HA 하이드로겔 입자가 가교되는 과정이 w/o 에멀젼에서 진행이 되기 때문에 팽윤된 HA 하이드로겔 입자의 크기를 결정하는 가장 큰 인자가 w/o 에멀젼의 입자크기이기 때문이다. w/o 에멀젼의 입자크기를 결정하는 인자들 뿐만 아니라, 가교제에 의한 가교정도와 가교제의 종류 또한 팽윤된 HA 하이드로겔 입자의 크기에 영향을 미칠 수 있다. 가교정도가 커지게 되면 건조된 상태에서 팽윤된 상태로의 변화는 상대적으로 작아지게 되고, 가교제의 종류에 따라 가교된 하이드로겔 입자의 친수성의 정도가 달라지기 때문이다.

[실험예 4] 프란츠-셀을 통한 형광물질이 공유결합된 HA 하이드로겔 입자 피부흡수실험

실시예 14로부터 제조된 형광물질인 LYD가 공유결합된 HA 하이드로겔 입자의 피부흡수실험을 수행하였다. 피부흡수 실험을 위하여 기니픽(albino guinea pig)에서 적출한 피부를 이용하여 프란츠-셀(Franz-cell) 기기를 통해 각각 3시간, 6시간 동안 피부흡수 실험을 진행하였으며, 건조된 HA 하이드로겔 입자를 피부조직에 도포하기 위하여 건조된 HA 하이드로겔 입자를 CEH에 1 중량%로 유화기를 통해 분산시킨 후, 이를 일정량 피부조직에 도포하였다. 일정시간 동안의 피부흡수정도를 비교하기 위하여 각각 3시간, 6시간 동안 LYD가 공유결합된 HA 하이드로겔 입자를 도포한 피부조직을 프란츠-셀에서 분리하여 현미경 관찰을 위한 절편을 제조하였으며, 이를 공초점 레이져 주사현미경을 이용하여 형광물질인 LYD를 관찰함으로써 HA 하이드로겔 입자의 피부흡수정도를 시간에 따라 비교할 수 있었다.

도 6에는 상기 실시예 14로부터 얻어진 형광물질인 LYD가 공유결합된 HA 하이드로겔 입자의 시간에 따른 피부흡수정도를 공초점 레이져 주사현미경을 이용하여 관찰한 LYD의 형광세기를 비교하여 나타내었다. 도 6을 통해 알 수 있듯이 시간이 지남에 따라 LYD의 형광세기가 피부조직의 각질층 부분에 고르게 분산되어 있는 결과를 토대로 오일에 분산된 HA 하이드로겔 나노입자들의 피부흡수가 최소 각질층 이상 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

[실험예 5] HA 하이드로겔 입자의 피부일차자극실험(Primary skin irritation test)

상기 실시예 11에서 제조된 HA 하이드로겔 입자에 대한 피부일차자극실험을 위해 토끼(New Zealand White rabbit, 한림실험동물) 수컷 2마리를 이용해, 드레이즈(Draize)의 시험방법에 따라 5% 농도로 실험을 실시하였다. 피부반응의 결과는『의약품등의독성시험기준』(식품의약품안전청 고시 제 2005-60호)의 "피부반응의 평가기준"에 따라 평점으로 평가하고, 시험물질의 사용 가능 여부는 피부일차자극 판정표에 의하여 결과를 판정하였다. 그 결과, P.I.I.(Index of primary irritation) 값은 0으로 홍반, 부종, 가피 형성 등의 피부 이상 증상을 관찰할 수 없었다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 화학적으로 가교된 히알루론산 하이드로겔 나노입자는 제조상의 여러 변수들을 조절함에 따라 기존의 일반적인 w/o 에멀젼을 통해 제조된 히알루론산 하이드로겔 마이크로입자보다 훨씬 작은 입자크기를 가지는 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 제조를 가능하게 하였으며, 나노크기로의 입자크기 감소에 의해 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 피부조직으로의 높은 흡수능이 관찰되었을 뿐만 아니라 피부일차자극실험을 통해 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 안전성을 확인할 수 있었다. 또한 본 발명은 HA 하이드로겔 나노입자들을 물에 분산시키면 빠르고 높은 수팽윤 거동을 보임을 확인하게 되어 다양한 용도로의 그 활용가치와 의의가 크다고 할 수 있다.

Claims

i) 계면활성제가 용해된 오일상 및 ii) 염기성 수용액에 히알루론산과 수용성 가교제가 용해된 수상을 혼합함으로써 w/o 에멀전을 형성시켜 가교반응을 진행하는 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 제조방법으로서,

상기 오일은 세틸 에틸헥사노에이트(Cetyl ethylhexanoate;CEH), 도데칸(dodecane) 및 헵탄(heptane)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이고,

상기 계면활성제는 세틸 PEG/PPG-10/1 디메치콘(cetyl PEG/PPG-10/1 dimethicone), 소르비탄 세스퀴올레이트(sorbitan sesquioleate) 및 폴리에틸렌 글리콜 (30) 디폴리히드록시 스테아레이트(polyethylene glycol (30) dipolyhydroxy stearate)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이며,

상기 수용성 가교제는 비스에폭시드로서 부틸렌 글리콜 디글리시딜에테르(BDG) 또는 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜에테르(PEGDG)임을 특징으로 하는 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 w/o 에멀젼을 구성하는데 사용되는 계면활성제가 용해된 오일상 및 염기성 수용액에 히알루론산과 수용성 가교제가 용해된 수상의 혼합비율은 중량기준으로 오일상: 수상이 1:1 ~ 7:3인 것을 특징으로 하는 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 제조방법은 하기의 단계를 거쳐 제조되는 것을 특징으로 하는 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 제조방법:

a) 오일성분에 계면활성제를 용해시키는 단계;

b) 염기성 수용액에 히알루론산 및 수용성 가교제를 용해시키는 단계;

c) 상기 a)의 혼합액에 상기 b)의 수용액을 투입하여 w/o 에멀젼을 형성하는 단계;

d) 상기 c)의 w/o 에멀젼을 60℃로 가열하면서 수용액 상의 가교제와 히알루 론산의 가교반응을 진행시키는 단계;

e) 상기 d)의 w/o 에멀젼의 온도를 상온으로 유지하면서 수용액을 산으로 중화시키고 수용액상의 가교제와 히알루론산의 가교반응을 완료하는 단계; 및

f) 상기 e)의 w/o 에멀젼으로부터 히알루론산 하이드로겔 나노입자를 회수하는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 히알루론산의 분자량이 수평균 분자량 기준 700,000~2,000,000인 것을 특징으로 하는 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 제조방법.
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 염기성 수용액의 pH를 12 ~ 14로 조절하여 이후의 가교반응을 진행시키는 것을 특징으로 하는 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 히알루론산의 함량은 염기성 수용액에 대하여 2 ~ 5 중량%인 것을 특징으로 하는 히알루론산 하이드로겔 나노입자의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 계면활성제의 함량은 w/o 에멀젼의 오일상과 수상의 혼합액 총 중량에 대하여 2 ~ 6 중량%인 것을 특징으로 하는 가교된 히알루론산 하이드로겔 나노입자 제조방법.
i) 계면활성제가 용해된 오일상 및 ii) 염기성 수용액에 히알루론산과 수용성 가교제가 용해된 수상이 혼합된 w/o 에멀전에서 가교된 히알루론산 하이드로겔 나노입자로서,

상기 오일은 세틸 에틸헥사노에이트(Cetyl ethylhexanoate;CEH), 도데칸(dodecane) 및 헵탄(heptane)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이고,

상기 계면활성제는 세틸 PEG/PPG-10/1 디메치콘(cetyl PEG/PPG-10/1 dimethicone), 소르비탄 세스퀴올레이트(sorbitan sesquioleate) 및 폴리에틸렌 글리콜 (30) 디폴리히드록시 스테아레이트(polyethylene glycol (30) dipolyhydroxy stearate)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이며,

상기 수용성 가교제는 비스에폭시드로서 부틸렌 글리콜 디글리시딜에테르(BDG) 또는 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜에테르(PEGDG)임을 특징으로 하는 히알루론산 하이드로겔 나노입자.
제11항에 있어서, 상기 w/o 에멀젼을 구성하는데 사용되는 계면활성제가 용해된 오일상 및 염기성 수용액에 히알루론산과 수용성 가교제가 용해된 수상의 혼합비율은 중량기준으로 오일상:수상이 1:1 ~ 7:3인 것을 특징으로 하는 히알루론산 하이드로겔 나노입자.
삭제