CN101626754B - 化学交联的透明质酸水凝胶纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了化学交联的透明质酸纳米颗粒及其制备方法。更具体地说，所述化学交联的透明质酸纳米颗粒是通过将油相与水相混合，从而形成w/o型乳液，并使所述透明质酸在该w/o型乳液中交联而制得的，所述油相含有溶解于其中的表面活性剂，所述水相含有溶解于碱性水溶液中的透明质酸和水溶性交联剂，当被施覆于皮肤上时，该纳米颗粒被均匀地吸收并分散于皮肤的角质层中，从而表现出得到改善的被皮肤吸收的能力，并且当被分散于水中时，该纳米颗粒表现出高的水溶胀比。

Description

化学交联的透明质酸水凝胶纳米颗粒及其制备方法
技术领域
本发明涉及化学交联的透明质酸纳米颗粒及其制备方法，更具体地说，本发明涉及这样的化学交联的透明质酸纳米颗粒，当被施覆在皮肤上时，该纳米颗粒被均匀地吸收并分散于皮肤的角质层中，从而表现出得到改善的被皮肤吸收的能力，当被分散于水中时，该纳米颗粒表现出高的水溶胀比(water-swelling ratio)，所述纳米颗粒是通过使油相与水相混合，从而形成油包水型(w/o)乳液，并使透明质酸在该w/o乳液中交联而制得的，所述油相含有溶解于其中的表面活性剂，所述水相含有溶解于碱性水溶液中的透明质酸和水溶性交联剂。
背景技术
透明质酸是由β-D-N-乙酰氨基葡糖和β-D-葡糖醛酸重复单元所组成的直链大分子粘多糖。已经知道透明质酸不仅发现于哺乳动物的结缔组织(例如，皮下组织或软骨组织)中，在眼睛的玻璃体、脐带、以及链球菌(Streptococci)的被膜(capsules)等中也发现了透明质酸。透明质酸通常不仅能由鸡冠花和脐带中提取得到，还可以作为从链球菌的肉汁培养基中提取和提纯的产物。
具有优异的生物相容性的天然透明质酸没有种特异性或者组织或器官特异性，并且其功能在于增加皮肤水分、保持皮肤弹性、当皮肤受到损伤时降低对下层皮肤的损伤，此外还起到类似润滑剂的作用，从而使胶原蛋白(皮肤的主要成分)在细胞之间顺利地移动。然而，当直接使用未经处理的天然透明质酸时，该天然透明质酸会表现出较差的机械性能，并且在体内易于被透明质酸酶所降解和除去，从而给它在各种应用中的使用设置了限制。为了克服这种天然透明质酸的不足所做出的努力中，已经进行了许多研究，这些研究致力于通过化学修饰或与各种交联剂进行交联来形成水凝胶。
由对透明质酸进行化学修饰或使透明质酸交联来形成水凝胶一般是通过位于透明质酸的骨架上的醇基或羧酸基而进行的。主要通过透明质酸骨架上的羧酸基的酯化来实现透明质酸的化学修饰(D.Campoccia等，Biomaterials，19，1998，2101-2127)，利用二酰肼(K.P.Vercruysse等，Bioconjug.Chem.，8，1997，686-694)、二醛(Y.Luo等.，J.Control.Release，69，2000，169-184)、或二硫化物(X.Z.Shu等，Biomacromolecules，3，2002，1304-1311)来实现交联以形成水凝胶。此外，已经进行了致力于通过将甲基丙烯酰胺光交联为羧酸基来制备水凝胶的研究(Y.D.Park等，Biomaterials，24，2003，893-900)。同时，也已经进行了致力于利用二乙烯基砜(divinylsulfone)((A.Ramamurthi等，J.Biomed.Master Res.，60，2002，195-205)或二缩水甘油醚(T.Segura等，Biomaterials，26，2005，359-371)作为透明质酸骨架的醇基的研究。
在20世纪80年代的后半段到20世纪90年代之间，对水凝胶颗粒进行的研究中，已经将微颗粒(microparticle)应用于各种领域，包括栓塞、酶的固定化和给药(drug delivery)，所述微颗粒是通过由聚合物材料制备微米大小的颗粒，并在该颗粒内进行化学修饰而得到的。自从2000年开始，随着纳米技术的发展，已经开展了由水溶性聚合物制备纳米大小的颗粒及其应用的研究。到目前为止，大多数对水凝胶颗粒的研究集于：使用生物可降解的聚合物，以应用于新型生物药物和生物器官(bio-organs)领域中；以及用于无创伤手术的可注入结构的制造。这些领域包括给药体系、栓塞、组织工程支架(tissue engineering scaffold)、填充剂和植入物。此外，水凝胶颗粒被广泛应用于以下应用中，包括：蛋白质的分离、浓缩和稳定；免疫测定；生物反应器；传感器；生物特异性色谱和化妆品填料(cosmetic fillers)。使用物理方法和化学方法来制备这种水凝胶颗粒，所述物理方法包括：乳化、团聚和喷雾干燥，所述化学方法例如为非均相聚合。例如，具有由多糖形成的壁的微胶囊可以通过在w/o型乳液的界面处进行交联而制备(M.C.Levy等，Int.J.Pharm.，62，1990，27-35；PCT/FR93/00237)。在该方法中，仅在界面处发生交联的大小大于数微米的微胶囊是通过使所述w/o型乳液内的含有交联剂的有机相与含有多糖的水相在它们之间的界面处发生交联而得到的。
随着可以应用于各种领域的水凝胶技术的发展，也已经开展了致力于利用具有许多优势的透明质酸来制备水凝胶颗粒的研究，并且如以上作为实例而描述的，通过w/o型乳液制备了大多数的透明质酸水凝胶颗粒(所述透明质酸水凝胶颗粒是通过化学交联制得的)(V.Dulong等，CarbohydratePolymers，57，2004，1-6；Y.H.Yun等，Biomaterials，25，2004，147-157)。然而，在大多数关于透明质酸水凝胶颗粒的研究中(包括上述研究)，透明质酸水凝胶颗粒的大小范围为由数微米至数十微米，且不能形成透明质水凝胶纳米颗粒。当水凝胶纳米颗粒的制备可以通过利用生物可降解的聚合物透明质酸的化学交联来实现时，能得到结合了透明质酸水凝胶的优点和纳米颗粒的特性的材料，所述透明质酸是一种亲水性的天然聚合物，同时具有优异的生物相容性。水凝胶纳米颗粒可以具有非常高的水溶胀比，这是因为它们具有短的水扩散长度和大的表面积，此外，随着颗粒大小的变小，与水凝胶微颗粒相比，它们可以表现出显著改善的皮肤吸收速率。当表现出上述特性的透明质酸水凝胶纳米颗粒的表面引入反应基团以提供目标因子(factor)时，具有生理活性的物质等结合于该目标因子上，能够开发出可以非常迅速地对外部刺激进行应答的功能性材料。
因此，为了将化学交联的透明质酸颗粒体系应用于各种领域中，迫切需要开发一种透明质酸水凝胶纳米颗粒体系，该纳米颗粒体系的颗粒大小小于现有的透明质酸水凝胶微颗粒的颗粒大小。
发明内容
因此，本发明的发明人试图解决现有技术中存在的上述问题，并开展了致力于通过使透明质酸在油包水型(w/o)乳液的碱性水溶液中交联，同时控制各种制备参数而制备透明质酸水凝胶纳米颗粒的研究。
具体地，本发明中，通过确定油的种类、w/o型乳液中油相与水相的比例、表面活性剂的种类和浓度、交联剂的种类和浓度、水溶液中的透明质酸的浓度等制备参数，并对这些参数进行控制从而制备透明质酸纳米颗粒。此外，通过透射电子显微镜和扫描电子显微镜观察到，可以将透明质酸水凝胶纳米颗粒的大小降低到数十纳米。
而且，通过光学显微镜观察到，当将干燥的透明质酸纳米颗粒分散于水中时，该水凝胶纳米颗粒被水所溶胀，从而使其颗粒大小增加到数微米或更大。此外，在本发明中，按以下方法进行皮肤吸收测试：将荧光共轭的透明质酸水凝胶纳米颗粒分散在油中、将该分散体施覆在来自白色的天竺鼠的皮肤上，并利用弗朗茨扩散池系统(Franz-cell system)来测量该水凝胶纳米颗粒的皮肤吸收。结果，通过共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scannningmicroscopy)观察到，所述透明质酸水凝胶纳米颗粒被均匀地吸收并分散于皮肤组织的角质层内，由此完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供化学交联的透明质酸水凝胶纳米颗粒及其制备方法，该纳米颗粒表现出改善的被皮肤吸收的能力和高的水溶胀比。
为了实现上述目的，一方面，本发明的方法提供了一种通过使透明质酸交联而制备透明质酸水凝胶纳米颗粒的方法，该方法包括：使i)油相与ii)水相混合，从而形成w/o型乳液，所述油相含有溶解于其中的表面活性剂，所述水相含有溶解于碱性水溶液中的透明质酸和水溶性交联剂；以及，使所述透明质酸在所述w/o型乳液中交联。
另一方面，本发明提供了透明质酸水凝胶纳米颗粒，该透明质酸水凝胶纳米颗粒是通过使透明质酸在i)油相与ii)水相的混合物中交联而制得的，所述油相含有溶解于其中的表面活性剂，所述水相含有溶解于碱性水溶液中的透明质酸和水溶性交联剂。
以下，将对本发明进行更详细的描述。
本发明涉及一种用于制备化学交联的透明质酸水凝胶纳米颗粒的方法，该方法包括：使i)油相与ii)水相混合，从而形成w/o型乳液，所述油相含有溶解于其中的表面活性剂，所述水相含有溶解于碱性水溶液中的透明质酸和水溶性交联剂；以及，使所述透明质酸在所述w/o型乳液中交联。
在该方法中，用于形成所述w/o型乳液的所述油相与所述水相之间的混合比以重量计优选为1∶1至7∶3(油相∶水相)，所述油相含有溶解于其中的表面活性剂，所述水相含有溶解于碱性水溶液中的透明质酸和水溶性交联剂。所述水相与所述油相的比例对颗粒大小和所述w/o型乳液的稳定性有影响，并且如果所述水相与所述油相的比例过高，则将形成大且不稳定的w/o型乳液，从而提高得到的干燥的颗粒的大小。另一方面，如果降低所述水相的比例，则将降低w/o型乳液的颗粒大小并提高它的稳定性，但是同时可获得的透明质酸颗粒的量将减少，导致效率方面的不足。
更具体地说，本发明的用于制备化学交联的透明质水凝胶纳米颗粒的方法包括以下步骤：
a)将表面活性剂溶解于油性组分中；
b)将透明质酸和水溶性交联剂溶解于碱性水溶液中；
c)将所述步骤b)的溶液添加到所述步骤a)的溶液中，从而形成w/o型乳液；
d)在60℃下，对所述步骤c)的所述w/o型乳液进行加热，同时使所述透明质酸与所述交联剂在所述水溶液中交联；
e)将所述步骤d)的所述w/o型乳液的温度保持为处于室温，同时用酸中和所述水溶液并完成所述交联剂与所述透明质酸之间的交联；以及
f)从所述步骤e)的所述w/o型乳液中收集透明质酸水凝胶纳米颗粒。
也可以通过用有机溶剂洗涤所述步骤e)的所述w/o型乳液，从而得到透明质酸水凝胶纳米颗粒溶液，并在70-90℃的温度下于真空中对得到的纳米颗粒溶液进行干燥，以除去残余的有机溶剂来进行所述步骤f)中的透明质酸水凝胶纳米颗粒的收集。
用于制备本发明的透明质酸水凝胶纳米颗粒的透明质酸的分子量对所述w/o型乳液的粘度有影响。用于本发明的透明质酸的分子量为300,000-10,000,000(数均分子量)，并且优选为700,000-2,000,000(数均分子量)。
用于本发明的透明质酸水凝胶纳米颗粒的油相可以为选自植物油、矿物油、硅油和合成油中的至少一种。优选为鲸蜡醇乙基己酸酯(cetylethylhexanoate)(CEH)、十二烷、或庚烷。
用于制备透明质酸水凝胶纳米颗粒的表面活性剂可以为选自能够稳定所述w/o型乳液的表面活性剂中的至少一种。优选地，所述表面活性剂可以为鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇-10/1聚二甲基硅氧烷(cetyl PEG/PPG-10/1dimethicone)(ABIL EM-90)、失水山梨糖醇倍半油酸酯(ARLACEL 83)、或聚乙二醇(30)二聚羟基硬脂酸酯(dipolyhydroxy stearate)(ARLACELP135)。
用于制备本发明的透明质酸水凝胶纳米颗粒的水溶性交联剂可以为选自与天然聚合物糖类形成交联的交联剂中的至少一种。当使用双环氧化物(bisepoxide)作为交联剂时，将形成酯键，而不是现有技术中通过酯化而通常形成的酯键。而且，在本发明中，当将交联结构分散于水中时，考虑使用PEG(聚乙二醇)链作为骨架，以使该交联结构的组分具有更高的亲水性。特别优选使用丁二醇二缩水甘油醚(BDG)或聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDG，一种在亲水性的PEG链的两端附着有环氧基团的结构)，并且用所述BDG或PEGDG交联的透明质酸水凝胶纳米颗粒在水相中表现出高的溶胀比。
在用于制备透明质酸水凝胶纳米颗粒的本发明的方法中，为了使所述透明质酸与所述交联剂在水溶液中进行交联，需要使用碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠或氨)将碱性水溶液的pH值提高至pH值为12-14，从而提高所述透明质酸的羟基的反应活性，所述碱性水溶液含有溶解于其中的透明质酸和交联剂。在本发明的实施例中，使用0.1N的氢氧化钠水溶液。
此外，当将透明质酸长时间置于碱性水溶液中时，透明质酸发生水解的可能性将增加。由于该原因，优选在尽可能最短的时间内使所述透明质酸和所述交联剂完全溶解于所述碱性水溶液中。此外，将该水溶液加入所述油相中，制得所述w/o型乳液(所述w/o型乳液随后在60℃下进行初始的交联反应)之后，优选将反应温度降低至室温并用酸(例如，乙酸、盐酸、硫酸、硝酸或柠檬酸)来中和所述碱性水溶液。
基于所述碱性水溶液的重量，用于本发明的透明质酸水凝胶纳米颗粒的所述透明质酸的量为1-10重量％，并优选为2-5重量％。如果水溶液中的所述透明质酸的浓度低于上述限定范围的下限，将减小聚合物链之间的缠结，因此将在同一链上发生交联而不是在不同链之间发生交联，从而不能得到含有多个透明质酸骨架的三维网络结构。另一方面，如果水溶液中的所述透明质酸的浓度超过上述限定范围的上限，则将过度地提高水溶液的粘度，使其难以形成小且稳定的w/o型乳液颗粒。出于这些原因，为了得到所期望的结果，基于所述水溶液的重量，所述透明质酸的浓度为2-5重量％。
此外，基于所述w/o型乳液中的所述油相和所述水相的混合物的重量，制备透明质酸水凝胶纳米颗粒并起到稳定地保持所述w/o型乳液的作用所需的所述表面活性剂的量为1-10重量％，并且优选为2-6重量％。所述表面活性剂的浓度对所述w/o型乳液的颗粒大小和稳定性有影响，因此如果所述表面活性剂的浓度低于上述限定的范围的下限，将提高颗粒的大小并降低颗粒的稳定性。如果所述表面活性剂的浓度超过上述限定范围的上限，则所述表面活性剂可以稳定所述w/o型乳液颗粒，但是在得到的颗粒中，所述表面活性剂会成为不必要的杂质成分，因此考虑到纯度，所述表面活性剂优选以少量使用。然而，考虑到所述w/o型乳液的稳定性，所述表面活性剂优选的用量为2-6重量％。
同时，用于从所述w/o型乳液中收集交联的透明质酸水凝胶纳米颗粒并洗涤该纳米颗粒的水混溶性有机溶剂没有特别地限定，但可以选自乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮和四氢呋喃。为了完全除去杂质(例如，油、表面活性剂和未反应的交联剂)，所述杂质可能存在于用所述有机溶剂洗涤之后的透明质酸水凝胶纳米颗粒中，本发明的制备方法可以进一步包括制备洗涤之后的透明质酸水凝胶纳米颗粒的水溶液，并用有机溶剂洗涤该水溶液的步骤。
通过控制制备参数(所述制备参数包括透明质酸在所述w/o型乳液的所述水相中的浓度、交联剂的种类、所述w/o型乳液中的水相与油相的比例、所述w/o型乳液中的油的种类、以及所述w/o型乳液中的表面活性剂的种类和浓度)，由以上描述的制备方法获得的本发明的化学交联的透明质酸水凝胶纳米颗粒在干态(dried state)下的颗粒大小的范围可以为数十纳米至数百纳米。所述透明质酸水凝胶纳米颗粒的特征在于，当它们被水所溶胀时，其颗粒大小将在短时间内增加至数微米或更大。当未对所述制备参数进行适当的控制时，所述w/o型乳液将变得不稳定，或者所述w/o型乳液的颗粒大小将增加，此外，得到的化学交联的透明质酸水凝胶颗粒的颗粒大小将增加，从而使得这些颗粒在干态下几乎不能具有纳米级的大小。
另一方面，本发明提供了透明质酸水凝胶纳米颗粒，该透明质酸水凝胶纳米颗粒是通过使透明质酸在含有i)油相与ii)水相的混合物的w/o型乳液中交联而制得的，所述油相含有溶解于其中的表面活性剂，所述水相含有溶解于碱性水溶液中的透明质酸和水溶性交联剂。
用于形成所述w/o型乳液的所述油相与所述水相之间的混合比以重量计优选为1∶1至7∶3(油相∶水相)，所述油相含有溶解于其中的表面活性剂，所述水相含有溶解于碱性水溶液中的透明质酸和水溶性交联剂。
而且，所述水溶性交联剂优选为双环氧化物，例如：丁二醇二缩水甘油醚(BDG)、或聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDG)。
如以上所描述地，作为对各种制备参数进行控制的结果，根据本发明的化学交联的透明质酸水凝胶纳米颗粒可以具有比通过现有的常规w/o型乳液制备的透明质酸水凝胶微颗粒小得多的颗粒大小。而且，由于本发明的化学交联的透明质酸水凝胶纳米颗粒的颗粒大小被降低至纳米级，观察到所述透明质酸水凝胶纳米颗粒表现出得到改善的被皮肤组织吸收的能力，而且，通过初级皮肤刺激试验可以证实所述透明质酸水凝胶纳米颗粒的安全性。此外，当将该HA(透明质酸)水凝胶纳米颗粒分散在水中时，它们表现出高的水溶胀比，这表明可以将它们用于各种应用中。
附图说明
图1为w/o型乳液的光学显微镜照片，该w/o型乳液在水相中含有透明质酸和交联剂。图1中，A：实施例12；B：实施例13；C：对比例5；以及D：对比例6。
图2为干燥的透明质酸水凝胶纳米颗粒的扫描电子显微镜照片。图2中，A：实施例13；以及B：对比例5。
图3为干燥的透明质酸水凝胶颗粒的扫描电子显微镜照片(实施例11)。
图4为干燥的透明质酸水凝胶颗粒的透射电子显微镜照片(实施例11)。
图5为在水溶液中溶胀的透明质酸水凝胶颗粒的光学显微镜照片。图5中，A：实施例12；B：实施例13；C：对比例5；以及D：对比例6。
图6为反映了荧光共轭的透明质酸水凝胶颗粒的皮肤吸收速率的共聚焦激光扫描显微镜照片。
具体实施方式
下面，将通过实施例和测试例对本发明进行更详细地描述，但本发明的范围不限于此。
在以下的实施例中，使用下列缩写：
HA：透明质酸
CEH：鲸蜡醇乙基己酸酯
ARLACEL 83：A-83
ARLACEL P135：A-P135
ABIL EM-90：AE-90
BDG：丁二醇二缩水甘油醚
PEGDG：聚乙二醇二缩水甘油醚
LYD：荧光黄葡聚糖(lucifer yellow dextran)
实施例1-6：使用十二烷作为w/o型乳液的油相来制备HA水凝胶颗粒
在实施例1-6中，根据下表1中所示的重量组成比，利用搅拌器将表面活性剂A-83或A-P135溶解于十二烷中，同时使用搅拌器将HA(数均分子量为1,500,000)与交联剂BDG或PEGDG溶解于0.1N的氢氧化钠水溶液中。向含有溶解于其中的表面活性剂的十二烷中缓慢地加入该0.1N的氢氧化钠溶液(该氢氧化钠溶液含有溶解于其中的HA和交联剂)时，用乳化器以7000转每分钟(rpm)的速度将该混合物搅拌混合10分钟，从而制得w/o型乳液。将该乳液转移到反应器中，在60℃下对该乳液进行加热并使该乳液进行初始的交联反应，同时进行搅拌从而使该w/o型乳液得以保持。在对该混合物进行持续搅拌的同时，将所述反应器的温度调节至室温，并向所述w/o型乳液中加入乙酸从而中和所述w/o型乳液的水相，并在室温下搅拌2天，使所述w/o型乳液进行交联反应。为了从所述w/o型乳液中收集交联的透明质酸水凝胶纳米颗粒，并对所收集的纳米颗粒进行洗涤，使反应后的w/o型乳液在丙酮、乙醇或四氢呋喃中进行沉淀。为了完全除去包括油、表面活性剂和未反应的交联剂在内的杂质，制备首次沉淀的HA水凝胶纳米颗粒的水溶液，并在丙酮或四氢呋喃中再次进行沉淀。通过上述过程得到的交联的HA水凝胶颗粒在真空中90℃下干燥24小时，由此将残留的溶剂从所述颗粒中完全除去。
表1用来制备HA水凝胶颗粒的含有十二烷作为油相的w/o型乳液的成分和组成
  十二烷   表面活性剂   0.1N的氢氧化钠水溶液   HA   交联剂   乙酸
实施例1 105g   4.5g的A-P135 45g 1.35g   1.3g的BDG   0.26ml
实施例2 105g   4.5g的A-83 45g 1.35g   1.3g的BDG   0.26ml
实施例3 105g   4.5g的A-P135 45g 1.35g   3.17g的PEGDG   0.26ml
实施例4 105g   4.5g的A-P135 45g 1.35g   1.59g的PEGDG   0.26ml
实施例5 105g   9g的A-P135 45g 1.35g   3.17g的PEGDG   0.26ml
实施例6 75g   9g的A-P135 75g 2.25g   5.28g的PEGDG   0.43ml
实施例7-13：使用庚烷作为w/o型乳液的油相来制备透明质酸水凝胶颗 粒
在实施例7-13中，根据下表2中所示的重量组成比，利用搅拌器将表面活性剂A-P135溶解于庚烷中，同时使用搅拌器将HA(数均分子量为1,500,000)与交联剂PEGDG溶解于0.1N的氢氧化钠水溶液中。向含有溶解于其中的A-P135的庚烷中缓慢地加入该0.1N的氢氧化钠溶液(该氢氧化钠溶液含有溶解于其中的HA和交联剂)时，用乳化器以7000rpm的速度将该混合物搅拌混合10分钟，从而制得w/o型乳液。将该乳液转移到反应器中，在60℃下对该乳液进行加热并使该乳液进行初始的交联反应，同时进行搅拌从而使该w/o型乳液得以保持。在对该混合物进行持续搅拌的同时，将所述反应器的温度调节至室温，并向所述w/o型乳液中加入乙酸从而中和所述w/o型乳液的水相，并在室温下搅拌2天，使所述w/o型乳液进行交联反应。为了从所述w/o型乳液中收集交联的透明质酸水凝胶纳米颗粒，并对所收集的纳米颗粒进行洗涤，使反应后的w/o型乳液在丙酮、乙醇或四氢呋喃中进行沉淀。为了完全除去包括油、表面活性剂和未反应的交联剂在内的杂质，制备首次沉淀的HA水凝胶纳米颗粒的水溶液，并在丙酮或四氢呋喃中再次进行沉淀。通过上述过程得到的交联的HA水凝胶颗粒在真空中90℃下干燥24小时，由此将残留的溶剂从所述颗粒中完全除去。
表2用来制备HA水凝胶颗粒的含有庚烷作为油相的w/o型乳液的成分和组成
  庚烷   A-P135   0.1N的氢氧化钠水溶液   HA   PEGDG   乙酸
  实施例7   105g   4.5g   45g   1.35g   3.17g   0.26ml
  实施例8   105g   9g   45g   1.35g   1.59g   0.26ml
  实施例9   75g   9g   75g   2.25g   2.64g   0.43ml
  实施例10   105g   9g   45g   2.25g   2.64g   0.26ml
  实施例11   500g   60g   500g   15g   20.1g   2.86ml
  实施例12   75g   9g   75g   2.25g   6g   0.43ml
  实施例13   113g   9g   37.5g   1.13g   1.51g   0.22ml
实施例14：荧光LYD共轭的透明质酸水凝胶颗粒的制备
在实施例14中，根据下表3中所示的重量组成比，利用搅拌器将表面活性剂A-P135溶解于庚烷中，同时使用搅拌器将HA(数均分子量为1,500,000)、交联剂PEGDG和荧光LYD溶解于0.1N的氢氧化钠的水溶液中。向含有溶解于其中的A-P135的庚烷中缓慢地加入该0.1N的氢氧化钠溶液(该氢氧化钠溶液含有溶解于其中的HA、PEGDC和LYD)时，用乳化器以7000rpm的速度将该混合物搅拌混合10分钟，从而制得w/o型乳液。将该乳液转移到反应器中，在60℃下对该乳液进行加热并使该乳液进行初始的交联反应，同时进行搅拌从而使该w/o型乳液得以保持。在对该混合物进行持续搅拌的同时，将所述反应器的温度调节至室温，并向所述w/o型乳液中加入乙酸，从而中和该w/o型乳液的水相，并在室温下搅拌2天，使该w/o型乳液进行交联反应。为了从所述w/o型乳液中收集交联的透明质酸水凝胶纳米颗粒，并对所收集的纳米颗粒进行洗涤，使反应后的w/o型乳液在丙酮、乙醇或四氢呋喃中进行沉淀。为了完全除去包括油、表面活性剂和未反应的交联剂在内的杂质，制备首次沉淀的HA水凝胶纳米颗粒的水溶液，并在丙酮或四氢呋喃中再次进行沉淀。通过上述过程得到的交联的HA水凝胶颗粒在真空中90℃下干燥24小时，由此将残留的溶剂从所述颗粒中完全除去。
表3用来制备LYD共轭的HA水凝胶颗粒的w/o型乳液的成分和组成
  庚烷   A-P135   0.1N的氢氧化钠水溶液   HA   PEGDG   LYD   乙酸
  实施例14   105g   9g   45g   1.35g   2.8g   20mg   0.26ml
对比例1和2：使用CEH作为w/o型乳液的油相来制备HA水凝胶颗粒
在对比例1和2中，根据下表4中所示的重量组成比，利用搅拌器将表面活性剂AE-90溶解于CEH中，同时使用搅拌器将HA(数均分子量为1,500,000)与交联剂BDG溶解于0.1N的氢氧化钠的水溶液中。向含有溶解于其中的AE-90的CEH中缓慢地加入该0.1N的氢氧化钠溶液(该氢氧化钠溶液含有溶解于其中的HA和BDG)时，用乳化器以7000rpm的速度将该混合物搅拌混合10分钟，从而制得w/o型乳液。将该乳液转移到反应器中，在60℃下对该乳液进行加热并使该乳液进行初始的交联反应，同时进行搅拌从而使该w/o型乳液得以保持。在对该混合物进行持续搅拌的同时，将所述反应器的温度调节至室温，并向所述w/o型乳液中加入乙酸从而中和该w/o型乳液中的水相，并在室温下搅拌2天，使该w/o型乳液进行交联反应。为了从所述w/o型乳液中收集交联的透明质酸水凝胶纳米颗粒，并对所收集的纳米颗粒进行洗涤，使反应后的w/o型乳液在丙酮、乙醇或四氢呋喃中进行沉淀。为了完全除去包括油、表面活性剂和未反应的交联剂在内的杂质，制备首次沉淀的HA水凝胶纳米颗粒的水溶液，并在丙酮或四氢呋喃中再次进行沉淀。通过上述过程得到的交联的HA水凝胶颗粒在真空中90℃下干燥24小时，由此将残留的溶剂从所述颗粒中完全除去。
表4用来制备HA水凝胶颗粒的含有CEH作为油相的w/o型乳液的成分和组成
  CEH   AE-90   0.1N的氢氧化钠水溶液   HA   BDG   乙酸
  对比例1   140g   10g   60g   1.8g   1.84g   0.35ml
  对比例2   140g   10g   60g   1.2g   1.22g   0.35ml
对比例3-7：使用庚烷作为w/o型乳液的油相来制备水凝胶颗粒
在对比例3-6中，根据下表5中所示的重量组成比，利用搅拌器将表面活性剂A-P135溶解于庚烷中，同时使用搅拌器使HA(数均分子量为1,500,000)与交联剂PEGDG溶解于0.1N的氢氧化钠的水溶液中。向含有溶解于其中的A-P135的庚烷中缓慢地加入该0.1N的氢氧化钠溶液(该氢氧化钠溶液含有溶解于其中的HA和PEGDG)时，用乳化器以7000rpm的速度将该混合物搅拌混合10分钟，从而制得w/o型乳液。将该乳液转移到反应器中，在60℃下对该乳液进行加热并使该乳液进行初始的交联反应，同时进行搅拌从而使得该w/o型乳液得以保持。在对该混合物进行持续搅拌的同时，将所述反应器的温度调节至室温，并向所述w/o型乳液中加入乙酸从而中和该w/o型乳液中的水相，并在室温下搅拌2天，使该w/o型乳液进行交联反应。为了从所述w/o型乳液中收集交联的透明质酸水凝胶纳米颗粒，并对所收集的纳米颗粒进行洗涤，使反应后的w/o型乳液在丙酮、乙醇或四氢呋喃中进行沉淀。为了完全除去包括油、表面活性剂和未反应的交联剂在内的杂质，制备首次沉淀的HA水凝胶纳米颗粒的水溶液，并在丙酮或四氢呋喃中再次进行沉淀。通过上述过程得到的交联的HA水凝胶颗粒在真空中90℃下干燥24小时，由此将残留的溶剂从所述颗粒中完全除去。
比较例7中，按照与比较例3-6相同的方式制备交联的HA水凝胶颗粒，不同的是，不进行使用乙酸来中和的操作。
表5用来制备HA水凝胶颗粒的含有庚烷作为油相的w/o型乳液的成分和组成
  庚烷   A-P135   0.1N的氢氧化钠水溶液   HA   PEGDG   乙酸
 对比例3   45g   9g   105g   3.15g   3.71g   0.61ml
 对比例4   75g   9g   75g   2.25g   1.32g   0.43ml
 对比例5   75g   3g   75g   2.25g   3.01g   0.43ml
 对比例6   37.5g   9g   113g   3.38g   4.52g   0.65ml
 对比例7   500g   60g   500g   15g   20.1g   -
测试例1：通过光学显微镜对水相中含有HA和交联剂的w/o型乳液的 大小进行观察
使用光学显微镜对实施例1-14和对比例1-7中得到的且水相中含有HA和交联剂的w/o型乳液的大小和形状进行测量。与对比例1-7的w/o型乳液相比，对实施例1-14中制备的w/o型乳液的大小和形状进行观察得到的结果中，实施例1-14中制备的乳液明显为球形的且颗粒大小约为1-20μm，并具有清晰的乳液界面以及相对小的w/o型乳液颗粒大小，所述对比例1-7的w/o型乳液的乳液颗粒大小约为10-60μm。
图1为实施例12-13和对比例5-6中获得的w/o型乳液颗粒的光学显微镜照片。如图1所示，决定w/o型乳液的稳定性和乳液颗粒大小的因素包括：油和表面活性剂的种类、水相与油相的比例、表面活性剂的浓度等。可以观察到，当所使用的油为十二烷或庚烷时，所述w/o型乳液具有相对小的颗粒大小和清晰的界面，并且水相与油相的比例的增大导致所述w/o型乳液的颗粒大小的增加。而且，当使用A-83或A-P135作为表面活性剂时，可以得到更稳定的w/o型乳液，当使用的表面活性剂的量超过3重量％(基于所述w/o型乳液的油和水性氢氧化钠的总重量)时，可以得到小且稳定的w/o型乳液。稳定的颗粒形状和w/o型乳液的形状之所以重要的原因在于，乳液强烈影响水溶液中得到的HA水凝胶颗粒的溶胀的颗粒的形状以及颗粒大小，并且较小的w/o型乳液的颗粒大小对于得到干燥的HA水凝胶纳米颗粒是有利的。
测试例2：使用扫描电子显微镜和透射电子显微镜对干燥的HA水凝胶 颗粒的大小进行观察
制备实施例1-14和对比例1-7中得到的干燥的HA水凝胶颗粒的1重量％的水溶液，并分别使用扫描电子显微镜和透射电子显微镜对干燥的HA水凝胶颗粒的颗粒大小进行观察。实施例1-14中得到的干燥的HA水凝胶颗粒的颗粒大小为约50-400nm，虽然在对比例1-7中得到的干燥的HA水凝胶颗粒中也观察到了纳米尺寸的颗粒，但是所观察到的颗粒的颗粒大小为大于1μm。
图2为实施例13和对比例5中得到的干燥的HA水凝胶颗粒的扫描电子显微镜照片。如图2所示，与对比例5中得到的颗粒相比，实施例13中得到的干燥的水凝胶颗粒的颗粒大小要小得多且均匀得多。
图3和图4为实施例11制得的干燥的HA水凝胶颗粒的扫描电子显微镜照片和透射电子显微镜照片。如图3和图4所示，干燥的水凝胶颗粒的颗粒大小为20-400nm。基于上述结果，可以发现除了在交联发生期间影响w/o型乳液的大小的因素之外，决定干燥的HA水凝胶颗粒的大小的因素还包括：交联的程度、w/o型乳液的水相中的HA的浓度、进行或不进行中和操作等。根据所述颗粒大小的扫描电子显微镜观察结果和透射电子显微镜观察结果认为，所述w/o型乳液的颗粒大小是决定最终的干燥的HA水凝胶颗粒的颗粒大小的最重要的因素。
测试例3：通过光学显微镜对溶胀的HA水凝胶颗粒的大小进行观察
制备实施例1-14和对比例1-7中得到的干燥的HA水凝胶颗粒的1重量％的水溶液，并使用光学显微镜观察该溶胀的HA水凝胶颗粒的颗粒大小。实施例1-14中得到的溶胀的HA水凝胶颗粒的颗粒大小为小于50μm，然而，可以观察到：在对比例1-7中得到的溶胀的HA水凝胶颗粒中，溶胀的HA水凝胶颗粒的颗粒大小为大于50μm，大于实施例1-14中得到的溶胀的HA水凝胶颗粒的颗粒大小。
图5示出了实施例12-13和对比例5-6中制备的溶胀的HA水凝胶颗粒的光学显微镜照片。图5中的结果是由于在所述w/o型乳液中发生了如上所述的HA水凝胶颗粒的交联，因此，决定该溶胀的HA水凝胶颗粒的大小的最重要的因素是w/o型乳液的颗粒大小。除了决定w/o型乳液的颗粒大小的因素之外，与交联剂的交联程度以及交联剂的种类也影响了溶胀的HA水凝胶颗粒的大小。当交联程度提高时，相对减少了HA水凝胶颗粒由干态向溶胀态(swollen state)的转变，并且交联的水凝胶颗粒的亲水性随着交联剂的种类而不同。
测试例4：通过弗朗茨扩散池系统对荧光共轭的HA水凝胶颗粒进行皮 肤吸收测试
对实施例14中制得的荧光共轭的HA水凝胶颗粒进行皮肤吸收测试。使用弗朗茨扩散池系统，在来自于白色的天竺鼠的皮肤上进行3小时和6小时的皮肤吸收测试。为了将干燥的HA水凝胶颗粒施覆在该皮肤组织上，用乳化器以1重量％的浓度将干燥的HA水凝胶颗粒分散在CEH中，随后将给定量的该分散体施覆在所述皮肤组织上。为了对作为时间的函数的该水凝胶颗粒的皮肤吸收进行测试，将用所述LYD共轭的水凝胶颗粒分别施覆了3小时和6小时的皮肤组织从所述弗朗茨扩散池中分离出来，以制备用于显微镜观察的样品。使用共聚焦激光扫描显微镜对所述样品中的荧光LYD进行观察，因此测定作为时间的函数的所述HA水凝胶颗粒的皮肤吸收。
图6显示了LYD的荧光强度，该LYD的荧光强度是用共聚焦激光扫描显微镜观察到的，以测定实施例14中得到的荧光LYD共轭的HA水凝胶颗粒的随着时间的皮肤吸收。如图6所示，随着时间的推移，该LYD的荧光强度均匀地分散在所述皮肤组织的角质层中，这说明了分散于油中的HA水凝胶纳米颗粒至少可以被吸收进入角质层。
测试例5：HA水凝胶颗粒的初级皮肤刺激试验
按照体内眼刺激试验方法(Draize test method)，对两只雄性新西兰白兔(Hallym实验动物中心，韩国)用实施例11所制备的HA水凝胶颗粒以5％的浓度进行初级皮肤刺激试验。根据韩国食品药品管理局2005-60号通告的毒性测试标准中所给出“皮肤反应评估标准”对皮肤反应的结果进行评估，并通过初级刺激指数(primary irritation index)(P.I.I)来确定是否使用测试材料。结果，测试材料的P.I.I值为0，这说明没有观察到异常的皮肤症状，包括红斑、水肿和结块(clusts)。
工业实用性
如以上所描述地，当被施覆在皮肤上时，根据本发明的化学交联的透明质酸水凝胶纳米颗粒被均匀地吸收并分散于皮肤的角质层中，从而表现出得到改善的被皮肤吸收的能力。而且，当将所述化学交联的透明质酸水凝胶纳米颗粒分散在水中时，它们表现出了高的水溶胀比。

Claims (8)

1.一种通过使透明质酸交联而制备透明质酸水凝胶纳米颗粒的方法，该方法包括：使i）油相与ii）水相混合，从而形成油包水型乳液，所述油相含有溶解于其中的表面活性剂，所述水相含有溶解于碱性水溶液中的透明质酸和水溶性交联剂；以及，使所述透明质酸在所述油包水型乳液中交联；其中，用于形成所述油包水型乳液的所述油相与所述水相之间的混合比以重量计为，油相：水相=1：1至7：3，基于所述油包水型乳液的所述油相和所述水相的总重量，所述表面活性剂的含量为2-6重量%；在进行所述交联反应之前，将所述碱性水溶液的pH值调节至12-14；且基于所述碱性水溶液的重量，所述透明质酸的含量为2-5重量%。
2.根据权利要求1所述的方法，该方法包括以下步骤：
a）将表面活性剂溶解于油性组分中；
b）将透明质酸和水溶性交联剂溶解于碱性水溶液中；
c）将所述步骤b）的溶液添加到所述步骤a）的溶液中，从而形成油包水型乳液；
d）在60℃下，对所述步骤c）的所述油包水型乳液进行加热，同时使所述透明质酸与所述交联剂在所述水溶液中交联；
e）将所述步骤d）的所述油包水型乳液的温度保持为处于室温，并且同时，用酸中和所述水溶液并完成所述交联剂与所述透明质酸之间的所述交联；以及
f）从所述步骤e）的所述油包水型乳液中收集透明质酸水凝胶纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述透明质酸的数均分子量为700000-2000000。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述油相为选自由鲸蜡醇乙基己酸酯、十二烷、和庚烷所组成的组中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述表面活性剂为选自由鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇-10/1聚二甲基硅氧烷、失水山梨糖醇倍半油酸酯、和聚乙二醇30二聚羟基硬脂酸酯所组成的组中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述水溶性交联剂为丁二醇二缩水甘油醚、或聚乙二醇二缩水甘油醚。
7.一种透明质酸水凝胶纳米颗粒，该透明质酸水凝胶纳米颗粒是通过使透明质酸在i）油相与ii）水相的混合物中进行交联而制得的，所述油相含有溶解于其中的表面活性剂，所述水相含有溶解于碱性水溶液中的透明质酸和水溶性交联剂，从而形成油包水型乳液，并使所述透明质酸在该油包水型乳液中交联；其中，用于形成所述油包水型乳液的所述油相与所述水相之间的混合比以重量计为，油相：水相=1：1至7：3；基于所述油包水型乳液的所述油相和所述水相的总重量，所述表面活性剂的含量为2-6重量%；在进行所述交联反应之前，将所述碱性水溶液的pH值调节至12-14；且基于所述碱性水溶液的重量，所述透明质酸的含量为2-5重量%。
8.根据权利要求7所述的透明质酸水凝胶纳米颗粒，其中，所述水溶性交联剂为丁二醇二缩水甘油醚、或聚乙二醇二缩水甘油醚。
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