WO2020145790A1 - 히알루론산 나노 입자를 합성하는 방법 및 이 방법으로 제조된 히알루론산 나노 입자 - Google Patents

히알루론산 나노 입자를 합성하는 방법 및 이 방법으로 제조된 히알루론산 나노 입자 Download PDF

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nanoparticles
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유정수
흉풍투
이웅희
박원철
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing nanoparticles having a biocompatible, pure hyaluronic acid crosslinking agent without a crosslinking agent, and to the nanoparticles thus prepared, and to the utilization of such nanoparticles.
  • Hyaluronic acid is a component constituting skin cells in addition to elastin and collagen, and can hold 1000 ml of moisture per gram, so it is called a water reservoir and is widely used as a cosmetic material.
  • Nanoparticles such as hydrogels of pure hyaluronic acid that can be used in vivo and biocompatible, will be essential for use as a contrast agent and in vivo, but research on utilizing hyaluronic acid in cross-linking and converting it into nanoparticle form is not yet available. In addition, few studies have been reported to synthesize nanoparticles without using a crosslinking agent.
  • the present invention recognizes the above-mentioned problems and needs, and provides a novel method for preparing biocompatible and pure hyaluronic acid nanoparticles or nanogels.
  • the method of the present invention provides a method capable of forming cross-linked nanoparticles of hyaluronic acid in an aqueous solution other than an organic solvent without a separate cross-linking agent, and also provides a method of controlling the size of the nano-particles.
  • the present invention provides a method for producing cross-linked hyaluronic acid nanoparticles comprising irradiating an electron beam to an aqueous hyaluronic acid solution to form intermolecular or intramolecular crosslinks.
  • the nanoparticle refers to a particle having a size of several hundreds to hundreds of nanometers (nm, a material of one billionth of a meter).
  • the nanoparticle may be characterized in that the particle size is 1 to 100 nm, but is not limited thereto.
  • the nanoparticles are concepts including nanogels or nanohydrogels.
  • nanoparticles, nanogels, or nanohydrogels are all used to mean nanoparticles according to the present invention.
  • the hyaluronic acid aqueous solution is characterized in that it is acidic, and for the acidic aqueous solution, HClO 4 may be additionally included in the hyaluronic acid-containing solution.
  • HClO 4 may be additionally included in the hyaluronic acid-containing solution.
  • the hyaluronic acid (hyaluronic acid) is widely distributed in the interstitial cells in the connective tissue to form an adhesive and elastic solution under physiological conditions, thereby mechanically protecting tissues such as iris, retina, vascular endothelial cells, epithelial cells, etc. It is a major component of the extracellular matrix, known to provide a buffering role.
  • the hyaluronic acid is not limited to physical properties, form, size, etc., and is preferably sterile. Further, the hyaluronic acid may have a weight average molecular weight of 5 to 5000 kDa, preferably 5 to 3000 kDa.
  • the hyaluronic acid may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, the pharmaceutically acceptable salt includes sodium salt, potassium salt, calcium salt, and the like, preferably sodium salt.
  • derivatives of hyaluronic acid may also be used, and these derivatives may be hyaluronic acid chemically modified by cross-linking, sulfation, esterification, or amino acid bonding.
  • the pH of the aqueous hyaluronic acid solution may be 1 to 6, more preferably pH 1 to 5, even more preferably pH 1 to 4, most preferably pH 1.5 to 3.5
  • the concentration of the aqueous hyaluronic acid solution may be 0.05 to 7% (w/v), and preferably 0.1 to 5% (w/v).
  • the aqueous solution is characterized in that it does not contain a crosslinking agent and an organic solvent.
  • the irradiation dose of the electron beam is changed to control the size of the hyaluronic acid nanoparticles, and the irradiation dose of the electron beam is increased to reduce the size of the hyaluronic acid nanoparticles.
  • the electron beam irradiated in the method for producing hyaluronic acid nanoparticles provided by the present invention may be irradiated with an irradiation amount of 0.5 to 300 kGy, preferably 1 to 250 kGy, and most preferably 1 to 200 kGy.
  • the total irradiation energy intensity of the electron beam may be characterized in that 0.1MeV to 5Mev.
  • the total irradiation energy intensity of the electron beam may be 0.5 MeV to 3 Mev, most preferably 1.0 MeV to 2.5 MeV.
  • the pH of the aqueous solution is controlled to control the size of the hyaluronic acid nanoparticles, and the size of the hyaluronic acid nanoparticles is increased by lowering the pH of the aqueous solution.
  • the method for producing hyaluronic acid nanoparticles provided by the present invention may be a method for producing hyaluronic acid nanoparticles having a diameter of 100 nm or less, preferably hyaluronic acid nanoparticles having a diameter of 50 nm or less, most preferably 30 nm or less It may be a method of manufacturing hyaluronic acid nanoparticles having a diameter.
  • the present invention provides intermolecular or intramolecular crosslinked nanoparticles of hyaluronic acid prepared by the above method.
  • the nanoparticles are characterized by being hydrogels with swelling properties.
  • the nanoparticles are characterized by having tumor selectivity.
  • the nanoparticles are characterized by having colorectal cancer or melanoma selectivity.
  • the nanoparticles are characterized by having a tumor-to-muscle ratio of 8 times or more and a tumor-to-blood ratio of 1.5 times or more for a colon cancer tumor.
  • the nanoparticles are characterized by having a tumor-to-muscle ratio of 14 times or more and a tumor-to-blood ratio of 3 times or more for melanoma.
  • the present invention is one selected from the group consisting of radioactive isotopes, organic fluorescent materials, inorganic material quantum dots, magnetic resonance imaging contrast agents, computed tomography contrast agents, positron tomography contrast agents, ultrasound contrast agents, fluorescent contrast agents, and pictoconversion materials It provides a contrast agent comprising the above-mentioned hyaluronic acid nanoparticles labeled with the above labeling material.
  • the ligand compound is NODA-GA-NH 2 , Characterized in that at least one of DOTA-GA, DOTA, TETA and NOTA.
  • the radioactive isotopes are 11 C, 13 N, 15 O, 18 F, 38 K, 62 Cu, 64 Cu, 68 Ga, 82 Rb, 124 I, 89 Zr, 99m Tc, 123 I, 111 In, 67 Ga, 177 Lu, 201 Tl, 117m Sn, 125 I, 131 I, 166 Ho, 188 Re, 67 Cu, 89 Sr, 90 Y, 225 Ac, 213 Bi, and 211 At.
  • the present invention provides ascorbic acid and hyaluronic acid nanogel conjugates.
  • the "conjugate (conjugate)” means a compound in which two or more compounds are connected to each other.
  • the linking can be achieved by non-covalent or covalent bonds. That is, the conjugate of the present invention means that ascorbic acid and hyaluronic acid are directly or indirectly non-covalently or covalently bound.
  • the conjugate of the present invention may be a hydroxy group of ascorbic acid in the carboxylic acid group of hyaluronic acid, which is firmly covalently linked by forming a bond through an alkyl group of C1 to C5.
  • the “ascorbic acid” is a substance having an antioxidant action represented by the following Chemical Formula 1 and is also called a water-soluble vitamin, vitamin C. It is a pharmaceutical preparation, feed, melanin pigment accumulation inhibition, medical drugs, cosmetics, and various other It is used for industrial applications.
  • the ascorbic acid is a very unstable compound, and is unstable in oxidizing and thermal conditions, and loses its activity when exposed to heat, air, and light during the manufacturing process.
  • Oxidation for example oxidation of -CH 2 OH groups to -CHO and/or -COOH; Periodic acid salts of adjacent hydroxyl groups, optionally with reduction, such as reduction with -CHO to -CH 2 OH or binding with amines to form imines and with reduction to secondary amines Periodic oxidation; Sulfate (sulphation); Deamidation, optionally involving deamination or formation of amides with new acids; Esterification; Crosslinking; Substitution with various compounds, including the binding of hyaluronic acid with various molecules such as proteins, peptides and active pharmaceutical ingredients, for example with the aid of a crosslinking agent or carbodiimide ; And nanogels derived from various derivatives of hyaluronic acid, such as deacetylation, are also covered by the term.
  • the manufacturing method is not particularly limited.
  • Methods of manufacturing nanometer-sized hyaluronic acid hydrogels are well known in the art, for example, a method using a crosslinking agent, a method using an electron beam, etc. may be referred to, but most preferably, the hyaluronic acid is used.
  • Nanogel may be prepared by irradiating an electron beam to the above-described aqueous solution of hyaluronic acid.
  • conjugate of ascorbic acid and hyaluronic acid nanogel may be characterized by having the following Chemical Formula 2:
  • m 1 to 5.
  • the conjugate provided by the present invention may have a ratio of the carboxylic acid group: ascorbic acid molecule of the hyaluronic acid molecule to 1 to 5:1, preferably 1 to 4:1, even more preferably 2 to 4:1 , Most preferably 2 to 3:1.
  • the ascorbic acid and hyaluronic acid nanogel conjugate may be characterized by being sequentially prepared according to the following reaction schemes 1 to 3:
  • m 1 to 5.
  • hyaluronic acid may undergo crosslinking after reaction schemes 2 and 3 to form nanogels, or according to a known method or a method for preparing a hyaluronic acid nanogel provided by the present invention
  • the reaction schemes 2 and 3 may be applied after being prepared in nanogel form.
  • hyaluronic acid is prepared in nanogel form according to a known method or a hyaluronic acid nanogel production method provided by the present invention, and then the reaction schemes 2 and 3 are applied. It can be characterized by.
  • the conjugate provided by the present invention may be characterized by improved storage stability of ascorbic acid.
  • the present invention provides an antioxidant, skin whitening, wrinkle improvement or skin aging cosmetic composition
  • an antioxidant, skin whitening, wrinkle improvement or skin aging cosmetic composition comprising the ascorbic acid and hyaluronic acid nanogel as an active ingredient.
  • the present invention provides an anti-oxidation, skin whitening, wrinkle improvement or skin aging cosmetic composition (essentially) comprising the ascorbic acid and hyaluronic acid nanogel as an active ingredient.
  • ingredients included in the cosmetic composition of the present invention include ingredients commonly used in cosmetic compositions in addition to the active ingredients as active ingredients, for example, conventional auxiliary agents such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and fragrances, And carriers.
  • conventional auxiliary agents such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and fragrances, And carriers.
  • the cosmetic composition of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing , May be formulated as an oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, but is not limited thereto. More specifically, it can be prepared in the form of a flexible lotion (skin), nutrition lotion (milk lotion), nutrition cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder. .
  • the cosmetic composition of the present invention may be characterized by W/O cream, O/W cream, O/W essence, and hydrogel formulation, and most preferably, it may be a hydrogel formulation, but is not limited thereto. .
  • the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, trakant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide, etc. may be used as a carrier component.
  • animal oil vegetable oil, wax, paraffin, starch, trakant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide, etc.
  • trakant cellulose derivative
  • polyethylene glycol silicone
  • bentonite silica
  • talc talc
  • zinc oxide etc.
  • lactose When the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, or polyamide powder may be used as a carrier component.
  • lactose talc
  • silica aluminum hydroxide
  • calcium silicate or polyamide powder
  • a carrier component in particular, in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane /Propellant such as butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizer or emulsifier is used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 Fatty acid esters of ,3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycol or sorbitan.
  • liquid diluents such as water, ethanol or propylene glycol as carrier components, ethoxylated isostearyl alcohol, suspensions such as polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters, microcrystals Sex cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or trakant, etc. can be used.
  • the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleansing, aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivatives, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide as a carrier component Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.
  • the composition may be characterized by having antioxidant activity.
  • the antioxidant refers to the action of inhibiting oxidation, and the human body has a balance of an oxidant and an antioxidant (antioxidant), but due to various factors, this balance is unbalanced and promotes oxidation. When tilted, oxidative stress is induced, causing potential cell damage and pathological diseases.
  • the composition exhibits excellent DPPH free radical scavenging activity.
  • the composition may be characterized by inhibiting the activity of tyrosinase (tyrosinase).
  • tyrosinase is a metal-containing protein that contains a pair of copper ions at the active site, and L-tyrosine undergoes a hydroxylation reaction in the production pathway of melanin, resulting in 3,4-dihydroxy phenylalanine (L-DOPA).
  • Enzymes involved in the step of oxidizing to phenylalanine-3,4-quinone (dopaquinone) and then synthesizing to melanin through various intermediates such as dopachrome and indole-5,6-quinone.
  • the composition exhibits a tyrosinase inhibitory activity in a concentration-dependent manner, and thus has a whitening activity.
  • the composition may be characterized by inhibiting the production of melanin (melanin).
  • melanin is a dark brown grain pigment and is produced by a cell organelle called melanosomes in melanocytes.
  • Melanin is present in the skin, hair, and eyes, and the skin color is determined by the amount of melanin. The larger the amount of melanin, the darker the skin color.
  • the composition exhibits a melanin production inhibitory effect in a concentration-dependent manner, and thus it has been found that it has a whitening activity.
  • the term “wrinkle” refers to a fine line formed due to skin deterioration, and may be caused by a gene, a decrease in collagen present in the dermis of the skin, or an external environment.
  • the composition may be characterized by promoting collagen biosynthesis.
  • the collagen is present in connective tissue such as bone, cartilage, skin, and tendon.
  • external stimuli such as ultraviolet rays
  • collagen fibers involved in skin elasticity are damaged and aging of the skin progresses.
  • the composition can increase collagen biosynthesis in a concentration-dependent manner, thereby exhibiting an effect on wrinkle improvement.
  • skin aging is a symptom of skin elasticity reduction, shine reduction, wrinkle formation, weakening of regenerative power, or severe drying, which may be caused by the passage of time or the external environment.
  • the composition can improve the regeneration and elasticity of damaged skin by promoting the proliferation of fibroblasts.
  • the present invention provides an antioxidant, skin whitening, wrinkle improvement or skin aging prevention food composition
  • an antioxidant, skin whitening, wrinkle improvement or skin aging prevention food composition comprising the ascorbic acid and hyaluronic acid nanogel conjugate as an active ingredient.
  • the present invention provides an antioxidant (essentially) antioxidant, skin whitening, wrinkle improvement or skin aging prevention composition
  • an antioxidant essentially
  • skin whitening, wrinkle improvement or skin aging prevention composition comprising the ascorbic acid and hyaluronic acid nanogel conjugate as an active ingredient.
  • the food composition according to the present invention includes all forms of functional food, nutritional supplement, health food, and food additives. These types can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • the food composition itself of the present invention may be prepared in the form of tea, juice, and drink to be consumed or granulated, encapsulated, and powdered.
  • the food composition of the present invention can be prepared in the form of a composition by mixing with a known substance or active ingredient known to have antioxidant, skin whitening, wrinkle improvement or skin anti-aging effects.
  • functional foods include beverages (including alcoholic beverages), fruits and processed foods thereof (for example, canned fruits, canned foods, jams, marmalades, etc.), fish, meat, and processed foods such as hams, sausages, etc. Corn beef, etc.), breads and noodles (e.g. udon, buckwheat noodles, ramen, spaghetti, macaroni, etc.), juice, various drinks, cookies, syrup, dairy products (e.g. butter, cheese, etc.), edible vegetable oil, margarine , Vegetable protein, retort food, frozen food, various seasonings (for example, miso, soy sauce, sauce, etc.) can be prepared by adding the food composition of the present invention.
  • beverages including alcoholic beverages
  • fruits and processed foods thereof for example, canned fruits, canned foods, jams, marmalades, etc.
  • fish, meat, and processed foods such as hams, sausages, etc. Corn beef, etc.
  • breads and noodles e.g. udon, buckwheat noodles,
  • the preferred content of the food composition according to the present invention is not limited to this, but is preferably from 0.01 to 50% by weight of the total weight of the food finally produced.
  • the food composition of the present invention in the form of a food additive, it may be prepared and used in powder or concentrate form.
  • the present invention provides the use of the ascorbic acid and hyaluronic acid nanogel conjugate to prepare an agent for antioxidant, skin whitening, wrinkle improvement or skin anti-aging.
  • the present invention provides an antioxidant, skin whitening, wrinkle improvement or skin aging prevention method comprising administering to an individual in need thereof an effective amount of a composition comprising the ascorbic acid and hyaluronic acid nanogel conjugate as an active ingredient. .
  • The'effective amount' of the present invention when administered to an individual, improves, treats, prevents, detects, diagnoses or inhibits antioxidants, skin whitening, wrinkles or skin aging-related diseases, or related diseases of skin whitening, wrinkles or skin aging. It refers to an amount that exhibits an inhibitory or reducing effect, and the'individual' may be an animal, preferably a mammal, particularly an animal including a human, and may also be an animal-derived cell, tissue, organ, or the like. The subject may be a patient in need of the effect.
  • The'treatment' of the present invention broadly refers to improving the symptoms of antioxidant, skin whitening, wrinkles or skin aging, or diseases related to antioxidant, skin whitening, wrinkles or skin aging, which heals the disease Or, substantially preventing, or improving a condition, including, but not limited to, alleviating, healing, or preventing one symptom or most symptoms resulting from the disease.
  • the term'comprising' is used in the same way as'containing' or'as a feature', and does not exclude additional component elements or method steps not mentioned in the composition or method. .
  • the term'consisting of' is used in the same way as'consisting of' and means excluding additional elements, steps or components, etc., which are not described separately.
  • the terms'essentially consisting of' or'essentially composed' refer to a component element or step described in the scope of a composition or method, as well as a component element or step that does not substantially affect its basic properties. It means to include.
  • the present invention provides a method for producing pure hyaluronic acid nanoparticles in an aqueous solution without a crosslinking agent and an organic solvent.
  • the present invention was capable of uniformly synthesizing various nanometer-sized hyaluronic acid nanoparticles reproducibly under optimized electron beam conditions, confirming skin permeability through fluorescent labeling, and tumor diagnostic contrast agent of hyaluronic acid nanoparticles synthesized through radioactive labeling, and It provides use as a therapeutic agent.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing that a hyaluronic acid polymer is crosslinked by an electron beam to form hyaluronic acid particles.
  • Example 2 and 3 are graphs showing the size distribution of hyaluronic acid in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 4 is a bar graph showing the particle size of the nanogel according to the electron beam irradiation dose when the electron beam is irradiated to a 0.5% (w/v) aqueous solution of hyaluronic acid (HA3) at 100 kDa (pH 2.0 to 2.4).
  • HA3 hyaluronic acid
  • Example 5 is a result of DLS analysis of hyaluronic acid nanoparticles in one of the samples of Example 1 of the present invention.
  • FIG. 6 is a photograph obtained by synthesizing hyaluronic acid nanoparticles in a large amount and obtaining a sample in powder form after a lyophilization process.
  • Example 7 is a TEM photograph of hyaluronic acid nanoparticles prepared according to Example 1 of the present invention.
  • Figure 8 is a photograph of the experimental results showing the hydrogel properties of the hyaluronic acid nanoparticles prepared according to Example 1 of the present invention.
  • FIG. 9 is a schematic view showing a process for preparing a chelating compound by conjugating the dual functional chelate NODA-GA-NH 2 to the hyaluronic acid nanoparticles of Example 2 of the present invention.
  • FIG. 10 is a schematic view showing a process of radiolabeling the hyaluronic acid nanoparticles of Example 2 of the present invention with Cu-64.
  • Example 13 is a result of a biodistribution confirmation experiment in normal mice of a radiolabeled chelate compound of Cu-64 in the hyaluronic acid nanoparticles of Example 2 of the present invention.
  • CT26 colorectal cancer tumor cells
  • Example 16 is a result of a biodistribution confirmation experiment in a tumor model using skin cancer cells (melanoma/B16F10) of hyaluronic acid nanoparticles of Example 2 of the present invention.
  • FIG. 17 is a nuclear medicine imaging image of a tumor model using hyaluronic acid nanogels labeled with radioactive isotope Cu-64.
  • FIG. 18 shows that ascorbic acid-protected ascorbic acid No. 3 OH group is bonded to 1-chloro-3-iodopropane, and then the chloro group (Cl) is replaced with iodine group (I), and the protective group acetal group is removed to remove the ascorbic acid derivative. It is a diagram showing the process of synthesis.
  • FIG. 19 is a view showing a process of substituting the carboxylic acid group of the hyaluronic acid nanogel with a tetrabutyl ammonium (TBA) group.
  • TSA tetrabutyl ammonium
  • FIG. 20 shows a hyaluronic acid nanogel derivative in which powdery ascorbic acid is combined by stirring the ascorbic acid derivative substituted with an iodine group in hyaluronic acid nanogel obtained in TBA form and DMSO solvent for about 12 hours, and adding acetone to the reaction solution. It is a diagram showing the process of synthesis.
  • FIG. 21A and 21B are diagrams confirming whether ascorbic acid-linked hyaluronic acid nanogel derivatives were prepared by NMR (FIG. 21A) and HPLC chromatogram (FIG. 21B).
  • HA-VitC ascorbic acid-linked hyaluronic acid nanogel derivative
  • AA ascorbic acid
  • 23A and 23B are results of evaluating melanin production inhibitory ability and tyrosinase activity inhibitory ability of each test substance.
  • 24A and 24B are graphs obtained by evaluating the free radical scavenging capacity of each test substance by a DPPH assay (FIG. 24B) and quantifying it (FIG. 24B).
  • 25A and 25B are results of evaluating the tyrosinase inhibitory ability of each test substance.
  • 26 is a result of evaluating the ability of each test substance to promote fibroblast proliferation.
  • Example 1 Analysis of nanoparticle synthesis according to molecular weight size of hyaluronic acid, electron beam conditions and acid concentration
  • HA1 Oligo Hyaluronic Acid 8 kDa
  • HA2 Polymer sodium hyaluronate 2.5 MDa
  • HA3 Low molecular sodium hyaluronate (100 kDa)
  • hyaluronic acid having a molecular weight (8 kDa) similar to that of the previous research, and it is possible to manufacture at a lower cost in an aqueous solution at a lower concentration of hyaluronic acid, and nanoparticles having a very small particle size
  • HA1 hyaluronic acid having a molecular weight (8 kDa) similar to that of the previous research, and it is possible to manufacture at a lower cost in an aqueous solution at a lower concentration of hyaluronic acid, and nanoparticles having a very small particle size
  • the electron beam is the energy of 1 MeV at the irradiation dose (kGy) shown in Table 2 below Was investigated.
  • acid (Acid A, HClO 4 ) was added to lower the pH of the aqueous solution to 1.8 to 2.2, and it was confirmed that nanoparticles were well formed when electron beam irradiation was performed. It was confirmed that the tendency of the particle size to increase with increasing concentration.
  • one particle of the sample synthesized in Example 1 was confirmed to be 8.1 nm in size through DLS.
  • Hyaluronic acid nanoparticles showing such results were synthesized in large quantities, and as shown in the photo of FIG. 6, samples could be obtained in powder form after the lyophilization process.
  • nanoparticles prepared by irradiating a 100kGy electron beam (irradiation energy 2.5MeV) to a pH 2.0, 1% (w/v) HA3 aqueous solution were used.
  • the synthesized hyaluronic acid nanoparticles not only measured the size of the nanoparticles through DLS, but also conducted a study to directly check the morphological shape of the nanoparticles actually synthesized through a transmission electron microscope (TEM).
  • TEM transmission electron microscope
  • the nanoparticles were dropped on the carbon-coated copper grid about 2-3 drops, and after a dyeing process using Uranyl acetate, after sufficient time, the moisture was completely dried and analyzed using TEM as shown in FIG. 7.
  • the particles had a small size of approximately 10 nm or less, and it was confirmed that the shape of the particles was not clear, but maintained a generally round shape.
  • NODA-GA-NH 2 was used to conduct the experiment of conjugation to the hyaluronic acid nanogel, the hyaluronic acid nanogel was dissolved in pyridine, and the tosyl chloride was slowly dropped dropwise and reacted overnight. Proceeded. Thereafter, after adding NODA-GA-NH 2 and applying a high heat to conduct the reaction for about a day, the hyaluronic acid nanogel having a conjugation reaction with NODA-GA-NH 2 was separated by a centrifugal filter. Through the lyophilization process, a hyaluronic acid nanogel conjugated with NODA-GA in the form of a pure white powder was obtained.
  • radiolabeling using Cu-64 was performed, and NODA-GA-hyaluronic acid nanogel was added to a buffer having a pH of 6.8, reacted with 64 CuCl 2 at an appropriate temperature and time, and then through a centrifugal filter. After undergoing the process of purifying Cu-64-labeled hyaluronic acid nanogel, radio-TLC was used to confirm radiochemical purity.
  • the experiment was conducted by confirming radiolysis, and the nanoparticles were analyzed by radio-TLC by time using PBS (Phosphate Buffer Saline) and serum (Fetal Bovine Serum). I wanted to check the stability of the.
  • PBS Phosphate Buffer Saline
  • serum Fetal Bovine Serum
  • Bio-distribution confirmation experiments were performed on normal mice using Cu-64-labeled hyaluronic acid (HA) nanogels, and studies were conducted to confirm distributions to organs and discharge pathways in vitro.
  • HA hyaluronic acid
  • the biodistribution confirmation experiment was conducted on the tumor model using Cu-64 and labeled nanoparticles, and the distribution of each organ was checked 24 hours after injection to confirm the degree of intake of the tumor.
  • a tumor model was prepared using colorectal cancer tumor cells (CT26), and a biodistribution confirmation experiment was performed on the tumor model when the tumor grew to an appropriate size of 6-8 mm, and as a result, as shown in FIG. 15.
  • the liver showed the highest intake with 4.5% ID/g, followed by high intake for kidney (1.6% ID/g) and spleen (1.2% ID/g).
  • 1.0% ID/g intake showed higher intake than other organs, and the tumor to muscle ratio was 8.4 times and the tumor to blood ratio was 1.9 times better. It was confirmed that the tumor can be diagnosed.
  • a tumor model was prepared using skin cancer cells (melanoma/B16F10), and when the tumor grew to the appropriate size, the biodistribution confirmation experiment was conducted 24 hours later.
  • the liver and kidney and spleen showed high intake, but the nanogel is excreted through the liver and kidney to the body, it was confirmed that the tendency to be discharged through the liver rather than the kidney, the nanoparticles Due to the characteristics, it was confirmed that high intake was also achieved in the spleen.
  • high intake was achieved in tumors (0.62% ID/g) and lymph nodes (0.89% ID/g).
  • Tumor to muscle ratio was 14.2 times and tumor to blood ratio (Tumor). to blood ratio) was confirmed to be excellent in 3.2 times tumor diagnosis.
  • Nuclear medicine imaging studies of tumor models using hyaluronic acid nanogels labeled with radioisotope Cu-64 were conducted, and the intake and organs of small organs that had not been confirmed in the previous biodistribution confirmation experiment were performed. Distribution and excretion for the tumor also confirmed the target ability for the tumor.
  • Colon cancer tumor cells were used for nuclear medicine imaging experiments.
  • CT26 Colon cancer tumor cells
  • Example 3 Synthesis of vitamin C-bound hyaluronic acid nanoparticles and evaluation of their efficacy
  • Example 1 The hyaluronic acid nanoparticles prepared in Example 1 were intended to bind the ascorbic acid derivatives prepared above.
  • hyaluronic acid nanoparticles having a carboxylic acid group are insoluble in DMSO as a reaction solvent, a method of substituting with TBA (Tetrabutyl ammonium) was used. Specifically, hyaluronic acid nanoparticles containing a carboxylic acid group were dissolved in water, TBAOH was added little by little to adjust the pH to 9-10, and then freeze-dried to prepare a TBA-type hyaluronic acid nanogel (FIG. 19).
  • TBA Tetrabutyl ammonium
  • FIGS. 21A and 21B Whether ascorbic acid-linked hyaluronic acid nanogel derivatives were prepared was confirmed by NMR and HPLC chromatograms, which are shown in FIGS. 21A and 21B. As shown in FIG. 21, it was confirmed that the ester bond of ascorbic acid and hyaluronic acid was formed as the ascorbic acid 1proton peak at 4.9 ppm and the CH 2 peak of the propyl linker at 2.1 ppm were confirmed (FIG. 21A), and ascorb in the HPLC chromatogram. The peak corresponding to the acid was confirmed (Fig. 21B).
  • the ratio of the carboxylic acid to ascorbic acid molecule of the hyaluronic acid molecule was confirmed to be 2.5:1. That is, it was confirmed that one ascorbic acid is bonded per 2.5 carboxylic acid groups of the hyaluronic acid molecule.
  • ascorbic acid (AA, 100 ⁇ M) and the prepared hyaluronic acid-ascorbic acid nanogel (HA-VitC, 0.5 mg/mL) aqueous solution were left at 50° C. for 48 hours, and then HPLC was performed. Analysis.
  • ascorbic acid (AA) was oxidized and disappeared over time, whereas HA-VitC was confirmed to be more stable than that (improved stability by 50% or more).
  • Hyaluronic acid-ascorbic acid nanoparticles whitening, antioxidant and wrinkle improvement efficacy evaluation
  • Evaluation of whitening efficacy was measured by treating each test substance in the B16F10 mouse melanoma cell line and incubating for 48 hours, followed by a method of melanan contents assay and cellular tyrosinase activity assay.
  • ascorbic acid and ascorbic acid-2-glucoside (AA2G) and HA1 (Oligo-HA) used in Example 2 were used.
  • HA-VitC can improve the storage stability of vitamin C and at the same time improve the effect of VitC. It is judged that the utilization is very high in that it is retained.
  • Test substance treatment time 48 hours
  • Cell line HDF-neo, Human primary dermal fibroblast-neonatal (passage 15), 1x10 4 cells/well in a 24-well plate
  • Test substance treatment time 3 day, 1 day fasting, serum free condition
  • ascorbic acid, AA2G (AG), and APPS showed little efficacy in promoting fibroblast proliferation, but HA-VitC was confirmed to promote fibroblast proliferation depending on concentration.
  • Test substance treatment time 3 day, 1 day fasting, serum free condition
  • the present invention provides a method for producing pure hyaluronic acid nanoparticles in an aqueous solution without a crosslinking agent and an organic solvent.
  • the present invention can uniformly synthesize various nanometer-sized hyaluronic acid nanoparticles reproducibly under optimized electron beam conditions, and to confirm skin permeability through fluorescent labeling and tumor diagnosis of hyaluronic acid nanoparticles synthesized through radioactive labeling. It is very useful in the development of contrast agents and therapeutic agents, so it has excellent industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 히알루론산 수용액에 전자빔을 조사하여, 히알루론산의 분자간 또는 분자내 가교결합을 형성함을 포함하는, 가교된 히알루론산 나노 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 최적화된 전자빔 조건하에서 재현성 있게 다양한 나노미터 사이즈의 히알루론산 나노입자를 균일하게 합성할 수 있었고, 형광 표지를 통한 피부투과도 확인 및 방사성 표지를 통해 합성된 히알루론산 나노입자의 종양진단 조영제 및 치료제로서의 용도를 제공한다.

Description

히알루론산 나노 입자를 합성하는 방법 및 이 방법으로 제조된 히알루론산 나노 입자
본 출원은 2019년 1월 11일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2019-0003966호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 가교제 없이 생체적합성을 가지며, 순수한 히알루론산 가교제인 나노 입자를 제조하는 방법 및 이렇게 제조된 나노 입자, 그리고 이러한 나노 입자의 활용에 관한 것이다.
히알루론산은 엘라스틴, 콜라겐과 더불어 피부세포를 구성하는 성분으로 1g 당 1000ml의 수분을 머금을 수 있어 일명 수분저장고로 불리며 화장품 재료로 널리 활용되고 있다.
생체에서 사용가능하고, 생체적합한 순수한 히알루론산의 수화겔과 같은 나노입자는 이의 조영제로서의 사용 및 생체 내에 사용에 필수적일 것인데, 히알루론산을 가교결합을 진행하며 나노입자 형태로 전환하여 활용하는 연구는 아직 초기 단계이며 더불어 가교제를 활용하지 않고 나노입자를 합성하는 연구는 거의 보고되고 있지 않다.
한편, 히알루론산 수용액에 전자빔을 조사함으로써 나노입자를 제조하는 방법이 제공된 바 있으나(한국 등록특허 제10-1893549호), 나노입자가 제조되는 조건에서의 히알루론산 농도가 높아 경제적이지 않으며, 직경 100nm를 초과하는 나노입자만이 제조되어 다양한 분야에 활용되기에는 한계가 있다.
이에 본 발명은 상기한 종래의 문제점 및 필요를 인식하고, 생체 적합하면서 순수한 히알루론산 나노입자 또는 나노겔을 제조하는 새로운 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 별도의 가교제 없고, 유기용매가 아닌 수용액 상에서 히알루론산 가교 나노 입자 형성할 수 있는 방법을 제공하며, 또한, 나노 입자의 크기를 제어할 수 있는 방법을 제공한다.
일 측면으로서 본 발명은, 히알루론산 수용액에 전자빔을 조사하여, 히알루론산의 분자간 또는 분자내 가교결합을 형성함을 포함하는, 가교된 히알루론산 나노 입자를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 나노입자란 크기가 수 내지 수백 나노미터(nm, 10억분의 1미터인 물질)인 입자를 말한다. 본 발명에서 상기 나노입자는 입자의 크기가 1 내지 100nm인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 나노입자란 나노겔 또는 나노하이드로겔도 포함하는 개념으로, 이하에서 나노입자, 나노겔 또는 나노하이드로겔은 모두 본 발명에 따른 나노입자를 의미하는 것으로 사용된다.
상기 히알루론산 수용액은 산성임을 특징으로 하며, 산성 수용액을 위해 상기 히알루론산 함유 용액에 HClO 4을 추가로 포함할 수 있다. 이하에서 자세히 설명되고 입증되는 바와 같이, 히알루론산 수용액을 산성으로 하거나, 히알루론산 수용액에 산이 첨가되는 경우, 그렇지 않는 경우에 비해, 높은 나노입자 합성 효율이 증대됨을 새롭게 제공한다. 또한 pH의 조절 및 산 화합물을 첨가 농도의 조절로 예기치 않게 나노 입자의 크기를 제어할 수 있음을 제공한다.
본 발명에서 상기 히알루론산(hyaluronic acid)은 결합조직 내의 세포 간질에 널리 분포되어 생리 조건 하에서 점착성 및 탄력성 용액을 형성함으로써, 홍채, 망막 등의 조직, 혈관 내피세포, 상피세포 등을 기계적으로 보호하며 완충역할을 제공하는 것으로 알려진, 세포외 매트릭스의 주요 성분이다. 본 발명에서 상기 히알루론산은 물성, 형태, 크기 등에 제한이 없으며, 무균 처리된 것이 바람직하다. 또한, 상기 히알루론산은 5 내지 5000kDa의 중량평균분자량, 바람직하게는 5 내지 3000kDa의 중량평균분자량을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 히알루론산은 약제학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있는데, 상기 약제학적으로 허용가능한 염은 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 등을 포함하며, 바람직하게는 나트륨염을 포함한다. 또한, 히알루론산의 유도체 또한 사용될 수 있는데 이러한 유도체는 구체적으로 교차결합, 황화, 에스터화 또는 아미노산 결합에 의해 화학적으로 변형된 히알루론산일 수 있다.
본 발명에서 상기 히알루론산 수용액의 pH는 1 내지 6일 수 있으며, 더 바람직하게는 pH 1 내지 5일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 pH 1 내지 4일 수 있으며, 가장 바람직하게는 pH 1.5 내지 3.5일 수 있다.
본 발명이 제공하는 히알루론산 나노 입자 제조방법에서 상기 히알루론산 수용액의 농도는 0.05 내지 7%(w/v)일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 5%(w/v)일 수 있다.
상기 수용액은 가교제 및 유기용매를 포함하지 않음을 특징으로 한다.
상기 전자빔을 조사한 이후, 투석 및 동결 건조단계를 추가로 포함한다.
상기 전자빔의 조사선량을 변경하여 히알루론산 나노 입자의 크기를 제어함을 특징으로 하며, 상기 전자빔의 조사선량을 늘려 상기 히알루론산 나노 입자의 크기를 줄임을 특징으로 한다.
본 발명이 제공하는 히알루론산 나노 입자 제조방법에서 조사되는 전자빔은 0.5 내지 300kGy의 조사량으로 조사될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 250kGy, 가장 바람직하게는 1 내지 200kGy의 조사량으로 조사될 수 있다.
본 발명에서 상기 전자빔 총 조사에너지 세기는 0.1MeV 내지 5Mev인 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는, 전자빔의 총 조사에너지 세기는 0.5MeV 내지 3Mev, 가장 바람직하게는 1.0MeV 내지 2.5MeV일 수 있다.
상기 수용액의 pH를 조절하여, 상기 히알루론산 나노 입자의 크기를 제어함을 특징으로 하며, 상기 수용액의 pH를 낮춰 상기 히알루론산 나노 입자의 크기를 증가시킴을 특징으로 한다.
본 발명이 제공하는 히알루론산 나노 입자 제조방법은 100nm 이하의 직경을 갖는 히알루론산 나노 입자의 제조방법일 수 있으며, 바람직하게는 50nm 이하의 직경을 갖는 히알루론산 나노 입자, 가장 바람직하게는 30nm 이하의 직경을 갖는 히알루론산 나노 입자의 제조방법일 수 있다.
다른 측면으로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 히알루론산의 분자간 또는 분자내 가교결합된 나노 입자를 제공한다.
상기 나노 입자는 팽윤 특성을 가지는 하이드로젤임을 특징으로 한다.
상기 나노 입자는 종양 선택성을 가짐을 특징으로 한다. 특히 상기 나노 입자는 대장암 또는 흑색종 선택성을 가짐을 특징으로 한다.
상기 나노 입자는 대장암종양에 대해서 8배 이상의 종양 대 근육비 및 1.5배 이상의 종양대 혈액비를 가짐을 특징으로 한다. 상기 나노 입자는 흑색종에 대해서 14배 이상의 종양 대 근육비 및 3배 이상의 종양대 혈액비를 가짐을 특징으로 한다.
다른 측면으로서, 본 발명은 방사성 동위원소, 유기 형광물질, 무기물질인 양자점, 자기공명영상 조영제, 컴퓨터단층촬영 조영제, 양전자단층촬영 조영제, 초음파 조영제, 형광 조영제 및 상형변환물질로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상의 표지 물질로 표지된 상기한 히알루론산 나노 입자를 포함하는 조영제를 제공한다.
상기 나노 입자에 접합된 리간드 화합물 및 상기 리간드 화합물에 배위결합된 방사성 동위 원소를 포함한다.
상기 리간드 화합물은 NODA-GA-NH 2, DOTA-GA, DOTA, TETA 및 NOTA 중 적어도 어느 하나임을 특징으로 한다.
상기 방사성 동위 원소는 11C, 13N, 15O, 18F, 38K, 62Cu, 64Cu, 68Ga, 82Rb, 124I, 89Zr, 99mTc, 123I, 111In, 67Ga, 177Lu, 201Tl, 117mSn, 125I, 131I, 166Ho, 188Re, 67Cu, 89Sr, 90Y, 225Ac, 213Bi, 및 211At 중 적어도 어느 하나임을 특징으로 한다.
다른 측면으로서, 본 발명은 아스코르브산(ascorbic acid) 및 히알루론산 나노젤 접합체(conjugate)를 제공한다.
본 발명에서 상기 "접합체(conjugate)"는 두 가지 이상의 화합물이 서로 연결된 화합물을 의미한다. 상기 연결은 비공유결합 또는 공유결합에 의해 달성될 수 있다. 즉, 본 발명의 상기 접합체는 아스코르브산과 히알루론산이 직접 또는 간접적으로 비공유결합 또는 공유결합되어 있는 것을 의미한다. 바람직하게 본 발명의 접합체는 히알루론산의 카르복실산기에 아스코르브산의 히드록시기가 C1 내지 C5의 알킬기를 통해 결합을 형성함으로써 견고하게 공유결합으로 연결된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 “아스코르브산(ascorbic acid)”은 하기 화학식 1로 표시되는 항산화 작용을 가진 물질로서 수용성 비타민으로 비타민C 라고도 하는데 약학 제제, 사료, 멜라닌색소의 축적억제, 의료약품, 화장품을 포함한 다양한 산업적응용에 사용되고 있다. 그러나, 상기 아스코르브산은 매우 불안정한 화합물로 산화조건 및 열 조건에 불안정하여 제조과정에서 열, 공기, 빛에 노출되면 활성을 잃어버리며, 유통과정에서 그 활성이 소실되어 활용에 큰 제한을 갖는다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2020000612-appb-img-000001
본 발명에서 상기 “히알루론산 나노젤”이라는 용어는, 달리 언급되지 않은 한, 가교결합을 포함하는 다양한 화학적 변형을 갖는 것뿐만 아니라 다양한 사슬 길이 및 전하 상태를 갖는 히알루론산, 히알루론산염(hyaluronate) 또는 히알루로난(hyaluronan)의 모든 변형체(variant) 및 변형체들이 가교결합을 형성하여 나노미터 크기의 하이드로젤(hydrogel)을 형성한 것을 의미한다. 즉, 상기 히알루론산 나노젤은 히알루론산 나트륨(sodium hyaluronate)과 같은, 다양한 반대 이온을 갖는 히알루론산의 다양한 히알루론산염 유래의 나노젤을 포괄한다. 예를 들면 -CH 2OH기의 -CHO 및/또는 -COOH로의 산화와 같은, 산화; 예를 들면 -CHO의 -CH 2OH로의 환원 또는 아민과의 결합으로 이민을 형성하고 2차 아민으로의 환원을 수반하는 환원과 같은, 선택적으로 환원을 수반하는, 인접한 하이드록실기의 과요오드산염 산화(periodate oxidation); 황산염화(sulphation); 선택적으로 탈아미노화(deamination) 또는 새로운 산과 함께 아미드의 형성을 수반하는, 탈아미드화(deamidation); 에스테르화(esterification); 가교결합; 단백질, 펩티드 및 활성 의약 성분과 같은 다양한 분자들과 히알루론산의 결합을 포함하는, 예를 들면 가교결합제(crosslinking agent) 또는 카르보디이미드(carbodiimide)의 도움에 의한 결합을 이용한, 다양한 화합물과의 치환; 및 탈아세틸화(deacetylation)와 같은 히알루론산의 다양한 유도체 유래의 나노젤 또한 상기 용어에 의해 포괄된다.
본 발명에 상기 히알루론산 나노젤은 히알루론산 분자를 기본단위로 하여 형성된 나노미터 크기의 하이드로젤이라면 그 제조방법은 특별히 제한되지 않는다. 당업계에서 나노미터 크기의 히알루론산 하이드로젤을 제조하는 방법은 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 가교제를 이용한 제조방법, 전자빔을 이용한 제조방법 등이 참고될 수 있으나, 가장 바람직하게는 상기 히알루론산 나노젤은 전술한 히알루론산 산성 수용액에 전자빔을 조사하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 아스코르브산 및 히알루론산 나노젤의 접합체는 하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[화학식 2]
Figure PCTKR2020000612-appb-img-000002
상기 식에서 m은 1 내지 5이다.
본 발명이 제공하는 상기 접합체는 히알루론산 분자의 카르복실산기 : 아스코르브산 분자의 비율이 1 내지 5 : 1일 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 4 : 1, 보다 더 바람직하게는 2 내지 4 : 1, 가장 바람직하게는 2 내지 3 : 1 일 수 있다.
본 발명에서 상기 아스코르브산 및 히알루론산 나노젤 접합체는 하기 반응식 1 내지 3에 따라 순차적으로 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다:
[반응식 1]
Figure PCTKR2020000612-appb-img-000003
[반응식 2]
Figure PCTKR2020000612-appb-img-000004
[반응식 3]
Figure PCTKR2020000612-appb-img-000005
상기 식에서 m은 1 내지 5이다.
본 발명의 상기 반응식 2 및 3에서 히알루론산은 반응식 2 및 3을 거친 이후에 가교결합이 유도되어 나노젤을 형성할 수도 있고, 공지된 방법 또는 본원발명이 제공하는 히알루론산 나노젤 제조방법에 따라 나노젤 형태로 제조가 된 이후에 상기 반응식 2 및 3을 적용할 수도 있다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 반응식 2 및 3에서 히알루론산은 공지된 방법 또는 본원발명이 제공하는 히알루론산 나노젤 제조방법에 따라 나노젤 형태로 제조가 된 이후에 상기 반응식 2 및 3을 적용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 다르면, 상기 접합체에 포함된 아스코르브산은 안정성이 현저히 향상되어 매우 가혹한 조건에서 방치한 이후에도 아스코르브산의 생리활성이 동일하게 발휘되는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명이 제공하는 상기 접합체는 아스코르브산의 보관 안정성이 향상된 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 아스코르브산 및 히알루론산 나노젤을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부 미백, 주름 개선 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 아스코르브산 및 히알루론산 나노젤을 유효성분으로 (필수적으로) 이루어지는 항산화, 피부 미백, 주름 개선 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수 (스킨), 영양 화장수 (밀크로션), 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 화장료 조성물은 W/O 크림, O/W 크림, O/W 에센스 및 하이드로겔 제형인 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 하이드로겔 제형일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 항산화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 상기 항산화는 산화를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 인체에는 산화촉진물질(prooxidant)과 산화억제물질(antioxidant)이 균형을 이루고 있으나 여러 가지 요인들에 의하여 이런 균형상태가 불균형을 이루게 되고 산화촉진 쪽으로 기울게 되면, 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 잠재적인 세포 손상 및 병리적인 질환을 일으키게 된다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 조성물이 우수한 DPPH 자유라디칼 소거활성을 나타냄을 확인하였다.
본 발명에서 사용된 용어, "미백"은 피부를 하얗게 하는 것을 의미하고, 멜라닌의 합성을 저해하여 멜라닌의 피부 침착을 억제하거나 방지하는 모든 작용을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 조성물은 티로시나아제(tyrosinase)의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 상기 티로시나아제는 활성 부위에 한 쌍의 구리 이온을 함유하고 있는 금속 함유 단백질로서, 멜라닌의 생성 경로에서 L-티로신이 하이드록실화 반응을 거쳐 3,4-디하이드록시 페닐알라닌(L-DOPA)으로 전환되고, 이것이 다시 페닐알라닌-3,4-퀴논(도파퀴논)으로 산화된 다음, 도파크롬(dopachrome), 인돌-5,6-퀴논 등의 여러 중간체를 거쳐 멜라닌으로 합성되는 단계에 관여하는 효소를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물이 농도 의존적으로 티로시나아제 저해 활성을 나타냄을 확인하여, 미백 활성을 가짐을 알 수 있었다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌(melanin)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 상기 멜라닌은 흑갈색 알갱이의 색소로서, 멜라닌 세포 내 멜라노솜이라는 세포 소기관에 의해 만들어진다. 멜라닌은 피부, 털, 눈 등에 존재하며, 멜라닌의 양에 따라 피부색이 결정되는데, 멜라닌의 양이 많을수록 검은 피부색을 띤다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물이 농도 의존적으로 멜라닌 생성 억제 효과를 나타냄을 확인하여, 미백 활성을 가짐을 알 수 있었다.
본 발명에서 사용된 용어, "주름"은 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는 것으로, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐의 감소, 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 조성물은 콜라겐 생합성을 촉진하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 콜라겐은 뼈, 연골, 피부, 힘줄 등의 결합조직에 존재한다. 피부가 자외선 등 외부 자극에 지속적으로 노출될 경우, 피부 탄력에 관여하는 콜라겐 섬유가 손상되어 피부의 노화가 진행된다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물이 농도 의존적으로 콜라겐 생합성을 증가시켜, 주름 개선에 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에서 사용된 용어, "피부 노화"는 피부의 탄력 감소, 윤기 감소, 주름 생성, 재생력 약화 또는 심한 건조 등의 증상이 나타나는 것으로, 시간의 흐름 또는 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물은 섬유아세포의 증식을 촉진하여 손상된 피부의 재생과 탄력을 개선할 수 있음을 알 수 있었다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 아스코르브산 및 히알루론산 나노젤 접합체를 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부 미백, 주름 개선 또는 피부 노화 방지용 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 아스코르브산 및 히알루론산 나노젤 접합체를 유효성분으로 (필수적으로) 이루어지는 항산화, 피부 미백, 주름 개선 또는 피부 노화 방지용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형들은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 식품용 조성물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한 본 발명의 식품용 조성물은 항산화, 피부 미백, 주름 개선 또는 피부 노화 방지의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예를 들어 과일 통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예를 들어 햄, 소시지, 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예를 들어 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예를 들어 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예를 들어 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 식품용 조성물을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 총 중량 중 0.01 내지 50 중량% 이다. 본 발명의 식품용 조성물을 식품첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 항산화, 피부 미백, 주름 개선 또는 피부 노화 방지용 제제를 제조하기 위한 상기 아스코르브산 및 히알루론산 나노젤 접합체의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 아스코르브산 및 히알루론산 나노젤 접합체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 항산화, 피부 미백, 주름 개선 또는 피부 노화 방지 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 ‘유효량’이란 개체에게 투여하였을 때, 항산화, 피부 미백, 주름 또는 피부 노화와 관련된 질환의 개선, 치료, 예방, 검출, 진단 또는 항산화, 피부 미백, 주름 또는 피부 노화와 관련된 질환의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 ‘개체’란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
본 발명의 상기 ‘치료’는 항산화, 피부 미백, 주름 또는 피부 노화와 관련된 질환, 또는 항산화, 피부 미백, 주름 또는 피부 노화와 관련된 질환의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 상기 질환을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 상기 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 '~을 포함하는(comprising)'이란 '함유하는' 또는 '특징으로 하는'과 동일하게 사용되며, 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 '~로 이루어지는(consisting of)'이란 '~로 구성되는'과 동일하게 사용되며, 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 '필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)' 또는 '필수적으로 구성되는'이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명은 순수한 히알루론산 나노 입자를 가교제 및 유기용매 없이 수용액 상에서 제조할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명은 최적화된 전자빔 조건하에서 재현성 있게 다양한 나노미터 사이즈의 히알루론산 나노입자를 균일하게 합성할 수 있었고, 형광 표지를 통한 피부투과도 확인 및 방사성 표지를 통해 합성된 히알루론산 나노입자의 종양진단 조영제 및 치료제로서의 용도를 제공한다.
도 1은 히알루론산 고분자가 전자빔에 의해 가교되어 히알루론산 입자가 형성됨을 보여주는 개념도이다.
도 2 및 도 3는 본 발명의 실시예 1의 히알루론산의 크기 분포를 보여주는 그래프이다.
도 4는 100kDa의 히알루론산(HA3) 0.5%(w/v) 수용액(pH 2.0 내지 2.4)에 전자빔을 조사하였을 때, 전자빔 조사선량에 따른 나노젤의 입자 크기를 막대 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1의 샘플 중 하나의 히알루론산 나노입자의 DLS 분석 결과이다.
도 6은 히알루론산 나노입자를 대량으로 합성하고 동결건조 과정 이후 파우더 형태로 샘플을 얻은 사진이다.
도 7은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산 나노 입자의 TEM 사진이다.
도 8은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 히알루론산 나노 입자의 하이드로젤 특성을 보여주는 실험 결과 사진이다.
도 9는 본 발명의 실시예 2의 히알루론산 나노입자에 이중기능킬레이트인 NODA-GA-NH 2를 접합하여 킬레이트 화합물을 제조하는 과정을 보여주는 개략도이다.
도 10은 본 발명의 실시예 2의 히알루론산 나노 입자를 Cu-64로 방사성 표지하는 과정을 보여주는 개략도이다.
도 11은 본 발명의 실시예 2의 히알루론산 나노 입자에 Cu-64의 방사성 표지된 킬레이트 화합물의 방사화학적 순도 결과를 보여준다.
도 12는 본 발명의 실시예 2의 히알루론산 나노 입자에 Cu-64의 방사성 표지된 킬레이트 화합물의 PBS(Phosphate Buffer Saline)와 혈청(Fetal Bovine Serum)에서의 안정성을 시간별 radio-TLC로 분석한 결과이다.
도 13은 본 발명의 실시예 2의 히알루론산 나노 입자에 Cu-64의 방사성 표지된 킬레이트 화합물의 정상 마우스에서의 생체분포확인 실험의 결과이다.
도 14는 합성된 HA 나노젤을 일반적으로 최종적인 샘플을 얻는 동결건조 과정이 아닌 유기용매로 침전시키는 방법으로 얻어진 HA 나노젤에 대해서도 생체분포확인 실험 결과이다.
도 15는 본 발명의 실시예 2의 히알루론산 나노 입자의 대장암종양세포(CT26)를 이용한 종양모델에서 생체분포확인 실험 결과이다.
도 16은 본 발명의 실시예 2의 히알루론산 나노 입자의 피부암세포(흑색종/B16F10)를 이용한 종양모델에서 생체분포확인 실험 결과이다.
도 17은 방사성 동위원소 Cu-64로 표지된 히알루론산 나노젤을 이용하여 종양모델에 대한 핵의학 영상 이미지이다.
도 18은 아세탈 형태로 보호된 아스코르브산 3번 OH기에 1-chloro-3-iodopropane을 결합시킨후 chloro기(Cl)을 요오드기(I)로 치환 시키고, 보호기인 아세탈기를 제거하여 아스코르브산 유도체를 합성하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 19는 히알루론산 나노젤의 카르복실산기를 TBA(tetrabutyl ammonium)기로 치환하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 20은 요오드기로 치환된 아스코르브산 유도체를 TBA형태로 얻어진 히알루론산 나노젤과 DMSO 용매하에서 약 12시간 정도 교반시키고, 반응용액에 아세톤을 첨가하여 분말형태의 아스코르브산이 결합된 히알루론산 나노젤 유도체를 합성하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 21a 및 21b는 아스코르브산이 결합된 히알루론산 나노젤 유도체가 제조되었는지 여부를 NMR(도 21a) 및 HPLC 크로마토그램(도 21b)으로 확인한 도면이다.
도 22는 아스코르브산이 결합된 히알루론산 나노젤 유도체(HA-VitC) 및 아스코르브산(AA) 수용액을 각각 50℃에서 48시간동안 방치 시킨 후 HPLC를 이용하여 분석하여 안정성을 평가한 결과이다.
도 23a 및 23b는 각 실험물질의 멜라닌 생성 억제능과 타이로시나제 활성 억제능을 평가한 결과이다.
도 24a 및 24b는 각 실험물질의 활성산소 제거능을 DPPH assay로 평가하고(도 24b), 이를 정량화하여 그래프로 나타낸 도면이다(도 24b).
도 25a 및 25b는 각 실험물질의 타이로시나제 억제능을 평가한 결과이다.
도 26은 각 실험물질의 섬유아세포 증식 촉진능을 평가한 결과이다.
도 27은 각 실험물질이 콜라겐 생합성에 미치는 영향을 평가한 결과이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
실시예 1: 히알루론산의 분자량 크기, 전자빔 조건 및 산의 농도에 따른 나노 입자 합성 분석
히알루론산을 이용한 전자빔 조사 실험의 경우, 아래와 같은, 3 종류의 서로 다른 분자량의 히알루론산을 사용하며, 산성 수용액 조건에서 실험을 진행하였다.
HA1 Oligo Hyaluronic Acid (8 kDa)
HA2 고분자 sodium hyaluronate (2.5 MDa)
HA3 저분자 sodium hyaluronate (100 kDa)
참고로, 본 발명자는 선행연구(한국 등록특허 제1893549호)를 통해 10kDa의 히알루론산 1%(w/v) 수용액에 50kGy의 전자빔을 조사하였을 때 380nm의 나노젤, 및 히알루론산 5%(w/v) 수용액에 200kGy의 전자빔을 조사하였을 때 108nm의 나노젤이 생성되는 것을 확인하였으나, 그 이외의 조건에서는 나노젤이 형성되지 않으며, 상기 조건에서 제조된 나노입자의 경우에도 크기가 상대적으로 컸기 때문에 산업적인 활용도에 한계가 있음을 발견하였다.
이에, 본 발명자는 선행연구와 유사한 분자량(8kDa)의 히알루론산(HA1)을 이용하면서, 좀 더 낮은 농도의 히알루론산 수용액 조건에서 경제적인 비용으로 제조가 가능할 뿐 아니라, 입자의 크기가 매우 작은 나노젤을 제공하기 위해 산성 조건의 히알루론산 수용액에 전자빔을 조사하는 방법을 시도해 보았다.
구체적으로, 하기 표 2에 나타낸 농도(w/v%)의 HA1 수용액에 HClO 4를 첨가하여 pH를 1.6 내지 2.1로 조절한 후, 전자빔을 하기 표 2에 나타낸 조사선량(kGy)으로 1MeV의 에너지로 조사하였다.
이에 대한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 다양한 전자빔 조사 에너지에서 다양한 농도의 히알루론산(HA1) 활용하며 추가로 산을 첨가하였을 때, 다분산성지수(Polydispersity index)가 낮은 3-4 nm 크기의 작은 나노입자를 합성할 수 있는 조건들을 확인하였다.
Figure PCTKR2020000612-appb-img-000006
그 다음으로, HA2의 경우, 산(Acid A, HClO 4)을 첨가하여 수용액의 pH를 1.8 내지 2.2로 낮추고, 전자빔 조사를 진행하였을 때 나노입자가 잘 만들어지는 것을 확인할 수 있었고, 첨가된 산의 농도가 증가함에 따라 입자의 크기가 증가하는 경향성을 확인하였다.
Figure PCTKR2020000612-appb-img-000007
그 다음으로, HA3을 활용한 실험에서도 산을 첨가하였을 때 나노입자가 만들어지는 것을 확인할 수 있었다. 이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다. 또한 대체로 첨가되는 산의 농도가 증가함에 따라 입자의 크기가 증가하는 경향성을 확인할 수 있었고, 전자빔 조사선량이 증가함에 따라 입자의 크기가 감소하는 경향성을 확인하였다.
실시예 1에서 합성된 샘플 중 하나의 입자는 도 5에서 확인되는 바와 같이, 8.1 nm의 크기임을 DLS를 통해서 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과를 보이는 히알루론산 나노입자를 대량으로 합성하였고, 도 6의 사진과 같이, 동결건조 과정 이후 파우더 형태로 샘플을 얻을 수 있었다.
이하 실험에서는 pH 2.0, 1%(w/v) HA3 수용액에 100kGy의 전자빔을 조사하여(조사에너지 2.5MeV) 제조된 나노입자를 이용하였다.
(1) 나노입자의 구조 분석
합성된 히알루론산 나노입자는 DLS를 통해 나노입자의 크기를 측정할 뿐만 아니라 투과전자현미경(TEM)을 통해 실제로 합성된 나노입자의 형태학적 모양을 직접 확인해보는 연구를 진행하였다.
나노입자를 Carbon이 코팅된 구리 Grid 위에 2~3 방울 정도 떨어뜨리고, Uranyl acetate를 사용해서 염색 과정을 거친 후 충분한 시간을 두고 수분을 완전히 건조한 후에 도 7에서와 같은 TEM을 이용해 분석하였다.
DLS에서의 결과와 마찬가지로 대략 10nm 이하의 작은 크기를 보이는 것을 확인해볼 수 있었고, 입자의 모양은 뚜렷하지는 않지만 대체로 둥근 모양을 유지하고 있음을 확인해볼 수 있었다.
(2) 하이드로젤 특성 분석
합성된 나노입자가 실질적으로 물을 잘 머금는(Swelling) 하이드로젤의 특징을 지니고 있는지를 확인하는 실험을 진행해보았고, 대조군으로는 순수한 물과 전자빔을 조사하지 않은 히알루론산을 사용하여 실험을 진행하였다.
동일한 양의 히알루론산 나노입자와 대조군을 각각 500 μL의 물에 녹인 후, 분리막을 가진 원심여과기를 사용하여 원심분리를 진행하여 각각의 튜브 바닥에 떨어진 물의 양을 확인해보았고, 그 차이가 잘 보이도록 하기 위하여 튜브 아래로 떨어진 물을 초록색의 잉크로 염색시킨 후 사진을 찍었다. 도 8에 제시하였다.
그 결과를 확인해보았을 때, 전자빔을 조사하여 얻어진 나노입자 샘플에서 원심분리 과정 이후 튜브 바닥으로 떨어지는 물의 양이 보다 적고, 상층액부분에 더 많은 용액이 남겨져 있음을 확인할 수 있다. 이와 같은 결과를 통하여 전자빔 조사를 통해 합성된 히알루론산 나노입자가 대조군보다 물을 잘 머금으며 하이드로젤로서의 특징을 지니고 있음을 확인할 수 있다.
실시예 2: 히알루론산 나노젤의 활용
(1) 조영제와 접합된 히알루론산 나노젤의 안정성 평가
도 9의 개략도와 같이, NODA-GA-NH 2를 사용해서 히알루론산 나노젤에 접합하는 실험을 진행하였고, 히알루론산 나노젤을 피리딘에 녹여준 후 토실 클로라이드를 한 방울씩 천천히 떨어뜨려주며 밤새 반응을 진행하였다. 이 후, NODA-GA-NH 2를 추가한 후 높은 열을 가해주며 하루정도 반응을 진행한 후, NODA-GA-NH 2와 접합반응이 이루어진 히알루론산 나노젤을 원심여과기로 분리하였다. 동결건조 과정을 통하여 순수한 흰색 파우더 형태의 NODA-GA가 접합된 히알루론산 나노젤을 얻었다.
도 10의 개략도와 같이, Cu-64를 이용한 방사성 표지를 진행해보았고 pH가 6.8인 버퍼에 NODA-GA-히알루론산 나노젤을 넣고 적정 온도 및 시간에서 64CuCl 2와 반응한 후, 원심여과기를 통하여 Cu-64가 표지된 히알루론산 나노젤을 정제해서 얻는 과정을 거친 후 Radio-TLC를 사용하여 방사화학적 순도를 확인하였다.
그 결과 도 11에서 확인되는 바와 같이, 방사화학적 순도가 거의 100%로 매우 높게 Cu-64와 우수하게 표지 반응이 이루어짐을 확인할 수 있었다.
방사 표지된 나노입자의 안정성의 경우, 방사선분해(Radiolysis)를 확인해보는 방식으로 실험을 진행하였고 PBS(Phosphate Buffer Saline)와 혈청(Fetal Bovine Serum)을 이용하여 시간별로 radio-TLC로 분석하며 나노입자의 안정성을 확인해보고자 하였다.
그 결과, 도 12의 결과와 같이, 1시간과 4시간까지 높은 안정성을 보여줌을 확인할 수 있었고, 24시간에 대한 결과에서도 동일하게 95% 이상의 뛰어난 안정성을 보였기에 마우스 내에서도 충분히 그 안정성을 유지할 수 있을 것으로 예측해볼 수 있었다.
(2) 정상 마우스에서 생체분포확인 실험
Cu-64로 표지된 히알루론산(HA) 나노젤을 이용하여 정상 마우스에 대한 생체분포확인 실험을 진행하며 장기들에 대한 분포 및 체외로 배출 경로를 확인해보기 위한 연구를 진행하였다.
이후 합성된 나노입자를 나노젤 기반 종양 조영제 개발 연구에 활용할 예정이기에 나노젤이 충분히 종양을 타겟팅 할 수 있는 시간을 두고 실험을 계획하였고, 그에 따라 나노젤을 주사한 후 24시간 후에 각 장기에 대한 분포를 확인하는 방법으로 실험하였다.
그에 대한 결과를 확인해보았을 때, 도 13에서와 같이, 합성된 HA 나노젤의 경우 간에 가장 높은 섭취를 보였다.
그런 다음에는 전자빔을 이용해 HA 나노젤을 합성하는 과정에서 빔 조사 샘플에 특정 Acid(HClO 4)를 추가함으로써 pH를 변화한 후 만들어진 HA를 사용하여서도 정상 마우스에 대하여 생체분포확인 실험을 진행해보았고 (도 14), 앞선 결과와 비교해 보았을 때보다 전체적으로 체내에 남아있는 정도가 많이 감소되는 경향을 확인해볼 수 있었다
또한 합성된 HA 나노젤을 일반적으로 최종적인 샘플을 얻는 동결건조 과정이 아닌 유기용매로 침전시키는 방법으로 얻어진 HA 나노젤에 대해서도 생체분포확인 실험을 진행해보았고, 도 14에서 확인되는 바와 같이, 다른 장기들에 대한 섭취 정도는 비슷하였다.
Cu-64와 표지 반응이 이루어진 나노입자를 사용하여 종양모델에 대하여 생체분포확인 실험을 진행하였고, 주사한지 24시간 후에 각 장기에 대한 분포를 확인하여 종양에 대한 섭취정도를 확인하였다.
먼저 대장암종양세포(CT26)를 이용하여 종양모델을 준비하였고, 6-8 mm로 적절한 크기로 종양이 자랐을 때 종양모델에 대한 생체분포확인 실험을 진행하였고, 그 결과 도 15에서 확인되는 바와 같이, 간에 대해서 4.5 %ID/g로 가장 높은 섭취를 보여주었고, 그 다음으로 신장 (1.6 %ID/g), 비장 (1.2 %ID/g)에 대한 섭취가 높았다. 그러나 종양에도 1.0 %ID/g의 섭취로 타 장기들에 비해 높은 섭취를 보여주었고, 종양 대 근육비(Tumor to muscle ratio)는 8.4배, 종양 대 혈액비(Tumor to blood ratio)는 1.9배로 우수하게 종양을 진단할 수 있음을 확인하였다.
또한 피부암세포(흑색종/B16F10)를 이용하여서도 종양모델을 준비하였고, 적절한 크기로 종양이 자랐을 때 동일하게 24시간 후 생체분포확인 실험을 진행하였다. 도 16에서 확인되는 바와 같이, 간과 신장 그리고 비장에 높은 섭취를 보였는데 나노젤이 간과 신장을 통하여 체외로 배출되지만, 신장보다는 간을 통하여 배출되는 경향이 좀 더 높음을 확인할 수 있었고, 나노입자의 특성상 비장에도 높은 섭취가 이루어짐을 확인하였다. 그 다음으로 종양(0.62%ID/g)과 림프절(0.89%ID/g)에 높은 섭취가 이루어짐을 확인할 수 있었는데, 종양 대 근육비(Tumor to muscle ratio)는 14.2배, 종양 대 혈액비(Tumor to blood ratio)는 3.2배로 우수하게 종양을 진단할 수 있음을 확인하였다.
방사성동위원소 Cu-64로 표지된 히알루론산 나노젤을 이용하여 종양모델에 대한 핵의학 영상 연구를 진행하며 앞서 진행한 생체분포확인 실험에서 미처 확인하지 못하였던 세세한 장기들에 대한 섭취 및 장기들에 대한 분포 및 배출 또한 종양에 대한 타겟 능력을 확인하였다.
핵의학 영상 실험에는 대장암종양세포(CT26) 세포를 사용하였다. 도 17에서 확인되는 바와 같이, 히알루론산 나노젤에 대한 5시간 PET영상에서는 생체분포확인실험에서와 동일하게 간에 가장 높은 신호가 나타남을 확인할 수 있고 그 다음으로 장과 종양 순으로 높은 섭취가 이루어짐을 확인하였다.
실시예 3: 비타민C가 결합된 히알루론산 나노 입자의 합성 및 이의 효능 평가
(1) 아스코르브산이 결합된 히알루론산 나노입자의 합성
1) 아스코르브산 유도체의 합성
히알루론산과 아스코르브산을 효과적으로 결합시키기 위한 방법으로 히알루론산의 카르복실산기에 아스코르브산 유도체를 에스터 결합으로 합성하고자 전략을 수립하였다.
아세탈 형태로 보호된 아스코르브산의 3번 하이드록시기에 위치 선택적으로 결합할 수 있는 alkylation 조건(1-chloro-3-iodopropane, NaHCO 3, DMSO)을 찾고 보호기를 제거하여 히알루론산과 결합할 수 있는 형태의 아스코르브산 유도체를 합성하였다(도 18).
구체적으로, 아세탈 형태로 보호된 아스코르브산 3번 OH기에 1-chloro-3-iodopropane을 결합시킨후 chloro기(Cl)을 iodo기(I)로 치환 시키고, 보호기인 아세탈기를 제거하여 아스코르브산 유도체를 합성하였다(도 18).
2) 아스코르브산이 결합된 히알루론산 나노 입자의 합성
상기 실시예 1에서 제조한 히알루론산 나노 입자에 상기 제조한 아스코르브산 유도체를 결합하고자 하였다.
카르복실산기를 가지고 있는 히알루론산 나노 입자는 반응용매인 DMSO에 녹지 않기 때문에 TBA(Tetrabutyl ammonium)기로 치환시키는 방법을 이용하였다. 구체적으로, 카르복실산기를 포함하는 히알루론산 나노 입자를 물에 녹인 후 TBAOH을 조금씩 첨가하여 pH=9~10 로 맞춘 후 동결냉동 건조시켜 TBA형태의 히알루론산 나노젤을 제조하였다(도 19).
이후, 상기 제조된 Iodo로 치환된 아스코르브산 유도체를 TBA형태로 얻어진 히알루론산 나노젤과 DMSO 용매하에서 약 12시간 정도 교반시키고, 반응용액에 아세톤을 첨가하여 분말형태의 아스코르브산이 결합된 히알루론산 나노젤 유도체를 수득하였다(도 20).
아스코르브산이 결합된 히알루론산 나노젤 유도체가 제조되었는지 여부를 NMR 및 HPLC 크로마토그램으로 확인하였으며, 이를 도 21a 및 도 21b에 나타내었다. 도 21에 나타낸 바와 같이, 4.9ppm에서 아스코르브산 1proton peak 및 2.1ppm에서 propyl linker의 CH 2 peak가 확인됨에 따라 아스코르브산과 히알루론산의 에스터 결합이 이루어진 것으로 확인되었으며(도 21a), HPLC 크로마토그램에서도 아스코르브산에 해당되는 피크를 확인하였다(도 21b).
NMR 분석 결과에 따르면 히알루론산 분자의 카르복실산 : 아스코르브산 분자의 비율은 2.5:1로 확인이 되었다. 즉, 히알루론산 분자의 카르복실산기 2.5개 당 아스코르브산 1개가 결합되어 있는 것으로 확인이 되었다.
(2) 히알루론산-아스코르브산 나노 입자(HA-VitC)의 안정성(stability) 및 유효성(efficacy) 평가
열적 안정성(thermal stability) 평가는 아스코르브산(AA, 100μM)과 상기 제조된 히알루론산-아스코르브산 나노젤 (HA-VitC, 0.5mg/mL) 수용액을 각각 50℃에서 48시간동안 방치 시킨 후 HPLC를 이용하여 분석했다.
이에 대한 결과를 도 22에 나타내었다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 아스코르브산(AA)은 시간이 지남에 따라 산화되어 없어지는 반면, HA-VitC는 그에 비해 안정함을 확인하였다(50% 이상 안정성 개선).
(3) 히알루론산-아스코르브산 나노 입자(HA-VitC)의 미백, 항산화 및 주름개선 효능 평가
미백 효능 평가는 B16F10 mouse melanoma cell line에 각 시험물질을 처리하고 48시간 동안 인큐베이션 후 Melanin contents assay 및 cellular tyrosinase activity assay 방법으로 측정하였다. 대조군으로 아스코르브산과 아스코르브산-2-글루코시드(AA2G) 및 상기 실시예 2에서 사용한 HA1(Oligo-HA)를 사용하였다.
시험에 사용된 물질들은 모두 -20℃ 또는 50℃에서 24시간 방치시킨 후 실험에 사용하였다.
이에 대한 결과를 도 23에 나타내었다.
도 23a 및 도 23b에 나타낸 바와 같이, 아스코르브산, AA2G, HA-VitC, Oligo-HA(올리고 히알루론산)를 각각 50℃에서 24시간 둔 뒤, -20도에서 보관한 시료와 효능을 비교한 결과, 아스코르브산은 50℃ 보관 시, 미백효능이 사라졌으나, HA-VitC의 경우에는 여전히 농도 의존적으로 멜라닌 생성과 타이로시나제 활성을 강하게 억제하는 것으로 확인이 되었다.
그 다음으로, DPPH assay를 이용하여 HA-VitC의 활성산소 제거능을 평가하였다. 구체적으로 아스코르브산, Oligo-HA 및 HA-VitC를 도 24에 표시된 농도별로 처리한 후 종래 공지된 방법에 따라 활성산소 제거능을 평가하고(도 24a), 이를 정량화하여 그래프로 나타내었다(도 24b).
도 24a 및 도 24b를 참고하면, 히알루론산(Oligo-HA)의 경우, 활성산소 제거능이 전혀 없었기 때문에, HA-VitC의 활성산소 제거능은 HA-VitC에서 HA 나노젤과 결합해 있는 Vit C(비타민C)에 의해 나타난 것이라고 판단해 볼 수 있었다.
특히 비타민C는 공기에 노출이 된 이후에 산화에 매우 취약하여 빨리 분해가 되는 것을 고려한다면, 본 발명에 따른 HA-VitC의 경우에는 비타민C의 보관 안정성을 향상시킬 수 있음과 동시에 VitC의 효과를 그대로 보유하고 있다는 점에서 활용도가 매우 높다고 판단된다.
그 다음으로, HA-VitC의 세포성 티로시나제(cellular tyrosinase) 억제 활성을 공지된 방법에 따라 평가하였다:
세포주: B16F10 mouse melanoma (Passage 10), 6 well plate, 4x10 5 cells/well
평가 방법: 세포성 타이로시나제 활성 어세이
실험물질 처리 시간: 48 시간
실험물질 처리 농도: 도 25 참고
이에 대한 결과를 도 25에 나타내었다.
도 25a 및 도 25b에 나타낸 바와 같이, HA-VitC는 농도 의존적으로 세포성 타이로시나제를 강하게 억제하는 것으로 확인되었다.
그 다음으로, 섬유아세포 증식 효과를 종래 공지된 방법에 따라 평가하였다.
간략하게 실험 조건은 다음과 같으며, 실험물질의 종류 및 각 물질의 처리 농도는 도 26에 나타낸 바와 같다:
세포주 : HDF-neo, Human primary dermal fibroblast-neonatal (passage 15), 24웰 플레이트에 1x10 4 세포/웰
평가 방법 : WST-8 assay(Ez-cytox) and Procollagen ELISA (Takara #MK101)
실험물질 처리 시간 : 3 day, 1day fasting, serum free condition
이에 대한 결과를 도 26에 나타내었다.
도 26에 나타낸 바와 같이, 아스코르브산, AA2G(AG), APPS의 경우 섬유아세포 증식 촉진 효능이 거의 나타나지 않았으나, HA-VitC의 경우 농도 의존적으로 섬유아세포의 증식을 촉진하는 것으로 확인이 되었다.
그 다음으로, HA-VitC가 콜라겐 생합성에 미치는 영향을 종래 공지된 방법에 따라 평가해 보았다. 간략하게 실험 조건은 다음과 같으며, 실험물질의 종류 및 각 물질의 처리 농도는 도 27에 나타낸 바와 같다:
세포주 : HDF-neo, Human primary dermal fibroblast-neonatal (passage 11), 96웰 플레이트, 3x10 3 세포/웰
평가 방법 : Procollagen ELISA (Takara #MK101)
실험물질 처리 시간 : 3 day, 1day fasting, serum free condition
이에 대한 결과를 도 27에 나타내었다.
도 27에 나타낸 바와 같이, HA-VitC 처리군에서 가장 높은 콜라겐 생합성이 유도되었음을 확인할 수 있었다.
본 발명은 순수한 히알루론산 나노 입자를 가교제 및 유기용매 없이 수용액 상에서 제조할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명은 최적화된 전자빔 조건하에서 재현성 있게 다양한 나노미터 사이즈의 히알루론산 나노입자를 균일하게 합성할 수 있고, 형광 표지를 통한 피부투과도 확인 및 방사성 표지를 통해 합성된 히알루론산 나노입자의 종양진단을 위한 조영제 및 치료제 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

Claims (25)

  1. 히알루론산 수용액에 전자빔을 조사하여, 히알루론산의 분자간 또는 분자내 가교결합을 형성함을 포함하는 가교된 히알루론산 나노 입자를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 히알루론산 수용액은 산성임을 특징으로 하는 가교된 히알루론산 나노 입자를 제조하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 히알루론산 수용액은 pH 1 내지 6인 것을 특징으로 하는 가교된 히알루론산 나노 입자를 제조하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 히알루론산 함유 용액에 HClO 4을 추가로 포함하는 가교된 히알루론산 나노 입자를 제조하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 전자빔의 조사선량을 변경하여 히알루론산 나노 입자의 크기를 제어함을 특징으로 하는 가교된 히알루론산 나노 입자를 제조하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 전자빔의 조사선량을 늘려 상기 히알루론산 나노 입자의 크기를 줄임을 특징으로 하는 가교된 히알루론산 나노 입자를 제조하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 수용액의 pH를 조절하여, 상기 히알루론산 나노 입자의 크기를 제어함을 특징으로 하는 가교된 히알루론산 나노 입자를 제조하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 히알루론산 수용액은 0.05 내지 7%(w/v)의 농도인 것을 특징으로 하는 가교된 히알루론산 나노 입자를 제조하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 전자빔은 0.5 내지 300kGy의 조사량으로 조사되는 것을 특징으로 하는 가교된 히알루론산 나노 입자를 제조하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 히알루론산 나노입자는 100nm 이하의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 가교된 히알루론산 나노 입자를 제조하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 히알루론산 나노 입자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 나노 입자는 종양 선택성을 가짐을 특징으로 하는 히알루론산 나노 입자.
  13. 방사성 동위원소, 유기 형광물질, 무기물질인 양자점, 자기공명영상 조영제, 컴퓨터단층촬영 조영제, 양전자단층촬영 조영제, 초음파 조영제, 형광 조영제 및 상형변환물질로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상의 표지 물질로 표지된 제10항 또는 제12항의 히알루론산 나노 입자를 포함하는 조영제 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 나노 입자에 접합된 리간드 화합물; 및
    상기 리간드 화합물에 배위결합된 방사성 동위 원소를 포함하는 조영제 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 리간드 화합물은 NODA-GA-NH 2, DOTA-GA, DOTA, TETA 및 NOTA 중 적어도 어느 하나임을 특징으로 하는 조영제 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 상기 방사성 동위 원소는 11C, 13N, 15O, 18F, 38K, 62Cu, 64Cu, 68Ga, 82Rb, 124I, 89Zr, 99mTc, 123I, 111In, 67Ga, 177Lu, 201Tl, 117mSn, 125I, 131I, 166Ho, 188Re, 67Cu, 89Sr, 90Y, 225Ac, 213Bi, 및 211At 중 적어도 어느 하나임을 특징으로 하는 조영제 조성물.
  17. 아스코르브산(ascorbic acid) 및 히알루론산 나노젤 접합체(conjugate).
  18. 제17항에 있어서, 상기 접합체는 하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 접합체:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2020000612-appb-img-000008
    상기 식에서 m은 1 내지 5이다.
  19. 제17항에 있어서, 상기 히알루론산 나노젤은 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 것을 특징으로 하는 접합체.
  20. 제17항에 있어서, 상기 접합체는 하기 반응식 1 내지 3에 따라 제조되는 것을 특징으로 하는 접합체:
    [반응식 1]
    Figure PCTKR2020000612-appb-img-000009
    [반응식 2]
    Figure PCTKR2020000612-appb-img-000010
    [반응식 3]
    Figure PCTKR2020000612-appb-img-000011
    상기 식에서 m은 1 내지 5이다.
  21. 제17항에 있어서, 상기 접합체는 아스코르브산의 보관 안정성이 향상된 것을 특징으로 하는 접합체.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 접합체를 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부 미백, 주름 개선 또는 피부 노화 방지용 화장료 조성물.
  23. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 접합체를 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부 미백, 주름 개선 또는 피부 노화 방지용 식품 조성물.
  24. 항산화, 피부 미백, 주름 개선 또는 피부 노화 방지용 제제를 제조하기 위한 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 접합체의 용도.
  25. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 접합체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 항산화, 피부 미백, 주름 개선 또는 피부 노화 방지 방법.
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