WO2020130489A1 - 양쪽이온성 알긴산 유도체 및 이를 포함하는 조영제 조성물 - Google Patents

양쪽이온성 알긴산 유도체 및 이를 포함하는 조영제 조성물 Download PDF

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WO2020130489A1
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alginic acid
alginate
alg
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최용두
이혜리
이연
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국립암센터
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Definitions

  • the present invention is a zwitterionic alginate (alginate) derivative; Contrast composition comprising the derivative; Pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of cancer or inflammatory diseases; It relates to a method for preparing the derivative and a method for preparing the contrast agent composition or pharmaceutical composition.
  • detecting the area and size of a tumor is a very important factor in effective treatment design.
  • imaging diagnostic methods such as biopsy by perforation, X-ray imaging, magnetic resonance imaging (MRI), ultrasound imaging, and fluorescence imaging.
  • Suitable imaging contrast agents are used in these imaging methods, and contrast agents in the form of iodine-based compounds, metal complexes, nanoparticles, bubbles, or dyes, which have properties of amplifying or reducing each image signal according to the imaging method used, are used. do.
  • the fluorescent image contrast agent functions to emit fluorescence by exposing to excitation light having a specific wavelength.
  • the subject is exposed to excitation light from the outside of the body, and the fluorescent contrast agent in the body emits fluorescence to detect it, thereby diagnosing the symptoms and progress of the disease.
  • the known contrast agents used in the diagnosis of in vitro and in vivo fluorescence imaging do not specifically bind to various types of plasma proteins present in the cell culture fluid and blood, while preventing the specific accumulation of contrast agents in disease lesions or , Due to the non-specific accumulation in normal tissues, it is difficult to accurately diagnose the diseased area, or there is a technical problem in that the image is diagnosed in a short time due to rapid discharge to the body.
  • the present inventors tried to find a substance capable of accurately diagnosing a non-specific interaction with serum protein and allowing a stable stay in the body for a longer period of time.
  • lysine or arginine arginine
  • an alginate derivative having zwitterionic properties by confirming that it is possible to prevent the contrast agent from being ingested non-specifically to an undesired organ or tissue, and to stay in the body at a high concentration even after a certain period of time.
  • the present invention was completed.
  • One object of the present invention is to provide zwitterionic alginate derivatives.
  • Another object of the present invention is to provide a contrast agent composition comprising the alginate derivative.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer or inflammatory diseases, including the alginic acid derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer or inflammatory disease, comprising administering to a subject a composition comprising the alginic acid derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the alginate derivative.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the contrast composition or pharmaceutical composition.
  • One aspect of the present invention for achieving the above object is to provide a zwitterionic alginate (alginate) derivative, the alginate derivative is characterized in that it has zwitterionicity by binding lysine or arginine to the alginate.
  • the zwitterionic alginic acid derivative may be represented by Formula 1 below.
  • n may be an integer from 1 to 3000, and R is a lysine or a combination of arginine, that is, , or Can be
  • alginic acid is a type of polysaccharide contained in seaweed, ⁇ (1 ⁇ 4)-D-mannuroinic acid and ⁇ (1 ⁇ 4)-L-guluronic acid.
  • a linear uronic acid polymer composed of residues the formula is (C 6 H 8 O) n and the molecular weight is known to be 20,000 to 240,000.
  • Properties such as degree of polymerization of alginic acid may vary depending on the type, source, and season of collecting seaweed used for extraction, and may vary depending on the composition, arrangement, and content of manuronic acid and guluronic acid.
  • Alginic acid used in the present invention has an average molecular weight range of 100,000 to 1,000,000, a viscosity of 15 to 600 mPa ⁇ s, and a ratio of the content of manuronic acid:gluronic acid having a value between 1.0 and 2.0, As long as it can be used for the synthesis of alginate derivatives, the molecular weight, viscosity, arrangement order of manuronic acid and gluronic acid, content ratio, etc. are not particularly limited.
  • the alginic acid derivative of the present invention exhibits zwitterionicity and is characterized by being able to avoid non-specific interactions with serum proteins present in cell culture or blood, etc. when used as contrast agents, which may include alginic acid and lysine or arginine ( arginine). More specifically, the alginic acid derivative of the present invention can be synthesized by forming an amide bond between alginate and lysine or arginine using an EDC/sulfo-NHS coupling reaction, and the lysine or arginine is L-form (ie, L-lysine Or L-arginine), but is not particularly limited thereto.
  • the alginic acid derivative of the present invention is a combination of an alginate derivative and L-lysine or L-arginine using EDC and sulfo-NHS coupling reaction, and after binding, the alginate derivative maintains zwitterionic cell Non-specific interactions with serum proteins present in culture or blood can be avoided.
  • a phosphate buffer (PBS), indocyanine green (ICG), anionic alginic acid (Alg@ZWA) combined with a fluorescent dye, and zwitterionic alginic acid derivative combined with a fluorescent dye ( Alg-lys@ZW38) was prepared and injected at the same dose through the tail vein of the rat.
  • PBS phosphate buffer
  • ICG indocyanine green
  • Alg@ZWA anionic alginic acid
  • Alg-lys@ZW38 zwitterionic alginic acid derivative combined with a fluorescent dye
  • alginic acid Alg@ZWA
  • a fluorescent dye a large amount is discharged into the urine within 20 minutes after injection, and the fluorescence signal in the body weakens after 1 hour after injection, and only partially after 3 hours after injection Fluorescence signal was observed.
  • the zwitterionic alginate derivative Alg-lys@ZW38
  • the alginic acid derivative of the present invention is not only a compound in which alginic acid and lysine or arginine are directly bonded, but also polyethylene glycol (PEG) is added to the alginic acid derivative to further improve the retention time in blood and the effect of inhibiting non-specific interactions. It may be combined.
  • PEG polyethylene glycol
  • the molecular weight, the binding position, and the number of PEG bound in the unit compound represented by Chemical Formula 1 may be differently applied by a person skilled in the art depending on the target residence time and application field. More specifically, PEG is coupled to a lysine or arginine residue of the terminal amine group (-NH 3 +) present in the unit compound represented by the formula (1) or carboxyl group (-COO -) may be coupled to.
  • PEG can be bound up to 50% of the total number of amine groups or carboxyl groups present per molecule of zwitterionic alginic acid derivatives of the present invention, and more specifically, total amine present per molecule of zwitterionic alginic acid derivatives. It may be combined with 1 to 20% of the number of groups or carboxyl groups, but is not particularly limited thereto.
  • the alginic acid derivative of the present invention may be a zwitterionic alginic acid derivative represented by Formula 2 below, but is not limited thereto.
  • n may be an integer from 1 to 3000, and m may be an integer from 6 to 1,000.
  • the zwitterionic alginic acid derivative of the present invention is methoxy polyethyleneglycol succinimidyl N-hydroxysuccinimide ester (mPEG 5K -NHS) or mPEG 5K- It can be synthesized by reacting SPA, but it is not particularly limited as long as it is a substance that can be used for the purpose of increasing the residence time in the blood by providing PEG for binding to the alginic acid derivative. That is, the alginic acid derivative of the present invention is characterized by further increasing the residence time in the blood of an individual by binding PEG and inhibiting non-specific interactions with serum proteins present in blood and the like.
  • the alginic acid derivative is a similar compound obtained by chemically changing a part of the compound in addition to the compound represented by Chemical Formula 1, as long as it exhibits zwitterionic properties and can retain a longer time in the individual. It is apparent to those skilled in the art that it can be included without limitation.
  • the alginic acid derivative of the present invention may be a combination of an imaging contrast agent or a drug to the zwitterionic alginic acid derivative.
  • the “image contrast medium” may be a magnetic resonance imaging contrast medium (MRI contrast medium), a CT (computed tomography) contrast medium, or a fluorescent dye, but is not limited thereto.
  • the “Magnetic Resonance Imaging Contrast” is injected into the body to change the relaxation rate of the tissues, thereby widening the difference in the degree of relaxation between tissues and inducing a change in the MRI signal to play a role in sharpening the contrast between tissues.
  • the magnetic resonance imaging contrast agents are representative of gadolinium contrast agents, specifically, ionized gadolinium (Gd)(III) complexes and neutral gadolinium (Gd)(III) complexes, and more specifically gadolinium complexes, manganese complexes, copper (Copper) (II) may be a complex compound, iron oxide nanoparticles and manganese oxide nanoparticles, but is not particularly limited thereto.
  • the “CT contrast agent” is a material used to clarify shading during X-ray imaging, and may be an iodide contrast agent or a barium contrast agent, but is not particularly limited thereto.
  • the iodinated contrast agent contains iodine that does not pass X-rays, and since the degree of iodine distribution is different between tissues with disease lesions and normal tissues, the difference in X-ray absorption in X-ray imaging or CT examination using X-rays, etc. By making it appear large, you can clearly contrast the condition of the tissue or lesion.
  • the iodinated contrast agents are ioxitalamic acid, iohexol, iopamidol, ioversol, iopromid, iomeprol, iobitrolidol (iobitridol) or iodixanol, but is not limited thereto.
  • barium is a white powder that does not dissolve in water, and barium contrast agents do not pass X-rays. When taking special X-ray examinations, CT imaging, or gastrointestinal imaging with barium contrast agents, the digestive tract outline can be clearly revealed.
  • the barium contrast agent may be barium sulfate, but is not limited thereto.
  • the "fluorescent dye” is fluorescein (Fluorescein), CR110: Carboxyrodamine 110: Rhodamine Green (trademark), TAMRA: Carboxytetramethylrodamine: TMR, Carboxyrodamine 6G: CR6G, BODIPY FL (Trade name): 4, 4-difluoro-5, 7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid, BODIPY 493/503 (Trade name): 4, 4- Difluoro-1, 3, 5, 7-tetramethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-8-propionic acid, BODIPYR6G (trade name): 4, 4-difluoro-5- (4-phenyl-1,3-butadienyl)-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-propionic acid, BODIPY
  • the bonding position and number of contrast agents bound to the unit compound represented by Formula 1 may be differently applied by a person skilled in the art depending on the application field.
  • the contrast agent may be bound up to 50% of the total number of amine groups or carboxyl groups present per molecule of the zwitterionic alginate derivative of the present invention, and more specifically, per zwitterionic alginate derivative molecule It may be combined with 1 to 20% of the total amine group or carboxyl group number present, but is not particularly limited thereto.
  • the alginic acid derivative of the present invention is a form in which a fluorescent dye ZW800 NHS ester is reacted with an alginic acid derivative represented by Chemical Formula 1 to be represented by the following Chemical Formula 3, but is not particularly limited thereto.
  • n may be an integer from 1 to 3000.
  • the drug may select a drug suitable for the target disease, for example, the drug is an anti-cancer agent, anti-inflammatory agent, anesthetic agent, anti-viral agent, anti-bacterial agent, therapeutic antibody, antibiotic, immunotherapeutic agent or photo-sensitizer (light Sensitizer), and more specifically, may be an anti-cancer agent or an anti-inflammatory agent, but is not particularly limited thereto.
  • the drug is an anti-cancer agent, anti-inflammatory agent, anesthetic agent, anti-viral agent, anti-bacterial agent, therapeutic antibody, antibiotic, immunotherapeutic agent or photo-sensitizer (light Sensitizer), and more specifically, may be an anti-cancer agent or an anti-inflammatory agent, but is not particularly limited thereto.
  • the “anti-cancer agent” includes doxorubicin, gosipol, nitrogen mustard, imatinib, oxaliplatin, rituximab, erlotinib, neratinib, lapatinib, gefitinib, vandetanib, nirotinib, semasanib, conservitinib, ax Citinib, Cediranib, Restautinib, Trastuzumab, Gefitinib, Bortezomib, Sunitinib, Carboplatin, Bevacizumab, Cisplatin, Cetuximab, Biscumalbum, Asparaginase, Tretinoin, Hyde Oxycarbamide, dasatinib, estramustine, gemtuzumab ozogamycin, britumomab tucetan, heptaplatin, methylaminolevulinic acid, amsacrine, alem
  • the “anti-inflammatory agent” includes salicylates, ibuprofen, naproxen, phenoprofen, indomethacin, phenyltazone, mesotrexate ( methotrexate, cyclophosphamide, mechlorethamine, dexamethasone, prednisolone, celecoxib, valdecoxib, nimesulide, cortisone (cortisone) and corticosteroid (corticoste roid) may be at least one selected from the group consisting of, but is not limited to.
  • the "photo-sensitizer” is a medicine that administers a substance that exhibits a light-sensitive reaction in the human body, and may be mainly used for cancer treatment, skin disease, and arthritis.
  • the photosensitizer may be, but is not limited to, a hematoporphyrin derivative (Hemato Porphyrin Derivative), amino levurinic acid (ALA) or chlorin (Chlorin).
  • the binding position and number of drugs bound to the unit compound represented by Chemical Formula 1 may be differently applied by a person skilled in the art depending on the application field.
  • the drug is a terminal amine group of a lysine or arginine residue (-NH 3 +) or carboxyl group (-COO -) present in a unit of the compound represented by Formula 1 can be coupled to, and , Alginic acid derivatives may be combined in a ratio of 1 to 20 w/w %, but are not particularly limited thereto.
  • alginic acid derivative of the present invention may be represented by the following Chemical Formula 4, but is not particularly limited thereto.
  • n may be an integer from 1 to 3000.
  • Another aspect of the present invention for achieving the above object is to provide a contrast agent composition comprising the alginate derivative.
  • the alginic acid derivative is as described above.
  • the term "contrast composition” refers to a substance that is administered to the human body so that specific tissues or blood vessels can be clearly seen during an imaging diagnosis or procedure, and is classified into an iodinated contrast agent, a gadolinium contrast agent, a barium contrast agent, etc.
  • an iodide contrast agent and a barium contrast agent are used for X-ray imaging and CT imaging
  • a gadolinium contrast agent is used for magnetic resonance imaging (MRI).
  • the contrast agent composition may include a compound in which an imaging contrast agent is additionally bound to the alginic acid derivative.
  • Another aspect of the present invention for achieving the above object is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer or inflammatory diseases, including the alginic acid derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • another aspect of the present invention for achieving the above object comprises the step of administering to the subject a composition comprising the alginic acid derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof, prevention or treatment of cancer or inflammatory disease Is to provide a way.
  • the alginic acid derivative is as described above.
  • the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically acceptable amount of the alginic acid derivative of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and the alginic acid derivative may mean a form in which the imaging contrast agent and/or drug are combined. have.
  • the pharmaceutical composition is cerebrospinal tumor, head and neck cancer, lung cancer, breast cancer, thymoma, mesothelioma, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, biliary cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, germ cell tumor, ovary Cancers such as cancer, cervical cancer, endometrial cancer, lymphoma, acute leukemia, chronic leukemia, multiple myeloma, sarcoma, malignant melanoma, or skin cancer; Ophthalmic diseases such as glaucoma, cataracts, and senile macular disease; Vascular diseases such as arteriosclerosis, cerebral infarction, and vascular restenosis; arthritis; Autoimmune diseases; Dental diseases such as tooth decay, periodontal abscess, alveolitis, chronic periodontitis, gingivitis; Or it may be for the prevention or treatment of diabetes, but is not particularly limited thereto.
  • pharmaceutically acceptable salt in the present invention means a formulation that does not impair the biological activity and properties of the alginate derivative of the present invention to be administered.
  • the pharmaceutically acceptable salt is an acid that forms a non-toxic acid addition salt containing a pharmaceutically acceptable anion, for example, an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, etc.
  • Organic carbon acids such as tartaric acid, formic acid, citric acid, acetic acid, trichloroacetic acid, trichloroacetic acid, gluconic acid, benzoic acid, lactic acid, fumaric acid, maleic acid, salicylic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p- And acid addition salts formed by sulfonic acids such as toluene sulfonic acid.
  • carboxylic acid salts include metal salts or alkaline earth metal salts formed by lithium, sodium, potassium, calcium, magnesium, etc., amino acid salts such as lysine, arginine, guanidine, dicyclohexylamine, N- Organic salts such as methyl-D-glucamine, tris(hydroxymethyl)methylamine, diethanolamine, choline and triethylamine, and the like.
  • pharmaceutically effective amount in the present invention means an amount sufficient to treat the disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and is generally in an amount of 0.001 to 1000 mg/kg, preferably 0.05 to The amount of 200 mg/kg, more preferably 0.1 to 100 mg/kg, may be administered once or several times a day.
  • a specific therapeutically effective amount for a particular patient includes the type and extent of the reaction desired to be achieved, and whether or not other agents are used in some cases, including the patient's age, weight, general health status, gender and diet. , It is preferable to apply differently according to various factors including the time of administration, route of administration and composition, the duration of treatment, drugs used simultaneously, and similar factors well known in the pharmaceutical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, and may be formulated with the carrier to provide food, pharmaceutical, feed additives, and drinking water additives.
  • pharmaceutically acceptable carrier of the present invention may mean a carrier or diluent that does not inhibit the biological activity and properties of the compound being injected without stimulating the organism.
  • the type of the carrier that can be used in the present invention is not particularly limited, and any carrier that is commonly used in the art and is pharmaceutically acceptable can be used.
  • Non-limiting examples of the carrier include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and the like.
  • composition comprising the pharmaceutically acceptable carrier may be various types of oral or parenteral formulations.
  • the carrier may include a non-naturally occurring carrier.
  • formulation it may be prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc., which are usually used.
  • the carrier, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, It may be one or more selected from the group consisting of polyvinyl pyrrolidone, physiological saline, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, dextrin, calcium carbonate, propylene glycol and liquid paraffin. It is not limited, and any conventional carrier, excipient, or diluent may be used.
  • the components may be added independently or in combination to an active ingredient of the pharmaceutical composition, an alginate derivative bound to a drug, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Solid preparations for oral administration may include tablets, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations include at least one excipient in one or more compounds, such as starch, calcium carbonate, sucrose, or It can be prepared by mixing lactose, gelatin, etc. In addition, lubricants such as magnesium stearate, talc, etc. may be used in addition to simple excipients.
  • Liquid preparations for oral administration include suspending agents, intravenous solutions, emulsions, syrups, etc. In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. have.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents, suspension solvents may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • injectable esters such as ethyl oleate.
  • As a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, and glycerogelatin may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, intravenous solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilizers and suppositories. It can have any one formulation.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • a pharmaceutically effective amount There is no particular restriction on the dosage, and it can be changed according to body absorption, body weight, patient's age, gender, health status, diet, administration time, administration method, excretion rate, and disease severity.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in consideration of an effective amount range, and the unit dosage form formulated in this way uses a specialized dosing method according to the needs of the individual and the judgment of experts to monitor or observe the administration of the drug as necessary. Or it may be administered several times at regular time intervals.
  • the route of administration of the composition can be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • Intraperitoneal administration intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, but are not particularly limited thereto.
  • Another aspect of the present invention for achieving the above object is to provide a method for producing the alginate derivative.
  • the alginic acid derivative is as described above.
  • the manufacturing method includes the steps of (a) treating EDC and sulfo-NHS on alginic acid; And (b) reacting EDC and sulfo-NHS-treated alginic acid with lysine or arginine.
  • the “EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) is a water-soluble carbodiimide generally obtained with hydrochloride, and can be used for peptide synthesis, protein crosslinking to nucleic acids, etc. , It can be used with N-hydroxysuccinimide (NHS) for immobilization of large biomolecules.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the NHS may be “sulfo-NHS (N-hydroxysulfoxuccinimide)”.
  • the alginate derivative and L-lysine were reacted and combined using the coupling reaction of EDC and sulfo-NHS, thereby maintaining the zwitterionicity of the alginate derivative even after binding to cell culture or blood. Nonspecific interactions with existing serum proteins can be avoided.
  • the method of preparing the alginic acid derivative may further include the step of reacting (c) a lysine or arginine-linked alginic acid derivative with polyethylene glycol (PEG) after step (b), or polyethylene with alginic acid.
  • PEG polyethylene glycol
  • Glycol may be bound first and then the step (b) may be used to prepare a zwitterionic alginate derivative.
  • the step (c) of reacting lysine or arginine-linked alginic acid derivative with polyethylene glycol is methoxy polyethyleneglycol succinimidyl N-hydroxysuccinimide ester, mPEG 5K -NHS) or mPEG 5K -SPA may be reacted, but other materials that can be used for the purpose of increasing residence time in the blood by providing PEG and binding to the alginate derivative are not limited thereto. That is, the alginic acid derivative prepared by the above production method is characterized in that the residence time in the blood of the individual is further increased as PEG is bound.
  • Another aspect of the present invention for achieving the above object is to provide a method for preparing a contrast agent composition or a pharmaceutical composition comprising the alginic acid derivative.
  • the alginic acid derivative, contrast agent and pharmaceutical composition are as described above.
  • the method for preparing the contrast agent composition or pharmaceutical composition may include reacting a zwitterionic alginic acid derivative prepared according to the method for preparing the alginic acid derivative with an imaging contrast agent or a drug, and the alginic acid derivative prepared therefrom.
  • the imaging contrast agent and the drug are as described above.
  • Alginic acid derivatives of the present invention are zwitterionic, thereby avoiding non-specific interactions with serum proteins present in cell culture fluids or blood, and non-specific intake of other organs or tissues other than the target organ or tissue is inhibited, thereby preventing blood While stable circulation is possible within, it can be used as a contrast agent composition or pharmaceutical composition by forming a conjugate with an imaging contrast agent or drug. In addition, not only can the delivery efficiency of contrast agents and drugs for targeted cancer cells be dramatically improved, but also the effect of imaging and treatment can be greatly improved.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a process for preparing a zwitterionic alginate derivative from alginic acid and a process of binding a contrast agent or drug to the zwitterionic alginate derivative.
  • 2A is a schematic diagram of synthesizing a zwitterionic alginate derivative by combining alginate and lysine.
  • Figure 2b is a schematic diagram for synthesizing zwitterionic alginate derivatives by combining alginate and arginine.
  • FIG. 3A is a result of 1 H-NMR measurement of a zwitterionic alginate derivative (Alg-lys) synthesized by binding lysine
  • FIG. 3B shows FT-IR of a zwitterionic alginate derivative synthesized by binding lysine. It is a measurement result.
  • FIG. 4 is the result of 1 H-NMR measurement of the zwitterionic alginate derivative (Alg-arg) synthesized by binding arginine
  • FIG. 4B shows FT-IR of the zwitterionic alginate derivative synthesized by binding arginine. It is a measurement result.
  • Figure 5 is a synthetic schematic diagram of ZW-800 NHS ester dye binding to a lysine-bound zwitterionic alginate derivative.
  • Figure 6a is a UV-vis absorption spectrum of the ZW-800 fluorescent dye, Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11, Alg-lys@ZW38
  • Figure 6b is a ZW-800 fluorescent dye, Alg-lys@ZW4, Alg Fluorescence spectra of -lys@ZW11 and Alg-lys@ZW38
  • Figure 6c is a table analyzing the fluorescence extinction ratios for Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11 and Alg-lys@ZW38.
  • FIG. 7A is an absorbance assay curve for each concentration of the ZW-800 NHS ester fluorescent substance
  • FIG. 7B is a fluorescent spectrum for each concentration of the ZW-800 NHS ester fluorescent substance.
  • PBS phosphate buffer
  • FIG. 10 is a synthetic schematic of Alg@ZWA in which ZW-800 amine dye is combined with alginic acid.
  • FIG. 11A is a UV-vis absorbance spectrum obtained by preparing and measuring an aqueous solution of ZW-800 amine fluorescent material and Alg-lys@ZWA at the same fluorescent dye concentration (2.1 ⁇ M)
  • FIG. 11B is ZW-800 amine fluorescent material and Alg- It is a fluorescence spectrum prepared and measured by preparing an aqueous solution of lys@ZWA at the same fluorescent dye concentration (2.1 ⁇ M).
  • Figure 12a is a phosphoric acid buffer solution, ICG, Alg-lys@ZW38, Alg@ZWA is injected through the tail vein of the rat, and is an hourly fluorescent image photographed in the dorsal direction
  • Figure 12b is in the vicinity of the heart of the mouse (Region of interest, ROI) is a graph showing the change in fluorescence intensity value over time.
  • FIG. 13 is an hourly fluorescence image photographed in the direction of the pear, injected with phosphate buffer, ICG, Alg-lys@ZW38, and Alg@ZWA through the tail vein of the rat.
  • Figure 14a is a 1 H-NMR analysis of the alginate's KIMICA
  • Figure 14b are both synthesized by coupling lysine to the alginate's KIMICA a 1 H-NMR analysis of the alginate ionic derivatives.
  • Figure 15a is a UV-vis absorption spectrum for ZW-800 fluorescent material bound zwitterionic alginate derivative (Alg (KIMICA)-lys@ZW-800) and ZW-800 NHS ester fluorescent material (2.9 ⁇ M)
  • 15b is a fluorescence spectrum of ZW-800 fluorescent substance bound zwitterionic alginic acid derivative (Alg(KIMICA)-lys@ZW-800) and ZW-800 NHS ester fluorescent substance (2.9 ⁇ M).
  • 16 is a schematic diagram showing the process of synthesizing Alg-lys-mPEG 5K by binding polyethylene glycol to zwitterionic alginate derivatives.
  • Figure 17a is the result of 1 H-NMR analysis of the synthesized Alg-lys-mPEG 5K
  • Figure 17b is a synthetic alginate, zwitterionic alginic acid and mPEG 5K combined zwitterionic alginic acid (Alg-lys-mPEG 5K ) It is the result of FT-IR analysis.
  • Figure 18a is a Alg-lys-mPEG 5K ZW- 800 was Alg-lys-mPEG 5K @ ZW -800 and ZW-800 (3.9 ⁇ M) UV -vis absorption spectra of the NHS ester fluorophore combine, as shown in Fig. 18b is Alg-lys-mPEG Alg-lys -mPEG that combines ZW-800 to 5K 5K @ ZW-800 and a ZW-800 (3.9 ⁇ M) the fluorescence spectrum of the fluorophore NHS ester.
  • 19 is a schematic diagram of the synthesis process of Alg-lys@Ce6 in which the zwitterionic alginic acid derivative is combined with the photosensitive agent chloroin e6.
  • Figure 20a is a UV-vis absorption spectrum of a photosensitive agent (Ce6) and Alg-lys@Ce6 dissolved in a phosphate buffer (PBS)
  • Figure 20b is a photosensitive agent (Ce6) and Alg dissolved in a phosphate buffer (PBS) Fluorescence spectrum of -lys@Ce6.
  • 20C is a result of analyzing the generation of single oxygen from Alg-lys@Ce6 when light is irradiated using the single oxygen analysis kit.
  • FIG. 21 is a confocal fluorescence micrograph obtained after treating the cancer cells with the same concentration of the photosensitizer (Ce6) and Alg-lys@Ce6. It can be seen that when the Alg-lys@Ce6 treatment is performed, the amount of intake and delivery into the cancer cells is significantly improved compared to the case of the treatment with Ce6.
  • Ce6 photosensitizer
  • FIG. 22 shows the results of analyzing cell viability after treating a photosensitive agent (Ce6) and Alg-lys@Ce6 on cancer cells, and irradiating light having a wavelength of 670 nm.
  • Example 1 Preparation and analysis of lysine-bound zwitterionic alginate derivatives
  • a zwitterionic alginate derivative was prepared by forming a covalent bond through the coupling of the amine group of lysine with a coupling agent to the carboxyl group of alginate.
  • various coupling agents can be used to bind lysine to alginic acid.
  • 1-ehtyl-3-(3-dimethylaminorpropyl)carbodiimide (EDC) and sulfo-N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) are used.
  • EDC 1-ehtyl-3-(3-dimethylaminorpropyl)carbodiimide
  • sulfo-NHS sulfo-N-hydroxysuccinimide
  • EDC 1.2 times mole number of moles of alginic acid reaction and sulfo equal to 1.3 times mole number NHS was added and stirred at room temperature for about 30 minutes. Then, to inactivate EDC that did not react in the solution, 2-mercaptoethanol (14.3 M) was injected with 7 ⁇ L (final concentration 20 mM), and then stirred at room temperature for 20 minutes.
  • 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid buffer MES, 0.1 M, pH 5.7
  • 1 H nuclear magnetic resonance spectrophotometer 1 H-NMR, 400 MHz NMR Spectrometer, Jeol JNM-LA400 with LFG, JEOL, Japan
  • FT-IR FT-IR Spectrophotometer
  • alginic acid (alginate) and on both sides via a lysine alginate contrast ratio of the hydrogen peak seen in the vicinity of 2.8 ppm of the 1 H-NMR spectrum of the ionic alginate derivative calculation when both the comparison of 1 H-NMR spectrum of the ionic alginic acid derivatives It was confirmed that about 100% of the carboxyl group of alginic acid is bound to lysine (A in FIG. 3).
  • a zwitterionic alginate derivative was prepared by forming a covalent bond through the binding of an arginine amine group with a coupling agent to the carboxyl group of alginic acid (FIG. 2B).
  • an alginate-NHS ester conjugate was obtained by activating alginic acid using an EDC/sulfo-NHS filling agent, and arginine was bound thereto.
  • EDC 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid buffer
  • sulfo 1.3 times mole number NHS was added and stirred at room temperature for about 30 minutes.
  • Example 2-1 For the zwitterionic alginate derivative (arginine-conjugated alginic acid) prepared in Example 2-1, 1 H nuclear magnetic resonance spectrophotometer ( 1 H-NMR, 400 MHz NMR Spectrometer, Jeol JNM-LA400 with LFG, JEOL , Japan) and an infrared spectrophotometer (FT-IR, FT-IR Spectrophotometer, Nicolet 6700, Thermo Scientific, USA) to analyze the structure (Fig. 4).
  • 1 H nuclear magnetic resonance spectrophotometer 1 H-NMR, 400 MHz NMR Spectrometer, Jeol JNM-LA400 with LFG, JEOL , Japan
  • FT-IR FT-IR Spectrophotometer
  • alginic acid (alginate) and both the hydrogen peak compared to alginate of arginine on both sides seen in the vicinity of 1.6 ppm and 1.8 ppm in 1 H-NMR spectrum of the ionic alginic acid derivatives, as compared to 1 H-NMR spectrum of the ionic alginate derivative peak Through the calculation of the ratio of, about 100% of the carboxyl group of alginic acid was confirmed to be bound to arginine (A in FIG. 4).
  • Example 3 Preparation and analysis of a fluorescence imaging contrast agent in combination with a near-infrared fluorescent dye ZW-800 to a zwitterionic alginate derivative
  • ZW-800 NHS ester is a near infrared fluorescent substance having a molar mass of 1001.28 g/mol, a maximum excitation wavelength of 754 nm, and a maximum emission wavelength of 775 nm.
  • the reaction molar ratio of the near infrared fluorescent dye ZW-800 NHS ester compared to the zwitterionic alginate derivative synthesized in Example 1 is 1:10. , 1:50, 1:100 were synthesized respectively.
  • 15 mg of alginic acid derivative was dissolved in 3 mL of sodium bicarbonate (NaHCO 3 , 50 mM, pH 8.5) and mixed homogeneously at a concentration of 5 mg/mL, and 0.86, 3.87, 8.65 mg ZW as in the reaction ratio.
  • NaHCO 3 sodium bicarbonate
  • pH 8.5 sodium bicarbonate
  • Each of -800 NHS ester fluorescent dye was added and stirred for 1 day to react.
  • the reaction solution was placed in a dialysis membrane tube (MWCO 10 kDa), and unreacted material was removed by dialysis in PBS (0.1 M, pH 7.4) and distilled water for 2 days. Thereafter, freeze-drying to obtain a fluorescent dye-cationic alginic acid derivative (Alg-lys@ZW) in which the powder form of ZW-800 was covalently bound.
  • MWCO 10 kDa dialysis membrane tube
  • PBS 0.1 M, pH 7.4
  • distilled water distilled water
  • the ratio of moles of reaction of the ZW-800 fluorescent dye to the alginate derivative was represented by the mole number of the ZW-800 fluorescent dye which actually reacted with the fluorescent dye-alginic acid derivative having 1:10, 1:50, and 1:100 respectively.
  • UV-vis absorption spectra of Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11, and Alg-lys@ZW38 were measured (FIG. 6A).
  • phosphoric acid buffer solution, ICG and the prepared fluorescent dye-cationic alginic acid derivatives Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11, Alg-lys@ZW38 were placed in 1 mL in a 1.5 mL tube, followed by near infrared fluorescence imaging.
  • ICG showed weak fluorescence as aggregation occurred in the aqueous solution, and when the fluorescent dye was combined with the zwitterionic alginate derivative, it was confirmed that the binder was evenly dissolved in the aqueous solution and generated strong fluorescence ( Fig. 9).
  • Example 4 Preparation, analysis and animal test results of a fluorescent image contrast medium in which ZW-800 amine dye is combined with alginic acid
  • Alg@ZWA As a control group of the conjugate in which the fluorescent dye was bound to the zwitterionic alginate derivative, Alg@ZWA was prepared in which ZW-800 dye was coupled to alginic acid (FIG. 10). Specifically, Alg@ZWA, a combination of ZW-800 and alginic acid, was prepared by reacting the carboxyl group of alginic acid with an EDC/sulfo-NHS coupling agent and reacting it with ZW-800 amine.
  • the ZW-800 amine (molecular weight 887 g/mol) is a near infrared fluorescent material having a maximum excitation wavelength of 753 nm and a maximum emission wavelength of 772 nm, and alginic acid is a product of Sigma-Aldrich molecular weight 190,000 Da (cas no. 9005-38-3) Was used.
  • Alg-lys@ZW38 in which ZW-800 NHS ester fluorescent dye was covalently bound to the zwitterionic alginate derivative
  • Alg@ZWA in which ZW-800 amine fluorescent dye was coupled to alginic acid
  • the fluorescence ROI value in the vicinity of the dorsal heart of the mouse is numerically displayed graphically
  • the Alg-lys@ZW38 conjugate after 20 minutes of in vivo injection of each fluorescent substance shows a fluorescence value about 3.8 times higher than the ROI value of the ICG.
  • the ROI value of the Alg@ZWA conjugate was a fluorescence value almost equal to the ICG fluorescence value (0.998 times the fluorescence yield of the ICG).
  • the Alg-lys@ZW38 conjugate was circulated through the bloodstream to the body 24 hours after injection, and fluorescence signals were observed throughout the body.
  • Alg-lys@ZW38 injected into the body was inhibited from non-specific ingestion of liver tissue and slowly discharged to the body through the bladder over 24 hours after injection. From this, it was confirmed that the zwitterionic alginate derivative of the present invention can significantly improve the residence time in the blood of the combined contrast agent or drug than when using alginate.
  • Example 5 Preparation and analysis of high molecular weight zwitterionic alginate derivative-near infrared fluorescent substance conjugate
  • an alginate-NHS ester conjugate was obtained by activating alginate using an EDC/sulfo-NHS coupling agent, and lysine was bound thereto. Specifically, after dissolving 50 mg of alginic acid in 10 mL of MES buffer (MES, 0.1 M, pH 5.7), room temperature was added by adding EDC corresponding to 1.2 times mole of alginic acid reaction moles and sulfo-NHS corresponding to 1.3 times mole Stir for about 30 minutes. Thereafter, in order to inactivate the unreacted EDC of the solution, 2-mercaptoethanol (14.3 M) was injected with 7 uL (final concentration 20 mM) and stirred at room temperature for 20 minutes.
  • MES buffer MES, 0.1 M, pH 5.7
  • the NHS ester fluorescent substance (MW 1001.28 g/mol, maximum excitation wavelength 754 nm, maximum emission wavelength 775 nm) and the zwitterionic alginic acid derivative of ZW-800 from the Harvard Medical School professor Haksoo Choi's research team used in Example 1 above are Bound conjugates were prepared.
  • the conjugate 10 mg of the zwitterionic alginate derivative was dissolved in 2 mL of sodium bicarbonate (NaHCO 3 , 50 mM, pH 8.5) and mixed homogeneously at a concentration of 5 mg/mL. Then, 5.64 mg of ZW-800 NHS ester fluorescent dye was added and reacted by stirring for one day. After the reaction was completed, the solution was placed in a dialysis membrane tube (MWCO 10 kDa) and dialyzed with PBS (0.1 M, pH 7.4) and distilled water for 2 days to remove unreacted chemicals. The solution was freeze-dried to obtain a powdered conjugate.
  • NaHCO 3 sodium bicarbonate
  • PBS 0.1 M, pH 7.4
  • Example 6 Preparation and analysis of PEG bound zwitterionic alginate derivative-near infrared fluorescent substance conjugate
  • mPEG 5K mPEG, mPEG 5K- SPA, succiinimidyl PEG, NANOCS, MW 5000Da
  • the molecular weight of the conjugate is increased and non-specific interaction with the protein PEG-linked zwitterionic alginic acid derivatives that can be further prevented were synthesized.
  • 15 mg of the zwitterionic alginate derivative prepared in Example 1 was dissolved in 5 mL of Tris buffer (0.1 M, pH 8.5) solution, and then 34 mg of mPEG-NHS (molecular weight 5 KDa) was added. It reacted by stirring for one day.
  • Dialysis (MWCO 10 kDa) was performed in distilled water for 2 days to remove unreacted molecules and impurities in the solution after completion of the reaction, and lyophilization was performed on the purified solution to give mPEG to a powdered zwitterionic alginate derivative. 5K bound Alg-lys-mPEG 5K was obtained.
  • Example 3 Furthermore, in order to bind the ZW-800 NHS ester near-infrared fluorescent substance to the PEG-linked zwitterionic alginic acid derivative (Alg-lys-mPEG 5K ), a method similar to Example 3 was used. Specifically, 10 mg of Alg-lys-mPEG 5K was added to 2 mL of sodium bicarbonate (NaHCO 3 , 50 mM, pH 8.5) and mixed homogeneously to a concentration of 5 mg/mL. Thereafter, 5.48 mg of ZW-800 NHS ester fluorescent dye was added and stirred for 1 day to proceed.
  • NaHCO 3 sodium bicarbonate
  • ZW-800 NHS ester fluorescent dye was added and stirred for 1 day to proceed.
  • the solution was placed in a dialysis membrane tube (MWCO 10 kDa), and unreacted matter was removed by dialysis with PBS (0.1 M, pH 7.4) and distilled water for 2 days.
  • the solution taken out through the dialysis membrane tube was freeze-dried to obtain a high molecular weight zwitterionic alginate derivative-near infrared fluorescent substance conjugate (Alg-lys-mPEG 5K @ZW-800) in powder form.
  • Example 7 Preparation of zwitterionic alginic acid derivative-photosensitive agent conjugate (Alg-lys@Ce6) and evaluation of spectroscopic properties
  • a conjugate of a zwitterionic alginate derivative and a contrast agent (or drug) As an example of synthesizing a conjugate of a zwitterionic alginate derivative and a contrast agent (or drug), a conjugate (Alg-lys@Ce6) of a photosensitive agent chlorin e6 (Ce6) and a zwitterionic alginate derivative was prepared (FIG. 19).
  • Alginic acid used in the manufacture was used by purchasing a product of sodium alginate (cas no. 9005-38-3) manufactured by Sigma Aldrich having a molecular weight of 190 kDa.
  • synthesis was performed to form a covalent bond with Ce6 at a rate corresponding to 3% of the number of lysine end groups present in the zwitterionic alginic acid derivative (about 32 Ce6 per molecule of the alginic acid derivative).
  • a rate corresponding to 3% of the number of lysine end groups present in the zwitterionic alginic acid derivative about 32 Ce6 per molecule of the alginic acid derivative.
  • PBS buffer 0.1 M, pH 7.4
  • EDC 0.78 mg of EDC and 1.11 mg of sulfo-NHS were added, followed by stirring for 30 minutes to react.
  • 20 mg of zwitterionic alginic acid derivative was dissolved in 3 mL of MES buffer (0.1 M, pH 7.4), mixed with Ce6 reaction solution and stirred for one day.
  • MWCO 10kDa dialysis
  • SCC7 a mouse squamous cell carcinoma cell line
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Media
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin/streptomycin at 37°C, 5% carbon dioxide and Cultured under standard humidity conditions.
  • SCC7 cells were placed in 5 ⁇ 10 4 cells for each well of LabTek II Chambered Coverglass, and cultured for 24 hours so that the cells adhered well.
  • the zwitterionic alginic acid derivative-photosensitive agent conjugate (Alg-lys@Ce6) and free photosensitive agent (free Ce6) were treated with cells at a concentration of 2.5 ⁇ M based on Ce6 for 5 hours.
  • the photosensitizer not ingested into the cells was removed by washing, and after adding a new cell culture solution, cell uptake was confirmed through confocal fluorescence microscopy ( ⁇ ex 633 nm, ⁇ em 650 nm long-pass filter). .
  • a cancer cell line not treated with a photosensitizer was used as a control.
  • the fluorescence intensity of Alg-lys@Ce6 is 25.5 times higher than that of the existing free Ce6 treatment, and this is a cancer cell of Alg-lys@Ce6 compared to free Ce6. It is a result showing that the intake in the stomach is 25 times higher.
  • SCC7 cancer cells were treated with free Ce6 as a control and zwitterionic alginic acid derivative-photosensitizer conjugate (Alg-lys@Ce6) according to the present invention in concentrations (1, 2.5 and 5 ⁇ M, respectively), followed by cancer conditions for 5 hours.
  • the cells were cultured in (dark condition), washed and replaced with fresh cell medium. Thereafter, light was irradiated to the cancer cells using a 670 nm laser (10 J/cm 2 ). After further incubation for 24 hours, cell viability was measured in each using CCK-8 assay analysis method. As a result, as shown in FIG.

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Abstract

본 발명은 양쪽이온성 알긴산(alginate) 유도체; 상기 유도체를 포함하는 조영제 조성물; 암 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물; 상기 유도체의 제조방법 및 상기 조영제 조성물 또는 약학 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 알긴산 유도체는 양쪽이온성을 가짐으로써 세포 배양액 또는 혈액 등에 존재하는 혈청 단백질과의 비특이적 상호작용을 회피하고, 목적으로 하는 기관 또는 조직 이외의 다른 기관 또는 조직에 대한 비특이적 섭취가 저해되어 혈액 내에서 안정적인 순환이 가능하면서도, 영상 조영제 또는 약물과 결합체를 형성하여 조영제 조성물 또는 약학적 조성물로 활용될 수 있다. 또한, 표적으로 하는 암세포에 대한 조영제와 약물의 전달 효율을 획기적으로 높일 수 있을 뿐 아니라, 영상 진단 및 치료 효과도 크게 향상 시킬 수 있다.

Description

양쪽이온성 알긴산 유도체 및 이를 포함하는 조영제 조성물
본 발명은 양쪽이온성 알긴산(alginate) 유도체; 상기 유도체를 포함하는 조영제 조성물; 암 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물; 상기 유도체의 제조방법 및 상기 조영제 조성물 또는 약학 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
질병을 치료하는 데 있어서 질병으로 인해 야기되는 생체 내의 형태학적, 기능적인 변화를 초기 단계에 탐지하는 것이 중요한데, 예컨대, 암을 치료할 때 종양의 부위와 크기를 탐지하는 것은 효과적인 치료 설계의 상당히 중요한 요인에 해당한다. 이렇게 질병으로 인한 생체 내 변화를 탐지하기 위한 목적으로 공지된 방법으로, 천공 등에 의한 생체검사, X선 영상, 자기공명영상(MRI), 초음파 영상 및 형광영상 등의 다양한 영상화 진단법이 존재한다.
이러한 영상화 진단법에는 적절한 영상 조영제가 사용되는데, 사용하는 영상법에 따라서 각 영상신호를 증폭 또는 감소시키는 특성을 갖는 아이오딘계 화합물, 금속 착물, 나노입자, 버블 또는 염료 등의 형태를 지닌 조영제를 사용한다. 일례로서, 형광영상 조영제는 특정 파장을 가지는 여기광에 노출시켜 형광을 방출하는 기능을 한다. 영상화 진단법 수행 시 개체는 체외로부터 여기광에 노출되며, 체내의 형광 조영제는 형광을 방출하여 이를 감지하는 원리로 질병의 증상, 경과 등을 진단할 수 있다.
그러나, 기존에 알려진 in vitro 및 in vivo 형광 영상 진단 시에 사용되는 조영제들은 세포 배양액 및 혈액 내에 존재하는 여러 종류의 혈장 단백질들과 비특이적으로 결합하면서 질병 병소에 조영제가 특이적으로 축적되는 것이 방해되거나, 정상 조직에 비특이적 축적이 일어남으로써 질병 부위의 정확한 영상 진단이 어렵게 되거나, 빠른 속도로 체외로 배출되어 단시간에 영상 진단을 해야 하는 기술적인 문제가 존재하였다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은 혈청 단백질과의 비특이적인 상호작용이 일어나지 않아 정확한 진단을 가능하게 하고 체내에 보다 오랜 시간 동안 안정적으로 체류할 수 있는 물질을 발굴하고자 예의 노력한 결과, 라이신(lysine) 또는 아르기닌(arginine)을 결합시킴으로써 양쪽이온성 특성을 갖는 알긴산 유도체를 사용할 경우, 목적하지 않는 기관 또는 조직에 조영제가 비특이적으로 섭취되는 것을 예방할 수 있으면서도, 일정 시간 후에도 높은 농도로 체내에 체류할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 양쪽이온성 알긴산(alginate) 유도체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 알긴산 유도체를 포함하는 조영제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 알긴산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 암 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 알긴산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 알긴산 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조영제 조성물 또는 약학 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 양쪽이온성 알긴산(alginate) 유도체를 제공하는 것으로, 상기 알긴산 유도체는 알긴산에 라이신 또는 아르기닌을 결합시킴으로써 양쪽이온성을 갖는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 상기 양쪽이온성 알긴산 유도체는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019017609-appb-I000001
상기 화학식 1에서 n은 1 내지 3000의 정수일 수 있으며, 상기 R은 라이신 또는 아르기닌의 결합체, 즉
Figure PCTKR2019017609-appb-I000002
,
Figure PCTKR2019017609-appb-I000003
또는
Figure PCTKR2019017609-appb-I000004
일 수 있다.
본 발명에서 용어 “알긴산”은 해조류에 포함된 다당류의 일종이자, β(1→4)-D-만유로닉산(mannuroinic acid)과 α(1→4)-L-글유로닉산(guluronic acid) 잔기로 구성된 선상의 우론산 중합체로서, 화학식은 (C6H8O)n이고, 분자량은 20,000 내지 240,000로 알려져 있다. 알긴산의 중합도 등 성질은 추출에 사용한 해조류의 종류, 출처, 해조류를 채집한 계절 등에 따라 달라질 수 있으며, 만유로닉산과 글유로닉산의 구성, 배열 및 함량에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에서 사용된 알긴산은 평균 분자량의 범위가 100,000 내지 1,000,000이며, 15 내지 600 mPa·s의 점도, 만유로닉산 : 글루로닉산의 함량 비율이 1.0 내지 2.0 사이의 값을 지니는 것이나, 본 발명의 알긴산 유도체의 합성에 사용될 수 있는 한 알긴산의 분자량, 점도, 만유로닉산과 글루로닉산의 배열 순서, 함량 비율 등은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 알긴산 유도체는 양쪽이온성을 나타내어, 조영제로 사용 시 세포 배양액 또는 혈액 등에 존재하는 혈청 단백질과의 비특이적 상호작용을 회피할 수 있는 것을 특징으로 하며, 이는 알긴산과 라이신(lysine) 또는 아르기닌(arginine)이 직접 결합됨으로써 나타나는 효과이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 알긴산 유도체는 EDC/sulfo-NHS coupling 반응을 이용하여 알긴산과 라이신 또는 아르기닌이 아마이드 결합을 형성하여 합성될 수 있으며, 상기 라이신 또는 아르기닌은 L-form(즉, L-lysine 또는 L-arginine)일 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 알긴산 유도체는 EDC 및 sulfo-NHS의 커플링 반응을 이용하여 알긴산 유도체와 L-라이신 또는 L-아르기닌을 반응하여 결합시킨 것으로, 결합 후에도 알긴산 유도체가 양쪽이온성을 유지하게 되어 세포 배양액 또는 혈액 등에 존재하는 혈청 단백질과 비특이적 상호작용 회피할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 인산완충액(PBS), 인도시아닌 그린(indocyanine gree, ICG), 형광염료가 결합된 음이온성 알긴산(Alg@ZWA) 및 형광염료가 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체 (Alg-lys@ZW38)를 준비하여 동일 용량으로 쥐의 꼬리정맥을 통하여 주사하였다. 그 결과, ICG를 주입한 경우 20분 이내에 주입한 ICG의 대부분이 간에 축적이 되어 있었으며, 24시간 이후에는 형광신호가 거의 검출되지 않는 것을 확인하였다. 형광염료가 결합된 알긴산(Alg@ZWA)의 경우에도 주입 후 20분 내에 많은 양이 소변으로 배출되고, 주입 1시간 이후에는 생체 내에서의 형광신호가 약해졌으며, 주입 3시간 이후부터는 간에서만 일부 형광신호가 관찰되었다. 반면, 형광염료가 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체(Alg-lys@ZW38)의 경우, 쥐의 몸 전체에 걸쳐서 24시간 동안 형광신호가 발생하는 것을 확인하였는바, 이는 본 발명의 양쪽이온성 알긴산 유도체에 조영제가 결합된 경우, 간에서의 비특이적 축적이 예방되고 나아가 혈액 내 체류 시간도 현저히 증가시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
본 발명의 알긴산 유도체는 알긴산과 라이신 또는 아르기닌이 직접 결합된 화합물뿐만 아니라, 혈액 내 체류 시간 향상과 비특이적 상호작용 억제 효과를 더욱 증진시키기 위하여 상기 알긴산 유도체에 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)이 추가로 결합된 것일 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 단위 화합물 내에 결합되는 PEG의 분자량, 결합 위치 및 개수는 목표로 하는 생체 내 체류 시간과 응용 분야에 따라서 당업계의 통상의 기술자가 각각 다르게 적용할 수 있다. 구체적으로, PEG는 상기 화학식 1로 표시되는 단위 화합물 내에 존재하는 라이신 또는 아르기닌 잔기의 말단 아민 그룹(-NH3 +)에 결합되거나 카르복실 그룹(-COO-)에 결합될 수 있다. 또한, PEG는 본 발명의 양쪽이온성 알긴산 유도체 한 분자 당 존재하는 전체 아민 그룹 또는 카르복실 그룹 숫자의 최대 50% 까지 결합될 수 있으며, 보다 구체적으로 양쪽이온성 알긴산 유도체 한 분자 당 존재하는 전체 아민 그룹 또는 카르복실 그룹 숫자의 1 내지 20%와 결합될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적인 예로, 본 발명의 알긴산 유도체는 하기 화학식 2로 표시되는 양쪽이온성 알긴산 유도체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2019017609-appb-I000005
상기 화학식 2에서 n은 1 내지 3000의 정수일 수 있으며, m은 6 내지 1,000의 정수일 수 있다.
본 발명의 양쪽이온성 알긴산 유도체는 화학식 1로 표시되는 알긴산 유도체에 메톡시 폴리에틸렌글리콜 석신이미딜 N-하이드록시석신이미드 에스터(methoxy polyethyleneglycol succinimidyl N-hydroxysuccinimide ester, mPEG5K-NHS) 또는 mPEG5K-SPA를 반응시켜 합성될 수 있으나, 이를 위해 PEG를 제공하여 상기 알긴산 유도체에 결합시킴으로써 혈액 내의 체류시간을 증가시키기 위한 목적으로 사용할 수 있는 물질이라면 이에 특별히 제한되지 않는다. 즉, 본 발명의 알긴산 유도체는 PEG를 결합시킴으로써 개체의 혈액 내 체류시간이 보다 더 증가되고 혈액 등에 존재하는 혈청 단백질과 비특이적 상호작용이 억제되는 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명에서 알긴산 유도체는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 이외에 상기 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜 얻어지는 유사한 화합물로서, 양쪽이온성을 나타내며 개체 내에서 보다 긴 시간 동안 체류할 수 있는 특징을 나타내는 한 이에 제한없이 포함될 수 있음은 당업자에게 자명하다.
또한, 본 발명의 알긴산 유도체는 상기 양쪽이온성 알긴산 유도체에 영상 조영제 또는 약물이 추가로 결합된 것일 수 있다. 상기 “영상 조영제”는 자기공명영상 조영제(MRI 조영제), CT(computed tomography) 조영제, 또는 형광염료일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “자기공명영상 조영제”는 체내에 주입되어 조직의 이완율을 변화시킴으로써 조직간 이완도의 차이를 벌리고, MRI 시그널의 변화를 유발하여 조직간의 대조를 보다 선명하게 하는 역할을 한다. 상기 자기공명영상 조영제로는 가돌리늄 조영제가 대표적이고, 구체적으로 이온화 가돌리늄(Gd)(Ⅲ) 착물과 중성 가돌리늄(Gd)(Ⅲ) 착물이 있으며, 보다 구체적으로 가돌리늄 착화합물, 망간 착화합물, 구리(Copper)(II) 착화합물, 산화철 나노입자 및 산화망간 나노입자일 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않는다.
상기 “CT 조영제”는 X선 촬영시 음영을 명확하게 하기 위해 사용하는 물질로, 요오드화 조영제 또는 바륨 조영제 등일 수 있으나 이에 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 요오드화 조영제는 X선을 통과시키지 않는 요오드를 함유하는 것으로, 질환 병변이 있는 조직과 정상 조직에 요오드가 분포되는 정도가 다르기 때문에 X선 촬영이나 X선을 사용한 CT 검사 등에서 X선 흡수 차이를 크게 나타나게 만들어서 조직이나 병변의 상태를 명확하게 대조시킬 수 있다. 상기 요오드화 조영제는 이옥시탈라민산(ioxitalamic acid), 이오헥솔(iohexol), 이오파미돌(iopamidol), 이오버솔(ioversol), 이오프로미드(iopromid), 이오메프롤(iomeprol), 이오비트리돌(iobitridol) 또는 이오딕산올(iodixanol)일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 바륨은 물에 녹지 않는 흰색 가루로, 바륨 조영제는 X선을 통과시키지 않는다. 특수한 X선 검사나 CT 촬영, 소화관 조영시 바륨 조영제를 마시고 촬영을 하면 소화관 윤곽이 명확히 드러날 수 있다. 구체적으로, 상기 바륨 조영제는 황산바륨(barium sulfate)일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서 상기 “형광염료”는 플루오레세인 (Fluorescein), CR110 : 카복시로다민 110 : 로다민 그린(상표명), TAMRA : 카복시테트라메틸로다민 : TMR, 카복시로다민 6G : CR6G, BODIPY FL(상표명) : 4, 4-디플루오로-5, 7-디메틸-4-보라-3a, 4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 493/503(상표명) : 4, 4-디플루오로-1, 3, 5, 7-테트라메틸-4-보라-3a, 4a-디아자-s-인다센-8-프로피온산, BODIPYR6G(상표명) : 4, 4-디플루오로-5-(4-페닐-1,3-부타디에닐)-4-보라-3a, 4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 558/568(상표명) : 4, 4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a, 4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 564/570(상표명) : 4, 4-디플루오로-5-스티릴-4-보라-3a, 4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 576/589(상표명) : 4, 4-디플루오로-5-(2-피롤릴)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, BODIPY 581/591(상표명) : 4, 4-디플루오로-5-(4-페닐-1, 3-부타디에닐)-4-보라-3a, 4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산, EvoBlue10(상표명), EvoBlue30(상표명), MR121, ATTO 655(상표명), ATTO 680(상표명), ATTO 700(상표명), ATTO MB2(상표명), Alexa Fluor 350(상표명), Alexa Fluor 405(상표명), Alexa Fluor 430(상표명), Alexa Fluor 488(상표명), Alexa Fluor 532(상표명), Alexa Fluor 546(상표명), Alexa Fluor 555(상표명), Alexa Fluor 568(상표명), Alexa Fluor 594(상표명), Alexa Fluor 633(상표명), Alexa Fluor 680(상표명), Alexa Fluor 700(상표명), Alexa Fluor 750(상표명), Alexa Fluor 790(상표명), Flamma 496(상표명), Flamma 507(상표명), Flamma 530(상표명), Flamma 552(상표명), Flamma 560(상표명), Flamma 575(상표명), Flamma 581(상표명), Flamma 648(상표명), Flamma 675(상표명), Flamma 749(상표명), Flamma 774(상표명), Flamma 775(상표명), Rhodamine Red-X(상표명), Texas Red-X(상표명), 5(6)-TAMRA-X(상표명), 5TAMRA(상표명), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 (Cy5, Cy5.5, Cy7, IR820), 인도시아닌 그린(Indocyaninegreen, ICG) 또는 ZW800(ZW800 NHS ester) 등 일 수 있으며, 이에 특별히 제한되지 않는다.
상기 화학식 1로 표시되는 단위 화합물에 결합되는 조영제의 결합 위치 및 개수는 응용 분야에 따라서 당업계의 통상의 기술자가 각각 다르게 적용할 수 있다. 구체적으로, 상기 조영제(형광염료)는 상기 화학식 1로 표시되는 단위 화합물 내에 존재하는 라이신 또는 아르기닌 잔기의 말단 아민 그룹(-NH3 +)에 결합되거나 카르복실 그룹(-COO-)에 결합될 수 있다. 또한, 상기 조영제는 본 발명의 본 발명의 양쪽이온성 알긴산 유도체 한 분자 당 존재하는 전체 아민 그룹 또는 카르복실 그룹 숫자의 최대 50% 까지 결합될 수 있으며, 보다 구체적으로 양쪽이온성 알긴산 유도체 한 분자 당 존재하는 전체 아민 그룹 또는 카르복실 그룹 숫자의 1 내지 20%와 결합될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적인 예로, 본 발명의 알긴산 유도체는 상기 화학식 1로 표시되는 알긴산 유도체에 형광염료인 ZW800 NHS ester를 반응하여 결합된 형태로, 하기 화학식 3으로 표시되는 것일 수 있으나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2019017609-appb-I000006
상기 화학식 3에서 n은 1 내지 3000의 정수일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 약물은 대상 질환에 적절한 약물을 선택할 수 있으며, 예를 들어 상기 약물은 항암제, 항염증제, 마취제, 항바이러스제, 항박테리아제, 치료용 항체, 항생제, 면역치료제 또는 광감각제(광감작제)일 수 있으며, 보다 구체적으로 항암제 또는 항염증제일 수 있으나 이에 특별히 제한되지 않는다.
상기 “항암제”는 독소루비신, 고시폴, 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “항염증제”는 살리실레이트(salicylates), 이부프로펜 (ibuprofen), 나프로센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indometha cin), 페닐타존(phenyltazone), 메소트렉세이트(methotrexate), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손 (dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone) 및 코르티코스테로이드(corticoste roid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 “광감각제”는 빛에 민감한 반응을 보이는 물질을 인체 내에 투여하는 의약품으로, 주로 암 치료나 피부 질환, 관절염을 목적으로 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 광감각제는 헤마토 포르피린 유도체(Hemato Porphyrin Derivative), 아미노 레뷰리닉산(ALA) 또는 클로린(Chlorin)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학식 1로 표시되는 단위 화합물에 결합되는 약물의 결합 위치 및 개수는 응용 분야에 따라서 당업계의 통상의 기술자가 각각 다르게 적용할 수 있다. 구체적으로, 상기 약물(광감각제)는 상기 화학식 1로 표시되는 단위 화합물 내에 존재하는 라이신 또는 아르기닌 잔기의 말단 아민 그룹(-NH3 +) 또는 카르복실 그룹(-COO-)에 결합할 수 있으며, 알긴산 유도체에 대해 1 내지 20 w/w % 비율로 결합할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적인 예로, 본 발명의 알긴산 유도체는 하기 화학식 4로 표시될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
[화학식 4]
Figure PCTKR2019017609-appb-I000007
상기 화학식 4에서 n은 1 내지 3000의 정수일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 알긴산 유도체를 포함하는 조영제 조성물을 제공하는 것이다. 상기 알긴산 유도체는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 “조영제 조성물”은 영상진단 검사 또는 시술 시 특정 조직이나 혈관이 잘 보일 수 있도록 인체에 투여하는 물질을 의미하는 것으로, 성분에 따라 요오드화 조영제, 가돌리늄 조영제, 바륨 조영제 등으로 구분되며, 일반적으로 X선 촬영 및 CT 촬영에는 요오드화 조영제와 바륨 조영제가 사용되고, MRI(magnetic resonance imaging, 자기공명검사)에는 가돌리늄 조영제가 사용된다. 본 발명에 있어서, 상기 조영제 조성물은 상기 알긴산 유도체에 영상 조영제가 추가로 결합된 화합물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 알긴산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 암 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 알긴산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다. 상기 알긴산 유도체는 전술한 바와 같다.
즉, 상기 약학 조성물은 본 발명의 알긴산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염를 약제학적으로 유효한 양만큼 포함할 수 있으며, 상기 알긴산 유도체는 상기 영상 조영제 및/또는 약물이 결합된 형태를 의미하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 약학적 조성물은 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중피종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 또는 피부암 등의 암; 녹내장, 백내장, 노인성 황반병성 등의 안과질환; 동맥경화, 뇌경색, 혈관 재협착 등의 혈관질환; 관절염; 자가면역질환; 충치, 치주농양, 치조골염, 만성 치주염, 치은염 등의 치과질환; 또는 당뇨병의 예방 또는 치료용일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 “약학적으로 허용 가능한 염”은 투여되는 본 발명의 알긴산 유도체가 갖는 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 제형을 의미한다. 구체적으로, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염을 포함한다. 보다 구체적으로, 약학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르기닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯하여, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다. 본 발명의 용어 “약학적으로 허용 가능한 담체”란, 생물체를 자극하지 않으면서 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 이때, 상기 담체는 비자연적인 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 생리식염수, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘 카보네이트, 프로필렌글리콜 및 리퀴드 파라핀으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다. 상기 성분들은 상기 약학 조성물의 유효성분인, 약물에 결합된 알긴산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 독립적으로, 또는 조합하여 추가될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화 된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
또한, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 알긴산 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다. 상기 알긴산 유도체는 전술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 제조방법은 (a) 알긴산에 EDC 및 sulfo-NHS를 처리하는 단계; 및 (b) EDC 및 sulfo-NHS가 처리된 알긴산을 라이신(lysine) 또는 아르기닌(alginine)과 반응시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 “EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)”는 일반적으로 하이드로클로라이드(hydrochloride)로 얻어지는 수용성 카르보디이미드(carbodiimide)로서, 펩타이드 합성, 핵산에 대한 단백질 가교결합 등에 사용될 수 있으며, 대형 생체 분자의 고정화를 위해 N-하이드록시석신이미드(NHS, N-hydroxysuccinimide)와 함께 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 NHS는 “sulfo-NHS(N-hydroxysulfoxuccinimide)”일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 EDC 및 sulfo-NHS의 커플링 반응을 이용하여 알긴산 유도체와 L-라이신을 반응하여 결합시켰고, 이를 통해 결합 후에도 알긴산 유도체가 양쪽이온성을 유지하게 되어 세포 배양액 또는 혈액 등에 존재하는 혈청 단백질과 비특이적 상호작용 회피할 수 있다.
또한, 상기 알긴산 유도체의 제조방법은 상기 (b) 단계 이후에 (c) 라이신 또는 아르기닌이 결합된 알긴산 유도체와 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 반응시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 또는 알긴산에 폴리에틸렌글리콜 먼저 결합시키고 상기 (b) 단계를 거쳐 양쪽이온성 알긴산 유도체를 제조 하는 것일 수 있다.
상기 (c) 라이신 또는 아르기닌이 결합된 알긴산 유도체와 폴리에틸렌글리콜을 반응시키는 단계는 상기 알긴산 유도체에 메톡시 폴리에틸렌글리콜 석신이미딜 N-하이드록시석신이미드 에스터(methoxy polyethyleneglycol succinimidyl N-hydroxysuccinimide ester, mPEG5K-NHS) 또는 mPEG5K-SPA를 반응시키는 것일 수 있으나, 이외에도 PEG를 제공하여 상기 알긴산 유도체에 결합시킴으로써 혈액 내의 체류시간을 증가시키기 위한 목적으로 사용할 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다. 즉, 상기 제조방법에 의해 제조된 알긴산 유도체는 PEG가 결합된 것으로서 개체의 혈액 내 체류시간이 보다 더 증가되는 것을 특징으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 알긴산 유도체를 포함하는 조영제 조성물 또는 약학 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다. 상기 알긴산 유도체, 조영제 및 약학 조성물은 전술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 조영제 조성물 또는 약학 조성물의 제조방법은 상기 알긴산 유도체의 제조방법에 따라 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체와, 영상 조영제 또는 약물을 반응시키는 단계를 포함할 수 있으며, 이를 통해 제조된 알긴산 유도체는 영상 조영제 또는 광감각제를 비롯한 약물이 결합된 화합물 형태로, 상기 영상 조영제 및 약물은 전술한 바와 같다.
본 발명의 알긴산 유도체는 양쪽이온성을 가짐으로써 세포 배양액 또는 혈액 등에 존재하는 혈청 단백질과의 비특이적 상호작용을 회피하고, 목적으로 하는 기관 또는 조직 이외의 다른 기관 또는 조직에 대한 비특이적 섭취가 저해되어 혈액 내에서 안정적인 순환이 가능하면서도, 영상 조영제 또는 약물과 결합체를 형성하여 조영제 조성물 또는 약학적 조성물로 활용될 수 있다. 또한, 표적으로 하는 암세포에 대한 조영제와 약물의 전달 효율을 획기적으로 높일 수 있을 뿐 아니라, 영상 진단 및 치료 효과도 크게 향상 시킬 수 있다.
도 1은 알긴산으로부터 양쪽이온성 알긴산 유도체를 제조하는 과정 및 양쪽이온성 알긴산 유도체에 조영제 또는 약물을 결합하는 과정을 보여주는 모식도이다.
도 2a는 알긴산과 라이신(lysine)을 결합시켜 양쪽이온성 알긴산 유도체를 합성하는 개략도이다.
도 2b는 알긴산과 아르기닌(arginine)을 결합시켜 양쪽이온성 알긴산 유도체를 합성하는 개략도이다.
도 3의 A는 라이신을 결합하여 합성한 양쪽이온성 알긴산 유도체(Alg-lys)의 1H-NMR 측정 결과이며, 도 3의 B는 라이신을 결합하여 합성한 양쪽이온성 알긴산 유도체의 FT-IR 측정 결과이다.
도 4의 A는 아르기닌을 결합하여 합성한 양쪽이온성 알긴산 유도체(Alg-arg)의 1H-NMR 측정 결과이며, 도 4의 B는 아르기닌을 결합하여 합성한 양쪽이온성 알긴산 유도체의 FT-IR 측정 결과이다.
도 5는 라이신이 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체에 ZW-800 NHS ester 염료를 결합시키는 합성 개략도이다.
도 6a는 ZW-800 형광염료, Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11, Alg-lys@ZW38의 UV-vis 흡광 스펙트럼이고, 도 6b는 ZW-800 형광염료, Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11, Alg-lys@ZW38의 형광 스펙트럼이며, 도 6c는 Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11 및 Alg-lys@ZW38에 대한 형광 소광 비율을 분석한 표이다.
도 7a은 ZW-800 NHS ester 형광물질의 농도별 흡광도 검정곡선이며, 도 7b는 ZW-800 NHS ester 형광물질의 농도별 형광 스펙트럼이다.
도 8은 Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11 및 Alg-lys@ZW38를 인산완충액(PBS)에 용해시킨 후 촬영한 사진이다.
도 9은 인산완충액(PBS), ICG, Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11, Alg-lys@ZW38이 담긴 튜브를 촬영한 근적외선 형광 영상(λex=780 nm, λem=845 nm)이다.
도 10은 알긴산에 ZW-800 amine dye를 결합시킨 Alg@ZWA의 합성 개략도이다.
도 11a는 ZW-800 amine 형광물질과 Alg-lys@ZWA의 수용액을 동일한 형광염료 농도(2.1μM)로 준비하고 측정한 UV-vis 흡광 스펙트럼이며, 도 11b는 ZW-800 amine 형광물질과 Alg-lys@ZWA의 수용액을 동일한 형광염료 농도(2.1μM)로 준비하고 측정한 형광 스펙트럼이다.
도 12a는 인산완충액, ICG, Alg-lys@ZW38, Alg@ZWA를 쥐의 꼬리 정맥을 통하여 주입하고, 등 쪽 방향에서 촬영한 시간별 형광영상 사진이며, 도 12b는 쥐의 심장 부근에서의(Region of interest, ROI) 시간에 따른 형광세기 값의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13는 인산완충액, ICG, Alg-lys@ZW38, Alg@ZWA를 쥐의 꼬리 정맥을 통하여 주입하고, 배 쪽 방향에서 촬영한 시간별 형광영상 사진이다.
도 14a는 KIMICA사의 알긴산에 대한 1H-NMR 분석 결과이며, 도 14b는 KIMICA사의 알긴산에 라이신을 결합시켜 합성한 양쪽이온성 알긴산 유도체에 대한 1H-NMR 분석 결과이다.
도 15a는 ZW-800 형광물질이 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체(Alg(KIMICA)-lys@ZW-800)와 ZW-800 NHS ester 형광물질(2.9 μM)에 대한 UV-vis 흡광 스펙트럼이며, 도 15b는 ZW-800 형광물질이 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체(Alg(KIMICA)-lys@ZW-800)와 ZW-800 NHS ester 형광물질(2.9 μM)에 대한 형광 스펙트럼이다.
도 16은 양쪽이온성 알긴산 유도체에 폴리에틸렌글리콜을 결합시켜서 Alg-lys-mPEG5K를 합성하는 과정을 보여주는 개략도이다.
도 17a는 합성된 Alg-lys-mPEG5K의 1H-NMR 분석 결과이며, 도 17b는 합성된 알긴산, 양쪽이온성 알긴산 및 mPEG5K가 결합된 양쪽이온성 알긴산(Alg-lys-mPEG5K)의 FT-IR 분석 결과이다.
도 18a는 Alg-lys-mPEG5K에 ZW-800를 결합시킨 Alg-lys-mPEG5K@ZW-800과 ZW-800 NHS ester 형광물질에 대한(3.9 μM) UV-vis 흡광 스펙트럼이며, 도 18b는 Alg-lys-mPEG5K에 ZW-800를 결합시킨 Alg-lys-mPEG5K@ZW-800과 ZW-800 NHS ester 형광물질에 대한 (3.9 μM) 형광 스펙트럼이다.
도 19는 양쪽이온성 알긴산 유도체와 광감각제인 chloroin e6를 결합시킨 Alg-lys@Ce6의 합성과정에 대한 개략도이다.
도 20a는 인산완충액(PBS)에 용해된 광감각제 (Ce6) 및 Alg-lys@Ce6의 UV-vis 흡광 스펙트럼이며, 도 20b는 인산완충액(PBS)에 용해된 광감각제 (Ce6) 및 Alg-lys@Ce6의 형광 스펙트럼이다. 도 20c는 일항산소 분석 키트를 이용하여 빛을 조사한 경우 Alg-lys@Ce6로부터 일항산소 생성을 분석한 결과이다.
도 21은 암세포에 광감각제(Ce6)와 Alg-lys@Ce6를 동일 농도로 처리한 후에 얻은 공초점 형광 현미경 사진이다. Ce6를 처리한 경우에 비해 Alg-lys@Ce6를 처리한 경우 암세포 내로 섭취 및 전달되는 양이 크게 향상됨을 알 수 있다.
도 22는 암세포에 광감작제(Ce6)와 Alg-lys@Ce6를 처리하고, 670 nm 파장의 빛을 조사한 후, 세포 생존율을 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 라이신(Lysine)이 결합된 양쪽이온성(zwitterionic) 알긴산 유도체의 제조 및 분석
1-1: 라이신이 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체 제조
양쪽이온성 알긴산 유도체를 합성하기 위해, 알긴산의 카르복시기에 커플링제를 이용해 라이신의 아민기와의 결합을 통해 공유 결합체를 형성함으로써 양쪽이온성 알긴산 유도체를 제조하였다. 유도체 제조에 사용된 알긴산은 씨그마알드리치사의 알긴산 나트륨염(cas no. 9005-38-3, average molecular weight = 190,000) 제품을 사용하였다(도 2a).
구체적으로, 알긴산에 라이신을 결합시키기 위하여 다양한 커플링제를 사용할 수 있는데, 본 발명에서는 1-ehtyl-3-(3-dimethylaminorpropyl)carbodiimide (EDC)와 sulfo-N-hydroxysuccinimide(sulfo-NHS)을 사용하여 알긴산의 카르복시기를 활성화하여 알긴산-NHS ester를 얻고 여기에 라이신을 결합하는 과정을 수행하였다. 알긴산 50 mg을 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid buffer (MES, 0.1 M, pH 5.7) 10 mL에 용해시킨 후, 알긴산 반응 몰수의 1.2배 몰수에 해당하는 EDC와 1.3배 몰수에 해당하는 sulfo-NHS을 첨가하여 상온에서 약 30분 동안 교반하였다. 이후 상기 용액에서 반응하지 않은 EDC를 비활성화 시키고자 2-mercaptoethanol(14.3 M)을 7μL(최종농도 20 mM)을 주사한 후 상온에서 20분간 교반하였다. 상기 용액에 대해 PD-10 컬럼을 이용하여 용액 내의 미반응물 및 불순물을 제거하고, 인산완충액 (PBS, 0.1 M, pH 7.4)으로 용매 교환을 실시하였다. 이후 알긴산의 5배 몰수에 해당하는 라이신을 첨가하고 상온에서 하루 동안 교반하였다. 반응을 마친 상기 용액에 대하여 증류수에서 하루 동안 투석(dialysis)을 진행하여 합성물 내의 미반응물 및 부산물을 제거하고, 동결건조를 통해 분말 형태의 라이신 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체를 수득하였다.
1-2: 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체의 구조 분석
상기 실시예 1-1에서 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체(lysine conjugated alginic acid)에 대하여, 1H 핵자기공명 분광광도계(1H-NMR, 400 MHz NMR Spectrometer, Jeol JNM-LA400 with LFG, JEOL, Japan)와 적외선분광광도계(FT-IR, FT-IR Spectrophotometer, Nicolet 6700, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 구조를 분석하였다(도 3).
구체적으로, 알긴산(alginate)과 양쪽이온성 알긴산 유도체의 1H-NMR 스펙트럼을 비교하였을 때 양쪽이온성 알긴산 유도체의 1H-NMR 스펙트럼 중 2.8 ppm 부근에서 보이는 lysine 수소 피크의 알긴산 대비 비율 계산을 통하여, 알긴산의 카르복시기의 약 100%가 라이신과 결합되어 있는 것으로 확인되었다(도 3의 A). 한편, 알긴산과 양쪽이온성 알긴산 유도체의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 그래프로부터, 알긴산의 경우 알긴산의 수산기 및 카르복시기의 -OH 스트레칭에 따른 특징적인 봉우리가 3300 cm-1 및 1619 cm-1 에서 나타났으며, 양쪽이온성 알긴산 유도체의 경우 알긴산의 -COO-의 대칭 및 비대칭 스트레칭에 의하여 나타나던 1600 cm-1과 1409 cm-1과 부근의 피크가 사라지고, 1645 cm-1의 amide I 및 1550 cm-1의 amide II 와 같이 -CONH-에 의한 피크가 나타난 것을 확인하였다(도 3의 B). 이로부터, 알긴산의 카르복시기와 라이신의 아민기가 아마이드 결합을 형성하며 알긴산과 라이신 사이에 공유 결합이 형성된 것을 확인하였다.
실시예 2: 아르기닌(Arginine)이 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체의 제조 및 분석
2-1: 아르기닌이 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체 제조
아르기닌이 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체를 합성하기 위해, 알긴산의 카르복시기에 커플링제를 이용해 아르기닌의 아민기와의 결합을 통해 공유 결합체를 형성함으로써 양쪽이온성 알긴산 유도체를 제조하였다(도 2b).
구체적으로, 상기 실시예 1-1과 같이 EDC/sulfo-NHS 커필링제를 사용해 알긴산을 활성화시켜 알긴산-NHS ester 결합물을 얻고 여기에 아르기닌을 결합하는 과정을 수행하였다. 알긴산 50 mg을 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid buffer(MES, 0.1 M, pH 5.7) 10 mL에 용해시킨 후, 알긴산 반응 몰수의 1.2배 몰수에 해당하는 EDC와 1.3배 몰수에 해당하는 sulfo-NHS을 첨가하여 상온에서 약 30분 동안 교반하였다. 이후 상기 용액에서 반응하지 않은 EDC를 비활성화 시키고자 2-mercaptoethanol(14.3 M)을 7μL(최종농도 20 mM)을 주사한 후 상온에서 20분간 교반하였다. 상기 용액에 대해 PD-10 컬럼을 이용하여 용액 내의 미반응물 및 불순물을 제거하고, Sodium bicarbonate (NaHCO3, 50 mM, pH 9.0)으로 용매 교환을 실시하였다. 이후 알긴산의 5배 몰수에 해당하는 아르기닌을 첨가하여 상온에서 하루 동안 교반하였다. 반응을 마친 상기 용액에 대하여 증류수에서 하루 동안 투석(dialysis)을 진행하여 합성물 내의 미반응물 및 부산물을 제거하고, 동결건조를 통해 분말 형태의 아르기닌이 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체를 수득하였다.
2-2: 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체의 구조 분석
상기 실시예 2-1에서 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체(arginine-conjugated alginic acid)에 대하여, 1H 핵자기공명 분광광도계(1H-NMR, 400 MHz NMR Spectrometer, Jeol JNM-LA400 with LFG, JEOL, Japan)와 적외선분광광도계(FT-IR, FT-IR Spectrophotometer, Nicolet 6700, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 구조를 분석하였다(도 4).
구체적으로, 알긴산(alginate)과 양쪽이온성 알긴산 유도체의 1H-NMR 스펙트럼을 비교하였을 때 양쪽이온성 알긴산 유도체의 1H-NMR 스펙트럼 중 1.6 ppm과 1.8 ppm 부근에서 보이는 아르기닌의 수소 피크 대비 알긴산 피크의 비율 계산을 통하여, 알긴산의 카르복시기의 약 100%가 아르기닌이 결합되어 있는 것으로 확인되었다(도 4의 A). 한편, 알긴산과 양쪽이온성 알긴산 유도체의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 그래프로부터, 알긴산의 경우 알긴산의 수산기 및 카르복시기의 -OH 스트레칭에 따른 특징적인 봉우리가 3300 cm-1 및 1619 cm-1 에서 나타났으며, 양쪽이온성 알긴산 유도체의 경우 1580 cm-1과 1400 cm-1에서 아르기닌 -COO-의 대칭 및 비대칭 스트레칭에 의한 피크가 나타났으며, 1690 cm-1의 -CONH-에 의한 피크가 나타난 것을 확인하였다(도 4의 B). 이로부터, 알긴산의 카르복시기와 아르기닌의 아민기가 amide 결합을 형성하며 알긴산과 아르기닌 사이에 공유 결합이 형성된 것을 확인하였다.
실시예 3: 양쪽이온성 알긴산 유도체에 근적외선 형광염료인 ZW-800을 결합한 형광영상 조영제 제조 및 분석
3-1: 양쪽이온성 알긴산 유도체에 ZW-800을 결합한 형광영상 조영제의 제조
근적외선 형광염료인 ZW-800의 NHS ester와 양쪽이온성의 아민기와의 공유결합체를 제조하였다(도 5). ZW-800 NHS ester는 몰질량 1001.28 g/mol, 최대 여기 파장 754 nm, 최대 방출 파장 775 nm를 갖는 근적외선 형광물질이다.
구체적으로, 양쪽이온성 알긴산 유도체에 ZW-800 NHS ester 근적외선 형광물질을 결합하기 위하여, 실시예 1에서 합성한 양쪽이온성 알긴산 유도체 대비 근적외선 형광염료 ZW-800 NHS ester의 반응 몰 비율을 1:10, 1:50, 1:100로 하여 각각 합성을 진행하였다. 먼저 15 mg의 알긴산 유도체를 3 mL의 Sodium bicarbonate (NaHCO3, 50 mM, pH 8.5)에 용해하여 5 mg/mL의 농도로 균질하게 혼합하고, 상기 반응 비율과 같이 0.86, 3.87, 8.65 mg의 ZW-800 NHS ester 형광염료를 각각 첨가하고 하루 동안 교반하여 반응하였다. 반응을 마친 용액을 투석막 튜브(MWCO 10kDa)에 넣고, 2일 동안 PBS(0.1 M, pH 7.4)와 증류수에서 투석함으로써 미반응물을 제거하였다. 이후, 동결 건조를 통하여 분말 형태의 ZW-800이 공유 결합된 형광염료-양쪽이온성 알긴산 유도체(Alg-lys@ZW)를 수득하였다.
3-2: 형광 영상 조영제의 분광학적 특성 분석
광학측정 분석을 통해, 양쪽이온성 알긴산 유도체체 대비 ZW-800 형광염료의 반응몰수의 비율이 1:10인 경우, 알긴산 유도체 한 분자당 약 4개의 ZW-800 형광염료가 결합되었으며, 반응몰수의 비율이 1:50의 경우 알긴산 유도체 한 분자 당 약 11개의 ZW-800 형광염료가 결합되었고, 반응몰수의 비율이 1:100의 경우 알긴산 유도체 한 분자 당 약 38개의 ZW-800 형광염료가 결합되었음을 확인하였다(도 6c).
이러한 결과를 바탕으로, 알긴산 유도체 대비 ZW-800 형광염료의 반응몰수 비율이 1:10, 1:50, 1:100인 형광염료-알긴산 유도체를 각각 실제 반응한 ZW-800 형광염료의 몰수로 나타낸 Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11, Alg-lys@ZW38의 UV-vis 흡광 스펙트럽을 측정하였다(도 6a). 또한, 각각의 형광염료-알긴산 유도체의 형광 스펙트럼(λex = 660 nm)으로부터 모든 결합체에서 강한 형광이 발생하였으며 형광소광(fluorescence quenching)은 거의 일어나지 않음을 확인하였다(도 6b 및 6c).
0.1M PBS 수용액 상에서 ZW-800 형광염료의 농도에 따른 흡광 교정 곡선 및 형광염료의 농도별 스펙트럼을 확인하였으며(도 7a 및 7b), 인산완충액(PBS)에 Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11, Alg-lys@ZW38을 각각 용해시킨 경우 합성된 모든 결합체가 수용액에 잘 분산되어 있음을 확인하였다(도 8).
또한, 인산완충액, ICG 및 제조된 각각의 형광염료-양쪽이온성 알긴산 유도체 Alg-lys@ZW4, Alg-lys@ZW11, Alg-lys@ZW38를 1.5 mL 튜브에 1 mL씩 담은 후, 근적외선 형광 영상 장비로 촬영한 결과, ICG는 수용액 상에서 서로 응집이 일어나면서 형광이 약하게 발생하였고, 양쪽이온성 알긴산 유도체에 형광염료를 결합시킨 경우 결합체가 수용액상에서 골고루 잘 녹아있고 강한 형광을 발생시킴을 확인하였다(도 9).
실시예 4: 알긴산에 ZW-800 amine 염료를 결합시킨 형광영상 조영물 제조, 분석 및 동물실험 결과
4-1: 알긴산에 ZW-800 amine 염료를 결합시킨 형광영상 조영물 제조
양쪽이온성 알긴산 유도체에 형광염료를 결합시킨 결합체의 대조군으로, 알긴산에 ZW-800염료를 결합시킨 Alg@ZWA를 제조하였다(도 10). 구체적으로, 알긴산의 카르복시기를 EDC/sulfo-NHS 커플링제와 반응시키고, 이를 ZW-800 amine과 반응시킴으로써 ZW-800과 알긴산의 결합체인 Alg@ZWA를 제조하였다. 상기 ZW-800 amine(분자량 887 g/mol)는 최대 여기 파장 753nm, 최대 방출 파장 772nm를 갖는 근적외선 형광물질이며, 알긴산은 씨그마알드리치사 분자량 190,000 Da의 제품(cas no. 9005-38-3)을 사용하였다.
먼저, 20 mg의 알긴산을 0.1 M 농도의 MES buffer에 녹인 뒤 10.37 mg의 EDC와 3.68 mg의 sulfo-NHS을 첨가하여 상온에서 30분 동안 교반하였다. 반응이 끝난 후 PD-10 컬럼을 이용하여 미반응물을 분리하고, 4.9 mg의 ZW-800 amine 형광물질을 첨가하여 하루 동안 교반하여 반응하였다. 반응을 마친 용액에 대하여 증류수에서 2일 동안 투석(dialysis, MWCO 10kDa)을 진행하여 합성물 내의 미반응물 및 부산물을 제거하였다. 이후 동결건조 실시하여 분말 형태의 ZW-800이 공유 결합된 형광염료-알긴산 결합체(Alg@ZWA)를 수득하였다.
4-2: 형광염료-알긴산 결합체(Alg@ZWA)의 분광학적 특성 분석
광학 측정 분석을 통하여 알긴산 한 분자 당 실제 반응한 ZW-800 amine 몰수를 측정하였다. 그 결과, Alg@ZWA 결합체의 UV-vis 흡광 측정을 통해 알긴산 한 분자 당 약 1.2개의 ZW-800 amine이 반응하여 결합되어 있음을 확인하였다(도 11a). 또한, 알긴산에 ZW-800이 공유 결합된 Alg@ZWA 결합체의 형광 평가(λex = 660 nm, λfl = 774 nm)를 수행한 결과, 합성된 Alg@ZWA 내의 형광염료는 형광소광(quenching)없이 형광 발생이 잘 되는 것을 확인하였다(도 11b).
4-3: 양쪽이온성 알긴산 유도체-형광염료 결합체와 알긴산-형광염료 결합체(Alg@ZWA)의 동물 시험 성능 평가
양쪽이온성 알긴산 유도체에 ZW-800 NHS ester 형광염료를 공유결합 시킨 Alg-lys@ZW38와 알긴산에 ZW-800 amine 형광염료를 결합시킨 Alg@ZWA의 생체 내 거동을 동물실험을 통하여 분석하였다. 구체적으로, ICG, Alg-lys@ZW38, Alg@ZWA에 대하여 10 nmol dye/100 μL의 농도로 녹이고, 이를 누드마우스의 꼬리 정맥을 통하여 투여한 뒤 20 분, 1 시간, 3 시간, 6 시간, 24 시간째에 IVIS 영상장비를 사용하여 근적외선 형광 영상을 촬영하였다(λex=780 nm, λem=845 nm).
그 결과, ICG는 정맥 투여 후 빠른 속도가 혈액에서 제거가 되면서 간을 제외한 다른 곳에서의 형광 신호가 급격히 감소하였다. Alg@ZWA는 한 시간까지는 형광신호가 몸 전체에 걸쳐서 나타났으나 그 이후에는 몸에서의 형광신호가 매우 낮아진 것으로 나타났는데, 이것은 혈액에 순환중인 결합체가 거의 없다는 것을 나타내는 결과이다. 반면, 양쪽이온성 알긴산 유도체에 형광염료를 공유결합 시킨 Alg-lys@ZW38 결합체의 경우, 24시간 까지 몸 전체에 걸쳐서 형광신호가 발생함을 관찰 할 수 있었다. 이는 본 발명의 양쪽이온성 알긴산 유도체를 이용한 결합체가 단백질과의 비특이적 상호작용을 회피할 수 있고, 목적으로 하는 기관 또는 조직 외에 간 등에 대한 비특이적 섭취가 저해되어 혈액 내에서 안정적인 순환이 가능하며, 혈액 내 체류 시간이 획기적으로 향상됨을 나타내는 결과이다(도 12a).
또한, 마우스의 등쪽의 심장 부근에서의 형광 ROI 값을 수치화하여 그래프로 나타낸 경우, 각 형광물질들의 체내 주입 20분 후 Alg-lys@ZW38 결합체는 ICG의 ROI 값 대비 약 3.8배 높은 형광 수치를 나타낸 반면, Alg@ZWA 결합체의 ROI 값은 ICG 형광 값과 거의 유사한 형광 수치(ICG 의 형광 수율의 0.998배)임을 확인하였다. 특히, 24시간째의 ICG, Alg-lys@ZW38, Alg@ZWA의 형광 ROI 값을 비교하였을 때 Alg-lys@ZW38 결합체의 경우에 월등한 형광 세기뿐만 아니라 장시간 동안 체내 전 영역에서 순환되는 것을 확인하였다(도 12b).
나아가, 각 형광물질들의 체내 주입 후 생체 내 거동을 더욱 명확히 확인하고자 마우스의 배 쪽을 촬영한 형광 영상을 비교하였다(도 13). 그 결과, ICG의 경우 투여 20분 째에 투여한 ICG가 대부분 간에 섭취되어 있었으며, 그 이후에는 소장으로 배출되어 사라지는 양상을 나타내었다. Alg@ZWA의 경우 투여 1시간까지 체내 전 영역에 순환하며 점차 소변으로 배출되었고, 투여 3시간째에는 Alg@ZWA 결합체 대부분이 사라지고 일부 적은 양의 형광물질이 간에서 잔존하는 형광 신호를 보이며, 24시간까지 간 조직 부근에서만 형광 신호가 지속되었다. 반면, Alg-lys@ZW38 결합체는 체내 주입 24시간 후까지 혈류를 통해 체내에 순환되며, 체내의 전 영역에 걸쳐 형광 신호가 관찰되었다. 즉, 체내에 주입된 Alg-lys@ZW38은 간 조직에 대한 비특이적 섭취가 억제되고 주입 후 24시간에 걸쳐 서서히 방광을 통해 체외로 배출되었다. 이로부터 본 발명의 양쪽이온성 알긴산 유도체는 알긴산을 사용하였을 경우보다 결합된 조영제 또는 약물의 혈액 내 체류 시간을 획기적으로 향상 시켜 줄 수 있음을 확인하였다.
실시예 5: 고분자량의 양쪽 이온성 알긴산 유도체-근적외선 형광물질 결합체 제조 및 분석
5-1: 고분자량의 양쪽 이온성 알긴산 유도체-근적외선 형광물질 결합체 제조
결합체의 혈액 내 체류시간은 분자량이 커질수록 증가하는 것으로 알려져 있는바, 상기 실시예 1에서 사용한 씨그마알드리치사의 190kDa 알긴산보다 고분자량의 일본 KIMICA사의 알긴산 제품 I-5(viscosity of 1 w/v% aqeous solution at20oC = 500 to 600 mPa·s average molecular weight = 800kDa)를 이용하여 양쪽이온성 알긴산 유도체를 합성하고, 형광염료 결합체의 합성도 잘 되는지를 시험하였다.
상기 실시예 1과 같이 EDC/sulfo-NHS 커플링제를 사용하여 알긴산을 활성화시켜 알긴산-NHS ester 결합물을 얻고, 여기에 라이신을 결합하였다. 구체적으로, 알긴산 50 mg을 MES buffer (MES, 0.1 M, pH 5.7) 10 mL에 용해시킨 후, 알긴산 반응 몰수의 1.2배 몰에 해당하는 EDC와 1.3배 몰에 해당하는 sulfo-NHS을 첨가하여 상온에서 약 30분 동안 교반하였다. 이후 상기 용액의 반응하지 않은 EDC를 비활성화 시키고자 2-mercaptoethanol (14.3 M)을 7uL(최종농도 20 mM) 주사한 후 상온에서 20분간 교반하였다. 상기 용액에 대해 PD-10 컬럼을 이용하여 용액 내의 미반응물 및 불순물을 제거하고, phosphate buffer (PBS, 0.1 M, pH 7.4)로 용매 교환을 실시하였다. 이후 알긴산의 5배 몰수에 해당하는 과량의 라이신을 첨가하고 이를 상온에서 하루 동안 교반하였다. 반응을 마친 상기 용액에 대하여 증류수에서 하루 동안 투석(dialysis)을 진행하여 합성물 내의 미반응물 및 부산물을 제거하고, 동결건조를 통해 분말 형태의 라이신 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체 (Alg(KIMICA)-lys)를 수득하였다.
나아가, 상기 실시예 1에서 사용한 하버드 의과대학 최학수 교수 연구팀의 ZW-800의 NHS ester 형광물질(MW 1001.28 g/mol, 최대 여기 파장 754 nm, 최대 방출 파장 775 nm)과 상기 양쪽이온성 알긴산 유도체가 결합된 결합체를 제조하였다.
구체적으로, 상기 결합체를 제조하기 위하여 10 mg의 상기 양쪽이온성 알긴산 유도체를 2 mL의 Sodium bicarbonate (NaHCO3, 50 mM, pH 8.5)에 용해하여 5 mg/mL의 농도로 균질하게 혼합하였다. 이후 5.64 mg의 ZW-800 NHS ester 형광염료를 첨가하고 하루 동안 교반하여 반응하였다. 반응을 마친 상기 용액은 투석막 튜브(MWCO 10kDa)에 담아 2일 동안 PBS(0.1 M, pH 7.4)와 증류수로 투석함으로써 미반응 화학물질을 제거하였다. 상기 용액을 동결 건조하여 분말 상태의 결합체를 얻었다.
5-2: 고분자량의 양쪽 이온성 알긴산 유도체-근적외선 형광물질 결합체의 구조 분석
상기 실시예 5-1에서 사용한 알긴산 및 이를 이용하여 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체(lysine conjugated alginic acid)에 대하여, 1H 핵자기공명 분광광도계(1H-NMR, 400 MHz NMR Spectrometer, Jeol JNM-LA400 with LFG, JEOL, Japan)를 이용하여 구조를 분석하였다. 그 결과, KIMICA사의 알긴산과 양쪽이온성 알긴산 유도체의 1H-NMR 스펙트럼 비교하였을 때, 양쪽이온성 알긴산 유도체의 1H-NMR 스펙트럼 중 2.8 ppm 부근에서 보이는 라이신 수소 피크의 알긴산 대비 비율 계산을 통하여, 알긴산의 카르복시기마다 라이신이 약 100%가 라이신과 결합되어 있는 것으로 계산되었다(도 14a 및 14b).
또한, 형광염료 결합체인 Alg(KIMIKA)-lys@ZW-800에 대한 분광학적 특성 평가를 수행한 결과, 양쪽이온성 알긴산 유도체 한 분자 당 1.1개의 ZW-800 형광물질이 결합됨을 확인하였다(도 15a). 한편, 흡광 최대 파장이 763 nm에서 770 nm로 장파장 쪽으로 7 nm 이동되었으며, 동일 농도의 형광염료와 비슷한 형광 세기를 보임을 확인하였다(도 15b).
실시예 6: PEG가 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체-근적외선 형광물질 결합체 제조 및 분석
6-1: PEG가 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체-근적외선 형광물질 결합체 제조
상기 실시예 1에서 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체에 mPEG5K (mPEG, mPEG5K-SPA, succiinimidyl PEG, NANOCS, MW 5000Da)를 추가로 결합시킴으로써, 결합체의 분자량을 증가시키고 단백질과의 비특이적 상호작용을 더욱 예방할 수 있는 PEG 결합 양쪽이온성 알긴산 유도체를 합성하였다. 구체적으로, 실시예 1에서 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체 15 mg을 5 mL의 Tris buffer (0.1 M, pH 8.5) 용액에 넣어 녹인 뒤, 34 mg의 mPEG-NHS (molecular weight 5 KDa)를 첨가하여 하루 동안 교반하여 반응하였다. 반응을 마친 상기 용액 내의 미반응 분자 및 불순물을 제거하기 위하여 증류수에서 2일 동안 투석(MWCO 10kDa)을 진행하였고, 정제된 상기 용액에 대해 동결건조를 실시하여 분말 형태의 양쪽이온성 알긴산 유도체에 mPEG5K가 결합되어 있는 Alg-lys-mPEG5K를 수득하였다.
나아가, 상기 PEG가 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체(Alg-lys-mPEG5K)에 ZW-800 NHS ester 근적외선 형광물질을 결합하기 위하여, 상기 실시예 3과 유사한 방법을 사용하였다. 구체적으로, 10 mg의 Alg-lys-mPEG5K를 2 mL의 Sodium bicarbonate (NaHCO3, 50 mM, pH 8.5)에 첨가하여 5 mg/mL의 농도로 균질하게 혼합하였다. 이후 5.48 mg의 ZW-800 NHS ester 형광염료를 첨가하여 하루 동안 교반하여 반응을 진행하였다. 반응을 마친 상기 용액은 투석막 튜브(MWCO 10kDa)에 담아 2일 동안 PBS (0.1 M, pH 7.4)와 증류수로 투석함으로써 미반응물을 제거하였다. 투석막 튜브로 빼낸 용액을 동결 건조하여 분말 형태의 고분자량 양쪽이온성 알긴산 유도체-근적외선 형광물질 결합체(Alg-lys-mPEG5K@ZW-800)를 수득하였다.
6-2: PEG가 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체-근적외선 형광물질 결합체의 구조 분석
양쪽이온성 알긴산 유도체에 mPEG5K가 공유 결합되어 있는 결합체 (Alg-lys-mPEG5K)에 대하여, 1H 핵자기공명 분광광도계(1H-NMR, 400 MHz NMR Spectrometer)와 적외선분광광도계(FT-IR)를 이용하여 구조를 분석하였다. 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체에 mPEG5K가 공유 결합되어 있는 결합체(Alg-lys-mPEG5K)의 1H-NMR 스펙트럼 비교에서, 3.6 ppm에서 보이는 PEG backbone의 특정 피크의 위치 확인 및 피크의 알긴산 고유피크의 면적 대비 비율 계산을 통해 양쪽이온성 알긴산 유도체 단량체 하나 당 약 9%의 mPEG5K가 결합되며 있음을 확인하였다(도 17a).
또한, 알긴산과 양쪽이온성 알긴산 유도체 및 양쪽이온성 알긴산 유도체에 mPEG5K가 공유 결합되어 있는 결합체의 FT-IR 스펙트럼을 비교하였다(도 17b). 구체적으로, 알긴산 경우 알긴산의 수산기 및 카르복시기의 -OH 스트레칭에 따른 특징적인 봉우리는 3300 cm-1 및 1619 cm-에서 나타났다. 양쪽이온성 알긴산 유도체의 경우 알긴산의 -COO-의 대칭 및 비대칭 스트레칭에 의하여 나타나던 1599 cm-1과 1409 cm-1과 부근의 피크가 사라지고, 1645 cm-1의 amide I 및 1550 cm-1의 amide II 와 같이 -CONH-에 의한 피크가 확인되었다. 이로부터 알긴산의 카르복시기와 라이신의 아민이 아마이드 결합을 형성하며 알긴산과 라이신 사이에 결합이 일어난 것을 확인하였다. 특히, 양쪽이온성 알긴산 유도체에 mPEG5K가 공유 결합되어 있는 결합체의 IR 스펙트럼의 경우, 2883 cm-1과 1720 cm-1과 부근에서 새로운 피크가 나타나는 것을 확인하였으며, 이는 mPEG5K-SPA의 특정 피크로서 이와 같은 결과를 바탕으로 양쪽이온성 알긴산 유도체에 mPEG5k가 공유 결합하여 결합체가 형성되었음을 확인하였다.
6-3: Alg-lys-mPEG와 형광염료 결합체(Alg-lys-mPEG@ZW-800)의 분광학적 특성 평가
Alg-lys-mPEG5K와 형광염료의 결합체(Alg-lys-mPEG5K@ZW-800)에 대한 흡광 및 형광 스펙트럼을 분석한 결과, 흡광 스펙트럼을 통해 양쪽이온성 알긴산 유도체 한 분자 당 59개의 ZW-800 형광물질이 결합됨을 확인하였으며(도 18a), 형광 스펙트럼을 통해 형광염료 결합체 형성 후 자유 염료 대비 약 29% 정도의 형광 감소가 있었으나 결합체 형성이 잘 되었고 강한 형광을 발생할 수 있음을 확인하였다(도 18b).
실시예 7: 양쪽이온성 알긴산 유도체-광감각제 결합체(Alg-lys@Ce6)의 제조 및 분광학적 특성 평가
7-1: 양쪽이온성 알긴산 유도체-광감각제 결합체(Alg-lys@Ce6)의 제조
양쪽이온성 알긴산 유도체와 조영제(또는 약물)의 결합체 합성에 관한 일 예로서, 광감각제인 chlorin e6(Ce6)와 양쪽이온성 알긴산 유도체의 결합체(Alg-lys@Ce6)를 제조하였다(도 19). 제조시 사용된 알긴산은 190kDa 분자량의 씨그마알드리치사의 알긴산나트륨염 (cas no. 9005-38-3) 제품을 구매하여 사용하였다.
구체적으로, 양쪽이온성 알긴산 유도체 내에 존재하는 라이신 말단기 숫자의 3%에 해당하는 비율(알긴산 유도체 한 분자 당 약 32개의 Ce6)로 Ce6와 공유결합을 형성하도록 합성을 진행하였다. 먼저 Ce6의 카르복시기를 활성화시키기 위하여 2.03 mg의 Ce6을 1 mL의 PBS buffer (0.1 M, pH 7.4)에 녹여 0.78 mg의 EDC와 1.11 mg의 sulfo-NHS을 첨가한 후 30분 동안 교반하여 반응하였다. 20 mg의 양쪽이온성 알긴산 유도체를 3 mL의 MES buffer (0.1 M, pH 7.4)에 용해하여 Ce6 반응용액과 섞어준 뒤 하루 동안 교반하였다. 반응을 마친 상기 용액 내의 미반응 분자 및 불순물을 제거하기 위하여 phosphate buffer (PB, 0.1M, pH 7.5)와 증류수를 이용하여 2일 동안 투석(MWCO 10kDa)을 진행하고, 정제된 상기 용액에 대해 동결건조를 실시하여 분말 형태의 결합체를 수득하였다.
7-2: 양쪽이온성 알긴산 유도체-광감각제 결합체(Alg-lys@Ce6)의 분광학적 특성 평가
상기 결합체(Alg-lys@Ce6)의 합성을 확인하기 위해 이에 대한 분광학적 특성 평가를 실시하였다. 광감각제인 Ce6와 상기 결합체를 인산완충액(PBS)에 녹이고 UV-vis 흡광분석을 실시한 결과, 양쪽이온성 알긴산 유도체 한 분자 당 약 22개의 Ce6가 결합됨을 확인하였다(도 20a). 또한, 형광 스펙트럼을 분석한 결과, 결합체 형성 후 광감각제의 광학 특성이 잘 유지가 되었음을 알 수 있었으며, 이는 결합체의 광역학 치료 효과가 잘 보존됨을 나타내는 결과이다(도 20b).
또한, 제조된 양쪽이온성 알긴산유도체-광감각제 결합체의 일항 산소 발생 특성을 확인하기 위해 일항산소 검출 시약인 SOSG(Singlet oxygen sensor green, Molecular Probe Inc. Eugene, OR, USA)룰 이용하여 670 nm 레이저를 조사하면서 30초 간격으로 일항 산소 발생을 측정하였다. 그 결과, 양쪽이온성 알긴산 유도체에 결합된 광감각제의 일항산소 발생이 단독의 광감각제를 사용한 경우보다 약간 더 높음을 확인하였다(도 20c). 이러한 결과는 Ce6가 수용액상에서 제한된 용해도 때문에 응집 현상이 일어나고, 응집된 광감각제 간의 소광(quenching) 효과로 인하여 일항 산소 발생이 원래 보다 낮게 나타났기 때문이다. 또한, Alg-lys@Ce6의 경우 광감각제가 알긴산 유도체에 결합 후 친수성이 높아지고 광감각제 간의 응집현상이 억제되었기 때문에 Ce6보다 일항산소의 발생량이 더 높게 측정이 되었다. 즉, 이는 광감각제가 결합된 양쪽이온성 알긴산 유도체가 안정한 결합체를 형성하여 향후 광역학 치료제로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
7-3: 암세포에 대한 양쪽이온성 알긴산 유도체-광감각제 결합체(Alg-lys@Ce6)의 섭취 시험
생쥐 편평세포 암종(mouse squamous cell carcinoma) 세포주인 SCC7은 우태아혈청 (FBS) 10% 및 페니실린/스트렙토마이신 1%를 포함하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지를 이용하여 37℃, 5% 이산화탄소 및 표준 습도 조건하에서 배양하였다. 이후 SCC7 세포를 LabTek II Chambered Coverglass의 각 웰마다 5×104개씩 넣고, 세포가 잘 부착되도록 24시간 동안 배양하였다. 양쪽이온성 알긴산 유도체-광감각제 결합체(Alg-lys@Ce6)와 자유 광감각제(free Ce6)를 Ce6기준 2.5 μM 농도로 세포에 5시간 동안 처리하였다. 그 후 세포에 섭취되지 않은 광감각제를 세척을 통해 제거하고, 새로운 세포배양액을 첨가한 후에 공초점 형광 현미경을 통해 세포 섭취를 확인하였다(λex 633 nm, λem 650 nm long-pass filter). 광감각제를 처리하지 않은 암세포주를 대조군(control)로 사용하였다. 그 결과, 도 21에 도시한 바와 같이 기존의 free Ce6를 처리한 것과 비교하여 Alg-lys@Ce6의 형광세기가 무려 25.5배 높은 것으로 분석되었으며, 이것은 free Ce6에 비교하여 Alg-lys@Ce6의 암세포 내로의 섭취량이 25배 이상 높다는 것을 나타내는 결과이다.
7-4: 암세포에 대한 양쪽이온성 알긴산 유도체-광감각제 결합체(Alg-lys@Ce6)의 항암효과 측정
SCC7 암세포에 대조군인 free Ce6와 본 발명에 의한 양쪽이온성 알긴산 유도체-광감각제 결합체(Alg-lys@Ce6)를 농도별(각각 1, 2.5 및 5 μM)로 처리한 후 5시간 동안 암조건(dark condition)에서 배양하고, 세척한 후 새로운 세포 배지로 교환하였다. 이후 670 nm 레이져를 이용하여 암세포에 빛을 조사해 주었다(10 J/cm2). 추가로 24시간 동안 배양한 뒤, CCK-8 assay 분석방법을 이용하여 각각에서 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, 도22에 도시한 바와 같이 기존의 free Ce6는 5 μM 농도에서도 광역학 치료 후 암세포가 거의 죽지 않았으나, Alg-lys@Ce6는 2.5 μM 농도로 처리 후 광역학 치료를 시행한 경우에도 대부분의 암세포가 사멸하였음을 확인하였다. 이러한 결과로부터 본 발명의 양쪽이온성 알긴산 유도체에 광감각제를 결합시킨 경우 암세포 내로의 광감각제 전달 및 섭취가 매우 향상될 수 있을 뿐 아니라, 암세포 치료 효과도 현저히 향상이 될 수 있음을 알 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는, 양쪽이온성 특성을 갖는 알긴산(alginate) 유도체:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019017609-appb-I000008
    상기 화학식 1에서 n은 1 내지 3000의 정수이며, 상기 R은
    Figure PCTKR2019017609-appb-I000009
    ,
    Figure PCTKR2019017609-appb-I000010
    또는
    Figure PCTKR2019017609-appb-I000011
    이다.
  2. 제1항에 있어서, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)이 추가로 결합된 것인, 양쪽이온성 알긴산 유도체.
  3. 제1항에 있어서, 영상 조영제 또는 약물이 추가로 결합된 것인, 양쪽이온성 알긴산 유도체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 영상 조영제는 자기공명영상 조영제(MRI 조영제), CT(computed tomography) 조영제, 또는 형광염료인 것인, 양쪽이온성 알긴산 유도체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 약물은 항암제, 항염증제, 마취제, 항바이러스제, 항박테리아제, 치료용 항체, 항생제, 면역치료제 또는 광감각제인 것인, 양쪽이온성 알긴산 유도체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 양쪽이온성 알긴산 유도체를 포함하는, 조영제 조성물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 양쪽이온성 알긴산 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 암 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. (a) 알긴산에 EDC 및 sulfo-NHS를 처리하는 단계; 및
    (b) EDC 및 sulfo-NHS가 처리된 알긴산을 라이신(lysine) 또는 아르기닌(arginine)과 반응시키는 단계를 포함하는, 양쪽이온성 알긴산 유도체의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, (c) 라이신(lysine) 또는 아르기닌(arginine)이 결합된 알긴산 유도체와 폴리에틸렌글리콜을 반응시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 양쪽이온성 알긴산 유도체의 제조방법.
  10. 제8항 또는 제9항의 제조방법에 따라 제조된 양쪽이온성 알긴산 유도체와 영상 조영제 또는 약물을 반응시키는 단계를 포함하는, 조영제 조성물 또는 약학 조성물의 제조방법.
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