DE2746761A1

DE2746761A1 - Verwendung von 2-pyrrolidonderivaten zur behandlung von gefaesserkrankungen beim menschen

Info

Publication number: DE2746761A1
Application number: DE19772746761
Authority: DE
Inventors: Joseph Dr Strubbe
Original assignee: UCB SA
Current assignee: UCB SA
Priority date: 1976-10-19
Filing date: 1977-10-18
Publication date: 1978-04-20
Also published as: JPS5386040A; BE859831A; MY8200199A; FR2368275A1; GB1583871A; US4115579A; DE2746761C2; RO75960A; HK63181A; AU509416B2; FR2368275B1; IL53146A; ZA776196B; JPS607972B2; BG35622A1; IL53146A0; AU2982477A

Description

PATENTANWÄLTE 27 4 υ 7 6

DR. A. VAN DERWERTH DR. FRANZ LEDERER REINER F. MEYER

DlPL-ING. (1934-1974) DlPL-CHrM. DIPL-ING.

8000 MÜNCHEN 80

LUCILE-GRAHN-STRASSE 22

TELEFON: (089) 472947 TELEX: 524624 LEDERD TFLEGR.: LEDERERPATENT

12. Oktober 197? 16.14.06

UCB, S.A.

-, Chaussee de Charleroi, Saint-Gilles-Xez-Bruxel3.es

Belgien

Verwendung von 2-PyrroIidonderivaten zur Behandlung von Gefäßerkrankungen beim Menschen

Die Erfindung "betrifft Arzneimittel, welche Eigenschaften als Antiaggregationsmittel und als Aggregationen bzw. Klumpenbildungen aufhebende Mittel für Blutplättchen (Thrombozyten) besitzen. Solche Mittel finden ihre Anwendung bei der Behandlung von allen Krankheiten und insbesondere Gefäßkrankheiten, bei welchen es erforderlich ist, entweder die Plättchenaggregation oder das Zusammenklumpen von Plättchen zu hemmen oder ein bereits gebildetes Plättchenaggregat bzw. einen bereits gebildeten Plattehenklumpen zu entfernen. Die erfindungsgemäßen Mittel sind ebenfalls bei der prophylaktischen Behandlung von Gefäßerkrankungen vorteilhaft.

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Die in den erfindungsgemäßen Mitteln verwendeten, aktiven Verbindungen sind nicht neu. Bereits bekannt ist ihre Aktivität auf das Nervensystem und insbesondere ihre als nootrop bezeichnete Aktivität, wobei diese Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel I entsprechen:

O (I) R-CH-CO-NH₂

worin R ein Wasserstoffatom, den Methyl- oder Äthylrest bedeutet. Diese drei 2-(2-0xo-pyrrolidino)-alkylamide sind die folgenden:

- Verbindung A: 2-0xo-1-pyrrolidinacetamid (oder Piracetam)

mit R=H;

- Verbindung B: 2-(2-Oxo-pyrrolidino)-propionamid mit R =

Methyl;

- Verbindung C: 2-(2-0xo-pyrrolidino)-butyraraid mit R =

Äthyl.

Die Verbindung A und das Verfahren zu ihrer Herstellung sind in der GB-Patentschrift 1 039 113 beschrieben, während die Verbindungen B und C und ihre Herstellungsverfahren in der GB-Patentschrift 1 309 693 beschrieben sind, wobei letzteres ein Zusatzpatent zum erstgenannten Patent ist.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Behandlung von Gefäßkrankheiten beim Menschen, bei welchen es erforderlich ist, mit Hilfe eines Antiaggregationsmittels die Plättchenaggregation zu hemmen oder ein bereits gebildetes Plättchenaggregat zu entfernen, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man dem Menschen als Antiaggregationsmittel eine therapeutisch wirksame Dosis einer Verbindung

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der Formel I, wie zuvor definiert, appliziert.

Im Verlauf von klinischen Untersuchungen, die mit diesen Verbindungen durchgeführt wurden, um ihren Einfluß auf eine Therapie in Verbindung mit indirekten Antikoagulationsmitteln wie beispielsweise Phenprocoumon zu bestimmen, wurde überraschenderweise gefunden, daß sie beträchtlich die Plättchenaggregation im Plasma von an Gefäßkrankheiten leidenden Patienten vermindern, ohne einen direkten oder indirekten Einfluß auf die Antikoagulationswirkung der gemeinsam verwendeten Antikoagulantien auszuüben.

Diese klinischen Beobachtungen führten zur Bestätigung dieser Aktivität auf die Plättchen mittels traditioneller Untersuchungsmethoden auf diesem Gebiet. Tatsächlich sind Verbindungen, welche eine solche Aktivität besitzen, derzeit besonders gefragt, und bislang waren noch keine Verbindungen gefunden worden, welche alle Gesichtspunkte erfüllen. In erster Linie ist es die Aufgabe solcher Verbindungen, bei jedem Beginn des Auftretens von Thrombosesymptomen derart zu wirken, daß das Auftreten hiervon im Bereich von beschädigten Gefäßendothelien vermieden wird. Es ist unbedingt erforderlich, daß die Antiaggregationsmittel - im Gegensatz zu Antikoagulationsmxtteln - nicht die Fähigkeit zur Koagulation verändern (insbesondere die Geschwindigkeit der Fibrinbildung), so daß ein Antiaggregationsmittel gleichzeitig mit einem Antikoagulationsmittel bei der prophylaktischen Behandlung von Thromboembolien eingesetzt werden kann.

Die Neigung von Plättchen zur Aggregation in menschlichem Plasma nimmt mit dem Alter zu, ebenso bei Personen, welche an Gefäßerkrankungen leiden, gleichgültig ob diese arteriell oder venös, obliterant oder chronisch sind. Aber selbst bei

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2 7 4 b 7 6 - κ-

Personen, welche nicht an Gefäßerkrankungen leiden, nimmt die Neigung der Plättchen zur Aggregation nach Infektionen zu. Die Antikoagulantien wie "beispielsweise Fhenprocouraon oder Heparin beeinflussen ganz allgemein die Phase der Bildung von Fibrin, ohne die Erhöhung der Neigung zur Aggregation von Plättchen zu heilen. Aus diesem Grund wurden in den letzten Jahren intensive Untersuchungen zur Auffindung von Arzneimitteln durchgeführt, welche überhaupt keine Wirkung auf den Hämostasemechanismus besitzen, jedoch die Aggregation von Plättchen herabsetzen oder unterdrücken. Beispielsweise hat sich herausgestellt, daß Acetylsalicylsäure eine starke Wirkung nicht nur auf die Plättchenaggregation sondern unglücklicherweise auch auf die Hämostase bzw. Blutstillung besitzt, wodurch ihre therapeutische Anwendung auf cüesem Gebiet beschränkt ist.

In gleicher Weise besitzen andere Antiaggregationsverbindüngen wie Indomethacin und Phenylbutazon einen schädlichen Einfluß auf die wirksame Dosis von indirekten Antikoagulantien wie beispielsweise Phenprocoumon. Hierdurch ist es ausgeschlossen, eine Therapie unter Kombination dieser beiden Typen von Arzneimitteln anzuwenden. Eine ideale Antiaggregationsverbindung müßte daher die Neigung zur Aggregation reduzieren oder sogar aufheben, ohne daß überhaupt ein Sekundäreffekt, insbesondere auf die Hämostase, vorliegt. Anders ausgedrückt bedeutet dies, daß diese Verbindungen, bei der Konzentration, wo sie die Plättchenaggregation inhibieren, überhaupt keinen Einfluß auf die anderen Plättchenfaktoren besitzen dürfen, welche für die Rolle der Plättchen bei der Hämostase verantwortlich sind. Insbesondere wäre es äußerst wünschenswert, daß solche Arzneimittel nicht den Koagulationsmechanismus beeinflussen, insbesondere die Thrombinbildung- Bislang waren solche Arzneimittel sehr selten, siehe ζ. Β..Έ. V/enzel et al., Med.Welt. _25 (1976).

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2 7 4 ü 7 6 1

Unter diesem Gesichtspunkt ist die Wirkung der der zuvor angegebenen Formel I entsprechenden Verbindungen, nämlich von Piracetam und seinen beiden höheren Homologen, besonders interessant. Diese Verbindungen modifizieren die Verteilung von Thrombozyten (Plättchen) in Abhängigkeit ihres Volumens nicht, ebenso nicht die morphologischen, im Mikroskop beobachteten Parameter von Thrombozyten, und zwar auch bei sehr hohen Konzentrationen in der Größenordnung von 5*10 Mol. Die drei Bubstanzen hemmen sehr wirksam eine durch ADP (Adenosindiphosphat) induzierte Aggregation bis zu Konzentrationen von Λ0~^ Mol, darüber hinaus erscheint ihre Spezifität in dem Fall sehr vorteilhaft, wo die durch ADP induzierte Aggregation inhibiert wird, ohne daß die anderen Funktionen der Plättchen beeinträchtigt werden. Obwohl dieser Effekt tatsächlich an erster Stelle klinisch bei Piracetam beobachtet wurde, d. h. in vivo, scheint es, daß diese Verbindung bei der gleichen Konzentration jedoch in vitro a priori nicht so interessant zu sein scheint, insbesondere im Vergleich zu den Verbindungen B und C. Dies ist der Tatsache zuzuschreiben, daß in-vitro-Untersuchungen eine Orientierung und einen Hinweis auf die Aktivität der untersuchten Verbindung geben, ohne daß es a priori möglich wäre, diese Schlußfolgerungen integral auf Verhältnisse in vivo zu übertragen.

Die folgenden Untersuchungen sollen diese Schlußfolgerungen zeigen.

A. Beschreibung der unterschiedlichen, angewandten Methoden 1. Thromboelastografische_Messungen_an_einera_an Plättchen

In einer TEG-Apparatur (Apparatur von Hartert) wurde ein mit Zitrat versetztes, an Plättchen reiches Plasma vom Menschen, das von gesunden Personen erhalten worden war,

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2 7 η ό'/ 6 1

wieder mit Calcium versetzt. In diesem Plasms sind die Anzahl von Thrombozyten und die Fibrinogenkonzentration bekannt und konstant. Der erneute Zusatz von Calcium erfolgt mit Hilfe einer 0,1-molaren Calciumchloridlösung. Die Rolle des Zitrates ist es, jede Koagulation vor dem Start der Versuche zu hemmen. Tatsächlich weisen die Zitrationen die Besonderheit; auf, daß sie in dem Plasma enthaltene Calciumionen chelatieren, wobei diese der Ursprung des Koagulationsprozesseri sind. Daß Auslösen des Koagulationsprozesses kann daher zu jedem Zeitpunkt durch eine einfache Wiederzuführung von Calcium unter Zugabe von Calciumchlorid erreicht werden. Es sei darauf hingewiesen, daß diese thromboelastografische Technik die Zunahme der Viskosität einer Blutpräparation im Verlauf der Koagulation ausnutzt. Das Prinzip dieser Technik besteht darin, daß der die zu untersuchende Präparation enthaltende Behälter einer oszillierenden Winkelbewegung unterworfen wird, und daß die Effekte der Koagulation auf einen am Ende eines Torsionsfadens aufgehängten und in die Präparation eintauchenden Zylinders untersucht werden. Wenn die Koagulation beginnt, nimmt das in dem Behälter enthaltene Plasma den Zylinder in seinen Oszillationsbewegungen mit. Als Zeitpunkt t = 0 der Koagulation wird der Zeitpunkt gewählt, wo man die Aktivierung der für die Koagulation verantwortlichen Faktoren durch Zugabe von Calciumionen hervorruft. Weiterhin werden bezeichnet:
"r" die Latenzzeit, welche dem wirksamen Beginn der

Koagulation vorausgeht,

"am" die maximale Amplitude der Oszillationen des Zylinders, "k" das Zeitintervall, welches zwischen dem Moment, in welchem der Zylinder zu oszillieren beginnt, und dem Moment, wo die Bewegungsamplitude gleich der unter den gleichen Bedingungen mit einem Plasma ohne Plättchen und daher mit normalem Fibrinogengehalt erhaltenen Maximalamplitude wird, liegt.

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Die Gesamtkoagulationszeit einer Präparation wird durch die Summe von r + k gebildet. Die Kinetik der Koagulation wird durch die Parameter r und r + k und die Intensität der Koagulation durch die Maxima!amplitude am der Zylinderoszillationen ausgedrückt.

Das Verhältnis am/r+k gibt die Geschwindigkeit der Verfesti gung des Blutgerinsels wieder.

In der gleichen Weise wird ebenfalls die maximale Elastizität des Thrombus (in den folgenden Tabellen mit max.E bezeichnet) gemessen, wobei dies ein indirektes Maß der Retraktion des Fibringerinsels, induziert durch die Thrombo zyten, ist. Die Bestimmung der Maximalzeit der Ha'ib-Lyse wird angewandt, um zu zeigen, daß keine Aktivierung des fibrinolytischen Systems vorliegt.

Die Zeit einer partiellen Wiederzugabe von Calcium eines mit Kaolin behandelten Plasmas (Test PTT) wird als Messung der Fähigkeit zur Bildung von Eigenprothrombinase angewandt, siehe H. Vinazzer, Gerinnungsstörungen in der Praxis, Fischer-Verlag Stuttgart (1972). Für die Geschwindigkeit der Bildung von äußerem Thrombin wird der Test ?-ur Messung der Prothrombinzeit (abgekürzt PTZ) und der Hepatoquick-Test (siehe Vinazzer, loc, cit.) angewandt.

Die Phase der Polymerisation des Fibrins wird durch die durch Thrombin, Reptilase und Thrombinkoagulase induzierte Koagulationszeit untersucht, siehe E. Wenzel et al. , Dtsch.med.Wsch. Λ^ (1974), S. 746-756 und P. E. Gregoire, Biochimie pathologique. Presses Acad. Eurpeennes, Paris, Maloine (1972), Kapitel 39, S. 831 (Les Maladies Hemorragiques)

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Z ι * ■■ · ö ϊ

2_i_Mor2hologische_Untersuchungen_von_Throrabozyten_und Analyse

Funktion ihres Volumens

Die Morphologie von Thrombozyten ausgestrichen auf einem Objektträger im Interferenzmikroskop (Vergrößerung 400 x) wird als sehr empfindlicher Tost zur Untersuchung der funktionellen Veränderungen von Thrombozyten angewandt. Dieser Test ergibt im wesentlichen nicht quantitative Anzeigen und ermöglicht es insbesondere die Veränderungen in den energetischen Metabolismen von Thrombozyten nachzuweisen.

Die Analyse des Volumens von '.l'eilchen mit einem Kanalanalysator (Coulter Counter Channelyzer), die elektronisch und automatisch erfolgt, ermöglicht den Erhalt von quantitativen jedoch weniger empfindlichen Angaben hinsichtlich der stärker ausgeprägten Veränderungen von Thrombozyten. Auf diese Weise können durch dieso Methode typische, morphologische Veränderungen von Thrombozyten oder Prozesse der Fragmentierung oder auch Erscheinungen der Aggregation auf präzise Weise quantitativ bestimmt werden. Geringere Modifikationen entziehen sich jedoch diesen Untersuchungen, siehe hinsichtlich dieser Methode H, Holzhüter el a,, Thromb. et diath. Suppl. im Druck (1976) sowie H. Holzhüter et al., Verh.Dtsch..Ges.f.Inn.Med. (W+)-

4. Trübungsmessung_des_Aggregations2rozesses In einem nach Born modifizierten Aggregometer (Modell ELVI) oder in einem Universalaggregometer von Eppendorf,, wird unter fortwährendem Rühren ein an Plättchen reiches Plasma (abgekürzt PRP) bei 37 °C eingesetzt. Nach einer konstanten Vorinkubationszeit von 30 Minuten wird zu dem PRP 10 bis 10~⁶ Mol ADP oder 20/Ug bis 4 /Ug/ral PRP an Collagen hinzugesetzt, und der Prozess der Aggregation wird direkt in Form der Kurven der Herabsetzung der Extinktion oder der Erhöhung der Transmission aufgezeichnet. Als Maßstab wird grafisch

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274b76

AO

die maximale Modifizierung der Extinktion pro Minute oder auch die Zeit, welche auf der Extinktionskurve den ersten Wendepunkt von dem niedrigsten Punkt dieser Kurve ("Reaktionszeit") trennt, ermittelt. Diese Messungen werden durch eine Analyse der Verteilung der nicht-aggregierten Thrombozyten als Funktion ihres Volumens vervollständigt.

B. Resultate der Untersuchungen.

Falls keine gegenteilige Angabe gemacht ist., sind die für die Verbindungen A, B und C angegebenen Konzentrationen die Endkonzentrationen in den zu untersuchenden Proben in Mol/l.

Zu einem aus dem Plasma von zehn gesunden Personen entnommenen PRP gibt man zunehmende Mengen der Verbindungen A, B und C, anschließend läßt man während 30 Minuten bei Umgebungs temperatur inkubieren, dann werden folgende Untersuchungen durchgeführt:

- eine Analyse der Verteilung in Volumen (Coulter-Zähler)

- thromboelastografische Untersuchungen bei einem wieder mit Calcium versetzten PRP,

- morphologische Untersuchungen der auf einem Mikroskopobjektträger ausgestrichenen Thrombozyten.

Ergebnisse_und_Schlußfolserung_en^

Selbst sehr hohe Konzentrationen (1 Mol) der Verbindungen A und C beeinflussen die Morphologie der ausgestrichenen Thrombozyten nur sehr minimal (leichtes Anwachsen der nicht ausgestrichenen Thrombozytenformen), Bei Konzentrationen von 10 Mol und geringer ist dieser Effekt für keine der Verbindungen A, B oder C mehr nachweisbar, siehe folgende Tabelle I. Der Normalwert für nicht-ausgestrichene Thrombozyten liegt zwischen 35 und 45 %.

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2 Ί u u 7 6 1

/14

Tabelle I

Produkt (Mol) Ergebnis

nicht-ausgestrichene Thrombozyten

Vergleich I
(NaCl)

Vergleich II
(NaCl)

A 10
A 10
A 1
B 1
B 10
B 10
B 10
C 1

C 10
C 10
C 10

-1
~²

-1

-3

schwache Inhibierung

geringe Zunahme der Inhibierung

wie Vergleich wie Vergleich wie Vergleich wie Vergleich wie Vergleich wie Vergleich wie Vergleich

geringe Zunahme der Inhibierung

wie Vergleich wie Vergleich wie Vergleich

39

43

38 40

37 39

40

37

40 41

40 39

Die Verteilung von Thrombozyten in Abhängigkeit ihres Volumens wird nicht modifiziert, selbst bei hohen Konzentrationen der drei untersuchten Verbindungen,

In der folgenden Tabelle II ist die Anzahl der Thrombozyten für zunehmende Konzentrationen an Verbindungen A, B und C angegeben.

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2 7 4-3761

Tabelle II Produkt (Mol) Anzahl der Thrombozyten

Vergleich 95.000

A 10~¹ 107.000

10~² 98.000

10"⁵ 97.000

B 10"¹ 97-000

10~² 98c000

1O~⁵ 97.000

c io~¹ 95.000

10~² 94.000

10"⁵ 89.000

In gleicher Weise werden die funktioneilen,thromboelastografischen Parameter von Plättchen und insbesondere die Festigkeit des Thrombus (wobei dies ein indirektes Maß der Retraktion des Blutgeririsels anter dem Einfluß von Thrombozyten ist) nicht signifikant durch selbst hohe Konzentrationen an Verbindungen A, B oder C beeinflußt. In der folgenden Tabelle III sind die Resulte des Thromboelastogramms angegeben, gemessen an Lösungen., v/elche 9 Teile PRP auf 1 Teil zu untersuchendes Produkt enthalten.

	PRP	Tabelle III	k	r+k	am	am r+k	max. E
	NaCl	r	0,5	2,1	4,9	2,33	96,1
Produkt (Mol)		1,6	0,8	2,8	5,4	1,93	117,4
Vergleich		2,0	0,5	2,0	4,7	2,35	88,7
Vergleich		1,5	1,1	2,8	3,3	1,18	49,3
A 10"⁵	PRP	1,7	1,1	2,6	3,0	1,15	42,9
A 10~⁴	NaCl	1,5	0,5	2,1	4,9	2,33	96,1
A 10"^		1,6	0,8	2,8	5,4	1,93	117,4
Vergleich		2,0	0,8	2,7	6,0	2,22	150,0
Vergleich		1,9	1,2	3,5	4,9	1,4	96,1
B 10"³	2,3	0,4	1,8	6,0	3,3	150,0
B 10"⁴	1,4
B 10"⁵

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6,4	3	,0	9,4	4,7	o,	5	88,7
6,5	2	,4	8,9	5,6	o,	63	127,3
5,8	?	,?	8,0	4,6	O₅	58	85,2
5,0	3	,7	8,7	3,9	o,	45	63,9

2 7

Tabelle III (Fortsetzung)

Vergleich PRP Vergleich NaCl

C 10"⁵

C 10

C 10~⁵ 4,1 1,4 5,5 4,5 0,82 82,2

Die Tabelle III zeigt den Einfluß der Verbindungen A, B und C auf die maximale Festigkeit des Thrombus und auf die Zeit zur Bildung des Blutgerinsels unter Zuhilfenahme von thromboelastografischen Untersuchungen bei einem PRP vom Menschen vor und nach Zugabe der zu untersuchenden Produkte,

~2 -5 Endkonzentrationen von 10 bin 10 ^ Mol dieser Verbindungen beeinflussen die maximale Festigkeit des Thrombus und die Zeit zur Bildung des Blutgerinsels nur in wenig ausgeprägter Weise.

y2D_yj?£^i£§y£6£iL^'-

auf_die Geschwindigkeit der Polyroerisation_yon Fibrin Zu einem Plasma, das von gesunden Spendern erhalten worden war, wurden zunehmende Konzentrationen der zu untersuchenden Produkte zugesetzt, anschließend wurde bei Umgebungstemperatur für 30 Minuten inkubiert. Ais Vergleich \nirden die gleichen Plasmapräparate verwendet, denen man das gleiche Volumen an Lösungsmittel, wie es für die zu untersuchenden Substanzen verwendet wurde (9 Teile isotonischer NaCl-Lösung auf 1 Teil Zitrat) zugesetzt hatte. Die pH-Werte der so erhaltenen Lösungen variierten zwischen 7₅2 und 7,6.

Resultate ^^Schlußfolgerungen:

Selbst sehr hohe Konzentrationen der drei Substanzen (bis zu 10" Mol) haben keinen Einfluß auf die Geschwindigkeit

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Γί it D /51

/lit

der Bildung von innerem Thrombin (Test PTT) und von äußerem Thrombin (Quicktest).

-2
Bei Konzentrationen höher als 10 Mol zeigten die drei untersuchten Verbindungen eine sehr deutliche Hemmwirkung auf die Fibrinpolymerisation, Die Thrombinzeit wird dagegen nur gering beeinflußt.

Bei Konzentrationen gleich oder unter 10 Mol (z. B. 10 und 10" ^ Mol) wird die Fibrinpolymerisation nicht in merklicher Weise beeinfl\ißt, ebensowenig die Phase der Thrombinbildung.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Ergebnisse der Plasmakoagulation nach Inkubation mit den Produkten A, B und C

Produkt (Mol)

Thrombin- PTT Quickzeit test

Fibri- Repti- Thrombinnqgen läse koagulase

Vergl. I (NaCl) 17,8 A 10~¹ 22,9 10~² 19,0 10~⁵ 20,2+ Vergl.II (NaCl) 20,8+

36.5 100 168 16,8 20,3 36,1 90 144 34,1 54,0

34.6 89 132 18,4 21,4 32,0+ 100+ 210+ 15,8+ 24,8+ 31,8+ 100+ 240+ 15,0+ 26,5+

Vergl. I (NaCl) 17,8

B 10~¹ 24,9

10~² 18,3

10~⁵ 21,2+

Vergl.II (NaCl) 20,8+

35,5 100 168 16,8 . 20,3

38,5 85 144 37,3 42,8

34,5 89 140 17,6 22,6

31,8+ 100+ 240+ 16,5+ 25,6+

31,8+ 100+ 240+ 15,0+ 26,5+

Vergl. I (NaCl) 17,8 C 10~¹ 22,9

10~² 19,0

10"⁵ 20,2+

Vergl.II (NaCl) 20,8+

35.5 100 168 16,8 20,3 36,1 90 144 34,1 54,0

34.6 89 132 18,4 21,4 32,0+ 100+ 210+ 15,8+ 24,8+ 31,8+ 100+ 240+ 15,0+ 26,5+

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+ = Dies bedeutet, daß der Vergleich II den bei der

Konzentration von 10"^ Mol durchgeführten Versuchen entspricht.

Die Ergebnisse sind in Sekunden angegeben, mit Ausnahme des Fibrinogens, wo sie in mg/100 ml angegeben sind.

oder_ADP_ induzierte _Plättchenaggregati.on

Der Einfluß von zunehmenden Konzentrationen der Verbindungen A, B und C auf den Vorgang der durch hohe oder schwache Konzentrationen von ADP oder von Collagen induzierten Flättchenaggregation wurde untersucht. Während 30 Miuuten wurde PRP mit den zu untersuchenden Substanzen bis zu Konzentrationen in der Größenordnung von 10"^ Mol inkubiert. Als Vergleiche wurden PRP mit einer konstanten Anzahl von Thrombozyten, entweder als solches oder mit einem Puffer versetzt verwendet. Da jeder Versuch ungefähr 4 Stunden dauert, muß die Veränderung der Plättchen berücksichtigt werden, die in jedem Falle stattfindet, wenn man Thrombozyten vom Menschen bei Umgebungstemperatur stehenläßt (tatsächlich gibt es eine spontane Neigung hiervon zur Aggregation). Infolgedessen wurden die Vergleiche nach jeder Reihe von Versuchen wiederholt.

Bei den ersten Vorversuchen wurde die nach dem Prinzip von Born modifizierte Trübungsmeßmethode (Trübungsmeßgerät ELVI) angewandt. Als Maß für die Aggregation (oder für die Entaggregation) wurde die Modifizierung der Extinktion herangezogen, gemessen durch grafische Extrapolation der aufgezeichneten Extinktionskurve. Außerdem wurde ebenfalls die Neigung der Kurve und die maximale Veränderung der Transmission im Verlauf der Reaktion in Betracht gezogen.

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2 7 ί. 6 7 6

Das quantitative Maß für die Erscheinungen der Aggregation und der Desaggregation (Entaggregation) wurde durch die Verminderung der absoluten Zahl der Plättchen (Verminderung der Zahl der nicht-aggregierten Thrombozyten in dem Plasma nach dem Beginn des Aggregationsprozesses) bestimmt. Weiterhin wurde die Volumenverteilung von freien, nicht-aggregierten Plättchen während des Aggregationsprozesses bestimmt. Auf diese Weise wurde ein direktes Maß der Kinetik der Aggregation und des Prozesses der Desaggregation erhalten.

Für die Versuche der durch ADP oder Collagen induzierten Aggregation wurden Piasmapräparationen von gesunden Personen verwendet, welche im Mittel zwischen 80 und 120.000 Plättchen pro mm- enthielten. Alle Versuche wurden mehrere Male wiederholt.

Resultate^

Die Verbindungen A, B und C inhibieren die durch ADP oder durch Collagen induzierte Aggregation von Plättchen, ohne die Verteilung von Thrombozyten in Abhängigkeit von ihrem Volumen zu beeinträchtigen. Ganz im Gegensatz dazu wird der Einfluß von ADP und von Collagen auf die letztgenannte Eigenschaft unterdrückt (dieser Einfluß zeigt sich durch eine Verminderung der größten Throrabozyten, welche funktionell besonders aktiv sind, sowie durch eine relative Erhöhung der Anzahl von kleineren Thrombozyten, welche relativ weniger aktiv sind, immer funktionell ausgedrückt).

Für die Verbindung A wurde dies in erster Linie durch fotometrische Methoden gezeigt.

In der folgenden Tabelle V sind die Ergebnisse der Extinktionskurven, welche selbst nicht wiedergegeben sind, angegeben.

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2 7 4 ■;"/ 6 1

- ye- -

Es handelt sich um eine durch ADP in unterschiedlichen

Konzentrationen (10

x-6

10 Mol) induzierte Aggregation.

Die Verbindung A (0,14 Mol) wurde während JO Minuten mit PRP inkubieren gelassen.

Bedeutung der verschiedenen Symbole:

- Tr: Dies ist die Zeitspanne, welche auf der Extinktionskurve den ersten Wendepunkt von dem niedrigsten Punkt dieser Kurve trennt;

- Lz: Winkel, der ein Maß der maximalen Aggregatjonsgeschwindigkeit gibt;

- max.E: Unterschied der absoluten Extinktion im Plasma

vor und nach der Aggregation

Tabelle V

Endkonzen- Produkt (Mol) Tr Lz max.E Anzahl der ThromboZyten tration "vor der nach der

von ADP Aggregation Aggregation

10"⁴ Mol NaCl (Vergl.) 0,5 70 610 112.000 20.000 A 0,14 1,0 60 340 109-000 78.000

10~⁵ Mol NaCl (Vergl.) 0,9 71 470 107-000 59.000 A 0,14 1,3 31 115 101.000 79.000

10"⁶ Mol NaCl (Vergl.) 1,5 33 220 112.000 54.000 A 0,14 0 95 105.000 83.000

In der folgenden Tabelle VI sind die Ergebnisse der Extinktionskurven wiedergegeben, wobei diesmal jedoch die Konzentration der Verbindung A variiert wurde. Die Arbeitsbedingungen waren die gleichen wie zuvor. Das ADP wurde in einer Konzentration von 10~ Mol verwendet. Die nicbt-vordünnte Lösung der Verbindung A ist 1,41 molar.

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2 7 '4 υ 7 6 1

Tabelle VI

Untersuchte Lösungen Endkonzentration Tr Lz max.E, Anzahl der

an A (in Mol) Thrombozyten

vor der Aggregation

9 Tie. 1 Tl.

PRP + NaCl

FRP + A (1:0)

PRP + A (1:5)

PRP + A (1:10)

PRP +

A (1:100)

PRP +

A (1:1000)

—	0,9	62	370	152.000
0,14	-	180	140	•152.000
0,028	1,0	45	270	152.000
0,014	1,2	59	380	160.000
0,0014	1,0	57	350	160.000
0,00014	1,0	58	370	160.000

In der Zeichnung ist ein Beispiel für Verteilungskurven von Plättchen in Abhängigkeit ihres Volumens, erhalten mit der Verbindung A unter folgenden Bedingungen wiedergegeben:

- 0,9 ml PRP, 30 Minuten inkubiert mit Verbindung A (0,14 Mol)

—4

- 0,1 ml einer ADP-Lösung , 10 molar.

Die Fig. 1 zeigt die Verteilungskurve in Abhängigkeit des Volumens von Plättchen mit der Verbindung A vor der Aggregation, während die Pig. 2 die gleiche Kurve nach der Aggregation wiedergibt.

Die Figuren III und IV zeigen die gleichen Kurven, erhalten mit einem Vergleich (NaCl).

Als Abszisse bei diesen Kurven sind die Kanäle von 0 bis 100 (nach dem Prinzip eines Kanalanalysators) angegeben, und auf der Ordinate ist die Zahl der einem vorgegebenen Kanal entsprechenden Throrabozyten aufgetragen.

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/ η υ / b

43

In der folgenden Tabelle VII sind die in den fotometrischen Kurven und in den Verteilungskurven pro Volumen der Plättchen enthaltenen Ergebnisse bei Verwendung der Verbindungen A, B und C wiedergegeben. Die Arbeitsbedingimg en waren wie folgt:

- durch 0,1 ml einer 10" molaren ADP-Lösung induzierten Aggregation,

- 0,9 ml PRP, inkubiert während 30 Minuten mit der zu untersuchenden Substanz.

Tabelle VII

Produkt (in Mol)

Tr Lz max.E (θ) ΤΓ~2. Spitze

Anzahl der Thrombozyten Spitze
vor der nach der vor nach

Aggregation Aggregation der der

Aggre- Aggre-Ration gation

Vergl.NaCl A 10~¹ A 10~² A 10 B 10 B 10 B

-3 -1 -2

C 10 C 10 C 10

-1 -2 -3

0,9 66 420 730 95.000 58,000 19

0 220 200 107-000 76,000 19

0,9 62 290 340 98.000 27-000 17

0,9 62 270 300 97.000 27-000 18

0 80 70 97-000 78.000 17

0,9 64 380 260 98.000 50.000 15-20

0,8 66 450 500 97.000 26.000 16

0 80 80 95.000 84.000 17

1,1 66 390 290 94.000 55.000 17

1,4 70 420 400 89.000 30.000 16

11.000 19

14 17 15 13 16

15

15 17 15

1 15

Vergl.NaCl 0,9 65 500 760 98.000

Die gleichen Versuche wurden für eine durch Collagen bei unterschiedlichen Konzentrationen des Collagens induzierte Aggregation durchgeführt. In der folgenden Tabelle VIII (Konzentration an Collagen = 4 ug/ml) und in der Tabelle IX (Konzentration an Collagen = 20 iig/ml) sind die aus den fotometrischen Kurven und aus den Verteilungskurven pro

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27*6761

-1h'-ZO

Volumen der Plättchen unter Verwendung der Verbindungen A, B und C erhaltenen Ergebnisse aufgeführt. Die Arbeitsbedingungen waren wie folgt:

- durch Collagen in einer Menge von 20 ug bzw. 4 ng Collagen (in Suspension) pro ml PRP induzierte Aggregation

- 0,9 ml PRP, inkubiert während 30 Minuten mit der zu untersuchenden Substanz.

	Tr	Lz	Tabelle VIII	! Anzahl der	Thrombozyten	Spitze	3
Produkt		(°)	max. E	vor der	nach der		3
(in Hol)				Aggregation	Aggregation		3
	7,5	80		106.000	4.000	vor der nach dei	3
Vergl.(NaCl)	6,4	79	820	106.000	4.000	Aggregation	3
A 10"²	6,2	80	700	106.000	10.000	14
B 10"⁵	7,3	78	790	106.000	5.000	14
ΙΟ"⁴	7.0	78	820	106.000	5,000	14
C 10"⁵		790			14
	14

	Tr	Lg	Tabelle IX	! Anzahl der	Thrombozyten	_s	3
Produkt		( )	max. E	vor der	nach der	vor c	11
(in Mol)				Aggregation	Aggregation		3
	4,0	82		111.000	5.000	jitze	12
Vergl.(NaCl)	8,0	74	1060	106.000	18.000	ler nach dei	3
A 10	6,4	79	790	106.000	4.000	Aggregation	11
10"²	7,5	70	860	106.000	33.000	13	3
B 10"¹	4,3	77	630	106.000	4.000	14
ΙΟ"²	8,0	0	990	106.000	78.000	14
C 10	5,1	81	340	106.000	4.000	14
10~²		900			14
	14
14

Die Tabelle IX zeigt, daß die drei Produkte A, B und C bei einer Endkonzentration von 10 Mol die durch 20 Mikrogramra

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27^6 76 1 U

Collagen induzierte Aggregation hemmen. Die abnehmende Reihenfolge der Aktivität der Produkte ist C, B, A, sowohl bei den optischen Messungen wie auch bei den Messungen zur Zählung der Thrombozyten. Bei 10 Mol ist die Aktivität nicht mehr feststellbar. Die Tabelle VIII zeigt dagegen, daß bei der durch eine geringere Menge an Collagen induzierten Aggregation, nämlich bei 4 Mikrogramm, lediglich das Produkt B bei einer Dosis von 10""^ oder sogar 10" Mol aktiv ist.

Aus dem vorangegangenen ergibt sich, daß die drei Substanzen insbesondere bei der durch ADP induzierten Aggregation gleich aktiv erscheinen. Die mit Collagen durchgeführten Messungen scheinen dagegen die Überlegenheit der Verbindung B und C gegenüber der Verbindung A zu zeigen. Die Untersuchung der Form der Aggregationskurven erlaubt außerdem die Beobachtung einer Erhöhung der Geschwindigkeit der Desaggregation,

Der allgemeine Schluß, der aup diesen Untersuchungen gezogen werden kann, ist, daß die drei Verbindungen eine ganz und gar gleiche Wirkung besitzen, wobei jede Konzentrationsbetrachtung außer Acht gelassen wird: Tatsächlich setzen sie in besonders wirksamer Weise die durch ADP induzierte Plättchenaggregation herab xznd erhöhen die Geschwindigkeit der Desaggregation während der Erscheinungen der Aggregation mit ADP. Sie schützen ebenfalls die Plättchen gegen morphologische Modifizierungen, welche durch ADP oder durch Collagen induziert werden.

Die Aktivität dieser Substanzen erscheint daher sehr vorteilhaft, umsomehr, als die Aktivität zur üntiaggregation bei Plättchen nicht gleichzeitig mit einem negativen Einfluß auf den Koagulationsmechanismus und insbesondere auf die Bildung von Thrombin begleitet ist.

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Zl

Ein Vergleich der Aktivität der Substanz C mit derjenigen eines bekannten Antiaggregationsmittels, nämlich Lysinacetylsalicylat, wobei dies ein handelsübliches Produkt ist (Markenbezeichnung Aspisol) und wobei diese Substanz im folgenden als Produkt X bezeichnet ist, zeigt den medizinischen Fortschritt der erstgenannten Verbindung (wie auch seiner Homologen , der Verbindungen B und A) ,

Tatsächlich besitzt das vorbekannte Produkt X bessere Antiaggregationseigenschaften wie äicc aus der folgenden Tabelle X der Vergleichsversuche beim Tent auf durch Collagen induzierte· Aggregation ersichtlich ist.

	Tabelle X	maximale Extinkt. max.E.	Aggregations- latenz	Erläuterung
Produkt (mg/ml)	max.Geschwin digkeit der Aggregation in Grad (Lz)	320	27	normal
Vergl.	51 °	390 400	5?- J	Aggregation vom Normaltyp, jedoch verzögert
C (2) CO	61 ° 51 °	200	64	verlangsamte Geschwindigkeit, reduzierte Inten sität, sehr merkliche Verzö Verzögerung
X (2)	24 °	O		vollständige Inhibierung
CO	ο °

Hieraus ist ersichtlich, daß die Verbindung C unter den angewandten Bedingungen die Aggregation leicht verlangsamt, und dies proportional zu der angewandten Konzentration. Diese Verzögerung läßt sich als leichte Inhibierung interpretieren.

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Das Produkt X inhibiert die Aggregation partiell bei 2 mg/ml jedoch vollständig bei 4 mg/ml.

Jedoch besitzt das Produkt X zwei Sekundäreffekte, die schädlich sein können, während das Produkt C diese nicht aufweist.

1) Die Tabelle XI der Vergleicnsversuche hinsichtlich der thromboelastografischen Messungen zeigt, daß das Produkt X wegen seiner Antikoagulationseigenschaften die Bildung des Blutgerinsels verlangsamt, wobei dieser Effekt proportional zur Konzentration an Produkt X ist. Dagegen weist das Produkt C diese Besonderheit nicht auf.

Tabelle XI

Produkt Zeit zur Bildung Erläuterung

(mg/ml) des Gerinseis r + k

C (2) 2,8 normal

(4) 2,3 normal

X (2) 4,6 Y merkliche Verlangsamung

(4) 5»2 ) der Koagulation

2) Die folgenden Tabellen XII und XIII zeigen die Verteilung der Plättchen in Abhängigkeit ihres Volumens und zwar Jeweils vor und nach der Zugabe von Collagen. Sie zeigen, daß das Produkt C diese Verteilung praktisch intakt, d. h. unverändert, läßt, während das Produkt X im Gegensatz hierzu eine Vermehrung des Prozentsatzes der wenig voluminösen Plättchen mit sich bringt, wobei diese relativ weniger funktionell aktiv sind (kleinere, zusammengezogene Plättchen und Zellbruchstücke).

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Tabelle XII

vor der Zugabe von Collagen

OO O CO CD

Produkt (mg/ml)	Prozentsätze der in den 0 - _ 2,16- , 4,56-,	11,04	21,82	folgenden Volumina gemessenen Plättchen 6,9- , 9,56- , 11,76- , 14,16- , 16,56- , 9,36^ 11,76 p^J 14-,16Ar* 16,56/u-⁷ 18,96^	16,19	10,59	6,75	4,42	Erläuterungen
Vergl.	2,6	15,13	24-,O	21,50	15,7	8,8	5,6	5,75	normal
C (2)	4,55	14,4	25,7	20,7	14,0	8,6	5,5	5,5	normal
(4)	6,14	15,9	24,5	21,0	15,8	8,5	5,0	5,2	normal
X (2)	5,5	16,6	2^,6^	20,7	15,21	7,6	4,5	2,7	normal
(4)	6,4	20,94	normal

unterstrichen « Maximum

(Si

Tabelle XIII nach Zugabe von Collagen

Frodukt (mg/ml)	Prozentsätze der 0- 2,16- 4,56- 2,16 4,56 6,96	,6	11,0	21,8	in den 6,96- 9,56	folgenden Volumina 9,36- 11,76- 14,16- 11,76 14,16 16,56	10,6	6,7	gemessenen Plättchen (ϊ 16,56- 18,96- 21,56- ' 18,96 21,5ό 25,76	2,9	1,8	Erläute rungen
Vergl.	2		14,1	25,4	21,5	16,2	9,1	5,9	Ll Zi ·+, ·*	2,6	1,6	(D
C (2)	4		15,6	25,8	21,1	14,4	8,3		3,9	1,53	-	(2)
W	6	,7	26,1	22,7	20,1	13,5	3,9	2,4	2,3	1	0,7	(2)
X (2)	21		22,4	12,9	13,2	7,0	2,15	1,13	1,3	0,45	0,24	(3)
(4)	50	6,5	3,4	0,72		(4)

σ.· cn

unterstrichen ■ Maximum

Anmerkungen zu Tabelle XIII:

(1) Normalverteilung ohne Collagen

(2) normal

(3) Mischverteilung: Zelltrümmer-Plättchen

(4) charakteristische Verteilung von Zelltrümmern; sehr wenig intakte Plättchen

Hieraus ergibt sich, daß das Produkt C und ebenso die Produkte A und B in vorteilhafter Weise das Produkt X in all den Fällen ersetzen können, wo das Arzneimittel kontra indiziert sein könnte., und insbesondere bei folgenden Situationen:

a) Gastro-duodenalgeschwüre oder bei Personen^ welche solche Anamnesen hatten;

b) jeder chirurgische Eingriff und insbesondere bei der Chirurgie der Wiederherstellung von Arteriengefäßen und Herzgefäßen, beispielsweise bei Operationen am offenen Herzen;

c) Thrombosenerkrankungen allgemein (Myocard., Cerebralthrombosen, Gliederthrombosen);

d) allgemeine Plättchenpathologie: Thrombasthenie, Hypohyperplättchenbildung.

C. Dosierung

Untersuchungen hinsichtlich des Metabolismus der Verbindungen A, B und C haben gezeigt, daß eine Dosis von 8,5 bis 500 mg/kg, appliziert dreimal pro Tag in einem Intervall von 8 Stunden, einen ausreichenden Blutwert zu erreichen gestattet, um die Plättchenap;gregation in vivo zu hemmen.

D. Applikationsarten

Die Intensität und die Geschwindigkeit der Resorption dieser Produkte ermöglicht es, die gewünschten Blutwerte unabhäggig vom Applikationsweg zu erreichen, d. h. per os, intramuskulär, intraperitoneal oder intravenös.

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E. galenische Formen

Beispiele für galenische Formen sind folgende:

- Applikation per os: Kapseln mit 500 mg aktiver Verbindung;

- intramuskuläre oder intraperitoneale Applikation: Ampulle mit 1 g aktiver Verbindung in 5 <al bidestilliertem Wasser;

- trinkbare Lösung mit 100 mg pro ml Wasser + Propylenglykol,

F. Anwendungen

Die Verbindungen A, B und C finden ihre Anwendung auf folgenden Gebieten: Infarkten des Myocard, welche sich aus einer Hyperaggregationsfahigkeit oder einer Hyperadhäsionsfähigkeit von Plättchen ergeben, extrakorporale Zirkulationen oder Verwendung von Valvularprothesen, thromboembolytische Erkrankungen, Hyperaggregationsfahigkeit der Koronargefäße.

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Claims

Patentansprüche

1. Verwendung von 2-Pyrrolidonderivaten der Formel (I)

(I)

R-CH-CO-NH₀

worin R ein Wasserstoffatom, ein Methylrest oder Äthylrest ist, zur Behandlung von Gefäßerkrankungen beim Menschen,

2. Verwendung von 2-0xo-1-pyrrolidinacetamid gemäß Anspruch 1.

3. Verwendung von 2- (2-Oxo-pyrrolidino)-propionamid gemäß Anspruch 1.

4. Verwendung von 2-(2-Oxo-pyrrolidino)-butyramid gemäß Anspruch 1

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