DE2746761C2

DE2746761C2 - Verwendung von 2-Pyrrolidonderivaten zur Behandlung von Gefäßerkrankungen beim Menschen

Info

Publication number: DE2746761C2
Application number: DE2746761A
Authority: DE
Inventors: Joseph Dr. Dilbeek Strubbe
Original assignee: UCB SA
Current assignee: UCB SA
Priority date: 1976-10-19
Filing date: 1977-10-18
Publication date: 1986-04-17
Also published as: BG35622A1; FR2368275B1; AU2982477A; GB1583871A; IL53146A; AU509416B2; JPS5386040A; HK63181A; US4115579A; JPS607972B2; FR2368275A1; DE2746761A1; MY8200199A; IL53146A0; ZA776196B; BE859831A; RO75960A

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung bestimmter 2-Pyrrolidonderivate zurBehandlung von Gefäßkrankheiten, bei welchen es erforderlich ist, entweder die Blutplättchenaggregation oder das Zusammenklumpen von Plättchen zu hemmen oder ein bereits gebildetes Plättchenaggregat bzw. einen bereits gebildeten Plättchenklumpen zu entfernen. Die erfindungsgemäß verwendeten Wirkstoffe sind ebenfalls bei der prophylaktischen Behandlung von Gefäßerkrankungen vorteilhaft.

Die erfindungsgemäß verwendeten, aktiven Verbindungen sind nicht neu. Bereits bekannt ist ihre Aktiviiäl auf das Nervensystem und insbesondere ihre als nootrop bezeichnete Aktivität, wobei diese Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel I entsprechen:

ζΡ (I)

R —CH- CO-NH.

worin R ein Wasserstoffatom, den Methyl-oder Äthylrest bedeutet. Diese drei 2-(2-Oxo-pyrrolidino)-alkylamide sind die folge iden:

Verbindung A: 2-Oxo-l-pyrrolidinacetamid (oder Piracetam) mit R = H;
I. 35 Verbindung B: 2-(2-Üxo"--;'rroIidino)-propionamid mit R = Methyl;

Verbindung C: 2-(2-Oxo-pyrrolidino)-butyramid mit R = Äthyl.

Die Verbindung A und das Verfahren zu ihrer Herstellung sind in der GB-Patentschrift 10 39 113 beschrieben, während die Verbindungen B und C und ihre Herstellungsverfahren in der GB-Patentschrifi 13 09 692 beschrieben sind, wobei letzteres ein Zusatzpatent zum erstgenannten Patent ist.
Der Gegenstand der Erfindung ist im Anspruch definiert.

Im Verlauf von klinischen Untersuchungen, die mit diesen Verbindungen durchgeführt wurden, um ihren Ein-

fluß auf eine Therapie in Verbindung mit indirekter. Antikoagulationsmitteln wie beispielsweise Phenprocoumon zu bestimmen, wurde überraschenderweise gefunden, daß sie beträchtlich die Plättchenaggregation im Plasma von an Gefäßkrankheiten leidenden Patienten vermindern, ohne einen direkten oder indirekten Einfluß auf die Antikoagulationswirkung der gemeinsam verwendeten Antikoagulantien auszuüben.

Diese klinischen Beobachtungen rührten zur Bestätigung dieser Aktivität auf die Plättchen mittels traditioneller Untersuchungsmethoden auf diesem Gebiet. Tatsächlich sind Verbindungen, welche eine solche Aktivität besitzen, derzeit besonders gefragt, und bislang waren noch keine Verbindungen gefunden worden, welche alle Gesichtspunkte erfüllen. In erster Linie ist es die Aufgabe solcher Verbindungen, bei jedem Beginn des Auftretens von Thrombosesymptomen derart zu wirken, daß das Auftreten hiervon im Bereich von beschädigten Gefäßendothelier vermieden wird. Es ist unbedingt erforderlich, daß die Antiaggregationsmittel - im Gegensatz zu Antikoagulationsmitteln - nicht die Fähigkeit zur Koagulation verändern (insbesondere die Geschwindigkeit der Fibrinbildung), so daß ein Antiaggregationsmittel gleichzeitig mit einem Antikoagulationsmittel bei der prophylaktischen Behandlung von Thromboembolien eingesetzt werden kann.

Die Neigung von Plättchen zur Aggregation in menschlichem Plasma nimmt mit dem Alter zu, ebenso bei Personen, weiche an Gefäßerkrankungen leiden, gleichgültig, ob diese arteriell oder venös, obliterant oder chronisch sind. Aber selbst bei Personen, welche nicht an Gefäßerkrankungen leiden, nimmt die Neigung der Plättchen zur Aggregation nach Infektionen zu. Die Antikoagulantien wie beispielsweise Phenprocoumon oder Heparin beeinflussen ganz allgemein die Phase der Bildung von Fibrin, ohne die Erhöhung der Neigung zur Aggregation von Plättchen zu heilen, Aus diesem Grund wurden in den letzten Jahren intensive Untersuchun-,igen zur Auffindung0n Arzneimitteln durchgeführt, welche überhaupt'keine Wirkung auf den Hämostase-' rriechanismus besitzen, jedoch die Aggregation von Plättchen herabsetzen "öder unterdrücken. Beispielsweise hat sich herausgestellt, daß Acetylsalicylsaure eine starke Wirkung nicht nur auf die Plättchenaggregation, sondem unglücklicherweise auch auf die Hömostase bzw. Blutstillung besitzt, wodurch ihre therapeutische Anwendung auf diesem Gebiet beschränkt ist.

In gleicher Weise besitzen andere Antiaggregätionsverbindungen, wie Indomethacin und Phenylbutazon, einen schädlichen Einfluß auf die wirksame Dosis von indirekten Antikoagulantien, wie beispielsweise

Phcnprocoumon. Hierdurch ist es ausgeschlossen, eine Therapie unter Kombination dieser beiden Typen von Arzneimitteln anzuwenden. Eine ideale Antiaggregationsverbindung müßte daher die Neigung zur Aggregalion reduzieren oder sogar aufheben, ohne daß überhaupt ein Sekundäreffekt, insbesondere auf die Hämostase, vorliegt. Anders ausgedrückt bedeutet dies, daß diese Verbindungen bei der Konzentration, wo sie die Plättchenaggregation inhibieren, überhaupt keinen Einfluß auf die anderen Plättchenfaktoren besitzen dürfen, welche für die Rolle der Plättchen bei der Hämostase verantwortlich sind. Insbesondere wäre es äußerst wünschenswert, daß solche Arzneimittel nicht den Koagulationsmechanismus beeinflussen, insbesondere die Thrombinbildung. Bislang waren solche Arzneimittel sehr selten, siehe z. B.: E. Wenzel et al., Med. Welt. 25 (1976).

Unter diesem Gesichtspunkt ist die Wirkung der der zuvor angegebenen Formel I entsprechenden Verbindungen, nämlich ,on Piracetam und seinen beideit höheren Homologen, besonders interessant. Diese Verbindungen modifizieren die Verteilung von Thrombozyten (Plättchen) in Abhängigkeit ihres Volumens nicht, ebenso nicht die morphologischen, im Mikroskop beobachteten Parameter von Thrombozyten, und zwar auch bei sehr hohen Konzentrationen in der Größenordnung von 5 ■ 10"² Mol. Die drei Substanzen hemmen sehr wirksam eine durch ADP (Adenosindiphosphat) induzierte Aggregation bis zu Konzentrationen von ICT³ Mol, darüber hinaus erscheint ihre Spezifität in dem Fall sehr vorteilhaft, wo die durch ADP induzierte Aggregation inhibiert is wird, ohne daß die anderen Funktionen der Plättchen beeinträchtigt werden. Obwohl dieser Effekt tatsächlich an erster Stelle klinisch bei Piracetam beobachtet wurde, d. h. in vivo, scheint es, daß diese Verbindung bei der gleichen Konzentration jedoch in vitro a priori nicht so interessant zu sein scheint, insbesondere im Vergleich zu den Verbindungen B und C. Dies ist der Tatsache zuzuschreiben, daß in-vitro-Untersuchungen eine Orientierung und einen Hinweis auf die Aktivität der untersuchten Verbindung geben, ohne daß es a priori möglich wäre, diese Schlußfolgerungen integral auf Verhältnisse in vivo zu übertragen.

Die folgenden Untersuchungen sollen diese Schlußfolgerungen zeigen.

A. Beschreibung der unterschiedlichen, angewandten Methoden

1. Thromboelastografische Messungen an einem an Plättchen reichen,
mit Zitrat versetztem Plasma

In einer TEG-Apparatur( Apparatur von Hartert) wurde ein mit Zitrat versetztes, an Plättchen reiches Plasma vom Menschen, das von gesunden Personen erhalten worden war, wieder mit Calcium versetzt. In diesem Plasma sind die Anzahl von Thrombozyten und die Fibrinogenkonzentration bekannt und konstant. Der erneute Zusatz von Calcium erfolgt mit Hilfe einer 0,lmolaren Calciumchloridlösung. Die Rolle des Zitrates ist es, jede Koagulation vor dem Start der Versuche zu hemmen. Tatsächlich weisen die Zitrationen dieBesonderheit auf, daß sie in dem Plasma enthaltene Calciumionen chelatieren, wobei diese der Ursprung des Koagulationsprozesses sind. Das Auslösen des Koagulationsprozesses kann daher zu jedem Zeitpunkt durch eine einfache Wicdcrzuführung von Calcium unter Zugabe von Calciumchlorid erreicht werden. Es sei darauf hingewiesen, daß diese thromboelastografische Technik die Zunahme der Viskosität einer Blutpräparation im Verlauf der Koagulation ausnutzt. Das Prinzip dieser Technik besteht darin, daß der die zu untersuchende PräparaiJon er>thaltende Behälter einer oszillierenden Winkelbewegung unterworfen wird, und daß die Effekte der Koagulation auf einen am Ende eines Torsionsfadens aufgehängten und in die Präparation eintauchenden Zylinders untersucht werden. Wenn die Koagulation beginnt, nimmt das in den. Behälter enthaltene Plasma den Zylinder in seinen Oszillationsbewegungen mit. Als Zeitpunkt ι = 0 der Koagulation wird der Zeitpunkt gewählt, wo man die Aktivierung der für die Koagulation verantwortlichen Faktoren durch Zugabe von Calciumiontn hervorruft. Weiterhin werden bezeichnet:

»r« die Latenzzeit, welche dem wirksamen Beginn der Koagulation vorausgeht,

»am« die maximale Amplitude der Oszillationen des Zylinders,

»A« das Zeitintervall, welches zwischen dem Moment, in welchem der Zylinder zu oszillieren beginnt, und dem Moment, wo die Bewegungsamplitude gleich der unter den gleichen Bedingungen mit einem Plasma ohne Plättchen und daher mit normalem Fibrinogengehalt erhaltenen Maximalamplitude wird, liegt.

Die Gesamtkoagulationszeit einer Präparation wird durch d'e Svmtne von r + k gebildet. Die Kinetik der Koagulation wird durch die Parameter r und r + k und die Intensität der Koagulation durch die Maximalamplitude am der Zylinderoszillationen ausgedrückt.

Das Verhältnis am/r + k gibt die Geschwindigkeit der Verfestigung des Blutgerinnsels wieder.

In der gleichen Weise wird ebenfalls die maximale Elastizität des Thromb js (in den folgenden Tabellen mit max. E bezeichnet) gemessen, wobei dies ein indirektes Maß der Refraktion des Fibringerinsds, induziert durch die Thrombozyten, ist. Die Bestimmung der Maximalzeit der Halb-Lyse wird angewandt, um zu zeigen, daß keine Aktivierung des fibrinolytischen Systems vorliegt,

2. Messung der Koagulation

Die Zeil einer partiellen Wiederzugabe von Calcium iiines mit Kaolin behandelten Plasmas (Test PTT) wird als Messung der Fähigkeit zur Bildung von Eigenprothrombinase angewandt, siehe H. Vinazzer, Gerinnungsstörungen in der Praxis, Fischer-Verlag Stuttgart (1972). Für die Geschwindigkeit der Bildung von äußerem

Thrombin wird der Test zur Messung der Prothrombinzeit (abgekürzt PTZ) und der Hepatoquick-Test (siehe Vinazzer, loc. cit.) Angewandt.

Die Phase der Polymerisation des Fibrins wird durch die durch Thrombin, Reptilase und Thrombinkoagulase induzierte Koagulationszeit untersucht, siehe E. Wenzel et a!., Dtsch. med. Wsch. 15 (1974), S. 746-756 und P. E. Gregoire, Biochimie pathologique. Presses Acad. Eurpeennes, Paris, Maloine (1972), Kapitel 39, S. 831 (Les Maladies Hemorragiques).

3. Morphologische Untersuchungen von Thrombozyten und Analyse der Verteilung
der Plättchen als Funktion ihres Volumens

Die Morphologie von Thrombozyten, ausgestrichen auf einem Objektträger im Interferenzmikroskop (Vergrößerung 40Ox), wird als sehr empfindlicher Test zur Untersuchung der funktionellen Veränderungen von Thrombozyten angewandt. Dieser Test ergibt im wesentlichen nicht quantitative Anzeigen und ermöglicht es insbesondere, die Veränderungen in den energetischen Metabolismen von Thrombozyten nachzuweisen.

Die Analyse des Volumens von Teilchen mit einem Kanalanalysator (Coulter Counter Channelyzer), die elektronisch und automatisch erfolgt, ermöglicht den Erhalt von qualitativen jedoch weniger empfindlichen Angaben hinsichtlich der stärker ausgeprägten Veränderungen von Thrombozyten. Auf diese Weise können durch diese Methode typische, morphologische Veränderungen von Thrombozyten oder Prozesse derFragmentierung oder auch Erscheinungen der Aggregation auf präzise Weise quatitativ bestimmt werden. Geringere Modifikationen entziehen sich jedoch diesen Untersuchungen, siehe hinsichtlich dieser Methode H. Holzhüter et al., Thromb. et diath. Suppl. im Druck (1976) sowie H. Holzhüter et al., Verh. Dtsch. Ges. f. Inn. Med. (1974).

4. Trübungsmessung des Aggregationsprozesses

In einem nach Born modifizierten Aggregator (Modell ELVI) oder in einem Universalaggregometer von Eppendorf, wird unter fortwährendem Rühren ein an Plättchen reiches Plasma (abgekürzt PRP) bei 37°C eingesetzt. Nach einer konstanten Vorinkubationszeit von 30 Minuten wird zu dem PRP 10"⁴ bis 10"⁶ Mol ADP oder 20 μg bis 4 ug/ml PRP an Collagen hinzugesetzt, und der Prozeß der Aggregation wird direkt in Form der Kurven der Herabsetzung der Extinktion oder der Erhöhung der Transmission aufgezeichnet. Als Maßstab wird grafisch die maximale Modifizierung der Extinktion pro Minute oder auch die Zeit, welche auf der Extinktionskurve den ersten Wendepunkt von dem niedrigsten Punkt dieser Kurve (»Reaktionszeit«) trennt, ermittelt. Diese Messungen werden durch eine Analyse der Verteilung der nicht-aggregierten Thrombozyten als Funktion ihres VoIumens vervollständigt.

B. Resultate der Untersuchungen

Falls keine gegenteilige Angabe gemacht ist, sind die für die Verbindungen A, B und C angegebenen Konzentrationen die Endkonzentrationen in den zu untersuchenden Proben in Mol/I.

1. Einfluß der Verbindungen A, B und C auf die funktionellen Fähigkeiten
von Thrombozyten des Menschen

Zu einem aus dem Plasma von zehn gesunden Personen entnommenen PRP gibt man zunehmende Mengen der Verbindungen A, B und C, anschließend läßt man während 30 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubieren, dann werden folgende Untersuchungen durchgeführt:

- eine Analyse der Verteilung in Volumen (Coulter-Zähler)

thromboelastografische Untersuchungen bei einem wieder mit Calcium versetzten PRP,
morphologische Untersuchungen der auf einem Mikroskopobjektträger ausgestrichenen Thrombozyten.

Ergebnisse und Schlußfolgerungen

Selbst sehr hohe Konzentrationen (1 Mol) der Verbindungen A und C beeinflussen die Morphologie der ausgestrichenen Thrombozyten nur sehr minimal (leichtes Anwachsen der nicht ausgestrichenen Thrombozytenj 60 formen). Bei Konzentrationen von 10~² Mol und geringer ist dieser Effekt für keine der Verbindungen A, B oder C mehr nachweisbar, siehe folgende Tabelle I. Der Normalwert für nicht-ausgestrichene Thrombozyten liegt

zwischen 35 und 45%.

Tabelle I

I'rodukl (Mol) Ergebnis Nichl-ausgeslrichene

Thrombozyten

Vergleich I schwache Inhibierung 39

(Nat.*?)

Vergleich II schwache Inhibierung 41 IO

(NaCI)

A 1 geringe Zunahme der Inhibierung 43

A 10"' wie Vergleich 38

A 10"- wie Vergleich 40 15

A 10"·' wie Vergleich 37

B 1 wie Vergleich 39

BIO'¹ wie Vergleich 40

B i0"² wie Vergleich 37 2ü

B 10"³ wie Vergleich 40

Cl geringe Zunahme der Inhibierung 41

C 10"' wie Vergleich 39

C I0'³ wie Vergleich 40 25

C 10~³ wie Vergleich 39

Die Verteilung von Thrombozyten in Abhängigkeit ihres Volumens wird nicht modifiziert, selbst bei hohen Konzentrationen der drei untersuchten Verbindungen. 30

in der folgenden Tabelle I] ist die Anzahl der Thrombozyten für zunehmende Konzentrationen an Verbindungen A, B und C angegeben.

belle II

In gleicherweise werden die funktionellen, thromboelastografischen Parameter von Plättchen und insbesondere die Festigkeit des Thrombus (wobei dies ein indirektes Maß der Retraktion des Blutgerinnsels unter dem Einfluß von Thrombozyten ist) nicht signifikant durch selbst hohe Konzentrationen an Verbindungen A, B oder C beeinflußt. In der folgenden Tabelle III sind die Resultate des Thromboelastogramms angegeben, gemessen an Lösungen, welche 9 Teile PRP auf 1 Teil zu untersuchendes Produkt enthalten. 55

Tabelle II	Anzahl der Thrombozyten
Produkt (Mol)	95 000
Vergleich	107 000
A ΙΟ'¹	98 000
ΙΟ"²	97 000
ΙΟ"⁵	97 000
B 10"'	98 000
ΙΟ"²	97 000
ΙΟ"³	95 000
C 10"'	94 000
ΙΟ"²	89 000
ΙΟ"³

Tabelle III

Produkt (Mol) r k r+k

Vergleich PRP 1,6 0,5 2,1 4,9

Vergleich NaCI 2,0 0,8 2,8 5,4

A IO"³ 1,5 0,5 2,0 4,7

A 10"⁴ 1,7 1,1 2,8 3,3

A ΙΟ"⁵ 1,5 1,1 2,6 3,0

am	max.E	60
r + k
2,33	96,1
1,93	117,4	63
2,35	88,7
1,18	49,3
1,15	42,9

Fortsetzung

Produkt (Mol) r k r + k am am max./;

Vergleich PRP 1,6 0,5 2,1 4,9

Vergleich NaCl 2,0 0,8 2,8 5,4

B 10"³ 1,9 0,8 2,7 6,0

B ΙΟ-⁴ 2,3 1,2 3,5 4,9

B ΙΟ"⁵ 1,4 0,4 1,8 6,0

10 „ .„..,

r + k	96,1
2,33	117,4
1,93	150,0
2,22	96,1
1,4	150,0
3,3	88,7
0,5	127,3
0,63	85,2
0,58

Vergleich PRP 6,4 3,0 9,4 4,7

Vergleich NaCl 6,5 2,4 8,9 5,6

C ΙΟ"³ 5,8 2,2 8,0 4,6

C 10"⁴ 5,0 3,7 8,7 3,9 0,45 63,9

C 10"⁵ 4,1 1,4 5,5 4,5 0,82 82,2

Die Tabelle III zeigt den Einfluß der Verbindungen A, B und C auf die maximale Festigkeit des Thrombus und auf die Zeit der Bildung des Blutgerinnsels unter Zuhilfenahme von thromboelastografischen Untersuchungen bei einem PRP vom Menschen vor und nach Zugabe der zu untersuchenden Produkte. Endkonzentrationen von 10~² bis 10"³ Mol dieser Verbindungen beeinflussen die maximale Festigkeit des Thrombus und die Zeit zur Bildung des Blutgerinnsels nur in wenig ausgeprägter Weise.

2. Einfluß von erhöhten Konzentrationen von Verbindungen A, B und C auf die innere und äußere Thrombinbildung und auf die Geschwindigkeit der Polymerisation von Fibrin

Zu einem Plasma, das von gesunden Spendern erhalten worden war, wurden zunehmende Konzentrationen der zu untersuchenden Produkte zugesetzt, anschließend wurde bei Umgebungstemperatur für 30 Minuten inkubiert. Als Vergleich wurden die gleichen Plasmapräparate verwendet, denen man das gleiche Volumen an Lösungsmittel, wie es für die zu untersuchenden Substanzen verwendet wurde (9 Teile isotonischer NaCI-Lösung auf 1 Teil Zitrat), zugesetzt hatte. Die pH-Werte der so erhaltenen Lösungen variierten zwischen 7,2 und 7,6.

Resultate und Schlußfolgerungen

Selbst sehr hohe Konzentrationen der drei Substanzen (bis zu 10"' Mol) haben keinen Einfluß auf die Geschwindigkeit der Bildung von innerem Thrombin (Test PTT) und von äußerem Thrombin (Qi'icktest).

Bei Konzentrationen höher als 10"² Mol zeigten die drei untersuchten Verbindungen eine sehr deutliche Hemmwirkung auf die Fibrinpolymerisation. Die Thrombinzeit wird dagegen nur gering beeinflußt. Bei Konzentrationen gleich oder unter 10~² Mol (z.B. 10~²und 10~³ Mol) wird die Fibrinpolymerisation nicht in merklicher Weise beeinflußt, ebensowenig die Phase der Thrombinbildung.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV
Ergebnisse der Plasmakoagulation nach Inkubation mit den Produkten A, B und C

Produkt (Mol) Thrombin- PTT Quick- Fibri- Repti- Thrombin

zeit test nogen läse koagulase

Vergl.	Il	(NaCl)
A 10	-1
10	-2
10	-J
Vergl.	II	(NaCl)
Vergl.	I	(NaCl)
B 10	-1
10	-2
10	3
Vergl. II	(NaCl)

17,8	36,5	100	168	16,8	20,3
22,9	36,1	90	144	34,1	54,0
19,0	34,6	89	132	18,4	21,4
20,2*)	32,0*)	100*)	210*)	15,8*)	24,8*)
20,8*)	31,8*)	100*)	240*)	15,0*)	26,5*)
17,8	35,5	100	168	16,8	20,3
24,9	38,5	85	144	37,3	42,8
18,3	34,5	89	140	17,6	22,6
21,2*)	31,8*)	100*)	240*)	16,5*)	25,6*)

20,8*) 31,8*) 100*) 240*) 15,0*) 26,5*)

X / TVJ /Vl

Fo rise !.zu ng

Produkt (Mol) Thrombin- PTT Quick- Fibri- Repti- Thrombin-

zcit test nogen läse koagulase

Vcrgl. I (NaCl) 17,8 35,5 100 168 16,8 20,J

C ΙΟ"¹ 22,9 36,1 90 144 34,1 54,0

10"² 19,0 34,6 89 132 18,4 21,4

10~³ 20,2*) 32,0*) 100*) 210*) 15,8*) 24,8*)

Vergl. II (NaCl) 20,8*) 31,8*) 100*) 240*) 15,0*) 26,5*)

*) Dies bedeutet, daß der Vergleich Il den bei der Konzentration von 10"³ Mol durchgeführten Versuchen entspricht.

Die Ergebnisse sind in Sekunden angegeben, mit Ausnahme des Fibrinogens, wo sie in mg/100 ml angegeben sind.

3. Einfluß der Verbindungen A, B und C auf die durch Collagen oder ADP

induzierte Fläiichenaggregation

Der Einfluß von zunehmenden Konzentrationen der Verbindungen A, B und C auf den Vorgang der durch hohe oder schwache Konzentrationen von ADP oder von Collagen induzierten Plättchenaggregation wurde untersucht. Während 30 Minuten wurde PRP mit den zu untersuchenden Substanzen bis zu Konzentrationen in der Größenordnung von 10"⁵ Mol inkubiert. Als Vergleiche wurden PRP mit einer konstanten Anzahl von Thrombozyten, entweder als solches oder mit einem Puffer versetzt verwendet. Da jeder Versuch ungefähr 4 Stunden dauert, muß die Veränderung der Plättchen berücksichtigt werden, die in jedem Falle stattfindet, wenn man Thrombozyten vom Menschen bei Umgebungstemperatur stehenläßt (tatsächlich gibt es eine spontane Neigung hiervon zur Aggregation). Infolgedessen wurden die Vergleiche nach jeder Reihe von Versuchen wiederholt.

Bei den ersten Vorversuchen «yurde die nach dem Prinzip von Born modifizierte Trübungsmethode (Trübungsmeßgerät ELVl) angewandt. Als Maß für die Aggregation (oder für die Entaggregation) wurde die Modifizierung der Extinktion herangezogen, gemessen durch grafische Extrapolation der aufgezeichneten Extinktionskurve. Außerdem wurde ebenfalls die Neigung der Kurve und die maximale Veränderung der Transmission im Verlauf der Reaktion in Betracht gezogen.

Das quantitative Maß für die Erscheinungen der Aggregation und der Desaggregation (Entaggregation) wurde durch die Verminderung der absoluten Zahl der Plättchen (Verminderung der Zahl der nicht-aggregierten Thrombozyten in dem Plasma nach dem Beginn des Aggregationsprozesses) bestimmt. Weiterhin wurde die Volumenverteilung von freien, nicht-aggregierten Plättchen während des Aggregationsprozesses bestimmt. Auf diese Weise wurde ein direktes Maß der Kinetik der Aggregation und des Prozesses der Pesaggregation erhalten.

Für die Versuche der durch ADP oder Collagen induzierten Aggregation wurden Plasmapräparationen von gesunden Personen verwendet, weiche im Mittel zwischen 80 und 120 000 Plättchen pro mm³ enthielten. Alle Versuche wurden mehrere Male wiederholt.

Resultate

Die Verbindungen A, B und C inhibieren die durch ADP oder durch Collagen induzierte Aggregation von Plättchen, ohne die Verteilung von Thrombozyten in Abhängigkeit von ihrem Volumen zu beeinträchtigen. Ganz im Gegensatz dazu wird der Einfluß von ADP und von Collagen auf die letztgenannte Eigenschaft unterdrückt (dieser Einfluß zeigt sich durch eine Verminderung der größten Thrombozyten, welche funktionell besonders aktiv sind, sowie durch eine relative Erhöhung der Anzahl von kleineren Thrombozyten, welche relativ weniger aktiv sind, immer funktionell ausgedrückt).

Für die Verbindung A wurde dies in erster Linie durch fotometrische Methoden gezeigt.

In der folgenden Tabelle V sind die Ergebnisse der Extinktionskurven, welche selbst nicht wiedergegeben sind, angegeben. Es handelt sich um eine durch ADP in unterschiedlichen Konzentrationen (10~⁴, 10"⁵, 10"⁶ Mol) induzierte Aggregation. Die Verbindung A (0,14 Mol) wurde während 30 Minuten mit PRP inkubieren gelassen.

Bedeutung der verschiedenen Symbole:

Tr. Dies ist die Zeitspanne, welche auf der Extinktionskurve den ersten Wendepunkt von dem niedrigsten

Punkt dieser Kurve trennt;

Lr. Winkel, der ein Maß der maximalen Aggregationsgeschwindigkeit gibt; max.f: Unterschied der absoluten Extinktion im Plasma vor und nach der Aeareeation.

Tabelle V

Endkonzentration 5 von ADP

Produkt (Mol)

Lz

max.£

Anzahl der Thrombozyten

vor der
Aggregation

nach der Aggregation

ΙΟ"·⁴ MoI

¹⁰ 10"⁵ Mol

10"" Mol

15

20

NaCl (Vergl.) A 0,14

0,5 1,0	70 60	610 340
0,9 1,3	71 31	470 115
1,5	33 0	220 95

112 000
109 000
107 000
101 000

112 000
105 000

20 000

78 000 59 000

79 000 54 000 83 000

In der folgenden Tabelle VI sind die Ergebnisse der Extinktionskurven wiedergegeben, wobei diesmal jedoch die Konzentxaiion der Verbindung A variiert wurde. Die Arbeitsbedingungen waren die gleichen wie zuvor. Das ADP wurde in einer Konzentration von 10"⁶ Mol verwendet. Die nicht-verdünnte Lösung der Verbindung A ist 1,41 molar.

Tabelle Vl

25

Untersuchte Lösungen

Endkonzentration an A (in Mol)

Lz

max.£

Anzahl der Thrombozyten vor der Aggregation

30

35

45

50

55

60

65

9 Tie. PRP + 1 Tl. NaCl

9TIe. PRP+ITl. A (1 :(/) 0,14

9TIe. PRP+ ITI. A(I : 5) 0,028

9 Tie. PRP + 1 Tl. A (I : 10) 0,014

9 Tie. PRP + 1 Tl. A (1 : 100) 0,0014

9 Tie. PRP + 1 TI. A (I : 1000) 0,00014

3,9	62	370
-	ISO	140
1,0	45	270
1,2	59	380
1,0	57	350
1,0	58	370

152 000 152 000 152 000 160 000 160 000 160 000

In der Zeichnung ist ein Beispiel für Verteilungskurven von Plättchen in A bhängigkeit ihres Volumens, erhalten mit der Verbindung A unter folgenden Bedingungen wiedergegeben:

- 0,9 ml PRP, 30 Minuten inkubiert mit Verbindung A (0,14MoI)
0,1 ml einer ADP-Lösung, 10~⁴molar.

Die F i g. 1 zeigt die Verteilungskurve in Abhängigkeit des Volumens von Plättchen mit der Verbindung A vor der Aggregation, während die Fig. 2 die gleiche Kurve nach der Aggregation wiedergibt.

Die Fig. III und IV zeigen die gleichen Kurven, erhalten mit einem Vergleich (NaCl).

Als Abszisse bei diesen Kurven sind die Kanäle von 0 bis 100 (nach dem Prinzip eines Kanalanalysators) angegeben, und auf der Ordinate ist die Zahl dereinem vorgegebenen Kanal entsprechenden Thrombozyten aufgetragen.

In der folgenden Tabelle VII sind die in den fotometrischen Kurven und in den Verteilungskurven pro Volumen der Plättchen enthaltenen Ergebnisse bei Verwendung der Verbindungen A, B und C wiedergegeben. Die Arbeitsbedingungen waren wie folgt:

durch 0,1 ml einer 10^⁶molaren ADP-Lösung induzierten Aggregation,
- 0,9 ml PRP, inkubiert während 30 Minuten mit der zu untersuchenden Substanz.

Tabelle VII	Tr	Lz	max.f	2.	Anzahl der Thrombozyten	nach der	Spitze	nach der
Produkt		(°)	1.	Spitze	vor der	Aggregation	vor der	Aggre
(in Mol)			Spitze		Aggregation		Aggre	gation
				730		58 000	gation	14
	0,9	66	420	200	95 000	76 000	19	17
Vergl. NaCl	-	0	220	340	107 000	37 000	19	15
A ΙΟ'¹	0,9	62	290	300	98 000	27 000	17	13
A 10"²	0,9	62	270		97 000		18
A 10'³

	Tr	Lz	27 46 761	max.iT	Anzahl der Thrombozyten	nach der	78 000	Spitze	nach der	ug/ml) und	Volumen der Plättchen unter	Verwendung	der Verbindungen A	B und C	erhaltenen	Lz	max.£	der zu untersuchenden Substanz.	nach der	nach der	Spitze	nach der	j I	20	I	25	j	50	.ί	55
		(°)		1. 2.	vor der	Aggregation Aggregation	50 000	vor der	Aggre	in der Tabelle IX (Konzentration an Collagen = 20 μg/ml) sind die aus den fotometrischeh Kurven und aus den	Die Arbeitsbedingungen waren wie .folgt:				(°)			Aggregation	Aggregation	vor der	Aggre	I S			!
			Spitze Spitze		26 000	Aggre	gation	Verteilungskurven pro	einer Menge von 20μg bzw. 4 μg Collagen (in Suspension) pro ml PRP induzierte Aggre-						Aggre	gation	j	I "i
				97 000		gation	16	Ergebnisse aufgeführt.					4 000	5 000	gation	3	i	30 I	60
		0	80 70	98 000	84 000	17	15	- durch Collagen in		80	820		4 000	18 000	14	3	5 . 1	I
	0,9	64	380 260	97 000	55 000	15-20	5	gation	inkubiert während 30 Minuten mit	79	700	Anzahl der Thrombozyten	10 000	4 000	14	3	I h	a
	0,8	66	450 500		30 000	16	15	- 0,9 ml PRP₁		80	790	vor der	5 000	33 000	14	3		35 ij	65 j
				95 000			17			78	820	Aggregation	5 000	4000	14	3	¹⁰ §	\
	—	0	80 80	94 000	11000	17	15	Tabelle VIII	Tr	78	790			78 000	14		I	I
	1,1	66	390 290	89 000		17	1	Produiit				106 000	Anzahl der Thrombozyten	4 000				40 !,
	1,4	70	420 400			16	15	(in MoI)		Lz	ma.\.E	106 000	vor der		Spitze	nach der
				98 000		5			(°)		106 000	Aggregation		vor der	Aggre	15 j	Fj
	0,9	65	500 760		19	Die gleichen Versuche wurden für eine durch Collagen bei unterschiedlichen Konzentrationen des Collagens		7,5			106 000			Aggre	gation	i	45 i
				induzierte Aggregation durchgeführt. In der folgenden Tabelle VIII (Konzentration an Collagen = 4	Vergl. NaCI	6,4			106 000	111000		gation	3		\
				A 10~²	6,2	82	1060		106 000	13	11
			B 10"³	7,3	74	790	106 000	14	3
	ίο-⁴	7,0	79	860	106 000	14	12
	C 10"³		70	630	106 000	14	3
	Tabelle IX	Tr	77	990	106 000	14	11
	Produkt		0	340	106 000	14	3
	(in Mol)		81	900	Produkte! A, B und C bei einer	14	!Endkonzentration von 10"' Moi die durch
			daß die die			Collagen induzierte Aggregation hemmen. Die abnehmende Reihenfolge der Aktivität der 9
		4,0
	Vergl. NaCl	8,0
	A 10"'	6,4
	ΙΟ"²	7,5
	B 10"'	4,3
	1Ö"²	8,0
	C 10"'	5,1
	ΙΟ"²	zeigt,
	Die Tabelle IX
	20 Mikrögrärnm

















Fortsetzung
Produkt
(in Mol)


B 10"'
B I0~²
B I0~³

C 10"¹
C 10"²
C 10~³

Vergl. NaCl

Produkte ist C, B A, sowohl bei den optischen Messungen wie auch bei den Messungen zur Zählung derThrombozyten. Bei 10~* Mol ist die Aktivität nicht mehr feststellbar. Die Tabelle VIII zeigt dagegen, daß bei der durch eine geringere Menge an Collagen induzierten Aggregation nämlich bei 4 Mikrogramm, lediglich das Produkt B bei einer Dosis von 10~³ oder sogar 10~⁴ Mol aktiv ist.

Aus dem vorangegangenen ergibt sich, daß die drei Substanzen insbesondere bei der durch ADP induzierten Aggregation gleich aktiv erscheinen. Die mit Collagen durchgeführten Messungen scheinen dagegen die Überlegenheit der Verbindung B und C gegenüber der Verbindung A zu zeigen. Die Untersuchung der Form der Aggregationskurven erlaubt außerdem die Beobachtung einer Erhöhung der Geschwindigkeit der Desaggregation.

Der allgemeine Schluß, der aus diesen Untersuchungen gezogen werden kann, ist, daß die drei Verbindungen eine ganz und gar gleiche Wirkung besitzen, wobei jede Konzentrationsbetrachtung außer acht gelassen wird: Tatsächlich setzen sie in besonders wirksamer Weise die durch ADP induzierte Plättchenaggregation herab und erhöhen die Geschwindigkeit der Desaggregation während der Erscheinungen der Aggregation mit ADP. Sie schützen ebenfalls die Plättchen gegen morphologische Modifizierungen, welche durch ADP oder durch Collagen induziert werden.

Die Aktivität dieser Substanzen erscheint daher sehr vorteilhaft, um so mehr, als die Aktivität zur Antiaggregation bei Plättchen nicht gleichzeitig mit einem negativen Einfluß auf den Koagulationsmechanismus und insbesondere auf die Bildung von Thrombin begleitet ist.

Ein Vergleich der Aktivität der Substanz C mii derjenigen eines bekannten Antiaggregationsmittels, nämlich LysinacetyisiJicylat, wobei dies ein handelsübliches Produkt ist (Markenbezeichnung Aspisol) und wobei diese Substanz im folgenden als Produkt X bezeichnet ist, zeigt den medizinischen Fortschritt der erstgenannten Verbindung (wie auch seiner Homologen, der Verbindungen B und A).

Tatsächlich besitzt das vorbekannte Produkt X bessere Antiaggregationseigenschaften, wie dies aus der folgenden Tabelle X der Vergleichsversuche beim Test auf durch Collagen induzierte Aggregation ersichtlich ist.

Tabelle X

Vergl.

35 C (2) (4)

X (2)

(4)

Produkt	Max. Geschwin	Maximale	Aggregations-	Erläuterung
(rag/ml)	digkeit der	Extinkt.	latenz
	Aggregation	max.£
	in Grad (Lz)

51°

61° 51^Ü

24°

0°

320

390 400

200

normal

Aggregation vom Normaltyp, jedoch verzögert

verlangsamte Geschwindigkeit, reduzier Intensität, sehr merkliche Verzögerung

vollständige Inhibierung

Hieraus ist ersichtlich, daß die Verbindung C unter den angewandten Bedingungen die Aggregation leicht verlangsamt und dies proportional zu der angewandten Konzentration. Diese Verzögerung läßt sich als leichte Inhibierung interpretieren.

Das Produkt X inhibiert die Aggregation partiell bei 2 mg/ml, jedoch vollständig bei 4 mg/ml.

Jedoch besitzt das Produkt X zwei Sekundärefiekte, die schädlich sein können, während das Produkt C diese nicht aufweist.

1) Die Tabelle XI der Vergleichsversuche hinsichtlich der thromboelastografischen Messungen zeigt, daß das Produkt X wegen seiner Antikoagulationseigenschaften die Bildung des Blutgerinnsels verlangsamt, wobei dieser Effekt proportional zur Konzentration an Produkt X ist. Dagegen weist das Produkt C diese Besonderheit nicht auf.

55 Tabelle XI

Produkt (mg/ml)

C^äi(2): (4)

(4)

Zeit zur Bildung des Gerinnsels r+k

Erläuterung

2,3

,2 J

normal .
normal

merkliche Veriangsämung der Koagulation

2) Die folgenden Tabellen XII und XJII zeigen die Verteilung der Plättchen in Abhängigkeit ihres Volumens, und zwar jeweils vor und nach der Zugabe von Collagen. Sie zeigen, daß das Produkt C diese Verteilung praktisch intakt, d. h. unverändert, läßt, während das Produkt X im Gegensatz hierzu eine Vermehrung des Prozentsatzes der wenig voluminösen Plättchen mit sich bringt, wobei diese relativ weniger funktionell aktiv sind (kleinere, zusammengezogene Plättchen und Zellbruchstücke).

Tabelle XII

Vor der Zugabe von Collagen

Produkt	Prozentsätze der in de;	ι folgenden	Volumina j	gemessenen	Plättchen	6,96-	9,36-	11,76-	14,16-	21,36	I6_V56-	Erläute
(mg/ml)	0- 2,16-	4,56-	6,9-	9,36-	11,76-	9,36	11,76	14,16	16,56 J		18,96 u?	rungen
	2,16 μ³ 4,56 μ³	6,9 -J	9,36 u³	11,76 a³	14,16 -J		6,73	4,42
Vergl.	2,6 11,04	21,82	21,50	16,19	10,59	5,6	3,75	normal
C (2)	4,35 15,13	24,0	20,7	13,7	8,8	5,3	3,5	normal
(4)	6,14 14,4	23,7	21,0	14,0	8,6	5,0	3,2	normal
X (2)	5,3 15,9	24,3	20,7	13,8	8,3	4,3	2,7	normal
(4)	6,4 16,6	25,05	20,94	13,21	7,6			normal
Unterstrichen = Maximum.
Tabelle ;
Kill
Nach Zugabe von Collagen	Prozentsätze der in den folgenden Volumina gemessenen Plättchen (■/)	14,16- 16,56- 18,96	- 21,36-	Erläu
Produkt	0- 2,16- 4,56-	16,56 18,96	23,76	terun
(mg/ml)	2,16 4,56 6,96	gen

Vergl.

2,6

21,7
50.1

11,0 21,8 21,5

14,1
!5,6

26,1
22,4

23,4 23,8

22,7 12,9

21,1

on ι

iU, I

13,2 6,5

16,2 14,4

7,0

3,4

10,6

9,1 8,3

3,9 2,15

1,3
0,72

2,9

2,6
1,53

1
0,45

1,8
1,6

0,7
0.24

(D

Unterstrichen = Maximum.
Anmerkungen zu Tabelle XIII: (1) Normalverteilung ohne Collagen {2) normal

(3) Mischverteilung: Zelltrümmer-Plättchen

(4) charakteristische Verteilung von Zelltrümmern; sehr wenig intakte Plättchen.

Hieraus ergibt sich, daß das Produkt C und ebenso die Produkte A und B in vorteilhafter Weise das Produkt X in all den Fällen ersetzen können, wo das Arzneimittel kontraindiziert sein könnte und insbesondere bei folgenden Situationen:

a) Gastro-duodenalgeschwüre oder bei Personen, welche solch? Anamnesen hatten;

b) jeder chirurgische Eingriff und insbesondere bei der Chirurgie der Wiederherstellung von Arteriengefäßen und Herzgefäßen, beispielsweise bei Operationen am offenen Herzen;

c) Thrombosenerkrankungen allgemein (Myocard, Cerebralthrombosen, Gliederthrombosen);

d) allgemeine Plättchenpathologie: Thrombasthenie, Hypohyperplättchenbildung.

C. Dosierung

Untersuchungen hinsichtlich des Metabolismus der Verbindungen A, B und C haben gezeigt, daß eine Docis von 8,5 bis S'OÖ'rngVkgV'äp'pi^ziert-drelmai.prö'iiagJn.einemJntervair-vöh 8 Stünden; einen äusreichenäjn'BJütwert zu erreichen gestattet, um die Plättchenaggregätion in vivo zu hemmen.

D. Applikationsarten

Die Intensität und die ileschwindigkeit der Resorption dieser Produkte ermöglicht eSj die gewünschten Blutwerte unabhängig vom Applikätiorisweg zu erreichen, d.h. peros, intramuskulär, intraperitorieal oder intravenös.

11

E. galenische Formen Beispiele für galenische Formen sind folgende:

5 - Applikation per os: Kapseln mit 500 mg aktiver Verbindung;

- intramuskuläre oder intraperitoneale Applikation: Ampulle mit 1 g aktiver Verbindung in 5 ml bidestillicrtem Wasser; trinkbare Lösung mit 100 mg pro ml Wasser + Propylenglykol.

F. Anwendungen

Die Verbindungen A, B und C finden ihre Anwendung auf folgenden Gebieten: Infarkten des Myocard'¹, welche sich aus einer Hyperaggregationsfähigkeit öder einer Hyperadhäsionsfähigkeit von Plättchen ergeben; •5 ejttrakorporale Zirkulationen oder Verwendung von Valvularprothesen, thromboembolytische Erkrankungen; Hyperaggregationsfähigkeit der Koronargefäße.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

12

Claims

Patentanspruch:
Verwendung von 2-Pyrrolidonderivaten der Formel (I)

ü=° ω

R—CH-CO—NH₂

worin R ein Wasserstoffatom, ein Methylrest oder Äthylrest ist,
zur Behandlung von Gefäßerkrankungen.