DE69911633T2

DE69911633T2 - Pharmazeutische zusammenstellungen die tetrahydroisoquinoleinverbindungen enthalten

Info

Publication number: DE69911633T2
Application number: DE69911633T
Authority: DE
Inventors: Hye Sook 11-205 Shindonga Apt. YUN-CHOI; Ki-Churl Chang; Duck-Hyung Anyang-si LEE; Jae-Chun Ryu
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST; Korea Institute of Science and Technology KIST
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST; Korea Institute of Science and Technology KIST
Priority date: 1998-10-21
Filing date: 1999-10-21
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2019-10-22
Also published as: CN100488508C; US6562837B1; KR100352425B1; JP3963301B2; CN1331593A; JP2002527479A; KR20000028711A; EP1124554B1; DE69911633D1; EP1124554A1; WO2000023078A1; AU6370299A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf neue pharmazeutische Verwendungen von Tetrahydroisochinolin-Verbindungen der nachstehend angegebenen chemischen Formeln 1 und 2. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können insbesondere als therapeutisch wirksame Ingredientien in pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Behandlung der Septikämie und der disseminierten intravasalen Koagulation (nachstehend als "DIC" bezeichnet) verwendet werden, die eindeutig verursacht wird durch eine Verstärkung der induzierbaren NO-Synthase-Induktion (nachstehend als "iNOS" bezeichnet):
chemische Formel 1
chemische Formel 2
Tetrahydroisochinolin-Verbindungen (nachstehend als "THI" bezeichnet) stellen N-Alkylphenylethylamine im Zustand eines geschlossenen Ringes dar. Insbesondere weisen die chemischen Strukturen von 6,7-Dihydroxytetrahydroisochinolinen ein gemeinsames Grundgerüst des Brenzkatechinamins auf. Das heißt, sie enthalten in ihren Strukturen, 3,4-Dihydroxyphenylethylamin, bei dem es sich um das Grundgerüst von Brenzkatechinamin handelt, für das Epinephrin, Norepinephrin und Dopamin repräsentative Beispiele sind. Viele THI-Verbindungen weisen eine Affinität gegenüber adrenergischen Rezeptoren auf. Außerdem wurde darüber berichtet, dass je nach ihren Substituenten-Arten und ihren Bindungspositionen, THI-Verbindungen auf α- und/oder β-Rezeptoren einwirken und agonistische und/oder antagonistische Effekte ausüben, wodurch sie verschiedene pharmakologische Aktivitäten aufweisen.
Insbesondere wird über THI-Verbindungen, die eine Hydroxy(OH-)-, Methoxy(OCH₃-)- oder halogen-substituierte Benzylgruppe an dem Kohlenstoffatom in der 1-Position aufweisen, berichtet, dass sie starke Aktivitäten aufweisen, wie z. B. eine Bronchodilatation, eine Inhibitor-Aktivität gegenüber der Blutplättchen-Aggregation, eine Calciumkanal-Blockierungswirkung und dgl. (King, V. F. et al., "J. Biol. Chem.", 263, 2238–2244, 1988; Triggle, D. J. et al., "Med. Res. Rev.", 9, 123–180, 1989; Lacorix, P. et al., "Eur. J. Pharmacol.", 192, 317–327, 1991; Chang, K. C. et al., "Life. Sci.", 51, 64–74, 1992; Chang, K. C. et al., "Eur. J. Pharmacol.", 238, 51–60, 1993).
Vor kurzem wurden Bisbenzyl-tetrahydroisochinolin-Verbindungen, wie z. B. Tetrandrin, Isotetrandrin und Chondrocurin, beschrieben, die eine starke Inhibitor-Aktivität gegenüber der Massenproduktion von NO, induziert durch das Endotoxin Lipopolysaccharid (nachstehend als "LPS" bezeichnet) aufweisen (Kondo, Y. et al., "Biochem. Pharmacol.", 46, 1861–1863, 1993).
Higenamin, eine THI-Verbindung, die eine 4-Hydroxybenzylgruppe in der Position 1 und eine Hydroxygruppe in jeder der Positionen 6 und 7 aufweist, ist sehr ähnlich in seiner Struktur dem Dobutamin, das als cardiotonisches Agens klinisch verwendet wird. Higenamin erhöht, wie gefunden wurde, die Herzmuskel(Myocard)-Kontraktionskraft und die Herzfrequenz und hemmt die Blutplättchenaggregation bei in vitro-Experimenten bei Verwendung von isolierten Herzen und sie erhöht die Herzleistung, die hypotensive Wirkung und die Blutplättchenaggregation bei in vivo-Experimenten bei Verwendung von Ratten oder Kaninchen. Es wurde außerdem berichtet, dass Higenamin bei Versuchen, bei denen peritoneale Makrophagen von Mäusen und Thorax-Aorta-Präparate von Ratten verwendet wurden, die Expression von iNOS und die NO-Bildung durch LPS hemmt (inhibiert), was zur Wiederherstellung der verminderten Gefäßreaktionsfähigkeit führte und die Mortalität als Folge von Endotoxin herabsetzte (Y. J. Kang et al., "J. Pharmacol. Exp. Ther." 291, 314–320, 1999). Außerdem wurde in einem Arthritis-Modell eine antiinflammatorische und analgetische Aktivität bei Higenamin festgestellt (Park, C. W. et al., "Arch. Int. Pharmacodyn.", 267, 279–288, 1984; Chang, K. C. et al., "Can. J. Physiol. Pharmacol.", 72, 327–334, 1994; Yun-Choi, H. S. et al., "Yakhak Hoeju" 38, 191–196, 1994; Kang, Y. J. et al., "Kor. J. Physiol. Phamacol.", 1, 297–302, 1997; Shin, K. N. et al., "Natural Products" Sciences, 2, 24–28, 1996). Higenamin hat jedoch den Nachteil, dass es einen Arzneimitteleffekt nur für eine kurze Zeitspanne aufweist und dass die genannten pharmakologischen Wirkungen unzureichend sind.
Als Ergebnis der Forschung zur Entwicklung von Higenamin-Derivaten mit verbesserten pharmakologischen Effekten ist es den Erfindern der vorliegenden Erfindung gelungen, neue Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 zu synthetisieren, die eine lang anhaltende Arzneimittelwirkung aufweisen und eine cardiotonische und hypotensive Wirkung haben, wie in dem Koreanischen Patent Nr. 148 755 beschrieben. Außerdem wurde in einem Versuch, bei dem isolierte Rattenherz-Präparate verwendet wurden, gefunden, dass diese neuen Verbindungen eine starke Wirkung in Bezug auf die Erhöhung der Herzmuskelkontraktionskraft und der Herzfrequenz haben, die isolierten Blut gefäße, die mit Phenylephrin kontrahiert worden waren, dilatieren und die Herzfrequenz erhöhen und den Blutdruck herabsetzen in einem Versuch, bei dem Kaninchen verwendet wurden, wie von den Erfindern der vorliegenden Erfindung berichtet (Lee, Y. S. et al.).
Aufgrund verschiedener Nachweise wurde berichtet, dass sauerstofffreie Radikale die in übermäßiger Menge gebildet werden, wie z. B. NO, als einer der Hauptfaktoren fungieren, die eine akute und chronische Gewebs/Organ-Schädigung hervorrufen. Die oben genannten Gewebs/Organ-Schädigungen können beispielsweise sein eine Gewebsschädigung durch eine Repertusion bei inflammatorischen Erkrankungen, wie z. B. Arthritis, Myocardinfarkt, einem cerebralen Apoplex, oder bei ischämischen Erkrankungen oder durch eine komplexe Organschädigung als Folge von Endotoxinen, die aus einer bakteriellen Infektion stammen. Es wurde daher viel Aufmerksamkeit gerichtet auf die Entwicklung von Materialien, welche die Expression von iNOS unterdrücken oder die Massenproduktion von NO hemmen (inhibieren), die zur Behandlung verschiedener Erkrankungen verwendet werden können, die durch eine große Menge NO hervorgerufen werden. Von diesen Materialien ist auch zu erwarten, dass sie gegen eine Myocard-Schädigung, die beispielsweise eine Folge eines akuten Herzinfarkts sein kann, oder gegen ischämische Herzerkrankungen schützen, wodurch die Verschlimmerung eines Herzversagens unterdrückt wird oder dieses geheilt wird.
Beschreibung der Erfindung
Unter Berücksichtigung der oben genannten Probleme haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung als Ergebnis umfangreicher Forschungsarbeiten gefunden, dass die Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 verwendbar sind als therapeutische Agentien zur Behandlung der Septikämie und der DIC aufgrund ihrer suppressiven Aktivität gegenüber der iNOS-Expression und der NO-Synthese.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Verwendung der Verbindungen der Formeln 1 und 2, bei denen es sich um 1-α-Naphthylmethyl-6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin bzw. um 1-β-Naphthylmethyl-6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin han delt, für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung der Septikämie und der DIC, wie in den Ansprüchen 1 und 5 jeweils beansprucht.
Es wurde festgestellt, dass die Verwendung der Verbindung der Formel 1 für die Behandlung des Kongestions-Herzversagens bekannt ist von Lee Y. S. et al., aus "Life Sciences" 1994, 55 (21), PL 415–420. Es ist ferner bekannt aus "Biosis AN=1998: 189 536, dass die Verbindung der Formel 1 die Expression des iNOS Gens im glatten Gefäßmuskel bei der Ratte unterdrücken kann.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Patentansprüchen 2 bis 4 bzw. 6 bis 8 definiert.
chemische Formel 1
chemische Formel 2
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die oben genannten und weitere Ziele, Merkmale und weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen deutlicher hervor, wobei zeigen:
1 ein Autoradiogramm eines Northern Blot das zeigt, dass die Verbindung der chemischen Formel 1 die Expression von iNOS mRNA in einer isolierten Rattenaorta, die durch LPS stimuliert wird, 8 h lang in vitro unterdrückt, wobei zeigen
die Bahn 1: die Kontrolle
die Bahn 2: LPS (300 ng/ml)
die Bahn 3: LPS (300 ng/ml) + Verbindung der chemischen Formel 1 (10 μM)
die Bahn 4: LPS (300 ng/ml) + Verbindung der chemischen Formel 1 (30 μM)
die Bahn 5: LPS (300 ng/ml) + Verbindung der chemischen Formel 1 (100 μM));
2 ein Autoradiogramm eines Northern Blot, das zeigt, dass die Verbindung der chemischen Formel 2 die Expression von iNOS mRNA, die durch LPS und IFN-γ in Macrophagen (RAW 264.7 Zellen) stimuliert wird, unterdrückt, wobei darstellen
die Bahn 1: die Kontrolle
die Bahn 2: LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (10 U/ml)
die Bahn 3: LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (10 U/ml) + Verbindung der chemischen Formel 2 (1 μM)
die Bahn 4: LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (10 U/ml) + Verbindung der chemischen Formel 2 (10 μM)
die Bahn 5: LPS (100 ng/ml) + IFN-γ (10 U/ml) + Verbindung der chemischen Formel 2 (100 μM);
3 ein Diagramm, das Veränderungen der Anzahl der Blutplättchen anzeigt, wenn LPS (20 mg/kg) einer Ratte über einen Zeitraum von 3 h intravenös infundiert wird, 1 h nach der letzten oralen Verabreichung von Higenamin und der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2;
4 ein Diagramm, das die Veränderungen der Prothrombin-Zeit zeigt, wenn LPS (20 mg/kg) über einen Zeitraum von 3 h in Ratten intravenös infundiert wird, 1 h nach der letzten oralen Verabreichung von Higenamin und der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2;
5 ein Diagramm, das die Veränderungen der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) zeigt, wenn LPS (20 mg/kg) über einen Zeitraum von 3 h in Ratten intravenös infundiert wird, 1 h nach der letzten oralen Verabreichung von Higenamin und der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2;
6 ein Diagramm, das die Veränderungen des Fibrinogen-Gehaltes im Blut zeigt, wenn LPS (20 mg/kg) über einen Zeitraum von 3 h in Ratten intravenös infundiert wird, 1 h nach der letzten oralen Verabreichung von Higenamin und der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2;
7 ein Diagramm, das die Veränderungen des Fibrin/Fibrinogen-Dehydrierungsprodukt(FDP)-Gehaltes im Blut zeigt, wenn LPS (20 mg/kg) über einen Zeitraum von 3 h in Ratten intravenös infundiert wird, 1 h nach der letzten oralen Verabreichung von Higenamin und der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2;
8 ein Diagramm, das die Veränderungen des S-GOT-Gehaltes im Blut zeigt, wenn LPS (20 mg/kg) über einen Zeitraum von 3 h in Ratten intravenös infundiert wird, 1 h nach der letzten oralen Verabreichung von Higenamin und der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2;
9 ein Diagramm, das die Veränderungen des S-GPT-Gehaltes im Blut zeigt, wenn LPS (20 mg/kg) über einen Zeitraum von 3 h intravenös in Ratten infundiert wird, 1 h nach der letzten oralen Verabreichung von Higenamin und der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2;
10 ein Diagramm, das die Veränderungen des BUN-Gehaltes im Blut zeigt, wenn LPS (20 mg/kg) über einen Zeitraum von 3 h intravenös in Ratten infundiert wird, 1 h nach der letzten oralen Verabreichung von Higenamin und der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2;
11a ein Diagramm, das den suppressiven Effekt der Verbindung der chemischen Formel 1 auf den durch LPS verursachten Tod bei Mäusen zeigt, in dem bedeuten
-o-: LPS (20 mg/kg)
-Δ-: LPS (20 mg/kg) + Verbindung der chemischen Formel 1 (10 mg/kg)
-☐-: LPS (20 mg/kg) + Verbindung der chemischen Formel 1 (20 mg/kg)); und
11b ein Diagramm, das den suppressiven Effekt der Verbindung der chemischen Formel 2 auf den durch LPS verursachten Tod bei Mäusen zeigt, in dem bedeuten
-o-: LPS (20 mg/kg)
-Δ-: LPS (20 mg/kg) + Verbindung der chemischen Formel 2 (10 mg/kg)
-☐-: LPS (20 mg/kg) + Verbindung der chemischen Formel 2 (20 mg/kg)).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind neue Verwendungen der THI-Verbindungen 1-α-Naphthylmethyl-6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin und 1-β-Naphthylmethyl-6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin, dargestellt durch die chemischen Formeln 1 und 2, für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Septikämie und DIC.
Die Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 können viele Isomere aufweisen. Beispielsweise können, wie aus den chemischen Formeln 1 und 2 ersichtlich, Tautomere vorliegen. Da jede der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 mindestens ein asymmetrisches Kohlenstoftatom aufweist, können die Verbindungen außerdem in Form eines optisch reinen (R)- oder (S)-Isomers, in Form einer Mischung mit ungleichen Mengenanteilen der (R)- und (S)-Isomeren oder in einer racemischen Form vorliegen. Es wird deshalb darauf hingewiesen, dass alle Isomeren der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 innerhalb des Bereiches der vorliegenden Erfindung lie gen. Außerdem gehören auch die pharmazeutisch akzeptablen Salze der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 und ihre Prodrugs zu der vorliegenden Erfindung.
Zu konkreten Beispielen für die Säuren, die zur Herstellung der pharmazeutisch akzeptablen Salze der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 verwendbar sind, gehören Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Methansulfonsäure, Propionsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Citronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Weinsäure, Glutaminsäure, Gluconsäure, Glucuronsäure, Galacturonsäure, Ascorbinsäure, Kohlensäure, Phosphonsäure, Salpetersäure, Essigsäure, L-Asparaginsäure, Milchsäure, Vanillinsäure und Iodwasserstoffsäure.
Wie oben angegeben, liegen die Prodrugs der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 ebenfalls innerhalb des Bereiches der vorliegenden Erfindung. Da sie die Fähigkeit haben, leicht in pharmakologisch aktive Formen in dem Körper umgewandelt zu werden, stellen diese Prodrugs reaktionsfähige Derivate der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 dar. Ein Dokument, das die Auswahl- und Herstellungsverfahren von geeigneten Prodrugs betrifft, ist "Design of Prodrug", ed. H. Bundgarrd, (1985).
Aufgrund ihrer antithrombotischen Aktivität durch eine Blutplättchenaggregations-Inhibierung und ihrer iNOS Inhibierungsaktivität kann jede der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 als wirksamer Bestandteil (Wirkstoff) in einer pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten sein, die verwendbar ist als Heilmittel für die Septikämie und/oder als therapeutisches Mittel für die DIC.
Das Septikämie-Heilmittel dient dazu, die DIC und die Septikämie, die durch eine komplexe Gewebsschädigung verursacht wird, zu behandeln.
Das therapeutische Agens für DIC besteht darin, die Syndrome zu behandeln, die durch die Aktivierung der Blutkoagulation (Blutgerinnung) verursacht werden, beispielsweise die schnelle Abnahme der Anzahl der Blutplättchen, eine Blutung, ein Schock, eine Thrombose und ein Gefäßinfarkt.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auf parenteralem, oralem, intravenösem oder rektalem Wege verabreicht werden und sie kann in einer Dosierungsform vorliegen, die beispielsweise ausgewählt wird aus einer parenteralen Lösung, einer Kapsel, einer Pille, einer Zucker-beschichteten Tablette, eines Suppositoriums, einer Lösung, einer Suspension oder einer Emulsion.
Zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzungen können die erfindungsgemäßen Verbindungen mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern, beispielsweise organischen oder anorganischen festen, halbfesten oder flüssigen Verdünnungsmitteln oder Exzipienten, gemischt werden. Erforderlichenfalls können in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen ein Hilfsmittel, ein Stabilisator, ein Netzmittel oder ein Emulgator, ein Puffer und/oder andere übliche Zusätze enthalten sein.
Wie ein Versuch gezeigt hat, behalten die erfindungsgemäßen Verbindungen selbst dann, wenn sie oral verabreicht werden, für einen beträchtlich langen Zeitraum ihre hohen Gehalte im Blut bei. Aufgrund der Daten des Versuchs können die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Dosis von 0,01 bis 20 mg pro kg Körpergewicht durch Injektion und in einer Dosis von 2 bis 200 mg pro kg Körpergewicht durch orale Verabreichung verabreicht werden.
Bei einem Toxizitätsversuch wurde gefunden, dass die endungsgemäßen Verbindungen eine 50% Letal-Dosis (LD₅₀) von mindestens 1 000 mg/kg bei oraler Verabreichung haben. Wenn sie intraperitoneal injiziert werden, weist 1-α-Naphthylmethyl-6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin, dargestellt durch die chemische Formel 1, eine LD₅₀ von 290,0 mg/kg, mit einer Zuverlässigkeitsgrenze von 95% in dem Bereich von 235,1 bis 359,9 mg/kg auf, während 1-β-Naphthylmethyl-6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin eine LD₅₀ von 438,6 mg/kg, mit einer Zuverlässigkeitsgrenze von 95% in dem Bereich von 350,9 bis 548,2 mg/kg aufweist.
Erfindungsgemäß wurden 1-α-Naphthylmethyl-6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin der chemischen Formel 1 und 1-β-Naphthylmethyl-6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin der chemischen Formel 2 in Bezug auf die oben genannten phar makologischen Effekte getestet und bewertet, wobei sie die verschiedenen Effekte in Kombination aufwiesen. Außerdem wurden die erfindungsgemäßen Verbindungen mit Higenamin, das ähnliche Wirkungen aufweist, in verschiedenen Versuchen verglichen. Aus den Ergebnissen der Versuche wurde geschlossen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 eine starke Inhibitor-Aktivität gegenüber einer Blutplättchen-Aggregation (-Gerinnung) induziert durch Epinephrin anstatt durch Adenosindiphosphat (nachstehend als "ADP" bezeichnet) oder Kollagen, aufweisen. Aufgrund der antagonistischen Effekte auf α-Adrenozeptoren dilatieren außerdem die erfindungsgemäßen Verbindungen die Blutgefäße und hemmen (inhibieren) die Blutplättchen-Aggregation (Blutgerinnung).
Die Unterdrückung der Expression der iNOS, die durch Endotoxine verursacht wird, und der Synthese von NO durch die Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 stellen Dosis-abhängige Effekte dar. Aufgrund der Inhibierung einer Gewebsschädigung als Folge einer NO-Synthese können die erfindungsgemäßen Verbindungen als Präventivmittel, Inhibierungsmittel oder Heilungsmittel in Bezug auf inflammatorische Erkrankungen, wie z. B. Arthritis, verschiedenen ischämischen Erkrankungen, wie z. B. dem zerebralen Apoplex und dem Myocarinfakt, und in Bezug auf eine Gewebsschädigung, die durch eine Reperfusion hervorgerufen wird, verwendet werden. Außerdem können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch für die Behandlung der Erkrankungen verwendet werden, die durch eine schnelle komplexe Gewebsschädigung verursacht werden, wie z. B. die Septikämie und die DIC.
In einem in vivo-Versuch, bei dem Mäuse und Ratten verwendet wurden, wurde gezeigt, dass die Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 eine verbesserte antithrombotische Aktivität aufweisen, welche die Mortalität als Folge einer akuten Thrombose signifikant herabsetzt, und eine Thrombose in arteriovenösen Shunt (AVS)-Schläuchen inhibiert.
Endotoxine, wie z. B. LPS, induzieren verschiedene DICs. Zu Beispielen für die Indikationen für DICs gehören eine Abnahme der Anzahl der Plättchen im Blut, eine Abnahme des Fibrinogen-Gehaltes und eine Zunahme des Fibrin/Fibrinogen-Abbauprodukt (FDP)-Gehaltes im Blut und eine Verlängerung der Prothrombinzeit (PT) und der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT). Diese Anzeichen für eine LPS-induzierte DIC können verbessert werden durch die erfindungsgemäßen Verbindungen. Das heißt, wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen verabreicht werden, verhindern sie die Abnahme der Anzahl der Blutplättchen und der Konzentration des Fibrinogens im Blut, die Zunahme des FDP-Gehaltes und die Verlängerung der PT und aPTT, die durch LPS induziert wird. Endotoxine sind aber auch dafür bekannt, dass sie einen Anstieg des Gehaltes an Serumglutaminsäure-Oxaloessigsäuretransaminase (S-GOT), an Serumglutaminsäure-Brenztraubensäuretransaminase (S-GPT) und an Blutharnstoffstickstoff (BUN) hervorrufen. Diesbezüglich können die erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, um die LPS daran zu hindern, einen Anstieg des S-GOT-, S-GPT- und BUN-Gehaltes zu bewirken. Das heißt, es können verschiedene Anzeichen für das LPS-induzierte multiple Organversagen (MOF) durch die erfindungsgemäßen Verbindungen verbessert werden. Aufgrund ihrer Aktivität, die LPS-induzierte Mortalität zu senken, schützen die erfindungsgemäßen Verbindungen außerdem gegen den Schock, der durch Endotoxin hervorgerufen wird.
Die vorliegende Erfindung ist besser verständlich im Lichte der nachfolgenden Beispiele, die jedoch die Erfindung lediglich erläutern, ohne sie darauf zu beschränken.
Versuchsbeispiel 1
Inhibierungseffekte auf die Blutplättchen-Aggregation
Für einen Versuch wurde ein Blutplättchen-Konzentrat, das von der Blutbank des Seoul National University Hospital, Korea, gekauft worden war, analysiert zur Bestimmung der Anzahl der Blutplättchen unter Verwendung eines Blutplättchen-Analysators (PLT-4 der Firma Texas Instruments) und mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung verdünnt (nachstehend als "PBS" bezeichnet), um ein an Blutplättchen reiches Plasma zu erhalten (nachstehend als "PRP" bezeichnet), bei dem die Anzahl die Blutplättchen in dem Bereich von 300 × 10⁶ bis 400 × 10⁶/ml lag. Nach 3-minütiger Inkubation bei 37°C wurde das PRP zusammen mit ADP, Kollagen oder Epinephrin zugegeben, um eine Blutplättchen-Aggregation zu induzieren. Es wurde eine Verringerung der Trübung des PRP beobachtet und der Grad der Aggregation wurde überwacht unter Verwendung eines Blutplättchen-Aggregometers, beispielsweise desjenigen, wie es von der Firma Chrono-Log Corp., USA, unter der Bezeichnung "Model 500VS" hergestellt wird.
Die Inhibitor-Aktivitäten der Testverbindungen gegenüber der Blutplättchen-Aggregation wurden bewertet als Prozentsatz der Inhibierung, errechnet nach der folgenden Gleichung: % Inhibierung = (A – B)/A × 100worin bedeuten:
A: den Grad der Blutplättchen-Aggregation, der bei der Zugabe nur eines die Blutplättchen-Aggregation induzierenden Mittels erhalten wurde;
B: den Grad der Blutplättchen-Aggregation, der erhalten wurde, wenn eine Kombination aus einer die Blutplättchen-Aggregation induzierenden Verbindung und einer Testverbindung zugegeben wurde.
Bei Verwendung von Human-Blutplättchen wurden die Inhibitor-Effekte der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 auf die Blutplättchen-Aggregation erhalten, wie sie zusammen mit den Ergebnissen der Kontroll-Verbindung Higenamin in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben sind.
Tabelle 1 Inhibitoreffekt der Verbindungen und von Higenamin auf die Blutplättchen-Aggregation
Wie aus den Daten der Tabelle 1 ersichtlich, weist eine Higenamin-Menge von 1 × 10^–3 M keine Inhibitor-Aktivität gegenüber der durch ADP induzierten Blutplättchen-Aggregation auf, während die Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 jeweils eine IC₅₀ von 7,3 × 10^–4 M bzw. 8,6 × 10^–4 M aufweisen. Im Vergleich zur Wirkung von Kollagen wurde die Inhibitor-Aktivität der Verbindung der chemischen Formel 1 bestimmt mit IC₅₀ = 9,2 × 10^–5 M, ein Wert, der ähnlich demjenigen von Higenamin ist. Die Verbindung der chemischen Formel 2 ist jedoch stärker in Bezug auf die Inhibitor-Aktivität um einen Faktor von etwa 10 als die Verbindung der chemischen Formel 1 und als Higenamin. Bezüglich der durch Epinephrin induzierten Blutplättchen-Aggregation weisen die Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 eine IC₅₀ von 3,4 × 10^–6 bzw. von 6,0 × 10^–6 auf, was zeigt, dass die Verbindungen eine höhere Aktivität aufweisen als Higenamin, dessen IC₅₀-Wert 1,9 × 10^–5 M betrug. Zusammenfassend zeigen die Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 einen höheren Wert in Bezug auf die Inhibitor-Aktivität als Higenamin in Bezug auf seine Inhibitor-Aktivität gegenüber der durch ADP oder Epinephrin induzierten Blutplättchen-Aggregation. In Bezug auf die Inhibitor-Aktivität gegenüber einer durch Kollagen induzierten Blutplättchen-Aggregation sind die Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 vergleichbar mit oder stärker als Higenamin.
Versuchsbeispiel II
Bindungsaffinität an einen α-Adrenozeptor
Um festzustellen, ob sich die erfindungsgemäßen Verbindungen konkurrierend an α-Rezeptoren binden, um die oben erläuterte Inhibitor-Aktivität gegenüber einer Blutplättchen-Aggregation aufzuweisen und eine Vasodilatation zu zeigen, wurde eine an α-Rezeptoren reiche Ratten-Cerebral-Cortical-Membran hergestellt. Zu diesem Zweck wurde die Cerebral-Cortex, die aus Ratten stammte (Sprague-Dawley, 250 ± 20 g; wenn nichts anderes angegeben ist, wurden die gleichen Ratten in den nachfolgenden Versuch verwendet), homogen gemischt mit einem 20 × Puffer (50 mM Tris, 5 mM MgSO₄, 1 mM EDTA, 1 mM Ascorbinsäure, pH 7,7) und dann dreimal bei 35 000 g 15 min lang zentrifugiert und das Pellet wurde bei –70°C gelagert. Eine Lösung von 5 mg des Pellets in 1 ml des Puffers wurde inkubiert zusammen mit [³H] Prazosin (200 pM) und mit den Testverbindungen bei 25°C für 30 min, danach wurden 10 ml eines Puffers (50 mM Tris, pH 7,7) zugegeben, um die Bindungsreaktion abzustoppen. Die resultierende Lösung wurde durch ein Whatman GF/C Glas-Mikrofaserfilter filtriert, dann wurde sie 2 h lang geschüttelt, wobei sie vollständig in einem Szintillationscocktail eingetaucht wurde. Die Radioaktivität wurde bestimmt unter Verwendung eines Szintillationszählers (Beckman, LS6500).
Tabelle 2 Dissoziationskonstanten (K_i) für einen cerebralen α-Receptor einer Ratte und IC₅₀ bei einer Ratten-Thoraxaorta
Aufgrund der Bindung von Prazosin an den α-Rezeptor erhielt man einen K_d-Wert von 133,5 ± 8,91 pM und einen B_max-Wert von 15,15 ± 0,64 fmol/mg. Die Testverbindungen wiesen, wie gefunden wurde, eine Affinität für den α-Rezeptor auf, bestimmt für die Dissoziationskonstanten-Werte (K_i), in dem Bereich von 0,15 bis 1,25 μM. Außerdem zeigt auch die Annäherung zwischen diesen gemessenen Dissoziationskonstanten-Werten und den IC₅₀-Werten (1,02–2,81 μM), gemessen in der mit Phenylephrin kontrahierten isolierten Aorta und den Inhibitor-Konzentrationswerten (IC₅₀: 3,4–19 μM) gegenüber einer durch Epinephrin induzierten Blutplättchen-Aggregation, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen α-Rezeptoren blockieren, um die Blutgefäße zu dilatieren und eine Blutplättchen-Aggregation zu hemmen (inhibieren).
Versuchsbeispiel III
Suppression der durch LPS induzierten iNOS mRNA Expression in einer aus einer Ratte isolierten Aorta
Ratten wurden mit Pentobarbitalnatrium (50 mg/kg) anästhesiert und die Aorta wurde isoliert, danach wurde das Endothelium von der Aorta entfernt. Nach 8-stündiger Inkubation bei 37°C in einer Krebs-Lösung, die 300 ng/ml LPS enthielt, wurde die Aorta einer Gesamt-RNA-Extraktion mit Hilfe einer Trizol-Lösung (GibcoBRL) unterzogen. Nach der quantitativen Bestimmung durch Verwendung eines UV-Spektrofotometers (Shimadzu, UV-1201) wurde die erhaltene Gesamt-RNA auf einem Formamid-Formaldehyd-Agarosegel elektrophoretisiert und auf eine Nylon-Membran übertragen. Danach wurde die Gesamt-RNA auf der Nylon-Membran mit cDNA-Sonden für iNOS hybridisiert, um den Expressionswert der iNOS mRNA zu bestimmen, in der die cDNA von iNOS mit ³²P-dCTP durch eine Random-Primer-Methode markiert wurde. Zur quantitativen Bestimmung wurde ein Röntgenfilm der radioaktiven Strahlung von der Nylonmembran ausgesetzt und entwickelt, um die Punktgrößen der gewünschten Objekte mit denjenigen von GAPDH (Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase) zu vergleichen.
Wenn die Aorta-Präparate in vitro inkubiert wurden, wurde das Blutgefäß in vitro in Gegenwart von LPS kultiviert und die iNOS mRNA wurde in einer großen Menge transkribiert. Die zusätzliche Anwesenheit der Verbindung der chemischen Formel 1 in der Kultur erlaubte jedoch nicht die Expression der iNOS mRNA. Diese Ergebnisse sind in der 1 angegeben, die Northern Blots für die iNOS mRNA zeigen, die erhalten wurden, nachdem die Aorten zusammen mit LPS und/oder der Verbindung der chemischen Formel 1 inkubiert worden waren. In den Autoradiogrammen des Northern Blot zeigen die Bahnen 3, 4 und 5 die iNOS mRNA Expression unter dem Einfluss der Verbindung der chemischen Formel 1 bei ihren verschiedenen Konzentrationen (10 μM, 30 μM bzw. 100 μM), während die Bahnen 1 und 2 eine Kontrolle (nur Aorta) bzw. den Einfluss von LPS allein (300 ng/ml) zeigen. Wie in der 1 darstellt, wird die iNOS mRNA in der mit LPS behandelten Gruppe stark exprimiert (Bahn 2), die Verbindung der chemischen Formel 1 inhibiert jedoch die durch LPS induzierte iNOS mRNA-Expression in einer konzentrationsabhänigen Weise (Bahnen 3, 4 und 5).
Versuchsbeispiel IV
Suppressiver Effekt auf die LPS- und IFN-γ-induzierte iNOS mRNA-Expression in einem Makrophagen
In einem DMEM-Medium, ergänzt durch ein thermisch behandeltes 10%iges fetales Kalbsserum, Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 mg/ml), wurden Makrophagen (RAW 264.7 Zellen) kultiviert, bis sie in einem CO-Inkubator konfluent waren. Nach der Übertragung in ein serumfreies DMEM-Medium wurden die Zellen weitere 24 h lang kultiviert und dann weitere 18 h lang kultiviert in Gegenwart von LPS (100 ng/ml) und γ-Interferon (nachstehend als "IFN-γ" bezeichnet; 10 U/ml) und/oder der Verbindung der chemischen Formel 2 (0; 1; 10 und 100 μM). Unter Verwendung einer Trizol-Lösung wurde die gesamte RNA aus den kultivierten Makrophagen extrahiert. Nach der quantitativen Bestimmung in einem Spektrofotometer wurde die erhaltene gesamte RNA elektrophoretisiert auf einem Formamid-Formaldehyd-Agarosegel und auf eine Nylonmembran übertragen. Danach wurde die gesamte RNA auf der Nylonmembran mit cDNA-Sonden für iNOS hybridisiert zur Bestimmung des Expressionswertes der iNOS mRNA, wobei die cDNA von iNOS mit ³²P-dCTP durch Anwendung einer Random-Primer-Methode markiert wurde. Zur quantitativen Bestimmung wurde ein Röntgenfilm der radioaktiven Strahlung aus der Nylonmembran ausgesetzt und entwickelt, um den Grad der Radioaktivität der gewünschten Objekte mit demjenigen von GAPDH zu vergleichen.
Diese Ergebnisse sind in der 2 darstellt, die Northern Blots für iNOS mRNA zeigt, die erhalten wurden, nachdem die Makrophagen zusammen mit LPS und IFN-γ und/oder der Verbindung der chemischen Formel 2 kultiviert worden waren. In dem Autoradiogramm des Northern Blot zeigen die Bahnen 3, 4 und 5 die iNOS mRNA-Expression unter dem Einfluss der Verbindung der chemischen Formel 2 in ihren verschiedenen Konzentrationswerten (1 μM, 10 μM bzw. 100 μM), während die Bahnen 1 und 2 eine Kontrolle (Zelle allein) und den Einfluss von LPS (100 ng/ml) und IFN-γ zeigen. Wie in der 2 dargestellt, wurde die iNOS mRNA exprimiert, wenn die Makrophagen 18 h lang in Gegenwart von LPS (100 ng/ml) und IFN-γ (10 U/ml) kultiviert wurden. Andererseits inhibierte (hemmte) die Verbindung der chemischen Formel 2 die durch LPS/IFN-γ induzierte iNOS mRNA-Expression auf konzentrationsabhängige Weise (Bahnen 3, 4 und 5).
Versuchsbeispiel V
Suppressiver Effekt auf die durch LPS und IFN-γ induzierte NO-Synthese in einem Makrophagen
In einem DMEM-Medium, das durch thermisch behandeltes 10%iges fetales Kalbsserum, Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 mg/ml) ergänzt worden war, wurden Makrophagen (RAW 264.7 Zellen) in einem Co-Inkubator kultiviert bis sie konfluent waren. Nach der Übertragung auf ein serumfreies DMEM-Medium wurden die Zellen weitere 24 h lang kultiviert und dann wurden sie weitere 18 h lang kultiviert in Gegenwart von LPS (100 ng/ml) und IFN-γ und jeder der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 (0; 1; 10 und 100 μM). Die Menge des synthetisierten NO wurde indirekt bestimmt anhand der Nitrit-Menge, einem Oxidationsprodukt von NO. Zu diesem Zweck wurde das Nitrit einer Farbreaktion mit dem Griess-Reagens, einer Lösung mit 0,1 Naphthylethylendiamindihydrochlorid, 1% Sulfanilamid, 5% Phosphat, unterworfen und seine Extinktion bei 550 nm wurde mittels eines Spektrofotometers gemessen. Die Nitrit-Mengen wurden unter Verwendung von NaNO₂ als Standard gemessen und die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3 Suppressiver Effekt auf die durch LPS und IFN-γ induzierte NO-Synthese in einem Makrophagen
Wie aus den Daten der Tabelle 3 hervorgeht, wurde dann, wenn die Makrophagen in Gegenwart des Endotoxins kultiviert wurden, eine große Menge Nitrit nachgewiesen, was auf die Massensynthese von NO hinweist. In dem Kontrollversuch, bei dem weder das Endotoxin noch IFN-γ zugegeben wurde, wurden 8 μM Nitrit nachgewiesen. Andererseits wurden bei der Kultur, der Endotoxin und IFN-γ zugesetzt worden waren, 57 μM Nitrit gemessen. Zusammen mit sowohl LPS als auch IFN-γ wurde jede der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 in einer Konzentration von 1 μM zu der Kultur zugegeben, wobei die Menge des synthetisierten Nitrits zu 30 μM oder 34 μM gemessen wurde, d. h. beide Werte sind niedriger als die bei der gleichzeitigen Gegenwart von LPS und IFN-γ gemessene Menge. Außerdem wurden geringere Mengen an Nitrit nachgewiesen bei Verwendung höherer Konzentrationen jeder der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2, was darauf hinweist, dass die Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 die NO-Synthese, hervorgerufen durch das Endotoxin, stark hemmten (inhibierten) in einer konzentrationsabhängigen Weise.
Versuchsbeispiel VI
Inhibitoreffekte auf die durch eine akute Thrombose verursachten Todesfälle bei Mäusen
Eine Mischung von Kollagen (300 μg/kg) und Epinephrin (30 μg/kg) wurden in die Schwanzvene von Mäusen (ICR; 20 ± 20 g, die gleichen Mäuse wurden in allen folgenden Versuchen verwendet) injiziert, um eine massive akute Thrombose in der Pulmonalarterie zu induzieren. Auf diese Weise wurde ein akutes Thrombosemodell erzeugt, bei dem die Mäuse innerhalb von 1 bis 3 min nach der Injektion paralysiert wurden und die meisten von ihnen innerhalb von 15 min verendeten. Um den Effekt der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 auf die akute Thrombose zu untersuchen, wurde jede der Verbindungen 1 bis 3 Tage lang oral an Mäuse verabreicht. Die intravenöse Injektion der Mischung von Kollagen und Epinephrin wurde 1 h nach der letzten oralen Verabreichung durchgeführt. Es wurde eine Beobachtung durchgeführt, um die Änderung der Mortalität und die Erholung von der Paralyse zu überprüfen, und die erhaltenen Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen 4 und 5 angegeben.
Tabelle 4 Erholungsrate von der Paralyse als Folge einer Thrombus-Bildung
Tabelle 5 Erholungsrate von der Paralyse als Folge einer Thrombus-Bildung
Die meisten der Mäuse wurden innerhalb von 1 min nach der Injektion paralysiert (gelähmt), woran sich eine Erweiterung der Pupillen, ein schweres Atmen und Krämpfe anschlossen. Die meisten der Mäuse verendeten innerhalb von 5 min oder wurden weitere 15 min lang oder länger paralysiert. Nur einige wenige von ihnen erholten sich von der Paralyse.
Wie in den Tabellen 4 und 5 angegeben, erholten sich nur 17 bis 20% der Kontrollgruppe, der eine Mischung von Kollagen und Epinephrin verabreicht worden war, die jedoch nicht die Testverbindungen erhielten, innerhalb von 15 min nach der Paralyse und konnten sich frei bewegen. Aspirin und Higenamin, die als positive Kontrollmaterialien verwendet wurden, ergaben eine Erholungsrate von 52% bzw. 37%, wenn beide einmal oral in einer Doses von 50 mg/kg verabreicht wurden. Eine Dosis von 100 mg/kg Higenamin erhöhte die Erholungsrate auf bis zu 48%, wenn es einmal verabreicht wurde. Was die Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 angeht, so ergaben sie ähnliche Erholungsraten wie Aspirin, wenn sie in einer Dosis von 50 mg/kg oder 100 mg/kg einmal verabreicht wurden. Wenn sie jedoch in einer Dosis von 10 mg/kg oder 50 mg/kg einmal am Tag an drei aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht wurden, war die Verbindung der chemischen Formel 2 dem Aspirin überlegen und sie erhöhte die Erholungsrate auf 64 bis 70%.
Versuchsbeispiel VII
Inhibitoreffekt auf die Thrombus-Bildung in einem arteriovenösen Shunt-Schlauch Gefäß
Es wurde ein AVS-Schlauch (Gefäß) hergestellt. Zu diesem Zweck wurde eine Scalp-Vene auf eine Länge von 18 cm zugeschnitten und jedes Ende wurde mit einer 18G-Spritzennadel verbunden, während ein 5 cm langer 100% Baumwollfaden im Zentrum des Schlauches (Gefäßes) fixiert wurde. Es wurden Ratten mit Ketamin (250 mg/kg) durch Injektion (i. m.) anästhesiert und einer Laparotomie unterzogen. Ein AVS-Schlauch, der mit einer Salzlösung gefüllt war, wurde zwischen der Abdominal-Aorta und der Rhenal-Vene in der Weise installiert, dass seine eine Spritzennadel in die Abdominal-Aorta eingeführt wurde und die andere Spritzennadel in die Rhenal-Vene eingeführt wurde. Man ließ Blut durch den AVS-Schlauch strömen, um einen Thrombus auf dem Baumwollfaden zu erzeugten. Nach 15-minütiger Zirkulation des Blutes durch den AVS-Schlauch wurde der Faden aus dem AVS-Schlauch herausgenommen. Das Gewicht des auf dem Baumwollfaden gebildeten Thrombus wurde bestimmt durch Wiegen des Fadens. Die Inhibitor-Effekte der oral verabreichten Testverbindungen auf die Thrombus-Bildung wurden bei Ratten beobachtet und die erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 6 und 7 angegeben.
Tabelle 6 Inhibitor-Effekte auf die Thrombus-Bildung in einem AVS-Schlauch, der in Ratten eingesetzt wurde, denen oral einmal verschiedene Arzneimittel verabreicht wurden
Tabelle 7 Inhibitor-Effekte auf die Thrombus-Bildung in einem AVS-Schlauch, der in Ratten eingesetzt wurde, denen oral einmal am Tage an drei aufeinanderfolgenden Tagen verschiedene Arzneimittel verabreicht wurden
Das Gewicht des im Innern des AVS-Schlauches gebildeten Thrombus wurde signifikant beeinflusst durch die Witterungsbedingungen (Atmosphärendruck, Feuchtigkeit und dgl.) am Versuchstag. Zur Durchführung einer effektiven Analyse wurde Aspirin, ein antithrombotisches Agens, als positives Kontrollmaterial verabreicht (50 mg/kg). Bei einer negativen Kontrolle, bei der keine Arzneimittel verabreicht wurde, bildete sich ein Thrombus in einer Menge von 33 bis 42 mg. Bei einer einmaligen Verabreichung von Aspirin in einer Dosis von 50 mg/kg erhielt man einen Inhibitor-Effekt gegenüber der Thrombus-Bildung von 36 bis 40%. Bei einmaliger Verabreichung in den beiden Dosen 25 mg/kg und 50 mg/kg ergab das Higenamin eine Inhibierung von 25 bis 31%. Andererseits inhibierten die Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 die Thrombus-Bildung um 24 bis 39% bei einmaliger Verabreichung in den beiden Dosen 25 mg/kg und 50 mg/kg. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Inhibierungsaktivität gegenüber der Thrombus-Bildung aufwiesen, die ähnlich derjenigen oder stärker war als diejenige von Higenamin.
Im Falle der Verabreichung einer Dosis von 50 mg/kg Aspirin an drei aufeinanderfolgenden Tagen nahm die Thrombus-Bildung nur um 12% ab. Dort, wo eine überdurchschnittliche Menge des Thrombus in dem AVS-Schlauch bei dem Kontrollversuch in Abhängigkeit von den Witterungsbedingungen am Versuchstag gebildet wurde, waren die Inhibitor-Effekte der Test-Arzneimittel auf die Thrombus-Bildung verhältnismäßig gering. Ein Vergleich zwischen den Test-Arzneimitteln und einer positiven Kontrolle (Gruppe, der Aspirin verabreicht wurde) war für eine genaue Analyse unerlässlich.
Bei der Verabreichung von Higenamin in den beiden Dosen 10 mg/kg und 50 mg/kg einmal am Tage an drei aufeinanderfolgenden Tagen wurde eine Inhibierung von 13 bis 18% erzielt, die ähnlich derjenigen von Aspirin war. Bei Verabreichung der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 in den beiden Dosen 10 mg/kg und 50 mg/kg nahm die Thrombus-Bildung um etwa 24% bzw. 28% ab. Diese Daten zeigen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen dem Aspirin oder dem Higenamin in Bezug auf die Inhibitor-Aktivität gegenüber der Thrombus-Bildung überlegen sind.
Versuchsbeispiel VIII
Verbesserungseffekt auf die Indices bei einer durch bakterielles Endotoxin induzierten DIC und MOF bei Ratten
Ratten (Sprague-Dawley, 250 ± 50 g) wurden durch Injektion (i.m.) mit Ketamin (250 mg/kg) anästhesiert. 30 min später wurde LPS (20 mg/kg) in die Schwanzvene der Ratten über einen Zeitraum von 3 h infundiert. Danach wurde aus der Arterie Blut entnommen und es wurden die Anzahl der Blutplättchen, die PT, die aPTT, der Fibrinogen-Gehalt, der FDP-Gehalt und die Gehalte an S-GOT, S-GPT und BUN bestimmt. Die Test-Arzneimittel wurden einmal am Tage zwei Tage lang verabreicht. 1 h nach der letzten Verabreichung der Testverbindungen wurden die Ratten anästhesiert.
Als Antikoagulans wurde Natriumcitrat verwendet. Die Anzahl der Blutplättchen in dem Blut wurde unter Verwendung eines Blutplättchenzählers bestimmt. Das mit dem Antikoagulans behandelte Blut wurde bei 1500 g 10 min lang zentrifugiert und das Plasma wurde zur Durchführung von Tests gewonnen.
Um die Prothrombinzeit (PT) zu bestimmen, wurden 100 μl des Plasmas mit 50 μl eines Thromboplastin-Reagens (Sigma, USA) versetzt und es wurde die Gerinnungszeit unter Verwendung eines Fibrometers (Becton Dickinson Co., Canada) gemessen. Vor dem Vermischen wurden das Plasma und das Thromboplastin-Reagens 3 min bzw. 5 min lang bei 37°C vorinkubiert.
Zur Bestimmung der aPTT wurden 100 μl des Plasmas 3 min lang bei 37°C inkubiert und mit 100 μl eines aktivierten partiellen Thromboplastinzeit-Reagens (Sigma USA) und 100 μl 0,02 M CaCl₂ versetzt und es wurde die Gerinnungszeit unter Verwendung eines Fibrometers gemessen. Vor der Zugabe wurde das Reagens 1 min lang bei 37°C vorinkubiert, während CaCl₂ auf 37°C vorerwärmt wurde.
Zur Bestimmung des Fibrinogen-Gehaltes wurden zuerst 20 μl des Plasmas mit 180 μl eines Puffers gemischt und 2 min lang bei 37°C inkubiert. Zu dieser Lösung wurden 100 μl eines Thrombin-Reagens (Sigma USA) zugegeben, danach wurde die Gerinnungszeit gemessen. Dann wurde der Fibrinogen-Gehalt bestimmt mittels einer Eichkurve, die mit einem Fibrinogen-Standard erhalten wurde.
Der FDP-Gehalt wurde bestimmt unter Verwendung des Thrombo-Wellcotest-Kits (Murex Biotech Limit, British). Zu diesem Zweck wurde zuerst jede Blutprobe (ohne Citrat-Behandlung) mit einem Sojabohnentrypsininhibitor und mit Bothrops Atrox-Venom gut gemischt und 30 min lang bei 37 C inkubiert. Nach zweimaligem Zentrifugieren für 10 min bei 1 500 g wurde das überstehende Serum mit einem Glycin-Kochsalz-Puffer verdünnt. 50 μl des verdünnten Serums wurden mit einem Tropfen einer Latexsuspension auf einem Test-Objekträgerglas gemischt und gleichmäßig verteilt. Der Objekträger wurde 2 min lang in einem Rüttler angeordnet und auf eine Agglutination hin beobachtet. Die FDP-Konzentration wurde halbquantitativ wie folgt bestimmt: mit einer 1 : 0-Verdünnung (–): 0 μg/ml; (+): 1 μg/ml; (++): 2 μg/ml; mit einer 1 : 1-Verdünnung: (+): 3 μg/ml; (++): 4 μg/ml; mit einer 1 : 2-Verdünnung: (+): 5 μg/ml, (++): 6 μg/ml und dgl.
Zur Bestimmung von S-GOT, S-GPT und BUN wurden diagnostische Kits (Boehringer Mannheim; AST-Kit für S-GOT, ALT-Kit für S-GPT und Harnstoff Kit für BUN) zusammen mit einem automatischen biochemischen Analysator (Hitachi 747) mit der Hilfe des Green Cross Reference Lab., Korea, verwendet.
Wenn bei den Versuchstieren durch Injizieren von LPS über einen langen Zeitraum ein spetischer Schock induziert wurde, wurden die DIC- und MOF-Indices verbessert durch die orale Verabreichung der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2. Bei einem Kontrollversuch, bei dem nur LPS verabreicht wurde, wurden eine plötzliche Abnahme der Anzahl der Blutplättchen und des Fibrinogen-Gehaltes im Blut und eine Verlängerung der PT und aPTT festgestellt. Außerdem wurde der FDP-Gehalt im Blut deutlich erhöht. Ferner wurden hohe S-GOT-, S-GPT- und BUN-Werte nachgewiesen, was anzeigt, dass die Funktion der Leber oder der Niere beeinträchtigt (verschlechtert) war. Eine Verbesserung wurde in Bezug auf die Indices für diese DIC- und MOF-Syndrome festgestellt, wenn die Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 oral verabreicht wurden.
Im einzelnen wurde nach einer oralen Verabreichung von Higenamin oder der Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 LPS (20 mg/kg) über einen Zeitraum von 3 h in Ratten injiziert, um eine DIC und MOF hervorzurufen. Zur Überprüfung der Verbesserung der Indices für DIC und MOF wurden diese Versuchstiere mit einer Kontrollgruppe verglichen, der nur LPS verabreicht worden war.
Was den Kontrollversuch angeht, so wurden 296 × 10³ Blutplättchen pro μl Blut gefunden, ein Wert, der etwas unterhalb der Hälfte der Anzahl der Blutplättchen des Normalwertes (747 × 10³/μl) liegt, wie in 3 dargestellt. Die PT- und aPTT-Werte wurden gemessen und sie betrugen jeweils 19 bzw 33 s. d. h. sie waren um 50% verlängert, verglichen mit denjenigen der Normalwerte (14 und 20 s) (vgl 4 und 5). In dem Kontrollversuch wurden eine Fibrinogen-Konzentration von 104 mg/ml und eine FDP-Konzentration von 168 μg/ml gemessen, während der Normalwert des Fibribnogen-Gehalts 202 mg/ml und des FDP-Gehalts 1 μg/ml betrug. Im Vergleich zu dem Normalwert war der Wert des Kontrollversuchs auf die Hälfte vermindert in Bezug auf den Fibrinogen-Gehalt und stark erhöht in Bezug auf den FDP-Gehalt, was anzeigt, dass die DIC stark verschlimmert war (vgl. 6 und 7). Außerdem betrugen die S-GOT-, S-GPT- und BUN-Werte 231,0 U/l, 60,8 U/l bzw. 25,6 mg/dl und waren somit höher als die entsprechenden Normalwerte (167 U/l, 49,3 U/l und 15,0 mg/dl). Das heißt, die MOF war ebenfalls stark verschlimmert.
Durch die orale Verabreichung von Higenamin oder der Verbindung der chemischen Formeln 1 oder 2 in den beiden Dosen 10 mg/kg und 50 mg/kg wurden die Indices für DIC und MOF verbessert im Vergleich zu dem Kontrollversuch, bei dem nur LPS verabreicht worden war. Das heißt, die Anzahl der Blutplättchen war erhöht, die PT- und aPTT-Werte waren verkürzt, der Fibrinogen-Gehalt war erhöht und der FDP-Gehalt war erniedrigt, wie in den 3 bis 7 dargestellt. Außerdem trat eine Abnahme der S-GOT-, S-GPT- und BUN-Werte auf, wie in den 8 bis 10 dargestellt. Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen die durch LPS induzierte DIC und MOF bessern können.
Versuchsbeispiel IX
Präventiver Effekt auf einen durch LPS verursachten Tod
Wenn eine große Menge LPS den Versuchstieren injiziert wird, entstehen verschiedene Krankheiten, wie z. B. die DIC, und die Tiere verenden durch einen septischen Schock innerhalb eines kurzen Zeitraums. Bei diesem Versuch wurde LPS (20 mg/kg) intraperitoneal in Mäuse injiziert und die Anzahl der Mäuse, die 48 h nach der Injektion noch am Leben waren, wurde gezählt. Außerdem wurde der Einfluss der Test-Arzneimittel auf die Überlebensrate geprüft.
LPS (20 mg/kg) wurde durch Injektion (i. p.) an Mäuse verabreicht, danach wurden die noch lebenden Mäuse alle 6 h 48 h lang gezählt. 30 min vor der LPS-Injektion wurden die Test-Arzneimittel intraperitoneal in die Mäuse injiziert, um den präventiven Effekt auf den durch LPS verursachten Tod zu untersuchen.
Wenn nur LPS injiziert wurde, betrug die Überlebensrate der Mäuse nach 48 h etwa 20 %. Nach der Vorbehandlung mit einer Dosis von 20 mg/kg der Verbindung der chemischen Formel 1 (11a) und der Verbindung der chemischen Formel 2 (11b) vor der Injektion von LPS trat jedoch bis 30 h nach der LPS-Injektion kein Verenden von Mäusen auf und 90% oder mehr der Mäuse waren auch nach 48 h noch am Leben. Wenn Higenamin oder die Verbindung der chemischen Formel 2 in einer Dosis von 10 mg/kg injiziert wurde, überlebten 80% der Mäuse bis zu 48 h. Bei der Injektion in einer Dosis von 10 mg/kg ergab die Verbindung der chemischen Formel 1 eine Überlebensrate bis zu 48 h von 60%. Die Verbindungen der chemischen Formeln 1 und 2 weisen somit eine Schutzaktivität gegenüber dem durch LPS verursachten Schock auf.
Industrielle Anwendbarkeit
Diese Verbindungen können als Septikämie-Heilmittel oder als therapeutisches Mittel für die DIC verwendet werden aufgrund ihrer suppressiven Aktivität gegenüber der iNOS-Expression und der NO-Bildung. Außerdem weisen die pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten, einen breiten Sicherheitsbereich auf und sie weisen eine lange Arzneimittel-Wirkungsdauer auf.
Die vorliegende Erfindung wurden anhand erläuternder Beispiele beschrieben und es ist selbstverständlich, dass die hier angewendete Terminologie mehr beschreibender als beschränkender Natur ist. Es können viele Modifikationen und Abänderungen der vorliegenden Erfindung im Lichte der oben genannten Lehren vorgenommen werden. Es ist daher selbstverständlich, dass die vorliegende Erfindung innerhalb des Schutzbereiches der nachfolgenden Patentansprüche auch anders als vorstehend spezifisch beschrieben, praktisch durchgeführt werden kann.

Claims

Verwendung der Verbindung 1-α-Naphthylmehtyl-6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetra-hydraisochinolin mit einer Formel 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Septikämie;
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Septikämie durch eine Aktivierung der Blutgerinnung verursacht wird, die eine schnelle Abnahme der Thrombocytenzahl, eine Blutung, einen Schock, eine Thrombose und einen Gefäßinfarkt einschließt.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Septikämie durch disseminierte intravasale Gerinnung (DIG) und eine komplexe Gewebeverletzung verursacht wird.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Verbindung der Formel 1 eine Hemmwirkung für die Thrombocytenagglomeration zeigt,
Verwendung der Verbindung 1-β-Naphthylmehtyl-6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetra-hydroisochinolin mit einer Formel 2 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Septikämie:
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Septikämie durch eine Aktivierung der Blutgerinnung verursacht wird, die eine schnelle Abnahme der Thrombocytenzahl, eine Blutung, einen Schock, eine Thrambose und einen Gefäßinfarkt einschließt.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Septikämie durch disseminierte intravasale Gerinnung (DIC) und eine komplexe Gewebeverletzung verursacht wird.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Verbindung der Formel 2 eine Hemmwirkung für die Thrombocytenagglomeration zeigt.