DE69819875T2

DE69819875T2 - Anhydrovinblastin zur Behandlung von Krebs

Info

Publication number: DE69819875T2
Application number: DE69819875T
Authority: DE
Inventors: Bruce Schmidt; James Kutney; Lawrence Mayer
Original assignee: University of British Columbia
Current assignee: University of British Columbia
Priority date: 1997-03-04
Filing date: 1998-03-04
Publication date: 2004-11-11
Anticipated expiration: 2018-03-05
Also published as: CA2219095A1; EP0969839B1; DK0969839T3; HK1026610A1; ES2212272T3; AU6388598A; ATE254460T1; DE69819875D1; WO1998039004A1; NZ337752A; US20020103218A1; US6326376B1; EP0969839A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verwendung von antineoplastischen Vinca-Alkaloiden als Antitumor-Mittel. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung die Bereitstellung eines Derivats von Vinblastin, Anhydrovinblastin (nachstehend AHVB), zur Verwendung als einen antineoplastischen Wirkstoff mit verbesserten therapeutischen Eigenschaften, der eine signifikant höhere maximal tolerierte Dosis und geringere Toxizität als seine Stamm- und verwandte Verbindungen aufweist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Aufgrund eines hohen Grades an Unvorhersagbarkeit sind klassische Techniken der Medikamentherstellung erfinderisch. Meistens werden eine große Anzahl natürlicher Produkte und synthetischer chemischer Verbindungen durch einen Eliminierungsprozess auf gewünschte Wirksamkeiten durchmustert, indem eine Reihe von zunehmend komplexer werdenden Systemen verwendet wird, beginnend mit einfachen in vitro-Untersuchungen auf Zellebene, fortgeführt an Tieren und schließlich mit klinischen Prüfungen am Menschen. Aufgrund von grundlegenden Eigenschaften wie Adsorption, Verteilung und Metabolismus, jedoch, können die anfänglichen in vitro-Tests, die diese Eigenschaften nicht in Betracht ziehen können, einen wirksamen Arzneistoff eliminieren, das in solch einfachen Systemen nicht gut abschneidet. Der Arzneistoff kann in Tiermodellen in andere Bestandteile verstoffwechselt werden als bei Menschen, die auch unterschiedliche Adsorptions- oder Verteilungsmuster aufweisen können. Oder die Verbindungen können schließlich auf der ganzen Strecke durch die klinischen Prüfungen sehr vielversprechend aussehen, dann aber unerwünschte Nebenwirkungen oder einen hohen Toleranzgrad aufweisen, wenn sie in der menschlichen Population in großem Rahmen eingesetzt werden. Es ist niemals klar, welche Verbindung bei Beginn jeder einzelnen Stufe der Tests und Entwicklung weiterhin vielversprechend sein wird.
Kontrolle über Tumorwachstum ist bis zu einem gewissen Grad erreicht worden, indem seit mehr als 20 Jahren onkolytische Vinca-Alkaloide als Antitumor-Mittel allein oder in Kombination mit anderen antineoplastischen Arzneistoff eingesetzt worden sind. Annähernd 30 Alkaloide mit einem weiten Bereich pharmakologischer Wirkungen sind aus der Vinca rosea (Catharanthus roseus), allgemein als Tropisches Immergrün bekannt, extrahiert worden. Von diesen besitzen nur Vinleurosin, Vinrosidin, Vinblastin und Vincristin signifikante Antitumor-Aktivität. Besonders Vinblastin und Vincristin sind in weiten Bereichen als alleinige Wirkstoffe oder in Kombination mit anderen antineoplastischen Arzneistoffen in der Chemotherapie gegen Krebserkrankungen eingesetzt worden. Zusätzlich zu den natürlich vorkommenden Alkaloiden sind einige Vinca-Alkaloid-Analoga durch funktionale Transformation oder durch semisynthetische Verfahren synthetisiert worden (R. J. Cersosimo et al., Pharmacotherapy 3: 359–274, 1983; P. Mangency et al., Org. Chem. 44: 3765–3768, 1979; R. Maral et al., Cancer Lett. 22: 49–54, 1984).
Chemisch haben diese Vinca-Alkaloide eine asymmetrische, dimere Struktur, bestehend aus zwei Kernen, die durch eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung miteinander verbunden sind; einem Dihydroindol-Kern (Vindolin), welcher das im Tropischen Immergrün enthaltene Hauptalkaloid darstellt, und dem Indol-Kern Catharanthin (1). Der strukturelle Unterschied zwischen Vincristin und Vinblastin besteht an der R1-Position, während sich Vinblastin und Vindesin in Bezug auf die R2 und R3-Substituenten unterscheiden.
Die Wirkungsweise der antineoplastischen Vinca-Alkaloide muss noch vollständig verstanden werden. Es wurde jedoch bewiesen, dass die Antitumor-Aktivität direkt mit der hohen Bindungsaffinität dieser Verbindungen für Tubulin, der grundlegenden Protein-Untereinheit der Mikrotubuli zusammenhängt (R. A. Bender und B. Chabner, in: Chabner (Hrsg.) Pharmacol. Princ. of Cancer Treat., Saunders, Phil, P. A., S. 256, 1982; W. A. Creasey, in: Hahn (Hrsg.) Antibiotica, Bd. 2, Springer, Berlin, S. 414, 1979). Die übereinstimmende Auffassung ist, dass diese Stoffe die Zellmitose in der Metaphase arretieren, indem sie die Polimerisation von Tubulin zur Bildung von Mikrotubuli verhindern und Depolymerisation induzieren (R. J. Owellen und C. A. Hartke, Cancer Res., 36: 1499–1504, 1976; R. H. Himes und R. N. Kersey, Cancer Res., 36: 3798–3806, 1976; R. S. Camplejohn, Cell Tissue Kinet. 13: 327–332, 1980). Als solche sind die Vinca-Alkaloide Zellzyklus-spezifische antimitotische Mittel oder Spindelgifte. Die Bindungsaffinität der Vinca-Alkaloide für Tubulin korrelliert nur wenig mit der relativen Fähigkeit von Vincristin, Vinblastin und Vindesin, Zellwachstum zu verhindern (R. S. Camplejohn, vorstehend; P. J. Ferguson und C. E. Cass, Cancer Res., 45: 5480–5488, 1985). Der Hauptunterschied in der Antitumor-Aktivität zwischen diesen Arzneistoffen scheint sich daher auf ihre Verweildauer im Tumorgewebe zu beziehen (P. Ferguson, vorstehend; J. K. Horton et al., Biochem. Pharmacol. 37: 3995–4000, 1988). In einer ähnlichen Vene scheinen die unterschiedlichen Toxizitätsprofile der Vinca-Alkaloide eher von Gewebeaufnahme- und Verweildauer-Eigenschaften abhängig zu sein, als von unterschiedlicher Tubulin-Bindungsaffinität. Zum Beispiel haben Studien gezeigt, dass Vincristin wirksamer als Vinblastin oder Vindesin den schnellen axoplasmatischen Transport in Nervenzellen blockiert (S. Ochs und R. Worth: Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 16 :70, 1975; S. Y. Chan et al., J. Neurobiol. 11: 251–264, 1980). Zusätzlich wird es viermal schneller als die anderen Arzneistoffe in die Nerven aufgenommen (Z. Iqbal und S. Ochs, J. Neurobiol., 11: 251–264, 1980) und zeigt eine erweitetre abschließende Eliminierungsphase der Plasma-Clearance, was eine verlängerte Vincristin-Exposition gegenüber den anderen Vinca-Alkaloiden nahe legt (R. L. Nelson et al., Cancer Treat Rev., 7: 17–24, 1980).
Die in vitro und in vivo Unterschiede, die zwischen den Vinca-Alkaloiden beobachtet werden, sind beeindruckend, berücksichtigt man die feinen chemischen Veränderungen, die die verschiedenen Wirkstoffe im Vergleich zu ihrer großen, komplexen Molekülstruktur aufweisen. Zum Beispiel ist Vincristin sehr wirksam bei der Behandlung von menschlichen Rhabdosarkomen, die Nacktmäusen transplantiert wurden, wohingegen Vinblastin in diesem System nicht wirksam ist (N. Bruchovsky et al., Cancer Res. 25: 1232–1238, 1965). Diesen Unterschied erhält man einfach als ein Ergebnis der Substitution einer Aldehydgruppe für eine Methylgruppe an der R1-Position. Weiter führt diese chemische Substitution zu einer Veränderung im toxikologischen Profil in der Weise, dass für Vincristin periphere Neuropathie (bei Abwesenheit von hämatologischer Toxizität) bei Menschen Dosislimitierend ist, während für Vinblastin Anämie und Leukopenie typischerweise Dosislimitierend sind (W. P. Brads, Proc. Int. Vincaalkaloid Symposium, 95–123, 1980; S. S. Legha, Med. Toxicol., 1: 421–427, 1986). Ein besonders interessantes therapeutisches Profil wurde für ein neues, semisynthetisches Vinca-Alkaloid namens Navelbin^TM (Vinorelbin, 5'-Noranhydroblastin) beobachtet. Diese Verbindung ist gegen murine P388- und L1210- Leukämie weniger wirksam als Vinblastin und Vincristin, ist aber wirksam gegen Zellen, die von menschlichem Lungenkrebs stammen, bei denen die anderen Vinca-Alkaloide unwirksam sind (S. Cros, et al., Seminars in Oncology, 16: 15–20, 1989). Ebenso unterstützen klinische Prüfungen mit Navelbine^TM seinen Nutzen bei der Behandlung von nicht-Kleinzelligem Lungenkrebs (A. Depierre et al., Am. J. Clin. Oncol., 14: 155–119, 1991; A. Yokoyama et al., Am. Soc. Clin. Oncol., 11: 957, 1992). Das Toxizitätsprofil dieses Wirkstoffes scheint dem von Vinblastin ähnlich zu sein, bei dem hämatologische Toxizitäten und nicht neurologische Nebenwirkungen Dosis-limitierend sind.
Es stellte sich heraus, dass Vincristin besonders nützlich als ein intravenös verabreichtes onkolytischen Mittel in Kombination mit anderen onkolytischen Stoffen für die Behandlung von verschiedenen Krebserkrankungen ist, einschließlich Leukämie des Zentralnervensystems, Hodgkin Krankheit, Lymphosarkom, Retothelsarkom, Rhabdomyosarkom, Neuroblastom und Wilma-Tumor. Es eignet sich nur zur inravenösen Anwendung, und die intratekale Verabreichung ist immer fatal. Nach einzelnen wöchentlichen Dosen ist die häufigste unerwünschte Reaktion Haarausfall, die beunruhigensten sind neuromuskulären Ursprungs. Wenn einzelne wöchentliche Dosen des Medikaments eingesetzt werden, können die unerwünschten Reaktionen Leukopenie, neuritischer Schmerz, Verstopfung und Schwierigkeiten beim Gehen auftreten. Andere unerwünschte Reaktionen, die berichtet worden sind, sind abdominale Krämpfe, Ataxie, Hängefuß, Gewichtsverlust, optische Atrophie mit Erblindung, vorübergehende kortikale Erblindung, Fieber, kraniale Nervenmanifestationen, Parehäsie und Gefühllosigkeit in den Fingern, Polyurie, Dysurie, orale Geschwürbildung, Kopfschmerzen, Brechreiz, Durchfall und intestinale Nekrose und/oder Perforation.
Navelbin^TM (Vinorelbintartrat) ist ein neuartiges Vinca-Alkaloid, bei dem die Catheranthin-Untereinheit die Stelle der strukturellen Veränderung ist. Es wird angenommen, dass seine Antitumor-Aktivität ebenfalls primär auf seiner Fähigkeit beruht, die Aktivität der Mikrotubuli zu beeinflussen, und damit die Mitose in der Metaphase durch seine Wechselwirkung mit Tubulin zu hemmen. Es ist bei der Behandlung von fortgeschrittenem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs als ein alleiniger Wirkstoff oder in Kombination angezeigt, verabreicht nur über den intravenösen Weg. Seine Nebenwirkungen umschließen Phlebitie oder Extravasions-Verletzung, da es ein moderat Vesikans ist. Untersuchungen der unerwünschten Reaktionen, die auf die Verwendung von Navelbin^TM als ein alleiniges Mittel zurückgehen, weisen Granculozytopenie als die hauptsächliche Dosis-limitierende Toxizität aus, obwohl sie allgemein reversibel und über die Zeit nicht kumulativ war. Leichte bis moderate periphere Neuropathie, manifestiert durch Pareathesie und Hypesthesie sind die am häufigsten berichteten neurologischen Toxizitäten, die bei 10% der Patienten auftreten. Leichte bis moderate Übelkeit tritt bei rund einem Drittel der mit Navelbine^TM behandelten Patienten auf, ein etwas geringerer Teil erleidet Verstopfung, Brechreiz, Durchfall, Anorexie und Stomatitis.
Es bleibt der Bedarf, Verbindungen, die weniger toxische Wirkungen bei gleicher oder größerer chemotherapeutischer Wirkung aufweisen, zu entwickeln. In gleicher Weise bleibt der Bedarf für die Bereitstellung eines Medikaments mit verbesserter Antitumor-Wirksamkeit zur Behandlung von Krebserkrankungen.
Es ist daher ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Behandlung von Krebserkrankungen bereit zu stellen, umfassend die Verabreichung einer Menge AHVB, die das Fortschreiten der Krankheit wirksam zum Stoppen bringt oder signifikant verlangsamt an einen menschlichen Patienten, der an einer Krebserkrankung leidet und Behandlung benötigt.
Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereit zu stellen, AHVB als einen Antitumor-Wirkstoff zu verwenden, umfassend eine therapeutische Menge der chemischen Substanz der vorliegenden Erfindung, um Tumorwachstum zum Stoppen zu bringen.
Die vorstehenden und verschiedene andere Gegenstände und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachstehenden genauen Beschreibung der vorliegenden Erfindung ersichtlich.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist besonders auf die Verwendung eines Derivat von Vinblastin, 3',4'-Anhydrovinblastin (AHVB), das sich von Vinblastin dadurch unterscheidet, dass es an der 3',4'-Position des Caranthin-Kerns eine Doppelbindung statt der Hydroxylgruppe, die in der Stammstruktur vorhanden ist, besitzt, als ein antineoplastisches Mittel zur therapeutischen Behandlung einer Krebserkrankung einzusetzten.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von 3',4'-Anhydrovinblastin oder Varianten hiervon als ein antineoplastiches Mittel bei der Behandlung einer Krebserkrankung.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von 3',4'-Anhydrovinblastin als ein antineoplastiches Mittel bei der Behandlung einer Krebserkrankung, wobei die Konzentration von 3',4'-Anhydrovinblastin in einer signifikant höheren maximalen Konzentration vorliegt als die therapeutisch verträglichen Konzentrationen von Vincristin oder Navelbine^TM bei der Verwendung zur Behandlung einer Krebserkrankung.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von 3',4'-Anhydrovinblastin als ein antineoplastisches Mittel zur Behandlung von Zervixkrebs.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von 3',4'-Anhydrovinblastin als ein antineoplastisches Mittel zur Behandlung von Lungenkrebs.
TABELLEN UND ABBILDUNGEN
Tabelle 1 stellt die relative Zytotoxizität von Vincristin, AHVB und Navelbin^TM auf Tumorzelllinien dar.
Tabelle 2 zeigt Schätzwerte der subakuten toxischen Dosis von Vincristin-Sulfat, Navelbine^TM und AHVB, wenn sie gesunden, männlichen Nb-Ratten als eine einzelne, intraperitoneale Injektion verabreicht wurde.
Tabelle 3 zeigt Hemmung von solidem C-4 Tumor in Wachstumsdaten.
1 stellt die chemische Struktur einiger Vinca-Alkaloide dar.
2 zeigt den Vergleich der Auswirkungen der Verabreichung einer einzelnen intraperitonealen Injektion von Vincristin, Navelbin^TM und AHVB in einer subakut toxischen Dosis auf Nb-Ratten mit einzelnen, gut entwickelten subkutanen Nb2-U17 Tumortransplantaten auf mittleres Tumorgewicht und mittleres Gewicht der Ratte als eine Funktion der Zeit.
3 zeigt den Vergleich der Auswirkungen der Verabreichung einer einzelnen intraperitonealen Injektion von Vincristin, Navelbin^TM und AHVB in einer halb-subakut toxischen Dosis auf Nb-Ratten mit einzelnen, gut entwickelten subkutanen Nb2-U17 Tumortransplantaten auf mittleres Tumorgewicht und mittleres Gewicht der Ratte als eine Funktion der Zeit.
4 zeigt die Veränderungen des mittleren Tiergewichtes von BDF1-Mäusen mit intraperitonealen P388-Tumoren nach i. v.-Verabreichung von Kochsalzlösung, Vincristin, Navelbin^TM und AHVB.
5 zeigt eine beispielhafte Zytotoxizitätskurve, die verwendet wurde, um den IC₅₀-Wert von verschiedenen Vinca-Alkaloiden zu bestimmen.
6 zeigt P388-Antitumor-Aktivität ausgewählter Formulierungen von Vinca-Alkaloiden.
7 zeigt eine Dosis-Wirkungs-Kurve, die für AHVB erhalten wurde, wenn es zur Behandlung von BDF1-Mäusen mit P388-Tumoren eingesetzt wurde.
8 zeigt Zytotoxizitätskurven, die verwendet wurden, um den IC₅₀-Wert von AHVB auf die Zelllinien SKOV3 und C-4 abzuschätzen.
9 zeigt das mittlere Tumorgewicht in Gramm über die Zeit (Periode von 30 Tagen) nach der Verabreichung von Navelbin^TM , Bisulfat-AHVB, Ditartrat-AHVB und Kontrolle an den Tagen 1, 5 und 9.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es sind viele mögliche Derivate oder Variationen von Vinblastin möglich. Es gibt jedoch keine Sicherheit, selbst für Fachleute auf dem Gebiet der Entwicklung von Antikrebs-Wirkstoffen, dass eines solcher Derivate so wirksam oder sogar wirksamer als die Stammverbindung sein wird. Dies bedarf umfangreicher Tests und Experimente.
Der Ausdruck „Varianten" in Bezug auf 3',4'-Anhydrovinblastin bezeichnet jede chemische Struktur, die ein Derivat von 3',4'-Anhydrovinblastin ist, das durch konservative Substitution von Seitengruppen erhalten wurde, aber noch die gleichen oder ähnliche antineoplastische Eigenschaften wie 3',4'-Anhydrovinblastin aufweist.
Charakterisierung der Antitumor-Aktivität von AHVB in vitro
Zytotoxische Experimente mit AHVB wurden als direkte Vergleiche mit Vincristin und Navelbine^TM durchgeführt, um das ihm eigene antineoplastische Profil gegen eine Reihe von Tumorzelltypen relativ zu anderen relevanten Vinca-Alkaloiden zu untersuchen. Die Zytotoxizität von AHVB wurde in vitro gegen eine Auswahl von Tumorzellinien unterschiedlicher Abstammung untersucht, um die Spezifität seiner Antitumor-Aktivität unter Berücksichtigung des Zelltyps zu bestimmen. Die untersuchten Tumorlinien waren P388-lymphatische Leukämie (eine murine lymphatische Leukämie), U17-Lymphom von Noble (Nb)-Ratten, MCF7 menschliches Brustkarzinom, H460 menschliches nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom, K562 menschliche Erythroleukämie und LS180 menschliches Kolonkarzinom, basierend auf standardisierten NCI in vitro Durchmusterungsprotokollen zur Zytotoxizität von neuen Antikrebs-Wirkstoffen.
Standard Dosis-Wirkungs-Zytotoxizitättests (R. Mosmass, J. Immunol. Meth., 65: 55–64, 1983) wurden verwendet, um den IC₅₀-Wert (Arzneistoffkonzentration, die erforderlich ist, um 50% Hemmung des Tumorzellwachstums auszulösen) für Vincristin, Navelbin^TM und AHVB zu bestimmen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 dargestellt. Die angegebenen Zelllinien wurden entweder von der ATCC oder der NCI-Tumorhinterlegungsstelle bezogen und in Gewebekulturmedien mit Standardtechniken kultiviert, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, bevor sie auf eine definierte Zellkonzentration verdünnt wurden, die für die Untersuchungen auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen erforderlich war.
Tumorzellen, die in der log-Phase auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wuchsen, wurden einem weiten Bereich an Arzneistoffkonzentrationen ausgesetzt. Die Zellkonzentrationen waren sowohl von der Zelllinie als auch der Kultivierungsdauer abhängig. Typischerweise wurden P388-Zellen in einer Konzentration von 30.000, 2.000 und 750 Zellen pro Vertiefung für Untersuchungen ausplattiert, die 1, 3 beziehungsweise 7 Tage dauerten. MCF7-Zellen wurden in einer Konzentration von 7.000 und 1.500 Zellen pro Vertiefung für Untersuchungen ausplattiert, die 3 beziehungsweise 7 Tage dauerten. H460-Zellen wurden in einer Konzentration von 2.500 und 1.000 Zellen pro Vertiefung für Untersuchungen ausplattiert, die 3 beziehungsweise 7 Tage dauerten. K562-Zellen wurden in einer Konzentration von 1.500 und 10.000 Zellen pro Vertiefung für Untersuchungen ausplattiert, die 1 beziehungsweise 3 Tage dauerten. LS180-Zellen wurden in einer Konzentration von 5.000 und 20.000 Zellen pro Vertiefung für Untersuchungen ausplattiert, die 3 beziehungsweise 7 Tage dauerten. Nach dem Ausplattieren wurden alle Zelllinien für 24 Stunden inkubiert (CO2-Incubator bei 37°C, 5% CO2), bevor die Zugabe des zytotoxischen Mittels erfolgte (vgl. Tabelle 1).
RELATIVE ZYTOTOXIZITÄT VON VINCRISTIN, AHVB UND NAVELBIN^TM AUF TUMORZELLLINIEN
Tabelle 1
Nachfolgend wurden die Platten über den angegebenen Zeitraum inkubiert. Zu bestimmten Zeiten wurden die Zellen gewaschen und dem Farbinklusionsmarker MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) ausgesetzt, der sich in lebensfähigen Zellen ansammelt. MTT wurde den Zellen in einer Endkonzentration von 50 μg pro Vertiefung zugegeben. Nach einer 4-ständigen Inkubation wurden die Zellen vom Medium und nicht reagiertem MTT freigewaschen, bevor DMSO zugegeben wurde, das erforderlich war, um den unlöslichen Formazan-Niederschlag zu lösen, der sich in lebensfähigen Zellen bildete. Nachdem die Probe durch wiederholtes Pipettieren vermischt worden war, wurde das gefärbte Produkt unter Verwendung eines bei 570 nm arbeitenden Plattenlesers gemessen. Es wurde angenommen, dass die Absorptionswerte, die für Zellen erhalten wurden, die in Abwesenheit der Wirkstoffe kultiviert worden waren, 100% Lebensfähigkeit bedeuteten. Die Experimente wurden wiederholt, um alle Unterschiede, die zwischen AHVB und anderen Vinca-Alkaloiden beobachtet wurden, zu bestätigen.
Charakterisierung der Anti-Tumoraktivität von AHVB in vivo
Die Evaluierung der in vitro Zell-Zytotoxizität war gefolgt von Studien bezüglich der antineoplastischen Wirkung von AHVB in drei in vivo Nagermodellen. Daher wurde die anti-Tumoraktivität von AHVB unter Verwendung eines Rattenmodells eines soliden Tumors (U17 Lymphoma) des murinen P388-Tumormodells (R. Noble et al., Cancer Res., 37: 1455–1460, 1977; P. W. Gout et al., Biochem. Cell Biol., 64: 659–666, 1986), und eines H460SC Tumor-Mausmodells bestimmt.
Die U17-Zelllinie stammte ursprünglich aus einem transplantierbaren malignen Lymphom, das sich spontan in männlichen Noble-Ratten bildete (British Columbia Cancer Research Centre Joint Animal Breeding Facility mit Eltern, die aus den National Institutes of Health, Bethesda, MD stammten). Die Zelllinie ist Prolaktin-abhängig und kann leicht in vitro kultiviert werden. Von U17 abstammende solide Tumoren werden durch subkutane Injektion (über das Verfahren mittels Trokar) eines kleinen (2 mm²) Tumorgewebestücks erzeugt, das von einer männlichen Noble-Ratte stammt. Tumorgewebe, das für die Implantate verwendet wurde, bildete sich zwei Wochen nach subkutaner Injektion von 5 × 10⁶ U17-Zellen (aus Kultur) in den Nacken. Zur Untersuchung der Antitumor-Aktivität von AHVB erhielten Tumor tragende Tiere (2–4 g Tumoren) eine einzelne Behandlung mit dem Arzneistoff, und die Tumorgröße wurde als eine Funktion der Zeit nach der Behandlung gemessen. Die Antitumor-Aktivität wurde mit einer Reihe unterschiedlicher Dosierungen untersucht, um die maximale therapeutische Dosis von AHVB zu bestimmen. Vergleichende Studien zwischen Vincristin, Vinblastin und AHVB wurden durchgeführt. Für diese Studien wurde die Antitumor-Aktivität bei der maximalen therapeutischen Dosis für jeden Arzneistoff bestimmt.
Antitumor-Studien an Mäusen konzentrierten sich in einem Fall auf dem P388-Leukämie-Modell. Dies ist ein standardisiertes NCI-Modell zur Bewertung von neuen Anti-Krebs Mittel, und es ist gezeigt worden, dass es auf die Behandlung mit Vinca-Alkaloiden sensibel reagiert. Dies ist ein Aszites-Tumormodell, das durch intraperitoneale Inokulation von 1 × 10⁶ P388-Zellen (aus Kultur stammend, mit einer ursprünglichen Zelllinie, die von der NCI-Tumorhinterlegungsstelle erhalten wurde) in BDF1-Mäuse (Charles Rivers) erzeugt wurde. Einen Tag nach der Inokulation der Tumorzellen wurden die Mäuse mit einer einzelnen intravenösen Injektion des Arzneistoffes behandelt. Das Gewicht der Tiere wurde täglich aufgezeichnet, und die Tumorprogression wurde als ein Anstieg des Tiergewichtes und durch die Bestimmung der Überlebenszeit gemessen. Die Therapie wurde durch eine Verzögerung der Tumorprogression und einen Anstieg der Überlebenszeit relativ zu einer unbehandelten Kontrollgruppe beschrieben. Anfängliche Studien setzten die maximale therapeutische Dosis für AHVB fest. Nachfolgend wurden vergleichende Studien mit Vincristin und Navalbine^TM begonnen, in denen die Tiere mit jedem Arzneistoff in maximaler therapeutischer Dosierung behandelt wurden.
Die kanadischen Richtlinien zum Tierschutz (The Canadian Council of Animal Care Guidelines) wurden streng eingehalten, und alle verwendeten Tierprotokolle wurden von den Animal Care Committees von UBC und der BCCA genehmigt. Die Tiere wurden zweimal täglich auf jegliche Anzeichen für Stress (bedingt durch Tumor oder Arzneistoff) untersucht, und wenn ein Tier zu leiden schien (exzessiver Gewichtsverlust oder -zunahme, Lethargie, struppiges Fell etc.), wurde das Tier getötet.
Bestimmung der maximalen tolerierten AHVB-Dosis
Bereichsfindende, akute (14 Tage) Einzeldosen-Studien zu Toxizität wurden an gesunden, männlichen Nb-Ratten durchgeführt, um die maximale tolerierte Dosis von Vincristin-Sulfat, Navalbin^TM und AHVB zu bestimmen, wenn sie diesen Nagern als eine einzelne, intraperitoneale Injektion verabreicht wurden (vgl. Tabelle 2).
Tabelle 2: Bestimmung von subakut toxischen Dosen von Vincristin-Sulfat, Navalbin^TM und AHVB, wenn sie gesunden, männlichen Nb-Ratten als eine einzelne, intraperitoneale Injektion verabreicht wurden
Zu diesem Zweck wurden gesunde, männliche Nb-Ratten ohne Tumor (Gewichtsbereich 333–399 Gramm) in Gruppen zu 3 Tieren eingeteilt. Jede Gruppe wurde verwendet, um einen Arzneistoff in einer Dosierung zu testen. In einer Gruppe erhielt jedes Tier eine intraperitoneale Injektion einer bestimmten Dosis, wie in Tabelle 2 angegeben. Die Volumen, in denen die Arzneistoffe verabreicht wurden, waren von der Konzentration der Arzneistofflösung (in Kochsalzlösung) und dem Gewicht der Tiere abhängig und lagen im Bereich von 0,1–1,0 ml. Kochsalzlösung wurde als Kontrolle verwendet. Die höchste Dosis eines jeden Arzneistoffes, die das Überleben aller Tiere in einer Gruppe gestattete (drei von Dreien), wurde als subakut toxische Dosis für den Arzneistoff genommen, d. h. 0,7 mg/kg für Vincristin, 2,0 mg/kg für Navalbin^TM und 3,0 mg/kg für AHVB.
Die Gesundheit der Tiere wurde durch tägliche Gewichtsmessungen zusätzlich zu Verhaltenshinweisen auf Stress untersucht. Die Tiere wurden fortlaufend während der gesamten 14 Tage dauernden Studie überwacht. Im Fall von Anzeichen für starken Stress oder Gewichtsverlust über 20% wurden die Tiere eingeschläfert. Alle Tiere wurden am Ende des Untersuchungszeitraumes oder bei vorzeitigem Einschläfern einer Autopsie unterzogen. Sobald Gewichtsverlust über 20% oder vorzeitiger Tod eines Tieres bei einer Dosierungshöhe festgestellt wurde, wurde die Dosis verringert, bis der größte Gewichtsverlust weniger als 20% betrug und kein vorzeitiges Sterben der Tiere beobachtet wurden.
Studien am U17-Lymphom-Rattenmodell
Kulturen der nicht metastasenbildenden, prä-TNb2-Lymphom-Linie wurden ursprünglich an der Universität von Britisch Columbia entwickelt und Nb2-U17 genannt (Anticancer Research 14: 2485–2492, 1994) und können vom British Columbia Cancer Research Centre bezogen werden. Zellen aus exponentiell wachsenden Nb2-U17-Suspensionskulturen wurden männlichen Nb-Ratten (5 Ratten, 310–380 Gramm; 5 × 10⁶ Zellen/Ratte in 1 ml Kulturmedium), die mit Methoxyfluran betäubt worden waren, subkutan unter Verwendung einer 1,5'' 20 Gange-Nadel in den Nacken injiziert. Nach etwa 3 Wochen, wenn die Tumoren eine Größe von 4–7 cm (Länge + Breite) erreicht hatten, wurden die Tiere getötet und die Tumoren zur Transplantation verwendet, wie nachfolgend beschrieben.
Ein Tumor einer Ratte wurde entnommen, zerkleinert, und das Tumorgewebe wurde in Trokare (2'', 13 Gauge) gegeben. Die Gewebeproben wurden männlichen Nb-Ratten (248–404 Gramm; 1 Kanüle pro Ratte), die mit Methoxyfluran betäubt worden waren, subkutan in den Nacken implantiert. Dieses Verfahren wurde fünfmal wiederholt, um insgesamt 60 Tumor tragende Ratten zu erhalten, die für die Wirksamkeitsstudien der drei Arzneistoffe verwendet werden sollten.
Sobald die Tumoren sich gut entwickelt hatten (1,5–2 Wochen später) wurden drei getrennte Gruppen von 20 Ratten, so ähnlich wie möglich sowohl in Bezug auf Tumorgewicht als auch auf Gewicht der Ratte, zur Verabreichung der drei Testsubstanzen (d. h. eine Gruppe für jede Testsubstanz) ausgewählt.
Vincristin wurde Ratten verabreicht, die 281–384 Gramm wogen und Tumoren mit einem Gewicht von 6,3–16 Gramm trugen. Navalbin^TM wurde Ratten verabreicht, die 274–389 Gramm wogen und Tumoren mit einem Gewicht von 9,1–23,3 Gramm trugen. AHVB wurde Ratten verabreicht, die 303–400 Gramm wogen und Tumoren mit einem Gewicht von 7,9–25,9 Gramm trugen. Die Tumorgewichte wurden mit dem hemi-ellipsoiden Modell (Gewicht in Gramm = Länge × Tiefe × π/6 in cm) berechnet.
Die onkolytischen Wirkungen jedes der drei Arzneistoffe wurde bei einer subakut toxischen Dosis untersucht, die für jeden Wirkstoff in voraus gehenden Studien unter Verwendung vollentwickelter, männlicher Nb-Ratten ohne Tumor bestimmt worden war, d. h. 3,0, 2,0 bzw. 0,7 mg/kg für AHVB, Navelbin^TM bzw. Vincristin, wie in 2 dargestellt. Zusätzlich wurde jeder Arzneistoff bei 50% und 25% seiner subakut toxischen Dosis untersucht. Fünf Tumor tragende Ratten wurden verwendet, um die Wirkung auf jeder Dosierungsebene zu bewerten. Die Arzneistoffe wurden intraperitoneal als ein einzelner Bolus in einem Volumen von 0,19–0,31 ml verabreicht, wie durch das Gewicht der Tiere angezeigt. Zu diesem Zweck wurden die Arzneistoff-Präparationen unter Verwendung von durchperlter Kochsalzlösung, die mit Essigsäure auf pH-Wert 4,2 eingestellt worden war, auf geeignete Konzentrationen verdünnt. Für jeden Arzneistoff erhielt eine Kontrollgruppe von 5 Ratten eine intraperitoneale Injektion der entsprechenden Menge Kochsalzlösung (pH-Wert 4,2). Die Tumor tragenden Gruppen wurden in die nachstehenden Gruppen eingeteilt:
Nach der Verabreichung der Testsubstanzen wurden Gewicht und Tumorgröße (unter Verwendung von Schieblehren) der Tiere täglich bestimmt, bis der Tumor ein geschätztes Gewicht von 35 Gramm erreicht hatte oder zu ulzerieren begann, zu diesen Zeitpunkten wurden die Tiere getötet (durch Inhalation von Kohlendioxid) und der Autopsie unterworfen. Die Tiere wurden auch während der gesamten Dauer der Studie mindestens täglich auf Anzeichen von Stress überwacht. Tiere, die schwere Anzeichen von Stress zeigten, (rapider Gewichtsverlust, Keuchen, gekrümmte Haltung, struppiges Fell) wurden ebenfalls getötet, und eine Autopsie wurde durchgeführt.
Anhydrovinblastin-Sulfat (3',4'-Dehydrovinblastin) wurde von der British Columbia Cancer Agency (BCCA), Investigational Drug Section, bezogen. Vincristin-Sulfat (Sulfat von 22-Oxovincaleukoblastin) wurde von den David Bull Laboratories Ltd., Australien, bezogen. Navelbin^TM (Vinorelbin-Tartrat; 3',4'-Didehydro-4'-desoxy-C'-norvincaleukoblastin-di-L-tartrat) wurde von Burroughs Wellcome Inc., Canada, bezogen; 0,9% Natriumchlorid-Injektion USP, pH-Wert 4.2, wurde von Baxter bezogen.
Die Tiere betreffende Methodik wurde vom BCCA Institutional Animal Care Committee (IACC) der UBC vor Durchführung der Studien genehmigt (Animal Care Certificate Nr. A94-1602). Während der Studie wurden die Pflege, Unterbringung und die Nutzung der Tiere in Einklang mit den kanadischen Richtlinien für Tierpflege (Canadian Council on Animal Care Guidelines) durchgeführt.
Die Ergebnisse der Wirksamkeitsstudien werden in den 2–3 dargestellt. Die 2–3 zeigen Mittelwerte der Daten von 5 oder weniger Tieren.
Die Wirkung der Verabreichung einer einzelnen, subakut toxischen Dosis von AHVB, Navelbin^TM und Vincristin auf die Größe einzelner gut entwickelter Nb2-U17-Lymphom-Transplantate (mittleres Gewicht 10–13 Gramm) und das Gewicht der Tiere werden in 2 als eine Funktion der Zeit dargestellt. Während die Tumoren in den Kontrolltieren weiterhin an Größe bis zu einem mittleren Gewicht von etwa 40 Gramm in 6 Tagen zunahmen, gingen die Tumoren in den mit Arzneistoff behandelten Tieren in jedem Fall innerhalb von 5 Tagen der Verabreichung des Wirkstoffes auf im Wesentlichen nicht tastbare Größe zurück. Nach Tag 10 kam es bei den mit Navalbin^TM und AHVB behandelten Tieren zu einer Wiederkehr der Tumoren zu etwa gleichem Ausmaß. Im Gegensatz dazu wurde eine Wiederkehr des Tumors bei mit Vincristin behandelten Tieren nicht beobachtet (selbst an Tag 29 nicht). 2 zeigt auch, dass die Tiere infolge der Verabreichung des Arzneistoffes an Gewicht verloren. Der größte Teil des Gewichts wurde jedoch nach etwa 17 Tagen zurück gewonnen. Als Kontrolle für jeden Arzneistoff wurden Ratten verwendet, die ein Nb2-U17-Tumortransplantat trugen und eine Injektion mit Kochsalzlösung erhalten hatten. Für jede der sechs Gruppen wurden 5 Tiere verwendet.
Vincristin-Sulfat (0,7 mg/kg) wurde in einem Volumen von 0,20–0,23 ml an Ratten verabreicht, die 281–331 Gramm wogen und Tumoren mit einem Gewicht von 7,6–14,2 Gramm trugen. Navelbin^TM (2,0 mg/kg) wurde in einem Volumen von 0,24–0,31 ml an Ratten verabreicht, die 297–389 Gramm wogen und Tumoren mit einem Gewicht von 11,5–13,7 Gramm trugen. AHVB (3,0 mg/kg) wurde in einem Volumen von 0,20–0,24 ml an Ratten verabreicht, die 314–374 Gramm wogen und Tumoren mit einem Gewicht von 8,2–14,2 Gramm trugen. Vincristin-Sulfat Kontrollen: Kochsalzlösung wurde in einem Volumen von 0,21–0,26 ml an Ratten verabreicht, die 294–370 Gramm wogen und Tumoren mit einem Gewicht von 9,4–14,6 Gramm trugen. Navelbin^TM Kontrollen: Kochsalzlösung wurden in einem Volumen von 0,25–0,29 ml an Ratten verabreicht, die 310–365 Gramm wogen und Tumoren mit einem Gewicht von 9,5–18,2 Gramm trugen. AHVB Kontrollen: Kochsalzlösung wurden in einem Volumen von 0,19–0,25 ml an Ratten verabreicht, die 303–400 Gramm wogen und Tumoren mit einem Gewicht von 7,9–16,6 Gramm trugen. Die Wirksamkeiten jedes einzelnen Arzneistoffes wurden getrennt für drei verschiedenen Dosierungen gegen eine Kontrolle bestimmt.
3 zeigt die Antitumor-Wirksamkeiten der drei Arzneistoffe bei 50% ihrer individuellen, maximal tolerierten Dosis. Die Daten zeigen, dass Navalbin^TM weniger wirksam als AHVB war, das wiederum weniger wirksam als Vincristin war.
Nb2-U17-Tumortransplantat tragende Ratten, denen Kochsalzlösung injiziert wurde, wurden als Kontrollen verwendet. Für jede der sechs Gruppen wurden fünf Tiere verwendet. Vincristin-Sulfat (0,35 mg/kg) wurde in einem Volumen von 0,23–0,27 ml an Ratten verabreicht, die 327–384 Gramm wogen und Tumoren mit einem Gewicht von 6,4–13,4 Gramm trugen. Navelbin^TM (1,0 mg/kg) wurde in einem Volumen von 0,24–0,28 ml an Ratten verabreicht, die 296–351 Gramm wogen und Tumoren mit einem Gewicht von 9,1–14,1 Gramm trugen. AHVB (1,5 mg/Kg) wurde in einem Volumen von 0,20–0,23 ml an Ratten verabreicht, die 308–359 Gramm wogen und Tumoren mit einem Gewicht von 9,7–19,5 Gramm trugen. Vincristin-Sulfat Kontrollen: Kochsalzlösung wurde in einem Volumen von 0,21–0,26 ml an Ratten verabreicht, die 294–370 Gramm wogen und Tumoren mit einem Gewicht von 9,4–14,6 Gramm trugen. Navelbin^TM Kontrollen: Kochsalzlösung wurde in einem Volumen von 0,25–0,29 ml an Ratten verabreicht, die 310–365 Gramm wogen und Tumoren mit einem Gewicht von 9,5–18,2 Gramm trugen. AHVB Kontrollen: Kochsalzlösung wurde in einem Volumen von 0,19–0,25 ml an Ratten verabreicht, die 303–400 Gramm wogen und Tumoren mit einem Gewicht von 7,9–16,6 Gramm trugen. Die Wirksamkeiten jedes einzelnen Wirkstoffes wurden getrennt bei drei verschiedenen Dosierungen gegen eine Kontrolle bestimmt. In 3 werden die drei Wirkstoffe bei äquivalenten, d. h. halben subakut toxischen Dosen miteinander verglichen. Die Kontrollen in 3 sind die gleichen wie in 2.
Studien am murinen P388-Modell
Eine Zytotoxizitäts-Kurve wurde erstellt, um den IC₅₀-Wert von Vincristin, Navelbin^TM und AHVB in der murinen P388-Zelllinie zu bestimmen (vgl. 5). In dieser Studie wurden P388-Zellen, die von einem ascitischen in BDF1 gezogenen Tumor stammten, zuerst mit Ficoll-Paque von roten Zellen getrennt. Isolierte weiße Zellen wurden zweimal gewaschen und dann in Serum gegeben, das Gewebekulturmedium enthielt (1 × 10⁵ Zellen pro ml RPMI 1640, ergänzt mit L-Glutamin, Penicillin, Streptomycin und 10% fötalem Rinderserum) und über 2 Stunden kultiviert. Alle nicht adherierenden Zellen wurden gesammelt, und diese Zellpopulation wurde als P388-Zellen definiert und 24 Stunden später für Zytotoxizitätstests verwendet. Die Zytotoxizitätstests wurden wie in dem „Charakterisierung der Antitumor-Aktivität von AHVB in vitro" betitelten Abschnitt beschrieben durchgeführt. Die verwendeten Arzneistoffkonzentrationen sind auf der X-Achse angegeben. Vincristin wird durch die gefüllten Kreise repräsentiert, Navelbine^TM durch die gefüllten Dreiecke und AHVB durch die gefüllten Quadrate.
Die Antitumor-Aktivität von AHVB in vitro wurde mit der von Vincristin und Navelbin^TM in dem murinen BDF1-P388-Modell mit dem nachstehenden Verfahren verglichen. P388-Zellen wurden aus den Aszites aus zuvor injizierten weiblichen BDF1-Mäusen (19–21 Gramm) erhalten. P388-Zellen aus der NCI-Tumorhinterlegungsstelle wurden direkt in die Mäuse inokulient. Die Zellen werden von NCI tiefgefroren in 1 ml-Aliquots geliefert. Diese Proben wurden schnell bei 37°C aufgetaut, und nachfolgend (innerhalb von 1 Stunde) zwei Mäusen intraperitoneal injiziert, 0,5 ml pro Maus. Eine Woche (7 Tage) nach der Inokulation wurden die Tumorzellen durch Entfernen der intraperitonealen Flüssigkeit unter Verwendung einer sterilen Spritze mit einer 22 Gauge Nadel geerntet. Die Zellen, aus zwei Tieren gepoolt, wurden mittels eines Hämozytometers gezählt, auf eine Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen/m1 verdünnt (RPMI-Medium), und 0,5 ml wurden dann jeder der beiden BDF1-Mäuse zurück injiziert. Die übrigen Zellen wurden gewaschen und in ein DMSO enthaltenes Kulturmedium gegeben und eingefroren (in Tiefkühleinheiten, die mit einer definierten Geschwindigkeit kühlen). Dieses Verfahren wurde wöchentlich über einen Zeitraum von zwei Wochen wiederholt. Zellen, die für die Antitumor-Studien verwendet wurden, wurden von der dritten Passage bis zur 20. Passage eingesammelt. Nach der 20. Passage wurden die Zellen nicht mehr für die experimentellen Studien verwendet. Neu etablierte Zellen wurden aus den eingefrorenen Zellen abgezweigt, die wie vorstehend beschrieben behandelt wurden.
Gruppen (fünf Mäuse pro Gruppe) aus weiblichen BDF1-Mäusen (Charles Rivers, Canada) wurden (intraperitoneal) 10⁶ P388-Zellen injiziert (wie vorstehend beschrieben). Einen Tag nach der Inokulation der Tumorzellen wurde den Mäusen eine intravenöse Bolusinjektion des angegebenen Arzneistoffes über die laterale Schwanzvene gegeben. Kontrollgruppen wurde Kochsalzlösung injiziert. Freie Arzneistoffproben wurden am Tag der Injektion hergestellt, so dass die Endkonzentrationen ausreichend waren, um die angezeigte Wirkstoffdosis in einem Volumen von 200 μl zu gewährleisten. Alle Verdünnungen wurden unter Verwendung von 0,9% Natriumchlorid-Injektion USP hergestellt. Die Mäuse wurden während der intravenösen Injektion kurz (weniger als 30 sec) festgehalten. Erweiterung der Vene wurde durch Halten der Tiere unter einer Wärmelampe für einen Zeitraum zwischen fünf und zehn Minuten erreicht. Nach der Verabreichung der Testsubstanzen wurden die Tiere über 14 Tage täglich gewogen und auf Anzeichen von Stress zweimal täglich während der ersten 14 Tage (einmal täglich an Wochenenden) und einmal täglich für den Rest der Studie überwacht. Ernstlich gestresste Tiere wurden durch CO₂-Erstickung getötet, und der Todeszeitpunkt wurde für den folgenden Tag aufgezeichnet. Obwohl vollständige Dosis-Titrationen für jeden Wirkstoff vollendet wurden, sind die in 6 gezeigten Daten jene, die nach Verabreichung der freien Wirkstoffe in ihrer maximal tolerierten Dosis erhalten wurden. Diese betrugen 3, 40 und 40 mg/kg für Vincristin, Navelbin^TM, bzw. AHVB.
4 stellt die Ergebnisse einer Studie dar, die den durch Vinca-Alkaloid ausgelösten Gewichtsverlust zeigt, der auf eine einzelne intravenöse Injektion des angezeigten Arzneistoffes bei der maximal tolerierten Dosis folgte (vgl. 6). Diese Daten wurden als Teil der Studie erhalten, die in 6 genauer dargestellt ist. Nach Behandlung der Mäuse (die den P388-Tumor trugen) mit einer einzelnen Dosis des angezeigten Wirkstoffes wurden die Tiere während der ersten 14 Tage zweimal täglich untersucht (einmal täglich an Wochenenden). Das mittlere Körpergewicht wurde in diesem Zeitraum täglich bestimmt, und die Ergebnisse werden in 4 gezeigt. Gewichtszunahme bei den Kontrollen ist ein Zeichen für Tumorprogression. Die Ergebnisse zeigen, dass AHVB, verabreicht mit 40 mg/kg, der am wenigsten toxische der drei untersuchten Arzneistoffe ist.
Die Dosis-Wirkungs-Kurve, die für AHVB erhalten wurde, wenn es verwendet wurde um BDF1-Mäuse mit P388-Tumoren zu behandeln, wird in 7 gezeigt. Die Studien wurden wie für 6 beschrieben durchgeführt. Die maximal tolerierte Dosis für AHVB (40 mg/kg), die in diesen Studien gefunden wurde, spiegelt eine sehr akut (innerhalb von 1 Stunde) toxische Reaktion wieder, die weitere Erhöhung der Dosis für die i. v.-Verabreichung von AHVB begrenzt. Dies steht im Kontrast zu der längerfristigen Toxizität, die für Navelbin^TM bei seiner maximal tolerierten Dosis beobachtet wurde und legt nahe, dass eine Möglichkeit, um die akute Toxizität von AHVB zu umgehen, zu signifikanten Erhöhungen der maximal tolerierten Dosis führen könnte.
Basierend auf der Berücksichtigung der in vitro Studien zur Durchmusterung der Arzneistoffe ist es überraschend, dass AHVB als ein antineoplastisches Mittel für den Einsatz in der Krebstherapie gut wirksam ist. Die in vitro-Tests zeigen an, dass AHVB durchgehend auf molarer Basis 10- bis 15mal weniger aktiv (Tabelle 1 und 5) als Vincristin und Navelbine^TM ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass AHVB nicht gut als ein Antitumor-Mittel geeignet sein würde. In einer Wirksamkeitsstudie jedoch, die auch die P388-Zelllinie verwendet (vgl. 6), ist die Antitumor-Aktivität von AHVB bei der maximal tolerierten Dosis (40 mg/kg, einzelne i. v.-Injektion) signifikant besser als die für Vincristin beobachtete (verabreicht mit der maximal tolerierten Dosis des freien Arzneistoffes von 3 mg/kg). Die verbesserte Antitumor-Aktivität wird in diesem Fall durch die Anzahl der Langzeitüberlebenden (> 60 Tage) gemessen. Es ist wichtig zu betonen, dass in diesem Beispiel AHVB etwa 10mal weniger toxisch (auf einer Gewichtsbasis) als Vincristin ist. Daher kann 10mal mehr von dem Arzneistoff gegeben werden, und gerade bei dieser Dosis werden Verbesserungen in der Langzeitüberlebensrate der Tiere mit P388-Tumoren beobachtet. Beim Vergleich mit Navelbine^TM sind die in vivo-Ergebnisse sogar noch überraschender, denn die maximal tolerierten Dosen beider Arzneistoffe in Tieren mit P388-Tumoren sind etwa die gleichen (40 mg/kg).
8 zeigt die Zytotoxizität von AHVB auf SKOV3-Zellen und C-4-Zellen mit einer Inkubationszeit von 3 Tagen. Die IC₅₀-Werte für SH0V3- und C-4-Zellen betrugen 4,0 μM beziehungsweise 0,02 μM. Beide Zelllinien wurden vom ATCC bezogen und unter Verwendung von standardisierten Kulturtechniken und Medien wie vorstehend beschrieben gezüchtet. Die IC₅₀-Werte wurden durch vorstehend beschriebene Standard Zytotoxizitätstests bestimmt, wobei jede Vertiefung etwa 10⁴ Zellen enthielt.
Studien am H460-SC-Tumor-Mausmodell
Kulturen der menschlichen H460 Lungenzellen sind vom British Columbia Cancer Research Center erhältlich. Die Zellen wurden vollentwickelten männlichen Rag-2-Mäusen unter Verwendung einer 26 Gauge-Nadel zweimal subkutan injiziert ( 24 Mäuse, 1 × 10⁶ Zellen/Maus). Die H460-Zellen wurden in einer Hank's Balanced Salt Solution ohne Calcium suspendiert. Die Tumoren konnten sich innerhalb von 11 Tagen in den Mäusen bilden.
Sobald sich die Tumoren gut entwickelt hatten, wurden vier getrennte Gruppen der Mäuse zur Verabreichung der drei Testsubstanzen (d. h. eine Gruppe für jede der Testsubstanzen AHVB-Bisulfat, AHVB-Ditartrat und Navelbin^TM) und eine Kontrollgruppe ausgewählt.
AHVB-Bisulfat, AHVB-Ditartrat und Navelbin^TM wurden unter Verwendung von 5% mit Argon gesättigter Dextrose gelöst. Beide dieser Substanzen hatten eine Konzentration von 20 mg/ml. Alle Dosisverdünnungen wurden mit 5% Dextrose durchgeführt.
Die Substanzen wurden an den Tagen 1, 5 und 9 intravenös verabreicht, ebenso wie die Kontrolllösungen aus 5% Dextrose. Messungen der Körpergewichte und Tumorvermessungen mit Schieblehren wurden in den ersten 10 Tagen täglich und dann für den Rest der Studie jeden zweiten Tag durchgeführt.
Nach Verabreichung der Testsubstanzen wurden Gewicht und Tumorgröße (mittels Schieblehre) der Tiere in den ersten 10 Tagen täglich und dann für den Rest der Studie jeden zweiten Tag durchgeführt. Wenn der Tumor ein Gewicht von 1 Gramm erreichte oder der Tumor zu ulzerieren begann, wurden die Tiere getötet (durch Inhalation von Kohlendioxid) und einer Autopsie unterzogen. Die Tiere wurden ebenso mindestens täglich auf Anzeichen von Stress während der gesamten Dauer der Studie beobachtet. Tiere, die schwere Symptome von Stress (rapider Gewichtsverlust, Keuchen, gekrümmte Haltung, struppiges Fell) aufwiesen, wurden gleichfalls getötet und einer Autopsie unterzogen.
Anhydrovinblastin-Sulfat (3',4'-Dehydrovinblastin) wurde von der British Columbia Cancer Agency (BCCA), Investigational Drug Section, bezogen. Navelbine^TM (Vinorelbin-Tartrat; 3',4'-Didehydro-4'-desoxy-C'-norvincaleukoblastin-di-L-tartrat) wurde von Glaxo/Burroughs Wellcome Inc., Kanada bezogen.
Die Tiere betreffende Methodik wurde vom BCCA's Institutional Animal Care Committee (IACC) der UBC vor Durchführung der Studien genehmigt (Animal Care Certificate Nr. A94-1602). Während der Studie wurden die Pflege, Unterbringung und die Nutzung der Tiere in Einklang mit den kanadischen Richtlinien für Tierpflege (Canadian Council on Animal Care Guidelines) durchgeführt.
Die Ergebnisse der Wirksamkeitsstudien werden in 9 dargestellt und zeigen Mittelwerte der Daten von 6 oder weniger Tieren. Jede Maus in einer bestimmten Substanz-Gruppe hatte zwei subkutane Tumoren auf ihrem Rücken. Jeder Tumor wurde in Länge und Breite vermessen, und das Volumen jedes Tumors wurde mit (L × B)²/2 berechnet. Die beiden Tumorvolumina wurden dann gemittelt. Die Mittelwerte der Volumina aller Mäuse/Gruppe wurden gemittelt, um einen Mittelwert für den einzelnen Datenpunkt zu erhalten, der auf dem Graph in 9 erscheint. Die Berechnung wurde an jedem Tag durchgeführt, an dem die Tumoren vermessen wurden. Die Standardabweichung und der Standardfehler des Mittelwertes wurden mit den Fehlerbalken, die in 9 dargestellt sind, berechnet.
Studien an dem C-4 (Zervix-) soliden Tumor-Modell
Kulturen menschlicher C-4-Zervixkarzinomzellen sind vom British Columbia Cancer Research Centre erhältlich. Die Zellen wurden reifen männlichen Rag-Mäusen zweimal subkutan unter Verwendung einer 26 Gauge-Nadel injiziert (24 Mäuse, 1 × 10⁶ Zellen/Maus). Die C-4-Zellen wurden in Hank's Balanced Salt Solution ohne Calcium suspendiert. Tumoren konnten sich innerhalb von 31 Tagen in den Mäusen bilden.
Sobald sich die Tumoren gut ausgebildet hatten, wurden vier Gruppen zur Verabreichung der drei Testsubstanzen (d. h. eine Gruppe für jede Testsubstanz aus AHVB-Bisulfat, AHVB-Ditartrat und Navelbin^TM) und eine Kontrollgruppe ausgewählt.
AHVB-Bisulfat und -Ditartrat und Navelbin^TM wurden unter Verwendung von 5% Dextrose, die mit Argon gesättigt war, gelöst. Diese Substanzen wurden in Dosen von 20 mg/kg i. v. verabreicht. Alle Dosisverdünnungen wurden mit 5% Dextrose durchgeführt.
Die Substanzen wurden intravenös an den Tagen 1, 5 und 9 verabreicht, ebenso wie die Kontrolllösungen aus 5% Dextrose. Messungen der Körpergewichte und Tumorvermessungen mit Schieblehren wurden regelmäßig während der Dauer der Studie von 69 Tagen vorgenommen.
Nach Verabreichung der Testsubstanzen wurden Gewicht und Tumorgröße (mittels Schieblehre) der Tiere regelmäßig während der Dauer der Studie gemessen. Wenn die Tumorgröße ein Gewicht von 1 Gramm erreichte oder der Tumor zu ulzerieren begann, wurden die Tiere getötet (durch Inhalation von Kohlendioxid) und einer Autopsie unterzogen. Die Tiere wurden ebenso mindestens täglich auf Anzeichen von Stress während der gesamten Dauer der Studie beobachtet. Tiere, die schwere Symptome von Stress (rapider Gewichtsverlust, Keuchen, gekrümmte Haltung, struppiges Fell) aufwiesen, wurden gleichfalls getötet und einer Autopsie unterzogen.
Anhydrovinblastin-Sulfat (3',4'-Dehydrovinblastin) wurde von der British Columbia Cancer Agency (BCCA), Investigational Drug Section bezogen. Navelbin^TM (Vinorelbin-Tartrat; 3',4'-Didehydro-4'-desoxy-C'-norvincaleukoblastin-di-L-tartrat) wurde von Glaxo/Burroughs Wellcome Inc., Kanada, bezogen.
Die Tiere betreffende Methodik wurde vom BCCA's Institutional Animal Care Committee (IACC) der UBC vor Durchführung der Studien genehmigt (Animal Care Certificate Nr. A94- 1602). Während der Studie wurden die Pflege, Unterbringung und die Nutzung der Tiere in Einklang mit den kanadischen Richtlinien für Tierpflege (Canadian Council on Animal Care Guidelines) durchgeführt.
Die Ergebnisse der Wirksamkeitsstudie werden in Tabelle 3 dargestellt und zeigen Mittelwerte der Daten von 6 oder weniger Tieren. Jede Maus in einer bestimmten Substanz- Gruppe hatte zwei subkutane Tumoren auf ihrem Rücken. Jeder Tumor wurde in Länge und Breite vermessen, und das Volumen jedes Tumors wurde mit (L × B)²/2 berechnet. Die beiden Tumorvolumina wurden dann gemittelt. Die Mittelwerte der Volumina aller Mäuse/Gruppe wurden gemittelt, um einen Mittelwert für den einzelnen Datenpunkt zu erhalten, der auf dem Graph in 9 erscheint. Die Berechnung wurde an jedem Tag durchgeführt, an dem die Tumoren vermessen wurden.
Navalbin^TM-Tumoren erreichten ihre beobachtbare „Wachstumsschwelle" an Tag 41 und wuchsen stetig weiter, während der von AHVB-Ditartrat die Schwelle an Tag 55 erreichte. Der mit AHVB-Bisulfat behandelte Tumor zeigte vernachlässigbares Tumorwachstum durchgehend bis zum Tag 69. Navelbin^TM wies eine 84%ige Verzögerung im Wachstum des Tumors auf, AHVB-Ditartrat hatte eine erweiterte Verzögerung von 106% und AHVB-Bisulfat zeigte eine bemerkenswerte Verzögerung des Tumorwachstums von mehr als 209%. Das Tumorwachstum erreichte die beobachtbare Wachstumsschwelle über 70 Tage nicht. Diese Daten finden sich in Tabelle 3, nachstehend.
Tabelle 3: Verringerung von solidem Tumor in Wachstumsdaten
Zusammen genommen zeigen die hier dargestellten Daten, das AHVB signifikante und einzigartige pharmakologische Eigenschaften in vivo besitzt, die zu signifikanten Verbesserungen der Antitumor-Wirksamkeit in vivo relativ zu anderen Vinca-Alkaloiden wie etwa Vincristin und Navelbin^TM führen. Diese Ergebnisse sind einzigartig und neu, denn aufgrund der Basis der in vitro-Studien zu Zytotoxizität wurde vorausgesagt, dass die in vivo-Aktivität von AHVB signifikant geringer sein würde.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Arzneimittel bereit, die eine wie in den Ansprüchen offenbarten Verbindungen zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen, inerten oder physiologisch aktiven Verdünnungsmitteln oder Hilfsstoffen enthält. Die Verbindungen der Erfindung können gefriergetrocknet werden und, falls erwünscht, mit anderen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten kombiniert werden, um Formulierungen zur Verabreichung herzustellen. Diese Zusammensetzungen können in jeder für den geplanten Applikationsweg geeigneten Form präsentiert werden. Der parenterale und der intravenöse Weg sind die bevorzugten Wege der Verabreichung.
3',4'-Anhydrovinblastin kann oral, topisch, parenteral, durch Inhalation oder Spray oder rektal als Dosierungseinheit in Formulierungen verabreicht werden, die herkömmliche, nicht toxische pharmazeutisch verträgliche Träger, Hilfsstoffe und Vehikel enthalten. Der hierin verwendete Ausdruck parenteral umfasst subkutane Injektion, intravenöse, intramuskuläre, intrasternale Injektions- oder Infusionstechniken. Zusätzlich wird eine pharmazeutische Formulierung bereit gestellt, die 3',4'-Anhydrovinblastin und einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält. 3',4'-Anhydrovinblastin kann in Verbindung mit einem oder mehreren nicht toxischen pharmazeutisch verträglichen Träger(n) und/oder Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsstoffen und, falls erwünscht, anderen Wirkstoff gebracht werden. Die Arzneimittel, die 3',4'-Anhydrovinblastin enthalten, können in einer Form vorliegen, die für orale Anwendung geeignet ist, zum Beispiel als Tabletten, Pastillen, Lutschtabletten, wässrige oder ölige Suspensionen, dispergierbare Puder oder Granula, Emulsion, Hart- oder Weichkapseln oder Sirups oder Elixire.
Zusammensetzungen, die für den oralen Gebrach gedacht sind, können nach jeder in dem Fachgebiet bekannten Art zur Herstellung von Arzneimitteln hergestellt werden, und solche Zusammensetzungen können einen oder mehrere Agenzien enthalten, die aus der Gruppe der Süßungsmittel, Geschmackstoffe, Farbstoffe und Konservierungsstoffe ausgewählt werden, um pharmazeutisch elegante und angenehme Präparate bereit zu stellen. Tabletten enthalten den Wirkstoff in Beimengung mit nicht toxischen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten, die sich zur Herstellung von Tabletten eignen. Diese Exzipienten können zum Beispiel inerte Verdünnungsmittel sein, wie etwa Calciumcarbonat, Natriumcarbonat, Laktose, Calciumphosphat oder Natriumphosphat; granulierende Agenzien und Sprengmittel, zum Beispiel Maisstärke oder Alginsäure; Bindemittel, zum Beispiel Stärke, Gelatine oder Gummi Arabicum Gleitmittel, zum Beispiel Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Talkum. Die Tabletten können ohne Überzug sein, oder sie können nach bekannten Verfahren überzogen werden, um Zerfall und Adsorption im Magen-Darm-Trakt zu verzögern und damit eine verlängerte Wirkung über einen längeren Zeitabschnitt liefern. Zum Beispiel kann ein Material zur Zeitverzögerung wie etwa Glycerinmonostearat oder Glycerindistearat verwendet werden.
Formulierungen zum oralen Gebrauch können auch als harte Hartgelatinekapseln bereit gestellt werden, in denen der Wirkstoff mit einem inerten, festen Verdünnungsmittel, zum Beispiel Calciumcarbonat, Calciumphosphat oder Kaolin vermischt ist, oder als Weichgelatinekapseln, in denen der Wirkstoff mit Wasser oder einem öligen Medium vermischt ist, zum Beispiel Erdnussöl, flüssigem Paraffin oder Olivenöl.
Wässrige Suspensionen enthalten Wirkstoff im Gemisch mit Exzipienten, die zur Herstellung wässriger Suspensionen geeignet sind. Solche Exzipienten sind suspendierende Agenzien, zum Beispiel Natriumcarboxymethylzellulose, Methylzellulose, Hydropropylmethylzellulose, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon, Tragant-Gummi und Gummi Arabicum; dispergierende oder feuchthaltende Mittel können ein natürlich vorkommendes Phosphatid sein, zum Beispiel Lecithin oder Kondensationsprodukte eines Alkylenoxids mit Fettsäuren, zum Beispiel Polyoxyethylenstearat, oder Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit langkettigen aliphatischen Alkoholen, zum Beispiel Heptadecaethylenoxycetanol, oder Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit partiellen Estern, die aus Fettsäuren und einem Hexitol stammen, wie etwa Polyoxyethylen-sorbitolmonooleat, oder Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit partiellen Estern, die aus Fettsäuren und Hexitolanhydriden stammen, zum Beispiel Polyethylensorbitanmonooleat. Die wässrigen Suspensionen können auch ein oder mehrere Konservierungsmittel enthalten, zum Beispiel Ethyl oder n-Propyl-p-hydroxybenzoat, ein oder mehrere Farbstoffe, ein oder mehrere Geschmackstoffe oder ein oder mehrere Süßungsmittel wie Sacherose oder Saccharose.
Ölige Suspensionen können formuliert werden, indem die Wirkstoffe in einem Pflanzenöl suspendiert werden, zum Beispiel in Erdnußöl, Olivenöl, Sesamöl oder Kokosnussöl oder in einem Mineralöl wie etwa flüssigem Paraffin. Die ölige Suspensionen können ein Verdickungsmittel enthalten, zum Beispiel Bienenwachs, hartes Paraffin oder Cetylalkohol. Süßungsmittel wie etwa die vorstehend genannten und Geschmackstoffe können zugegeben werden, um angenehme orale Präparate bereit zu stellen. Diese Zusammensetzungen können durch die Zugabe eines Antioxidants wie etwa Ascorbinsäure konserviert werden.
Dispergierbare Puder und Granula, die für die Herstellung einer wässrigen Suspension durch die Zugabe von Wasser geeignet sind, stellen den Wirkstoff in einem Gemisch mit einem dispergierendem oder feuchthaltendem Mittel, suspendierenden Mittel und einem oder mehreren Konservierungsmitteln bereit. Geeignete dispergierende oder benetzende Mittel und suspendierende Mittel sind exemplarisch durch die bereits vorstehend genannten angeführt. Zusätzliche Exzipienten, zum Beispiel süßende, Geschmack gebende und färbende Mittel können ebenfalls anwesend sein.
Arzneimittel der Erfindung können auch in der Form einer Öl-in-Wasser Emulsion vorliegen. Die Öl-Phase kann ein Pflanzenöl sein, zum Beispiel Olivenöl oder Erdnußöl oder ein Mineralöl, zum Beispiel flüssiges Paraffin oder Gemische aus diesen. Geeignete Emulgatoren können natürlich vorkommende Gummis sein, zum Beispiel Gummi Arabicum oder Tragant-Gummi, natürlich vorkommende Phosphatide, zum Beispiel Sojabohne, Lecithin und Ester oder partielle Ester, die von Fettsäuren und Hexitol abgeleitet sind, Anhydride, zum Beispiel Sorbitanmonoleat und Kondensationsprodukte der genannten partiellen Ester mit Ethylenoxid, zum Beispiel Polyoxyethylensorbitanmonoleat. Die Emulsionen können auch süßende und Geschmack gebende Agenzien enthalten.
Sirups und Elixire können mit süßenden Agenzien, zum Beispiel Glycerin, Propylenglycol, Sorbit oder Saccharose formuliert werden. Solche Formulierungen können auch ein Reiz linderndes Mittel, ein Konservierungsmittel und Geschmack gebende und färbende Mittel enthalten. Die Arzneimittel können die Form einer sterilen, injizierbaren wässrigen oder öligen Suspension haben. Diese Suspension kann eine Formulierung nach bekannter Weise unter Verwendung jener geeigneten dispergierender oder benetzenden Mittel und suspendierenden Mittel sein, die vorstehend genannt wurden. Das sterile, injizierbare Präparat kann auch eine sterile, injizierbare Lösung oder Suspension in einem nicht toxischen grundsätzlich verträglichen Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel sein, zum Beispiel als eine Lösung in 1,3-Butandiol. Zu den verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, gehört Wasser, Ringerlösung und isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden sterile, nicht flüssige Öle in herkömmlicher Weise als ein Lösungsmittel oder suspendierendes Medium verwendet. Zu diesem Zweck kann jedes milde nicht flüssige Öl verwendet werden, einschließlich synthetischer Mono- oder Diglyceride. Zusätzlich finden Fettsäuren wie etwa Ölsäure Verwendung bei der Herstellung von Injectabilia.
3',4'-Anhydrovinblastin kann auch die Form von Zäpfchen zur rektalen Verabreichung des Arzneistoffes haben. Diese Zusammensetzung können durch das Vermischen des Wirkstoffes mit einem geeigneten, nicht reizenden Exziprienten hergestellt werden, der unter normalen Temperaturen fest ist, bei der rektalen Temperatur aber flüssig, sodass er daher im Rektum schmelzen und den Arzneistoff freisetzen wird. Solche Materialien sind Kakaobutter und Polyethylenglykole.
3',4'-Anhydrovinblastin kann parenteral in einem sterilen Medium verabreicht werden. Der Arzneistoff kann, abhängig von dem Vehikel und der verwendeten Konzentration, entweder im Vehikel suspendiert oder gelöst sein. Es ist von Vorteil, das Hilfsstoffe wie Lokalanaesthetika, Konservierungsmittel und Puffernde Mittel in dem Vehikel gelöst werden können.
Für die Zusammensetzungen dieser Erfindung wird die zu verabreichende Dosis, ob als Einzeldosis, Mehrfachdosis oder Tagesdosis, mit der speziellen zu verwendenden Verbindung unterschiedlich sein. Faktoren, die bei der Entscheidung für ein Dosierungs-Schema zu berücksichtigen sind, schließen die Wirksamkeit der Verbindung, den Weg der Verabreichung, die Größe des Empfängers und die Art der Erkrankung des Patienten mit ein.
Die zu verabreichende Dosierung ist keinen definierten Grenzen unterworfen, sie wird jedoch allgemein eine wirksame Menge sein. Es wird allgemein ein Äquivalent auf einer molaren Basis der pharmakologisch aktiven freien Form sein, die mit einer Darreichungsformulierung mit der metabolischen Freisetzung des aktiven freien Arzneistoffes seine erwünschten pharmakologischen und physiologischen Wirkungen erreicht.
Ein auf dem Gebiet der Krebsbehandlung erfahrener Onkologe wird in der Lage sein, ohne unzumutbare Experimente entsprechende Protokolle zur wirksamen Anwendung der Verbindungen dieser vorliegenden Erfindung durch Bezugnahme auf vorausgehende Studien zu Vinblastin und seinen Derivaten zu überprüfen.
AHVB, ein Derivat des Vinka-Alkaloids Vinblastin, hat signifikantes zytotoxisches Potential gegen eine Reihe von menschlichen Krebszelllinen und signifikante Aktivität gegen das Xenograph des menschlichen H460-nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms in SCID/Rag-2-Mäusen gezeigt. In vitro-Untersuchungen zur Zytotoxizität, die den MTT-Test zur Zytotoxizität mit einer Wirkstoffexpositionszeit von 72 Stunden verwendeten, haben gezeigt, dass AHVB ein aktiver zytotoxischer Arzneistoff ist, dessen IC⁵⁰-Werte gegen das menschliche H460-nicht-kleinzellige Lungenkarzinom, das menschliche C-4-Zervixkarzinom, die menschliche K562-Leukämie und die menschlichen A431 epidermoiden Zelllinien im Bereich von 20–24 nM liegen. AHVB war etwa 10mal weniger wirksam als Navelbin^TM, wenn es in vitro gegen die gleichen Zelllinen getestet wurde. Überraschend stellte sich jedoch heraus, dass AHVB wirksamer als Navalbin^TM war, wenn es in Experimenten in vivo auf Wirksamkeit gegen solidee Tumoren getestet wurde. Männliche SCID/Rag-2-Mäusen wurden H460-Zellen s. c. inokuliert, und nach 12 Tagen des Tumorwachstums wurden AHVB und Navelbin^TM in Dosen von 10 mg/kg und 20 mg/kg an den Tagen 1, 5, 9, i. v. gegeben. In diesem Modell bewirkte AHVB größere Hemmung des Tumorwachstums und war weniger toxisch als Navelbin^TM. Diese Ergebnisse legen nahe, dass AHVB erwünschte pharmakologische Eigenschaften für therapeutische Anwendungen haben könnte.
Es ist selbstverständlich, dass die vorstehend beschriebenen Beispiele den Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht begrenzen sollen. Es wird erwartet, dass Fachleuten auf dem Gebiet, das die vorliegende Erfindung betrifft, zahlreiche Variationen offensichtlich sind, ohne vom Geist der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Die anliegenden, sorgfältig formulierten Ansprüche bilden die einzige Eingrenzung des Rahmens der vorliegenden Erfindung.

Claims

3',4'-Anhydrovinblastin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon zur Verwendung in der Behandlung eines Karzinoms in einem Säuger.
3',4'-Anhydrovinblastin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon nach Anspruch 1, wobei das Karzinom Brustkrebs, Zervixkrebs, Lungenkrebs oder Dickdarmkrebs ist.
3',4'-Anhydrovinblastin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Karzinom Brustkrebs ist.
3',4'-Anhydrovinblastin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Karzinom Zervixkrebs ist.
3',4'-Anhydrovinblastin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Karzinom Lungenkrebs ist.
3',4'-Anhydrovinblastin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Karzinom Dickdarmkrebs ist.
3',4'-Anhydrovinblastin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon zur Verwendung in der Behandlung eines Sarkoms in einem Säuger.
3',4'-Anhydrovinblastin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon zur Verwendung in der Behandlung eines Lymphoms in einem Säuger.
3',4'-Anhydrovinblastin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon nach Anspruch 8, wobei das Lymphom ein T-Zell-Lymphom ist.
3',4'-Anhydrovinblastin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon zur Verwendung in der Behandlung von Leukämie in einem Säuger.
3',4'-Anhydrovinblastin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon nach Anspruch 10, wobei die Leukämie Erythroleukämie ist.
Pharmazeutisch verträgliches Salz von 3',4'-Anhydrovinblastin nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Salz 3',4'-Anhydrovinblastinsulfat, 3',4'-Anhydrovinblastinbisulfat oder 3',4'-Anhydrovinblastinditartrat ist.
3',4'-Anhydrovinblastin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Verwendung bei einer maximalen Konzentration erfolgt, die etwa zehnmal höher ist als die therapeutisch verträglichen Konzentrationen von Vincristin.
Verwendung von 3',4'-Anhydrovinblastin oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Karzinoms in einem Säuger.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Karzinom Brustkrebs, Zervixkrebs, Lungenkrebs oder Dickdarmkrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei das Karzinom Brustkrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei das Karzinom Zervixkrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei das Karzinom Lungenkrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, wobei das Karzinom Dickdarmkrebs ist.
Verwendung von 3',4'-Anhydrovinblastin oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Sarkoms in einem Säuger.
Verwendung von 3',4'-Anhydrovinblastin, oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines Lymphoms in einem Säuger.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Lymphom ein T-Zell-Lymphom ist.
Verwendung von 3',4'-Anhydrovinblastin oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Leukämie in einem Säuger.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei die Leukämie eine Erythroleukämie ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 24, wobei 3',4'-Anhydrovinblastin in einer maximalen Konzentration vorhanden ist, die etwa zehnmal höher ist als die therapeutisch verträglichen Konzentrationen von Vincristin.
Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 25, wobei das pharmazeutisch verträgliche Salz von 3',4'-Anhydrovinblastin 3',4'-Anhydrovinblastinsulfat, 3',4'-Anhydrovinblastinbisulfat oder 3',4'-Anhydrovinblastinditartrat ist.
Therapeutische oder pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge von 3',4'-Anhydrovinblastin oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon und ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche, physiologisch inerte oder aktive Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe umfasst, wobei 3',4'-Anhydrovinblastin in einer maximalen Konzentration anwesend ist, die etwa zehnmal höher ist als die therapeutisch verträglichen Konzentrationen von Vincristin, zur Verwendung in der Behandlung eines Karzinoms in einem Säuger.
Zusammensetzung nach Anspruch 27, wobei das Karzinom Brustkrebs, Zervixkrebs, Lungenkrebs oder Dickdarmkrebs ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 27 oder 28, wobei das Karzinom Brustkrebs ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 27 oder 28, wobei das Karzinom Zervixkrebs ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 27 oder 28, wobei das Karzinom Lungenkrebs ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 27 oder 28, wobei das Karzinom Dickdarmkrebs ist.
Therapeutische oder pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge von 3',4'-Anhydrovinblastin oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon und ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche, physiologisch inerte oder aktive Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe umfasst, wobei 3',4'-Anhydrovinblastin in einer maximalen Konzentration anwesend ist, die etwa zehnmal höher ist als die therapeutisch verträglichen Konzentrationen von Vincristin, zur Verwendung in der Behandlung eines Sarkoms in einem Säuger.
Therapeutische oder pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge von 3',4'-Anhydrovinblastin oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon und ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche, physiologisch inerte oder aktive Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe umfasst, wobei 3',4'-Anhydrovinblastin in einer maximalen Konzentration anwesend ist, die etwa zehnmal höher ist als die therapeutisch verträglichen Konzentrationen von Vincristin, zur Verwendung in der Behandlung von Leukämie in einem Säuger.
Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei die Leukämie eine Erythroleukämie ist.
Therapeutische oder pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge von 3',4'-Anhydrovinblastin oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon und ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche, physiologisch inerte oder aktive Verdünnungsmittel oder Hilfsstoffe umfasst, wobei 3',4'-Anhydrovinblastin in einer maximalen Konzentration anwesend ist, die etwa zehnmal höher ist als die therapeutisch verträglichen Konzentrationen von Vincristin, zur Verwendung in der Behandlung eines Lymphoms in einem Säuger.
Zusammensetzung nach Anspruch 36, wobei das Lymphom ein T-Zell-Lymphom ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 27 bis 37, wobei das pharmazeutisch verträgliche Salz 3',4'-Anhydrovinblastinsulfat, 3',4'-Anhydrovinblastinbisulfat oder 3',4'-Anhydrovinblastinditartrat ist.