DE69534361T2

DE69534361T2 - Therapeutische Quassinoid-Zubereitungen mit antineoplastischer, antiviraler und herbistatischer Wirkung

Info

Publication number: DE69534361T2
Application number: DE69534361T
Authority: DE
Inventors: Paul A Grieco; D. James Morre; Thomas H. Corbett; Frederick A. Valeriote
Original assignee: Wayne State University; Indiana University Research and Technology Corp; Purdue Research Foundation
Current assignee: Wayne State University; Indiana University Research and Technology Corp; Purdue Research Foundation
Priority date: 1994-11-04
Filing date: 1995-11-03
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2015-11-04
Also published as: DE69530857T2; EP1325922B1; DE69530857D1; EP0792148B1; EP1325922A2; DE69534361D1; JPH09511761A; EP1325922A3; ATE300943T1; WO1996014065A1; ES2201136T3; EP0792148A4; JP3058188B2; EP0792148A1; CA2204361A1; US5849748A; ATE240726T1; DK0792148T3; US5965493A; US5639712A

Description

Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der US-Regierung unter den Erteilungsnummern CA 22865 und CA 46560 des National Institutes of Health gemacht. Die US-Regierung hat an der Erfindung gewisse Rechte.
Hintergrund und Zusammenfassung der Erfindung
Die Pflanzenfamilie Simaroubaceae umfasst zahlreiche Spezies, die in erster Linie in pantropischen Regionen verteilt sind. Diese Pflanzenspezies sind Quelle einer großen Familie von bitteren Terpenoid-Substanzen, mit dem Sammelbegriff Quassinoide. Wie bei vielen Pflanzenalkaloiden oder natürlichen isolierten Pflanzenextrakten wurde herausgefunden, dass Quassinoide vielfältige biologische Aktivität besitzen, einschließlich anti-malarische, anti-insektizide, anti-amoebicidale, anti-leukämische und anti-virale Aktivität.
Die große Mehrheit der Quassinoide sind stark oxidierte Lactone, die das folgende Gerüst mit zwanzig Kohlenstoffatomen enthalten,
üblicherweise Picrasan genannt, obwohl Gerüste mit achtzehn, neunzehn und fünfundzwanzig Kohlenstoffatomen ebenso bekannt sind. Viele verschiedene Ringstrukturen und Seitenketten, insbesondere am C-15, sind bekannt (siehe z. B. Grieco, Paul A. et al: „Synthetic studies on quassinoids: total synthesis of (–)-chaparrinone, (–)-glaucarubolone, and (+)-glaucarubinone". S. Am. Chem. Soc. (1993), 115 (14), 6078–93; Polonsky, „Quassinoid Bitter Principles 11", Fortschr. Chem. Org Naturst, Progress in the Chemistry of Organic Natural Products, 1985, 47, 221). Die vorliegende Erfindung umfasst sowohl neue als auch synthetisch erhaltene Quassinoid-Analoge ebenso wie neue Verwendungen für solche synthetischen Quassinoide und zuvor identifizierte und isolierte natürliche Quassinoide. Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung offenbart, die durch die Formel
charakterisiert ist, worin R Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl oder Aryl darstellt und Y eine Seitenkette mit der Formel
darstellt, worin R₂ eine Methylgruppe, R₃ eine Methylgruppe und R₄ eine Hydroxylgruppe, Hydroxyalkan oder Hydroxyalken ist.
Zusätzlich sind Verbindungen, in denen R₂ eine Methylgruppe, R₃ eine Methylgruppe und R₄ eine Hydroxymethylgruppe ist, in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Seitenkette Y durch
dargestellt sein, wobei R₅ und R₆ ist eine Isopropylgruppe oder R₅ und R₆ ist eine Ethylgruppe und R₇ ist eine Hydroxylgruppe.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der zuvor beschriebenen, synthetisch erhaltenen Quassinoide oder zuvor bekannter, gereinigter und isolierter Quassinoide zur Behandlung von neoplastischen Störungen wie festen Tumoren in Verbindung mit geeigneten pharmazeutischen Trägern.
Nach dem Verständnis der Fachleute können die besonderen pharmazeutischen Träger Salzlösungen sein, die geeignete Stabilisatoren, Puffer, antimikrobielle Mittel, Antifungizidemittel oder andere solche Zusätze, die zur Lagerung und Lieferung erforderlich sind, enthalten. Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung die lyophilisierte Lagerung mit Aktivierung durch Vermischung oder jede andere Lagerungstechnik, die im pharmazeutischen Bereich dem Fachmann bekannt und von ihm verwendet wird. Deren Verwendung oder die Verwendung von Konjugaten anderer Mitglieder der Quassinoid-Familie als Breitspektrum-Antikrebsmittel ist angezeigt.
Die Möglichkeiten für eine Konjugation sind breit. Die grundsätzlichen Erfordernisse sind, dass die konjugierten Materialien das Quassinoid unverändert belassen und deren Fähigkeit, das Wachstum durch die Zelloberflächenseite zu hemmen, nicht beeinflussen. Zusätzlich wird erwartet, dass die Materialien mit therapeutischem Verwendungszweck davon profitieren, nicht-toxisch und nicht-immunogen zu sein und Konjugate bilden, sollten die wasserlöslich und/oder leicht zu verabreichen sind. Aktive Spezies in hoher Ausbeute und Wirksamkeit bei geringen Kosten würden zusätzliche gewünschte Eigenschaften ausmachen.
Beispiele für geeignete konjugierte Materialien schließen ein: Polyethylenglykol, Dextran, Dextrine, Carboxymethylcellulose, Polyoxyethylen/Polyoxypropylen (Polyoxamin)-Blockpolymere, Polyglutamin und andere Polyamine, N-(2-hydroxypropyl)methacrylamidcopolymere und andere Polymere, die geeignet funktionalisiert sind, um eine leichte und funktionelle Konjugatbildung zu erlauben. Der Polymerisationsgrad des Polymers in den Polymer-Arzneimittelkonjugat kann von N = 1 bis N = 1000 oder mehr variieren, so lange das letztliche Konjugat unverändert, wirksam und fähig ist, die Ziellage zu erreichen, um therapeutische Arzneimittel-Niveaus zu liefern. Die Bindung kann nicht-hydrolisierbar oder hydrolisierbar sein und ein oder mehrere Spacer-Atome enthalten, die zur Verbesserung der Wirksamkeit optimiert sind.
Um den wirksamen Transport eines Antikrebs- oder Antivirenmittels der vorliegenden Erfindung an eine gewünschte Körperposition zu unterstützen, können zielführende Mittel wie monoklonale Antikörper, chemische Komponenten, die durch cancerogen oder viral infizierte Zellen unterschiedlich aufgenommen werden oder Mittel, die dafür bekannt sind, cancerogen oder viral infiziertes Gewebe zu erreichen (z. B. hepatisches Gewebe, das durch Acetaminophen-Derivaten oder Glycosacchariden erreicht wird), mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung gekoppelt werden. Nach dem Verständnis der Fachleute ist die intravenöse Zufuhr bevorzugt, obwohl in besonderen Situationen auch die topische, orale oder subkutane Zufuhr geeignet sein kann.
Um Konjugate herzustellen, die die Ziel-Spezifität beeinflussen, können die Quassinoide unterschiedlich kombiniert werden, z. B. mit Protein-Antikörpern, Nukleinsäuren oder sogar Lipiden oder derivatisierten Polymersubstanzen und verschiedenen natürlich vorkommenden Makromolekülen wie Immunoglobulin, Wachstumshormone, Insulin, Interferon, Plasma-Albumin, Fibrinogen, Plasminogen-Aktivator, Heparin, Chondroitinsulfat, Soja-Trypsin-Inhibitor, L-Asparaginase, Ribonuclease usw., die als Heimkehr-Rezeptoren oder Ziele für einen speziellen Zelltyp (z. B. Krebszellen) oder eine bestimmte Position (z. B. Knochenmark) fungieren.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der zuvor beschriebenen synthetisch erhaltenen Quassinoide oder zuvor bekannten gereinigten und isolierten Quassinode für die Verwendung als NADH-Oxidase-Inhibitor. Von dieser Verwendung wird geglaubt, dass sie für die unterschiedliche Cytotoxizität der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung genauso wie für die herbistatische Aktivität der Verbindungen verantwortlich ist.
Zusätzliche Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden unter Berücksichtigung der folgenden detaillierten Beschreibung und begleitenden Zeichnungen ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die chemische Struktur von Peninsularinon;
2 zeigt die chemische Struktur von Glaucarubolon, gereinigt und isoliert aus natürlichen Quellen;
3 zeigt die mit ORTEP erhaltene physikalische Struktur von Peninsularinon wie in 1 gesehen;
4 ist ein Diagramm, das die logarithmische Konzentration von Glaucarubolon mit der zunehmenden Zahl von Zellen, die mit dem felinen Immunodeffizitvirus (FIV) infiziert sind, und nicht infizierten Kontrollzellen nach 48 Stunden, vergleicht;
5 ist ein Diagramm, das die logarithmische Konzentration von Glaucarubolon mit der zunehmenden Zahl von Zellen, die mit dem felinen Immunodeffizitvirus (FIV) infiziert sind, und nicht infizierten Kontrollzellen nach 72 Stunden, vergleicht;
6 ist ein Diagramm, das die Zellkonzentration gegen die Zeit für Zellen, die mit dem felinen Immunodeffizitvirus (FIV) infiziert sind, und Crandall-Felin-Nieren-Zellen als Kontrollzellen, kontaktiert mit einem Glaucarubolon-Brefeldin-A-Konjugat, vergleicht;
7 ist ein Diagramm, das die Zellkonzentration gegen die Zeit für Zellen, die mit dem felinen Immunodeffizitvirus (FIV) infiziert sind, und Crandall-Felin-Nieren-Zellen als Kontrollzellen, kontaktiert mit einem Glaucarubolon, vergleicht;
8 ist ein Diagramm, das die logarithmische Konzentration von Glaucarubolon mit der Zunahme der Zellzahl von Zellen, die mit dem humanen Immunodeffizit-Virus (HIV) infiziert sind, und nicht-infizierten Kontrollzellen vergleicht;
9 ist ein Diagramm, das die logarithmische Konzentration von Glaucarubolon-Brefeldin-A-Konjugat mit der Zunahme der Zellzahl von Zellen, die mit dem humanen Immunodeffizit-Virus (HIV) infiziert sind, und nicht-infizierten Kontrollzellen vergleicht;
10 ist ein Diagramm, das die Inhibierung der NADH-Oxidation sowohl in HeLa und isolierten Plasmamembranen von Leberzellen durch Glaucarubolon zeigt;
11 zeigt die Inhibierung der NADH-Oxidation in pflanzlichen Sojazellen, die mit Glaucarubolon behandelt wurden;
12 zeigt ein Diagramm, das die Wirkung des Redox-Gleichgewichts auf die Inhibierung der NADH-Oxidation in HeLa-Zellplasmamembran durch Glaucarubolon zeigt und
13 ist ein Diagramm, das die Inhibierung der NADH-Oxidaseaktivität von HeLa-Zellplasmamembranen durch ein Glaucarubolon-Aminopolyethylenglykol-Arzneimittelkonjugats zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
In den folgenden Beispielen wird die Isolation, Reinigung, Synthese und Verwendung von Quassinoiden beschrieben. Nach dem Verständnis der Fachleute ist die Isolation neuer Quassinoide gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur aus den Wurzeln der Castela peninsularis möglich, sondern auch aus anderen Castela-Spezies, -Subspezies oder Variationen und von verwandten Mitgliedern der Familie Simaroubaceae. Die Reinigung und Trennung der neuen Quassinoide kann durch Verwendung von Lösungsmittelextrakten wie Methanol, Ethanol, aromatischen Lösungsmitteln oder anderen geeigneten Extraktionsmitteln erfolgen. Die Synthese umfasst alles von kleineren Seitenketten- Additionen oder -Subtraktionen des Picrasan-Kohlenstoffgerüsts bis zur kompletten Synthese wie sie in Grieco et al., „Synthetic Studies on Quassinoids: Total Synthesis of (–)-Chaparrinone, H-Glaucarubolone, and (+) Glaucarubinone", Jour. Am. Chem. Soc. 1993, 115, pp. 6078–6093 offenbart ist, auf deren Offenbarungsgehalt hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Wie für den Fachmann aus der Offenbarung verständlich, wurden zahlreiche Verbindungen innerhalb des Schutzbereiches der vorliegenden Erfindung und mit Seitenkettenmodifikationen an der C-15-Position natürlich isoliert oder synthetisiert. Die therapeutische Anwendbarkeit der Verbindungen der vorliegenden Erfindung beruht hauptsächlich auf der Erkenntnis, die aus Zellkulturstudien und Lebend-Tierversuchen erlangt wurden. Die Aktivität gegen Krebsformen mit festen Tumoren und viral-infizierte Zellen sowie die unterschiedliche zytotoxische Aktivität basierend auf der Hemmung der NADH-Oxidase sowie die herbizide und herbistatische Aktivität werden in den folgenden Beispielen beschrieben. Wie für die Fachleute verständlich, kann dennoch ein breiterer Schutzbereich der therapeutischen Aktivität für gewisse Verbindungen existieren.
Beispiel 1 Isolierung und Identifizierung von Peninsularinon und Glaucarubolon
Die Isolierung und Charakterisierung des Quassinoids (–)-Peninsularinon (siehe 1) zusammen mit einem zuvor identifizierten Quassinoid Glaucarubolon (siehe 2) wurde durch Verwendung eines Methanolextrakts der Wurzeln von Castela peninsularis durchgeführt. Die Struktur des Glaucarubolons wurde durch Vergleich der ¹H- und ¹³C-NIVIR-Spektren von natürlich isoliertem und gereinigtem Glaucarubolon mit denen, die von synthetischem Glaucarubolon erhalten wurden, identifiziert.
Die Struktur von Peninsularinon wurde durch eine Kombination von ¹H- und ¹³C-NMR-Spektroskopie, Massenspektrometrie und Röntgenstrahl-Kristallographie bestimmt. Das Massenspektrum von Peninsularinon zeigte eine Molekülformel von C₂₈H₄₀O₁₀. Zusätzlich zeigte das Massenspektrum einen größeren Peak bei M-C₈H₁₅O₃. Ein Vergleich von ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren von Peninsularinon mit denen von Glaucarubolon ergab, dass die Spektren sehr ähnlich waren und legte nahe, dass das C(15)-Hydroxyl vom Glaucarubolon acyliert wurde. In Übereinstimmung mit den Daten des Massenspektrums ergab das ¹³C-NMR-Spektrum deutlich acht zusätzliche Kohlenstoffatome: Ein Carbonyl (168,4 ppm), ein quaternäres Kohlenstoffatom, das einen Sauerstoff trägt (75,4 ppm), zwei Methylen (40,8 und 29,6 ppm), drei Methylgruppen (17,2, 17,4 und 8,3 ppm) und ein Methin-Kohlenstoff (34,7 ppm). Das ¹H-NMR-Spektrum zeigte einen AB-Quartett mit einem Zentrum bei δ 2,88 (J = 15 Hz), was zusammen mit den ¹³C-Daten die Anwesenheit einer Methylen-Gruppe benachbart zum Carbonyl und einem quaternären Kohlenstoff mit einem Sauerstoffatom nahe legte: C(q)CH₂C=O. Aus dem Protonen-Spektrum war auch deutlich die Anwesenheit einer Isopropylgruppe und einer Ethylgruppe, die vermutlich an das gleiche quaternäre, eine Hydroxylgruppe tragende Kohlenstoffatom gebunden waren, zu erkennen.
Die absolute Konfiguration des carbocyclischen Picrasan-Netzwerks der Quassinoide folgt aus biosynthetischen Überlegungungen, Röntgen-Kristallographiedaten und der Totalsynthese. Die Bestimmung der absoluten Konfiguration des quaternären Kohlenstoffatoms in der C-15-Seitenkette wurde über eine einzelne Röntgenstruktur-Analyse von Peninsularinon durchgeführt. Die Analyse der röntgen-kristallographischen Daten von Peninsularinon ergaben einen orthorhombischen Kristall (C2, Z = 8) mit den folgenden Dimensionen: a = 28,538 (25) Å, b = 6,866 (5) Å, c = 30,300 (26) Å 35 und β = 116,57(2)°. Das Volumen des Kristalls betrug 5310.13 Å³ mit einer Dichte von 1,342 g/cm³. Proton (¹H)- und Kohlenstoff (¹³C)-Kernspinnresonanzspektren wurden entweder mit einem Varian VXR-400 MHz (100 MHz) Spektrometer oder einem Bruker AM-500 MHz (125 MHz) Spektrometer (wie angezeigt), aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm (δ) in Bezug zu Tetramethylsilan (δ 0.0) angegeben. Die Infrarot (IR)-Spektren wurden auf einem FTIR-Spektrometer der Mattson Galaxy 4020 Serie aufgenommen. Die Absorptionsintensitäten sind als stark (s), mittel (m) oder schwach (w) angegeben. Die hochauflösenden Massenspektren wurden mit einem Spektrometer vom Typ Kratos MS 80/RFAQ erhalten. Die Elementaranalysen wurden von den Galbraith Laboratorien, Inc., Knoxville, TN durchgeführt. Die Schmelzpunkte wurden mit einer Fisher-Johns Heiztisch-Apparatur erhalten und sind unkorrigiert. Die optischen Rotationen wurden mit einem Perkin-Elmer Modell 241-Polarimeter erhalten. Die Dünnschicht-Chromatographie wurde unter Verwendung von vorbeschichteten Silicagel-Platten vom Typ 60 F-254 (0,25 mm Dicke) von E. Merck durchgeführt. Die Platten wurden durch Eintauchen in eine p-Anisaldehyd-Lösung und Aufwärmen auf einer Heizplatte visualisiert. Für die Flash-Silicagel-Chromatographie wurde Silicagel vom Typ 60 (230 bis 400 Mesh) der Firma E. Merck verwendet. Alle chromatographischen Lösungsmittel sind analysenrein, sofern nichts anderes angegeben ist. Das Sammeln der Fraktionen wurde nach der Elution einer Lösungsmittelfront von der Säule begonnen.
Pflanzenmaterial: Die Wurzeln der Rose Castela peninsularis wurden am 18. April 1993 durch World Botanical Associates aus Baia California besorgt.
Extraktion und Isolation: Getrocknete Bodenwurzeln (962 g) wurden in 2800 ml Methanol eingeweicht. Nach drei Tagen wurde das Pflanzenmaterial abgegossen und mit Methanol (1 × 2800 ml) gespült. Das Verfahren wurde mit den gleichen 962 g des Pflanzenmaterials insgesamt neun Mal wiederholt. Die vereinigten Methanolextrakte und Methanolwaschlösungen wurden im Vakuum zu einem braunen Schlamm auf konzentriert (ca. 120 g), der mit 20% Methanol/Chloroform (1000 ml) verdünnt wurde, 24 Stunden lang gerührt wurde, durch eine Unterlage aus Flash-Silicagel filtriert und mit 20% Methanol/Chloroform gut gewaschen wurde. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden im Vakuum zu einem braunen Öl (ca. 32 g) auf konzentriert. Das braune Öl wurde chromatographisch über 690 g Flash-Silicagel (gepackt mit 10% Methanol/Chloroform) getrennt. Die Säule wurde im Anschluss eluiert, wobei 150 ml Fraktionen gesammelt wurden: die Fraktionen 3 bis 16 (Teil I) wurden vereinigt und in Vakuum aufkonzentriert, wodurch 19 g eines braunen Schlamms erhalten wurden; Fraktionen 17 bis 28 (Teil II) wurden vereinigt und im Vakuum aufkonzentriert, wobei 2,0 g eines gelben Schaums zurückblieben. Teil I (19 g) wurde über 400 g Flash-Silicagel (gepackt in 3:1 Ethylacetat/Hexane) chromatographisch getrennt. Die Säule wurde im Anschluss eluiert, wobei 75 ml Fraktionen gesammelt wurden: Fraktionen 48 bis 66 (IA) (3:1/Ethylacetat:Hexane) und Fraktionen 67 bis 98 (113) (5:1/Ethylacetat:Hexane) wurden vereinigt. Die Fraktionen 48 bis 66 (IA) wurden im Vakuum zu einem matten gelbfarbigen Festkörper (684 mg) aufkonzentriert, der aus Ethylacetat auskristallisiert wurde, wobei 2 als lange Nadeln (161 mg) erhalten wurde. Die Mutterlösung wurde über 130 g Flash-Silicagel (gepackt in 2% Methanol/Chloroform) chromatographisch getrennt. Die Säule wurde im Anschluss eluiert, wobei 40 ml Fraktionen gesammelt wurden: Die Fraktionen 43 bis 49 (5% Methanol/Chloroform) wurden gesammelt und vereinigt, wobei weitere 2 als weißer Feststoff (260 ml) erhalten wurde. Der Teil IB wurde im Vakuum zu einem gelben Schaum (864 mg) auf konzentriert, der über 125 g Flash-Silicagel (gepackt in 5% Methanol/Chloroform) chromatographisch getrennt wurde. Die Säule wurde im Anschluss eluiert, wobei 12 ml Fraktionen gesammelt wurden: die Fraktionen 43 bis 55 wurden vereinigt und im Vakuum auf konzentriert, wobei ein weißlicher Feststoff (371 mg) zurückblieb, der aus Ethylacetat auskristallisierte und 1 als kleine weiße Nadeln (148 mg) lieferte. Eine Reinigung der Mutterlösung durch präparative Dünnschicht-Chromatographie (11 Böden (0,5 mm Dicke, 5% Methanol/Chloroform, doppelte Elution) lieferten 1 als weißen Feststoff (94 mg).
Teil II (2,0 g) wurde über 200 g Flash-Silicagel (gepackt in Ethylacetat) chromatographisch getrennt. Die Säule wurde im Anschluss eluiert, wobei 40 ml Fraktionen gesammelt wurden. Die Fraktionen 17 bis 41 wurden vereinigt und im Vakuum aufkonzentriert, wobei 681 mg kristallines Glaucarubolon erhalten wurden, welches durch Vergleich seiner spektroskopischen Daten (IR, IVIS, ¹H-NMR, ¹³C-NMR) mit denen zuvor in der Literatur genannten Daten identifiziert wurde.
(–)-Peninsolarinon 1: Rf 0,14 (Ethylacetat:Hexan, 2:1), 0,20 (5% Methanol/Chloroform); FTIR KBO 3520 (s), 2969 (m), 2884 (m), 1728 (s), 1680 (s), 1460 (w), 1385 W, 1254 (m), 1229 (m), 1192 (m), 1115 (m), 988 W, 961 (w), 916 W cryfl; 400 MHz ¹H-NMR (C₅D₅N) δ9,78 (br s, 1H), 9,43 (br s, 1H), 7,46 (d, 1H, J = 3,6 Hz), 6,42 K 1H, J = 11,2 Hz), 6,09 (s, 1H), 4,79 (s, 1H), 4,23 (s, 1H), 4,14 K 1H, J = 8,6 Hz), 4,03 (br s, 1H), 3,83 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 3,39 (s, 1H) 3,09 (br d, 1H, J = 12,4 Hz), 2,95 und 2,81 (AB-Quartett, 2H, J = 15 Hz), 2,66 bis 2, 54 (m, 2H), 2,25 bis 2,10 (m, 211), 2,08 bis 1,85 (m, 3H), 1,71 (s, 3H), 1,55 (s, 3H), 1,39 (d, 3H, J = Hz), 1,12 bis 1,01 (m, 9H); 100 MHz ¹³C-NMR (C₅D₅N) δ 197,38, 172,02, 168,36, 162,29, 126,16, 110,73, 84,34, 79–97, 78,56, 75,41, 71,30, 70,78, 48,09, 45,99, 45,58, 45,44, 45,19, 40,85, 34,69, 32,74, 29,59, *25,90, 22,34, 17,445, 17,23, 15,52, 10,74, 8,30. Hochauflösendes MS (CI) berechnet für C₂₈H₄₁O₁₀ (M + 1) m/e 537.2700, gefunden 537.2686; C₂₀H₂₅O₇ (M-C₈H₁₅O₃) m/e 377.1601, gefunden 377.1594.
Eine Analysenprobe wurde durch Rekristallisation aus Ethylacetat hergestellt: Schmelzpunkt: 221 bis 223°C; [a]² _D ⁵ – 22,6° (c 0,19, Pyridin). Anal. berechnet für C₂₈H₄₀O₁₀: C, 62,67; H, 7.51, gefunden: C, 62.34; H, 7,62.
Röntgen-Daten für Penisularinon: Monokline Kristalle mit a 28.538 (25), b = 6.866 (5), c = 30.300 (26) Å, β = 116.57(2)° und V 5310.1(9) Å³ bei –172°C. Die Raumgruppe war C2 mit Z = 8 und D_ber. = 1,342 g/cm³, F(000) = 2304. Die Reflektionen wurden auf einem bereichsweise modifizierten Picker-Goniostaten gemessen, λ(MoKa) = 0,71069 Å. Intensitäten wurden durch Verwendung eines kontinuierlichen Scan-Modus mit festen Hintergründen für 3818 einzelne Reflektionen gemessen, von denen 2512 beobachtet wurden [F > 2,33 σ (F)]. Die Struktur wurde durch direkte Methoden (SHELXS-86) gelöst und durch die Gesamtmatrix-Methode der ganzen Quadrate verfeinert. Letztlich betrug der Abweichungsindex R = 0,072.
Beispiel 2: Quassinoid-Analoge
Zusätzlich zu gereinigten, isolierten natürlichen Produkten schließt die vorliegende Erfindung Seitenketten-modifizierte Analoge von natürlich vorkommenden Quassinoiden ein. Am wichtigsten sind hier Modifikationen der C-15-Seitenkette, obwohl gewisse Modifikationen der Ringstruktur oder variierende Substituenten an der C-4-Position als im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet werden.
Zum Beispiel ist es, wie in dem folgenden schematischen Syntheseschema zu sehen (Formeln VIII bis XIII, nachfolgend), ausgehend von Glaucarubolon (Formel VIII) möglich, durch entsprechende chemische Modifikationen 15-Oxy-(hydroxypivaloyl)-glaucarubolon (Formel XI) oder 1,5-Oxy(N,N-dimethylglycin)-glaucarubolon (Formel XIII) herzustellen:
Die Synthese und Charakterisierung der obigen Verbindungen umfasst magnetische Protonen (¹H)- und Kohlenstoff (¹³C)-Kernresonanz-Spektren, die mit einem Spektrometer vom Typ Varian VXR-400 MHz (100 MHz) oder Bruker AM 500 MHz (125 MHz) aufgenommen worden. Die chemischen Verschiebungen werden in ppm (δ) in Bezug auf Tetramethylsilan (δ 0.0) angegeben. Die Infrarot-Spektren (IR) wurden mit einem Spektrophotometer vom Typ Perkin-Elmer Modell 298 oder einem FTIR-Spektrometer vom Typ Mattson Galaxy 4020 aufgenommen. Die Adsorptionsintensitäten sind mit stark (s), mittel (m) oder schwach (w) bezeichnet. Die hochauflösenden Massenspektren wurden mit einem Spektrometer vom Typ Kratos MS 80/RFAQ erhalten. Die Elementaranalysen wurden durch die Galbraith Laboratorien Inc. Knoxville, TN, oder durch die Roberton Microlit Laboratorien Inc, Madison, NJ durchgeführt. Die Schmelzpunkte wurden mit einem Fisher-Johns-Heiztisch erhalten und sind unkorrigiert. Die optischen Rotationen wurden mit einem Polarimeter vom Typ Perkin-Elmer Modell 241 erhalten. Die Reaktionen wurden mittels Dünnschicht-Chromatographie unter Verwendung von vorbeschichteten Silicagel 60 F-254-Platten (0,25 mm Dicke) von E. Merck beobachtet. Die Platten wurden durch Eintauchen in eine p-Anisaldehyd-Lösung und Aufwärmen auf einer Heizplatte visualisiert. Für die Flash-Silicagel-Chromatographie wurde Silicagel 60 (230 bis 400 mesh) von E. Merck verwendet.
Alle Reaktionen wurden in bei 110°C im Ofen getrockneten Glaswaren unter Argon-Atmosphäre unter Verwendung wasserfreier Lösungsmittel durchgeführt. Alle Lösungsmittel sind analysenrein, sofern nichts anderes angegeben ist. Dichlormethan, Triethylamin, 2,6-Lutidin, Pyridin, Chlorotrimethylsilan und Trimethylsilyl-trifluoromethansulfonat wurden mit Calciumhyd rid destilliert. Tetrahydrofuran wurde mit Natriumbenzophenonketyl destilliert.
1,11-Bis(trimethylsilyloxy)glaucarubolon (Formel IX):
Eine Lösung von 300 mg (0,761 mmol) Glaucarubolon (Formel VIII) in 8,5 ml Pyridin enthaltend 1,3 ml (9,13 mmol) Triethylamin bei 0°C wurde mit 898 μl (4,56 mmol) Trimethylsilyl-Trifluromethansulfonat behandelt. Nach Erwärmen auf Raumtemperatur und einstündigem Rühren wurde die Reaktion wieder auf 0°C abgekühlt und mit 761 μl (0,761 mmol) einer 1,0 M Lösung von Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran alle 30 Minuten behandelt bis eine Gesamtmenge von 5 Äquivalenten (3,81 mmol) Tetrabutylammoniumfluorid-Lösung zugesetzt waren. Nach weiterem 30-minütigem Rühren bei 0°C und 30 minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung auf 17 ml einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat gegossen und mit 20 ml Ethylacetat verdünnt. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase mit 1 × 17 ml Kochsalzlösung gewaschen. Die vereinigten wässrigen Phasen wurden mit 1 × 10 ml Ethylacetat gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), gefiltert und im Vakuum zu einem braunen Öl aufkonzentriert. Das Öl wurde über 80 g Flash-Silicagel chromatographisch aufgetrennt, wobei mit Ethylacetat/Hexane (4:1) eluiert wurde und wobei 270 ml (66%) 1,11-bis(trimethylsilyoxy)glaucarubolon (Formel IX) als weißer Feststoff erhalten wurden: Rf 0,72 (Ethylacetat/Hexane, 4:1); IR (KBr) 3595 (m), 3545 (w), 2970 (m), 2895 (w), 1720 (s), 1690 (s), 1327 (m), 1250 (s), 1152 (m), 1057 (s), 922 (s), 840 (s), 758 (m), cm^–1; 400 MHz ¹H NMR (C₅D₅N) δ 7,93 (d, 1H, J = 5,2 Hz), 6,04 (br S, 1H), 5,88 (d, 1H, J = 4,8 Hz), 5,32 (dd, 1H J = 11,2, 5,2 Hz), 4,57 (br s, 1H), 4,2 3/s, 1H), 4,00 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 3,88 (t, 1H, J = 4,8 Hz), 3,73 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 3,11–3,02 (m, 1H), 3,06 (s, 1H), 2,54 (m, 1H), 2,26 (dd, 1H, J – 11,2, 6,4 Hz), 2,06 (dt, 1H, J = 14,2, 2,8 Hz), 1,88 (t, 1H, J = 14,2 Hz), 1,71 (s, 3H), 1,66 (d, 3H, J = 7,2 Hz), 1,32 (s, 3H), 0,36 (s, 9H), 0,32 (s, 9H); 100 MHz ¹³C NMR (C₅D₅N) J 198,49, 174,06, 160,92, 127,08, 113,61, 88,04, 81,02, 77,96, 71,71, 68,58, 49,83, 47,26, 46,04, 44,28, 44,09, 33,55, 25,85, 22,36, 16,25, 10,651 3,01, 1,55; hochauflösendes MS El berechnet für C₂₆H₄₂O₈Si₂ (M) m/e 538,2419, gefunden 538,2393. Eine analytische Probe wurde durch Rekristallisierung aus Ethylacetat hergestellt: Schmelzpunkt 228–230°C (dec); [a]D²⁵ –12,0 (c 0,55 Pyridin). Anal. berechnet für C₂₆H₄₂O₈Si₂; C, 57.96; H, 7,86, gefunden C, 57,85; H, 8,09.
15-Oxy-(hydroxypivaloyl)glaucarubolon (Formel XI):
Eine Lösung von 69 mg (0,13 mmol) 1,11-Bis(Trimethylsilyloxy)glaucarubolon (Formel IX) und 31 mg (0,26 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 0,64 ml Dichlormethan wurde auf 0°C gekühlt und mit 89 μl (0,64 mmol) Triethylamin, gefolgt von 80 mg (0,32 mmol) des sauren Chlorids das aus dem Tertbuyldimethylsilylether von Hydroxypivalinsäure (Formel X) erhalten wurde, behandelt. Nach Aufwärmen auf Raumtemperatur und 2-stündigem Rühren wurde die heterogene Mischung mit Hexan (1 ml) verdünnt und durch einen schmalen Pfopfen Silicagel mit Ethylacetat (10 × 1 ml) gefiltert. Das Filtrat wurde im Vakuum aufkonzentriert und das Rohprodukt über 20 g Flash-Silicagel, eluiert mit Hexan-Ethylacetat (5:1) chromatographisch gereinigt, wobei sich 96 mg (100%) des gewünschten Produktes ergaben.
Das gereinigte Material (96 mg) wurde in 2,5 ml Acetonitril aufgelöst und bei 0°C gekühlt. Unter Rühren wurden 635 μl einer 1 M Lösung von Fluorsäure in Acetonitril zugesetzt und man ließ die resultierende Lösung auf Raumtemperatur erwärmen und eine halbe Stunde rühren. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat/Methanol (1:1, 2 ml) verdünnt und mit 200 μl einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat-Lösung behandelt und anschließend durch einen schmalen Pfropfen Silicagel mit Ethylacetat/Methanol (20:1, 10 × 1 ml) gefiltert. Das Filtrat wurde im Vakuum aufkonzentriert und über 20 g Flash-Silicagel chromatographisch aufgereinigt, wobei mit Chloroform/Methanol (10:1) eluiert wurde. Hierbei ergaben sich 55,8 mg (88%) eines weißen Feststoffs der Formel X: Rf 0,19 (Chloroformmethanol, 10:1); IR (Kbr) 2517 (s), 3468 (s), 2974 (m), 2928 (m), 1746 (s), 1715 (s), 1682 (s), 1383 (m), 1248 (m), 1121 (s), 1053 (s) cm^–1; 500 MHz ¹H NMR (C₅D₅N) σ 9,74 (br s, 1H), 9.41 (br s, 1H), 7,44 (d, 1H, J = 4,7 Hz), 6,40 (br d, 1H, J = 11,7 Hz), 6,27 (br t, 1H, J = 6,0 Hz), 6,09 (br s, 1H), 4,81 (br s, 1H, 4,19 (br s, 1H), 4,13 (d, 1H J = 8,8 Hz), 4,05–3,98 (m, 3H), 3,79 K 1H, J = 8,8 Hz), 3,37 (s, 1H), 3,10 (br d, 1H, J = 13,3 Hz), 2,67 (dd, 1H, J = 11,7, 6,3 Hz), 2,59 (m, 1H), 2,14, (dt, 1H, J = 14,5, 3,2 Hz), 2,00 (br t, 1H, J = 14,5 Hz), 1,70 (s, 3H), 1,55 (s, 3H), 1,48 (s, 6H), 1,46 (d, 3H, J 7,4 Hz); 125 MHz-¹³C NMR (C₅D₅N) σ 197,26, 176,38, 168,54, 162,41, 126,13, 110,67, 84,40, 80,09, 78,46, 71,33, 71,21, 69,43, 48,19, 46,23, 45,59, 45,45, 42,23, 32,81, 25,93, 22,25, 22,23, 22,17, 15,71, 10,70. Eine Analysenprobe wurde durch Rekristallisierung aus Ethylacetat-Methanol hergestellt: Schmelzpunkt 259–261°C; [a]D²⁵ – 17,1 (c 0,59, Pyridin). Anal. berechnet für C₂₅H₃₄O₁₀: C, 60,72; H, 6,93, gefunden: C, 60,63; H, 6,92.
15-Oxy-(N,N-dimethylglycin)glaucarubolon (Formel XIII), 10 mg (0,02 mmol) von 1, 11-Bis-(Trimethylsilyloxyl)glaucarobolon (Formel IX), 4 mg (0,04 mmol)) von N,N-Dimethylglycin (Formel XII), 5 mg (0,04 mmol) von 4-Dimethylaminopyridin und 10 mg (0,04 mmol) von 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid wurden in einer schmalen Ampulle zusammengegeben. Es wurden 93 μl Dichlormethan zugefügt und man ließ die resultierende Lösung 12 Stunden bei Raumtemperatur rühren. Die heterogene Mischung wurde durch einen schmalen Pfropfen Silicagel mit Ethylacetat (10 × 1 ml) filtriert und das Filtrat im Vakuum auf konzentriert. Eine Chromotographie über 10 g Flash-Silicagel, eluiert mit Chloroform-Methanol (20:1) lieferte das Rohprodukt, das noch stark mit Dicyclohexyl-Harnstoff verunreinigt war.
Das Rohprodukt (20,3 mg) wurde in 370 μl Acetonitril aufgelöst und bei 0°C gekühlt. Unter Rühren wurden 185 μl einer 1 M Lösung von Fluorsäure in Acetonitril zugesetzt und die resultierende Lösung eine halbe Stunde bei 0°C gerührt. Zusätzliche 185 μl einer 1 M Lösung von Fluorsäure in Acetonitril wurden zugesetzt und man ließ die Lösung bis auf Raumtemperatur erwärmen und für eine halbe Stunde rühren. Die Reaktion wurde mit 200 μl Wasser verdünnt, es wurden 50 mg (0,60 mmol) Natriumhydrogencarbonat zugesetzt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur gerührt, bis keine Schaumbildung mehr beobachtet werden konnte. Die Mischung wurde durch einen kleinen Pfropfen Silicagel mit Ethylacetat/Methanol (20:1 10 × 1 ml) filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum auf konzentriert und über 10 g Flash-Silicagel chromatographisch aufgereinigt, wobei mit Chloroform-Methanol (20:1 → 5:1) eluiert wurde. Hierbei ergaben sich 217,7 mg (87%) von (4) als weißer Feststoff: Rf 0,30 (Chloroform-Methanol, 5:1); IR (Kbr) 3520 (m), 3395 (m), 2944 (m), 2890 (m), 1740 (s), 1674 (s), 1458 (w), 1385 (w), 1229 (m), 1192 (m), 1049 (m) cm^–1; 500 MHz ¹H NMR C₅D₅N σ 9,78 (br s, 1H), 7,46 (d, 1H J = 4,7 Hz), 6,51 (br d, 1H, J = 11,3 Hz), 6,10 (br s, 1H), 4,78 (br s, 1H), 4,24 (br s, 1H), 4,15 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 4,03 (br t, 1H, J = 4,7 Hz), 3,85 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 3,43 (scheinbar q, 2H, J = 16,6 Hz), 3,40 (s, 1H), 3,08 (br d, 1H J = 12,4 Hz), 2,58 (m, 2H), 2,38 (s, 6H), 2,16 (dt, 1H, J = 14,7, 2,8 Hz), 2,03 (br t, 1H J = 14,7 Hz), 1,73 (s, 3H), 1,56 (s, 3H), 1,32 (d, 3H, J = 6,7 Hz); 125 MHz ¹³C NMR (C₅D₅N σ 197,36, 170,15, 168-12, 162,22, 126,16, 110,73, 84,29, 79,90, 78,55, 71,27, 70,43, 60,64, 48,00, 46,06, 45,51, 45,45, 45,04, 42,16, 32,69, 25,88 22,28, 15,2, 10,65.
Natürlich sind zusätzliche Seitenkettenmodifikationen, wie Additionen an der Hydroxylgruppe der Formel XI oder am Amin der Formel XIII innerhalb des Schutzbereiches der vorliegenden Erfindung. Wie es für die Fachleute ersichtlich ist, können die synthetischen Verfahren, die für die vorhergehenden neuen Verbindungen eingesetzt wurden, ausgeweitet werden, um alternative C-15-Seitenketten mit unterschiedlicher Selektivität, Toxizität, Potenzial, Löslichkeit und therapeutischer Wirksamkeit zu umfassen.
Beispiel 3 Anti-cancerogene Aktivität von Penisularinon, Glaucarubinon und verwandten Analogen.
Bei der in vitro-Untersuchung von Glaucarubinon stellte sich dieses als selektiv gegenüber festen Tu moren heraus (Tabelle 1, nachfolgend), wobei sich ein Zonendifferential von 400 Einheiten zwischen C38 und L1210 (bei 1 μg/Disk) zeigte. Ein ähnliches oder größeres Differential wurde für P03 festgestellt, während für M 17/Adr kein Differential gefunden wurde, was eine wahrscheinliche Kreuzresistenz mit anderen natürlichen Produkten wie z. B. Adriamycin, anzeigt. Weiterhin konnte in Abhängigkeit von der im Assay verwendeten menschlichen Zellinie eine unterschiedliche Cytotoxizität (H 125, MX-1) oder keine Cytotoxizität (CX-1, H-8) gezeigt werden.
Die sich anschließende in vivo-Untersuchung (Tabelle 2, nachfolgend) zeigte eine Heilwirkung sowohl gegen C38 und P03. Ebenso konnte eine Antitumor-Aktivität gegenüber zwei weiteren untersuchten Tumortypen, Col26 und Mam 16/C, festgestellt werden. Als einer der interessantesten Erkenntnisse über diese Verbindungen wurde festgestellt, dass die Dosis während der Behandlung bis zu mehr als einer Größenordnung der Differenz vom Therapiebeginn gesteigert werden konnte. Das bedeutet, dass supralethale Dosen von Glaucarubinon verabreicht werden konnten, wenn die Tiere über einige Tage mit geringeren, nicht-toxischen Dosen der Verbindung vorbehandelt wurden.
Es wurden auch Quassinoid-Analoge mit verschiedenen Substituenten an der C-15-Position auf ihre anticancerogene Aktivität untersucht. Die Ergebnisse fünf solcher Verbindungen sind in Tabelle 1 dargestellt. Überraschenderweise zeigte Ailanthinon, dem in der C-15-Kette eine Hydroxylgruppe fehlt, keine Selektivität gegenüber festen Tumoren, obwohl es eine ähnliche Wirksamkeit wie Glaucarubinon aufweist. Aus diesem Grunde wurde nicht in vivo getestet, allerdings zeigten die bei der Verminderung der Länge der Seitenket te verbleibenden drei Komponenten Holacanthon (der Acetatester), Glaucarubolon (das Hydroxy-Analoge) und Chapparinon (bei dem die C-15-Seitenkette fehlt) nicht nur eine Selektivität bezüglich fester Tumoren sowohl muriner als auch humaner Zellen, sondern zeigte auch eine Selektivität gegen den gegen viele Arzneimittel resistente Brusttumor (Mam 17/Adr), der die Expression des p-Glycoproteins bewirkt. Schließlich erscheint Peninsularion, eine neuere Entwicklung, das zwei Kohlenstoffatome mehr als Glaucarubinone besitzt, eine ähnliche Wirksamkeit und ein ähnliches Aktivitätsspektrum zu besitzen.
Zwei dieser Komponenten Glaucarubolon und Chaparrinon, wurden in vivo untersucht. Wie Tabelle 2 zeigt, besitzen beide eine therapeutische Aktivität gegen C38, wobei die letztere Verbindung ebenfalls eine Aktivität gegen Mam 16/C und Mam 17/Adr aufweist. Wie in den in vitro-Untersuchungen beobachtet, dass die Wirksamkeit sowohl von Glaucarubolon als auch von Chapparinon um etwa eine Größenordnung geringer als die von Glaucarubonon war, wurde dies ebenfalls in den in vivo-Untersuchungen beobachtet.
Mäuse: Es wurden gezüchtete Mäuse C57131/6, C3H/He, Balb/c und DBA/2 verwendet, als Hybride wurden B6D2F1 (C57B1/6 weiblich × DBA/2 männlich) und CD2F1 (Balb/c weiblich × DBA/2 männlich) verwendet. Alle Mäuse wurden von der Frederick Cancer Research Facility, Frederick, Maryland erhalten.
Tumore: Die folgenden transplantierbaren festen Tumore von Mäusen wurden für die in vitro- und/oder in vivo-Untersuchungen verwendet: Adenokarzinom des Ductus pancreatiucus #02[P02] (3), Adenokarzinom des Ductus pancreaticus #03 [P03], Kolon-Adenokarzinome #07/A [C7], #38 [C38] und #51/A [C51], undifferenziertes Kolon-Karzinom #26 [C26], Brust-Adenokarzinom 1 6/C [Mamm 16/C], 17/A [Mamm 17] und 17/A/ADR. [Mamm 17 Adr]. Die untersuchten Leukämien waren L1210, P388, lymphozytische Leukämie und C1498 Rückenmarks-Leukämie. Alle Tumore gehören zu dem Aufbewahrungsort gefrorener Tumore des Entwicklungsprogramms für Therapeutika (DTP), die vom biologischen Untersuchungszweig in Frederick, Maryland, erhalten wurden. Jeder Tumor hat eine detaillierte Beschreibung, eine Code-Identifikationsnummer und eine Liste von Literaturstellen beim nationalen Aufbewahrungsort für Tumore.
Die Tumore wurden aus den originären Mausstämmen erhalten und entweder in das entsprechende F1-Hybrid oder den originären Stamm für die Therapieuntersuchungen transplantiert. Alle Mäuse wogen beim Beginn der Therapie etwa 17 g, wobei der Schwankungsbereich des individuellen Körpergewichts in jedem Versuch innerhalb von 2 g lag. Die Mäuse wurden nach Belieben mit Nahrung und Wasser versorgt.
Folgende humane Tumore wurden eingesetzt: Humaner adenosquamöser Lungentumor H-125 (7) und die Kolontu more H8, HCT-116 und CX-1 wurden für die in vitro-Untersuchung separat eingesetzt. Jede humane Zelllinie wurde in der Kultur gehalten, bis eine Plattenkultur vorlag. HCT-116, H8 und CX-1 wurden aus McCoy-Medien und durch mit Hitze inaktivierten fetalen Bovinenserum (11% FBS) erhalten. Man ließ dies zweimal die Woche durchlaufen (Verdünnung 1:5), gefolgt von einer enzymatischen Dissoziation unter Verwendung einer Trypsin/PBS-EDTA-Mischung. H-125 wurde aus CMRL/Fischer-Medium (1:1) mit 11% FBS erhalten. Es wurde mechanisch dispergiert und man ließ es wöchentlich durchlaufen (Verdünnung 3:10). Für die Plattenkultur wurden alle Zellen mechanisch dispergiert und in CMRL/Fischer-Medium verdünnt.
Antitumormittel: Die Verbindung war in einem Verdünnungsmittel, das aus 3% [V/V (100%-Reinheit)] Ethanol, 1% (V/V) Polyoxyethylansorbitan-Monopalmitat (P. O. E. 40) und 96% sterilem destilliertem Wasser bestand, leicht löslich. Die intravenöse Verabreichung war bevorzugt (IV).
In vitro-Untersuchungen: Für das Assay wurden Leukämiezellen und feste Tumorzellen in einer Plattenkultur mit weichem Agar eingesetzt. Der Wirkstoff wurde auf eine Filterpapier-Disk gegeben, die dann auf das die Tumorzellen (9, 10) enthaltende weiche Agar gegeben wurden. In Kürze, es wurde eine harte Unterschicht [enthaltend eine tryptische Sojakultur (0,8%), Edel-Agar (0,8%), CMRL/Fischer-Medium und Pferdeserum (11%) bei 480] in 60 mm-Kunststoffschalen gegeben (3 ml in jede), man ließ diese erstarren und bewahrte sie bei 37°C in 5% CO₂ auf. Die Unterschichten wurden 4 bis 10 Tage nach der Herstellung verwendet. Eine weiche Agar-Oberschicht, enthaltend Edel-Agar (0,44%), das CMRL/Fischer- Medium, Pferdeserum (11%) und einen Tumorzellen-Titer wurden darübergegeben und man ließ diese erstarren.
50 μl jeder Wirkstoff-Verdünnung in Ethanol wurden 6,5-mm-Disks zugesetzt, die man trocknen ließ und dann in die die Tumorzelle enthaltende Schale gab. Die Platten wurden 6 bis 10 Tagen inkubiert und mit einem Le-Chatellier-Mikroskop geprüft (40fache Vergrößerung). In Abhängigkeit von der den Zellen innewohnenden Empfindlichkeit für den Wirkstoff (und die Konzentration des Wirkstoffs) trat eine Inhibierungszone der Kolonienbildung auf. Die Inhibierungszone (gemessen von der Kante der Disk bis zu den ersten Kolonien) wurde in Einheiten bestimmt: 200 Einheiten = 6,5 mm (die Größe der Filterpapier-Disk).
Präparierung der Zellen: sowohl die Tumorzellen der Maus als auch die Leukämie L1210 ließ man subkutan in den entsprechend erzeugten Mäusen durchlaufen. P388 wurde durch Gewebskulturen für die beschriebenen in vitro-Studien erhalten. Zellen für das in vitro-Assay wurden direkt von diesen SC-Durchlauftumoren wie zuvor erörtert, erhalten. Die Titer wurden so eingestellt, um mehr als 500 Kolonien pro Schale herzustellen.
In vivo-Chemotherapie: Die Verfahren des Protokolldesigns, der Tumortransplantation, der Wirkstoffbehandlung der Endpunktbestimmung der Zeitraumsbestimmung, der Evaluierung der Toxizität, der Datenanalyse der Quantifizierung der Tumorzellenabtötung und die biologische Bedeutung der Ergebnisse der Wirkstoffbehandlung von transplantierbaren Tumoren sind vorgestellt worden. Im Folgenden ist eine kurze Zusammen fassung dieser Methoden aufgeführt, die die beschriebene Arbeit betreffen.
Die Tiere, die zum Beginnen eines Experiments notwendig sind, wurden gepoolt, es wurden doppelseitig SC am Tag 0 bis 60 mg Tumorfragmente unter Verwendung eines 12-Gauge-Trokars implantiert und vor der Randomisierung der verschiedenen Behandlungs- und Kontrollgruppen erneut gepoolt. Die Chemotherapie wurde jeweils innerhalb von 3 Tagen nach der Tumorimplantation begonnen, als die Zellenzahl pro Maus relativ gering war (10⁷ bis 10⁸ Zellen) oder man ließ sie bis zur Palpation im fortgeschrittenen Stadium (etwa 3 × 10⁸ Zellen) wachsen.
Die Tumore wurden jeweils einmal oder zweimal wöchentlich (wie erforderlich) mit einem Caliper gemessen, bis jeder Tumor 1500 mg übertraf oder die Heilung gesichert war. Die Tumorgewichte wurden aus zweidimensionalen Messungen berechnet: Tumorgewicht (mg) = (a × b²)/2, wobei a und b die Tumorlänge bzw. Tumorbreite (mm) darstellen.
Endpunkte für die Bewertung der Antitumor-Aktivität: Die folgenden quantitativen Endpunkte wurden zur Bewertung der Antitumor-Aktivität verwendet:
Verzögerung des Tumorwachstums: (T-C-Wert), worin T den zeitlichen Mittelwert (in Tagen) darstellt, der erforderlich ist, dass die Tumore der Behandlungsgruppe eine vorbestimmte Größe erreichen, und C den zeitlichen Mittelwert (in Tagen) für die Tumore der Kontrollgruppe darstellt, um die gleiche Größe zu erreichen. Tumor-freie Überlebende wurden von diesen Berechnungen ausgeschlossen (die Heilungen wurden separat tabelliert).
Berechnungen der Zerstörung der Tumorzellen: Für SC-wachsende Tumore wurde der Log₁₀-Kill aus folgender Formel berechnet:
worin T-C die Verzögerung des Tumorwachstums (in Tagen), wie zuvor beschrieben, darstellt und Td die Verdoppelungszeit des Tumorvolumens (in Tagen) ist, wobei letztere aus der Linearität der Best-Fit-Straight-Line (BFSL) für den logarithmisch-linearen Wachstumsplot der Tumoren der Kontrollgruppe im exponentiellen Wachstum (500 bis 1500 mg-Bereich) berechnet wird. Die Umwandlung der T-C-Werte des Log₁₀-Kills ist möglich, da die Td-Werte der Tumore in unbehandelten Kontroll-Mäusen durch die Td der Tumore, die bei der Nachbehandlung nachwachsen, angenähert wurde.
Bestimmung der Aktivität durch Inhibierung des Tumorwachstums (T/C-Wert):
Die Messungen wurden gleichzeitig sowohl in der Behandlungsgruppe als auch in der Kontrollgruppe durchgeführt. Das mittlere Tumorgewicht jeder Gruppe wurde bestimmt (einschließlich 0), wenn die Tumore der Kontrollgruppe ungefähr 750 bis 1500 mg (Mittelwert der Gruppe) erreichten. Der T/C-Wert in Prozent ist ein Anzeichen für die Antitumor-Effizienz. Ein T/C von weniger oder gleich 42% wird als signifikante Antitumor-Aktivität betrachtet. Ein T/C-Wert < 10% zeigt einen hohen Grad an Antitumor-Aktivität an und stellt das Niveau dar, das von NO verwendet wird, um eine weitere Entwicklung zu rechtfertigen, wenn andere Er fordernisse erfüllt sind (genannt DN-Niveau-Aktivität).
Ein Gewichtsverlust-Nadir von 20% pro Maus oder mehr (Mittelwert der Gruppe) oder 20% oder mehr Arzneimittel-Sterbefällen wird ausdrücklich als tödliche Dosis betrachtet. Die Körpergewichte der Tiere schlossen die Gewichte der Tumore ein.
Beispiel 4 Antivirale Aktivität und Inhibierungsaktivität der NADH-Oxidase
Gereinigtes und isoliertes Glaucarubolon und bestimmte synthetische Analoga wurden auf die Möglichkeit einer antiviralen und einer Anti-NADH-Oxidase-Aktivität untersucht. Wie in den nachfolgenden 4 bis 7 und Tabellen 3 bis 5 dargestellt, zeigt Glaucarubolone und identifizierte Analoga in einer Serie von Experimenten eine wirksame antivirale Aktivität gegen Rhinoviren die Aujeszky-Krankheit und bei Retroviren wie den FIV-Virus und den HIV-Virus wurde die Inhibierung der NADH-Oxidasen mit Glaucarubolon sowohl in tierischen Zellkulturen als auch in aus Pflanzen ausgeschnittenen Gewebssegmenten beobachtet.

A. Crandall-Feline-Nierenzellen (CFK-Zellen) wurden mit dem felinen Immunodefizit-Virus (FIV) infiziert und mit Glaucarubolon und Glaucarubolon-Brefeldin-A-Konjugat, wie es in 6 zu sehen ist, geprüft. Wie in den nachfolgenden 6 und 7 und Tab. 3 zu sehen, zeigten beide unterschiedliche Zerstörungen infizierter Zellen im Vergleich zu nicht-infizierten Zellen.
B. Wie in 8 zu sehen, wurden menschliche HIV-infizierte MOLT-4-Zellen unterschiedlich zerstört, wobei dieser Unterschied zwei logarithmische Einheiten für Glaucarubolon gegenüber nicht-infizierten Zellen betrug. Wie in 9 zu sehen, konnte eine ähnliche Aktivität mit einem Glaucarubolon-Brefeldin-A-Konjugat beobachtet werden.
C. HeLa-Zellen (Wisconsin-Stamm, Berlin, Deutschland) wurden mit menschlichem Rhinovirus-14 in Kontakt gebracht. Die infizierten Zellen (Wisconsin-Stamm) wurden beobachtet. Cytopathische Effekte wurden durch Glaucarubolon, Simalikalacton D, Quassimarin und Peninsularinon verzögert. HeLa-Zellen wurden von keiner einzigen verwendeten Verbindung zerstört. Zellen anderer HeLa-Linien (z. B. ATCC CCL2) wurden zerstört. Glaucarubolon, Simalikalacton D und Chaparinon wurden auf die Zellzerstörung und Virus-Produktion durch primäre Blutmonozyten getestet. Alle drei Arzneimittel wurden bei fünf Konzentrationen (0, 10^–9, 10^–8, 10^–7 und 10^–6 M) getestet. Die Arzneimittel wurden zu unterschiedlichen Zeiten vor der Infektion, zum Zeitpunkt der Infektion oder zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion gegeben. Es wurden gleiche Resultate erzielt, was dafür spricht, dass die toxischen Effekte eher gegen die infizierten Zellen als gegen den Virus an sich gerichtet waren.
D. Nierenzellen von Kaninchen wurden mit porcinen Viren der Aujeszky-Krankheit in Kontakt gebracht und visuell beobachtet. Glaucarubolon inhibierte cytopathische Effekte des Virus und zeigte keine cytopathischen Effekte auf nicht-infizierte Kontrollzellen, die mit Glaucarubolon behandelt wurden. Inhibierende Effekte wurden ebenso mit Quassimarin, Similakalacton D, Bruceantin und Peninsularinon beobachtet.
E. Die Inhibierung der NADH-Oxidase-Aktivität in tierischen und pflanzlichen Zellen wird mit Bezug auf Tab. 4 und 10 und 11 gezeigt. Es wurde herausgefunden, dass Glaucarubolon die NADH-Oxidation der Plasmamembran in FIV-infizierten HeLa-Zellen ebenso wie in nicht-infizierten Zellen inhibiert. Wie in 10 zu sehen, inhibiert Glaucarubolon die NADH-Oxidation sowohl in HeLa (ATCC CCL2-Stamm) als auch in isolierten Plasmamembranen von Leberzellen. Wie in 11 zu sehen, ist die NADH-Oxidation in Hypocotyl-Gewebe von pflanzlichen Sojabohnen ähnlich inhibiert.

Tabelle 3: Zeit zur kompletten Zellzerstörung (> 98%) durch Glaucarubolon
Tabelle 4 zeigt die Inhibierung der NADH-Oxidase-Aktivität von Zellfraktionen durch Glaucarubolon.
Tabelle 5 zeigt die Inhibierung durch variierende Konzentrationen von Simalikalacton D der NADH-Oxidase-Aktivität isolierter Plasmamembran-Vesikel, die aus verlängerten Bereichen dunkler Sojabohnen-Hypokotylen und vom Wachstum von 1 cm-Bereichen, die aus den verlängerten Bereichen der dunklen Sojabohnen-Hypokotylen geschnitten wurden und auf der Lösung schwimmen. Die Inhibierung der NADH-Oxidase wurde durch Zusatz der Simalikalacton D-Lösungen direkt zu den isolierten Plasmamembran-Vesikeln bestimmt.
Tabelle 5
Beispiel 5 Herbistatische und herbizide Aktivität
Es wurde herausgefunden, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen den Wachtums-Phenotypen von Pflanzen beeinflussen, typischerweise durch Inhibierung des fortgesetzten Wachstums der Pflanzen oder durch Auslösung einer Zellzerstörung der Pflanzen. Die vorliegende Erfindung umfasst daher die Verwendung der Quassinoide wie Glaucarubolon als Herbistatika oder Herbizide, nützlicherweise in Verbindung mit konventionellen herbistatischen oder herbiziden Trägern, die dem Fachmann zur Kontrolle des Pflanzenwachstums bekannt sind. Es wird vermutet, dass herbistatische und herbizide Vorgänge von Modifikationen der zellulären NADH-Oxidase-Aktivität abhängen. Außerordentlicherweise wurde die Inhibierung sowohl basaler als auch auxin-stimmulierter Komponenten der NADH-Oxidase in Pflanzen identifiert.
Um den Wachstums-Phenotypen einer Gruppe von Pflanzen zu bewerten, wurde eine 1 mg-Probe von Glaucarubolon in DMSO oder Ethanol mit einer endgültigen Konzentration von 100 mM (Lösung QD-2) gelöst. Diese Lösung wurde reihenweise mit Wasser mit oder ohne Triton X-100, Ethanol oder DMSO verdünnt und direkt für die Messungen der Effekte auf die Samenkeimung verwendet oder mittels einer Mikroliter-Spritze den Blättern zugeführt, um die Wachstumseffekte auf die Pflanzen zu bestimmen.
Hinsichtlich der Samenkeimung wurde die Verbindung hinsichtlich fünf Spezien bewertet: Kohl (Early Jersey Wakefield), Rettich (Scarlet Turnip White Tipped), Karotten (Denvers Half Long), Tomaten (Rutgers) und Sorghum (DeKalb 18). Für die Wasserverdünnungen wurde die Samenkeimung aller Spezien bei 10 μm (eine wässrige Verdünnung von 10 μl von 100 mM 1:1000 in 100 μl Wasser) inhibiert (Endgültige DMSO-Konzentration von 1:10.000 = 0,01%). Die Keimung der Tomaten wurde bei 10 μl/100 μl einer wässrigen Verdünnung von 1:10.000 = 1 μM endgültige Konzentration inhibiert. Mit DMSO- und Ethanol-Verdünnungen wurden Inhibierungen bei einer endgültigen Verdünnung von 1:10⁶ oder 1:10⁷ (10–100 Nm) beobachtet, aber die Lösungsmittel an sich tendieren dazu, die Keimung ebenfalls zu hemmen.
Bei Anwendung gegenüber Arabadopsis (var. Columbia), das im Boden in 4-inch-Kunststofftöpfen wuchs, wirkte die Glaucarubolon-Zubereitung bei Verdünnungen von 1:100 und 1:1000 (10 μl/halber Topf) herbizid. Die Pflanzen wurden nach 10 Tagen Keimungszeit behandelt. Bei einer Verdünnung von 1:10.000 wurden die Pflanzen nicht zerstört, aber das Wachstum wurde für 3 Wochen vollständig gestopt. Das Wachstum setzte nach mehr als 30 Tagen nach der Behandlung wieder ein. Die Anwendungsdosis für den behandelten Bereich (schätzungsweise ein 2-inch-Kreisdurchmesser) wurde mit 2,5 × 10^–4 oz/A berechnet. Etwa 10% der Pflanzen, die eine Verdünnung von 1:1000 überlebten, wuchsen für > 50 Tage nicht. Die berechnete Anwendungsdosis betrug 2, 5 × 10^–3 oz/A.
Im Boden wachsendes Sorghum (DeKalb 18)-Pflanzen wurden wie zuvor Arabadopsis thaflani nach 6 Tagen Keimung, wenn die Pflanzen über 5 cm hoch waren (wenn das Blatt aus der Coleoptilen-Umhüllung hervortritt), behandelt. Das Wachstum wurde gebremst. 20 Tage nach der Behandlung waren die Kontroll-Pflanzen 16 cm hoch und die behandelten Pflanzen 12 cm hoch. Die Anwendungsdosis betrug 10 μl von 1:1000/halber Topf = 2,5 × 10^–3 oz/A.
Tomatenpflanzen, die über zum Zeitpunkt der Behandlung 3,5 cm hoch waren, wurden in Torf in Bereichen von 1,5-inch-Durchmesser-Zellen gezüchtet und wurden entweder mit wässrigen Simalikalacton (Lösung QD-1) oder wässrigen Glaucarubolon (Lösung QD-2), enthaltend 0,1% Triton X-100, behandelt. Das letztliche Volumen pro Pflanze betrug 10 μl für die wässrige Lösung und 200 μl für die wässrige Lösung enthaltend Triton X-100. Bei einer Anwendungsdosis von 100 mM, verdünnt 1:100 (10 μl im 200 μl 0,1% Triton X-100), wachsen die behandelten Pflanzen nicht und sind schließlich nach etwa 30 Tagen zerstört. 30 Tage nach der Behandlung waren die behandelten Pflanzen, die 1:1000 und 1:10.000 Verdünnungen in Detergenzlösungen erhielten, noch inhibiert. Bei der wässrigen Behandlung waren die Pflanzen ebenfalls inhibiert, aber nicht so beachtlich wie mit einem Detergenz.
In einem Experiment mit Arabadopsis, bei dem die Quassinoid-Zubereitung in Ethanol verabreicht wurde, wurde eine herbizide Aktivität bis hinab zu einer Verdünnung von 1:10⁴ (2, 5 × 10^–5 oz/A) beobachtet, und eine Verdünnung von 1:10⁵ (2,5 × 10^–6 oz/A) schien das Wachstum für wenigstens 30 Tage zu beenden. Alle Pflanzen wurden von unten bewässert, um eine Oberflächenverbreiterung der Pflanzen zu vermindern. Der inhibierte Phänotyp schließt eine beeinträchtigte Wachstumsfähigkeit der Pflanzen ein, d. h. die Zellverlängerung/Zellvergrößerung wird verhindert oder um mindestens 50% über mehrere Wochen reduziert.
Beispiel 6 Die Herstellung von Antikrebs-Arzneimittelkonjugaten enthaltend Quassinoide, die ein spezifisches Target für eine Zelloberfläche, die NADH-Oxidase-spezifisch für Krebszellen ist und als tNOX benannt ist, bildet
Die wirkstoffaktive Stelle für tNOX ist an der äußeren Oberfläche der Krebszelle angeordnet. Somit braucht das Arzneimittel nicht in die Zelle einzudringen, um wirksam zu sein. Tatsächlich ist ein Ziel der hier beschriebenen Konjugate, die Toxizität zu vermindern, indem das Eindringen der Arzneimittel in die Zellen verhindert wird.
Der Wachstum der Zellen, die Herstellung der Plasmamembranen und die spektrophotometrischen Messungen wurden wie zuvor beschrieben, durchgeführt.
Während vorbereitender Studien wurde ein derivatisiertes Glaucarubolon (unten) zur Verbindung mit Antikörpern hergestellt. Das derivatisierte Arzneimittel wurde an Amino-Propylenglykol (durchschnittliches Molekulargewicht 5.000) in Gegenwart von 10 mM des Kupplungsreagenzes Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (Sigma) gekoppelt.
Diese Ausführungsform ist die Grundlage für eine neue Strategie zur Herstellung von Antikrebsmitteln, wobei die als Targetmolekül für tNOX dienenden Antikrebs- Quassinoide mit Polymeren kombiniert werden, um die Wirksamkeit zu erhöhen und ungewünschte Toxizitäten zu reduzieren. Die konjugierten Arzneimittel brauchen nicht in die Zelle einzudringen, um wirksam zu sein und können als Targetmolekül für Zellen, die spezifische Determinanten tragen, spezifiziert werden. Die Erfindung ist eine Verbesserung gegenüber dem was bis dato existiert, da ein Zelloberflächen-Target bereitgestellt und ein hoher Spezifizitätsgrad erreicht wird. Demgemäß brauchen die Arzneimittel nicht in die Zelle einzudringen, um wirksam zu sein. Durch die spezifische Ansteuerung der Krebszellen werden nur die Krebszellen zerstört und normale Zellen bleiben unbeschädigt.
Das Wesen des Kleinmoleküls, das durch die Konjugation mit einem Polymer unbeständig ist, kann jedes Quassinoid einschließen, das tNOX-inhibiert, einschließlich aber nicht beschränkt auf Glaucarubolon. Die Polymere kommen alle wasserlöslichen, geeignet fraktionalisierten Makromoleküle in Frage, einschließlich aber nicht beschränkt auf Proteine, Dextrane, Cyclodextrine, Polyethylenglykole, Nukleinsäuren, Polymere von Ethylen- oder Propylenglykol und verschiedene 35 einfache und komplexe Carbohydrat-Polymere. Charakteristiken von Polymeren, die für die Herstellung effektiver Anti-tNOX-Arzneimittelkonjugate für die Verwendung in der Krebsbehandlung geeignet sind, schließen einen hohen Grad an Wasserlöslichkeit, eine geringe Toxizität und eine geringe Antigenizität ein. Cyclodextrine, Polyethylenglykole und Ethylen- oder Propylenoxid-Polymere zeigen nahezu ideale Eigenschaften in dieser Hinsicht. Die Zahl der Polymeruntereinheiten kann zwischen n = 1 bis n = 1000 oder höher variieren, was von der Löslichkeit und der Permeationscharakteristik, die für die Opti mierung der Bereitstellung des Arzneimittels an der aktiven Targetposition erforderlich ist, abhängt. Im einfachsten Beispiel, wo n = 1 ist, wurde das Arzneimittel nur konjugiert, um den Transport zum tNOX-Target sicherzustellen und den Zelleintritt zu verhindern, aber nicht den Eintritt des Arzneimittels in feste Tumore und Tumorzellenaggregate zu begrenzen, wodurch die Entwicklung eines Konjugates mit guter oraler Bioverfügbarkeit ausgeschlossen wird. Die Bindung der kleinen Moleküle und der Polymere kann auf verschiedenen Wegen durchgeführt werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf die zuvor genannten Beispiele. Für die Bindungsmethode wichtige Faktoren können die Einfachheit der Herstellung, die Reproduzierbarkeit und die relative Stabilität des Konjugates einschließen.
Wie in 12 zu sehen, wird die Abhängigkeit der NADH-Oxidase-Aktivität der HeLa-Zell-Plasmamembranen auf die Konzentration von Glaucarubolon vom Redox-Gleichgewicht wenig beeinflusst. Es scheint, dass es einen vom Redox-gleichgewicht unabhängigen tNOX-Inhibitor darstellt. Weiterhin scheint es, wie es 13 zeigt, dass das Glaucarubolon-Aminopolyethylenglykol-Arzneimittel-Konjugat die grundlegende tNOX-Aktivität bei subnanomolaren Konzentrationen in Gegenwart von GSSG, oxidiert bei 1 μM in Gegenwart von GSH, zu inhibieren.
Tabelle 6 zeigt die Redox-Unabhängigkeit der Wachstumsinhibierung von HeLa-Zellen durch das Glaucarubolon-Aminopolyethylenglykol-Konjugat im Vergleich zu Glaucarubolon alleine. Die reduzierte Umgebung wurde durch Zusatz von 100 μm Cystein und die oxidierte Umgebung durch Zusatz von 10 μm tert-Butylhydroperoxid erhalten.
Tabelle 6
Tabelle 7 zeigt die Antwort normaler und anhaltend infizierter CFK-Zellen auf Glaucarubolon-Amino-PEG-Konjugate, untersucht bei 10^–6 M.
Tabelle 7

Claims

Verbindung gekennzeichnet durch die Formel
wobei R₁ Wasserstoff, Alkyl oder Alkenyl darstellt und Y eine Seitenkette, dargestellt durch die Formel
ist, wobei R₂ und R₃ eine Methylgrupe und R₄ eine Hydroxyl-, Hydroxyalkan- oder Hydroxyalkengruppe ist oder Y eine Seitenkette, dargestellt durch die Formel
ist, wobei R₅ und R₆ eine Isopropylgruppe oder R₅ und R₆ eine Ethylgruppe ist und R₇ eine Hydroxylgruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₂ eine Methylgruppe, R₃ eine Methylgruppe und R₄ eine Hydroxymethylgruppe ist.
Verwendung eines Quassinoids nach einem der Ansprüche 1 oder 2 zur Herstellung einer pharmazeutisch aktiven Zusammensetzung zur Behandlung von festen Tumoren.
Die Verwendung eines Quassinoids nach Anspruch 3 zur Herstellung einer pharmazeutisch aktiven Zusammensetzung zur Behandlung von Wirbeltieren mit supralethalen Konzentrationen.