CN107870246B - 血清制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有凝血酶原激活剂的凝结组合物生产用于病理学或其他生物学测定的用途和含有这些凝结组合物的容器以及相关的使用方法。

Description

血清制备
本申请是申请日为2011年9月20日，申请号为201180055870.3，题为《血清制备》的中国发明专利申请的分案申请。本发明要求2010年9月20日提交的名称为“血清制备”的澳大利亚临时申请2010904233的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明通常涉及使用前凝血剂生产用于病理学和其他生物学测定的高品质血清样品。
发明背景
血液收集装置，包括管，被用于收集血液以生产血清或血浆，其反过来被用于生物化学或其他病理学测定。
血清通过允许血液样品凝结并且之后将样品离心以将包括细胞的血液凝块从血清分离。目前通常使用塑料管(代替玻璃)并且需要前凝血剂(常常是微粒化的二氧化硅颗粒)以增强凝结过程。对于生物学测试来说血清通常是比血浆优选的，除非需要紧急结果，在这样情况下血清管凝结时间被认为过长。即便使用现有的前凝血剂，最贵的试管中制造商建议的所需的最小凝结时间对于来自正常患者的血液样品来说是30分钟，而对于来自接受抗凝结治疗剂例如华法林或肝素的患者的样品来说要长得多(通常60分钟或更长)。对于来自紧急情况(急诊科、重症监护、手术室等)的患者样品来说，所述时间过长并且因此可迅速得多地生产的血浆常常是比血清优选的。据称解决这一问题的可选择方案是近来由Becton-Dickinson开发的用于血清生产的血液收集管(特定的BD快速血清管，BDT或BDRST)，其含有计划增加血液样品中血液凝结的速度和程度的凝血酶。
血浆通过将血液收集在含有抗凝血剂的管中之后离心来获得，离心可在收集之后立即进行以分离细胞并由此获得用于分析的血浆。肝素锂是这些管中最常用的抗凝血剂。柠檬酸盐、氟化钠/草酸钾和EDTA是用于某些管中以产生用于评估少量其他分析物的血浆的其他抗凝血剂。
不完全凝结
制备血清样品中的凝结过程消耗血纤蛋白原并且将血小板和其他细胞陷入血纤蛋白的网络中。当离心时，通过收集装置中的血清分离器或通过将血清等分至二级容器将血清从所述凝块分离以避免与细胞接触。这一分离允许样品在延长的时间段保持稳定。这一稳定性在不立即分析样品或需要再次分析或另外的分析时尤其重要。
对于某些血清样品，凝结在所推荐的等待时间之后是不完全的。这一不完全凝结的问题在处于抗凝结治疗的患者或从抗凝结的龙头或套管收集的样本中尤其普遍。样本在收集期间被抗凝血剂污染也可能发生。这些血液可能花费比制造商建议的等待时间长得多的时间来凝结，或者事实上可能在标准血清管中永远不会完全凝结(例如来自完全肝素化的心外科手术患者的血液)。如果血清样品在凝结完成之前被离心，那么凝结可在血清中继续，导致凝块、微小凝块或形成能够导致分析者或分析物特定问题的血纤蛋白串。样品制备期间微小凝块和血纤蛋白原串的形成同样可在血浆管中发生，尤其是在低温保存后。血液收集后未能将肝素锂管及时倒置可导致橡皮塞附近小凝块形成。未以及时的方式肝素化的血液的微滴将凝结并且凝块在肝素化时不分解。
即使最小的凝块也能够产生临床上显著的误差。因此，对于准确度而言，样品必须通过眼睛或使用自动化检测系统(如果有的话)进行人工检验以确保它们不含有血纤蛋白丝或凝块。如果存在不溶材料的丝或凝块，样品需要二级取样至新容器中并且在测试分析之前再次离心。表现出重复的潜在凝结的样品可能需要被转移至肝素锂管以停止进行中的凝结。这些行为花费另外的时间。而且，血纤蛋白丝或凝块并不总能被检测到(例如它们可能甚至在分析仪取样后发生)并且因而产生的取样误差可导致在不准确的结果上所做的病人护理决定。
血浆管中的细胞污染
在血浆管中获得的样本，尤其是肝素锂血浆，可被细胞污染。肝素锂凝胶管离心后总是在血浆底部的凝胶顶部存在小的“层状血块黄层”。这一层含有血纤蛋白、细胞和细胞基质。离心期间快速的凝胶运动在血浆中留下一些细胞。如果血浆样品是混合的(例如二级取样或处理期间)，其将因为含有细胞的材料和血纤蛋白的悬浮而变得混浊，这降低了样本完整性。此外，血小板凝集物可形成，其同样可能含有血纤蛋白和/或白细胞。这些凝集物可以大至肉眼可见并且已经由于其典型的白色颜色被命名为“白色颗粒物”，并呈现与上文讨论的不完全凝结相似的问题。
样品中细胞的存在可影响分析物浓度。某些分析物(例如葡萄糖)可通过细胞活性来降低而其他的可通过渗漏或者细胞溶解而增加(例如乳酸脱氢酶、钾、磷酸盐)。
分析物干扰
尽管在血清管和血浆管中测量的分析物的浓度通常没有差异，但也有某些例外。
使用肝素的血浆管不适于肝素分析或基于细胞的测定。肝素锂血浆管不适于锂分析。血浆对于另外的测试或再测试来说可能不可靠，归因于细胞的存在和2-8℃的长时间储存时不溶的血纤蛋白形成
此外，已经有了一些血清或血浆管产生不准确的分析物水平结果的报道，归因于与所述管中前凝血剂或抗凝剂的相互作用或相反(Ciuti et al.,1989；Cowley et al.,1985；Davidson et al.,2006；Dimeski et al.,2004；Dimeski et al.,2005；Dimeski etal.,2010；Hartland et al.,1999；Miles et al.,2004；O’Keane et al.,2006；Wannaslipet al.,2006)。
样品大小
期望的是减少测试所需的样品大小，尤其是在危重患者、接受输血的患者和婴儿中，以便减少从患者采集的血液体积。因此能够使用在一个血液收集管中采集的样品进行所有必须的测试是最佳的。为了达到这一目的，已经开发了使用非常小的样品体积(例如2μL)的测试方法以使得通常一个血清或血浆试管被用于至少21个测试，但是取决于每个测试所需要的样品的体积可用于50-60个之间或甚至70-80个测试。然而，当对在血清或血浆管中测量特定分析物的准确度有疑问时，可能必须采用来自患者的血清管和血浆管两者而这么做使得减少从患者采集的血液体积的目标失败了。
从使用目前的血清和血浆制备方法而产生的问题显示需要改进以从各种各样的血液样品普遍获得及时、可靠的分析结果。
蛇毒凝血酶原激活剂
为了迅速凝结它们猎物的血液，许多蛇毒含有凝血酶原激活剂。这些凝血酶原激活剂是将血液中存在的凝血酶原转化为反过来导致凝结的凝血酶的蛋白水解酶。
蛇毒凝血酶原激活剂是已知的前凝血剂，它们同时也已知具有类似蛋白水解胰蛋白酶的活性(Schieck et al.,1972；Parker,H.W.和Grandison A.G.C.,1977；Masci,P.P.,1986；Nicholson et al.,2006；Lavin和Masci,2009)。据假设凝血酶原激活剂具有前凝血剂和蛋白水解性质两者可能有进化原因因为它们起到杀死和降解猎物两种作用(Masci,P.P.,1986,page 143)。例如，蛇静脉酶(ecarin)(从锯鳞蝰(Echis carinatus)毒液纯化的凝血酶原激活剂)已经显示具有前凝血剂活性以及若干其他蛋白水解活性例如血纤蛋白溶解、明胶分解、caesionlysis和出血(Schieck et al.,1972)，并且从东部拟眼镜蛇(Pseudonaja textilis)的毒液纯化的凝血酶原激活剂(PtPA)对设计用于不同蛋白水解酶的多种生色肽底物是有活性(Masci,P.P.,1986)。
可在包含蛋白的血液、血清或血浆样品上进行许多分析物测试，包括将蛋白(例如全蛋白、白蛋白)作为分析物测量的测试；测量血液蛋白的酶活性的测试(例如在对γ-谷氨酰转肽酶，天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、脂肪酶的测试中使用的γ-谷氨酰转移酶)；使用蛋白作为试剂的测试(例如免疫测定)；在分析方法中使用酶的测试(例如葡萄糖氧化酶)。其他常用的涉及蛋白的测试包括对葡萄糖、尿素、尿酸、丙氨酸转氨酶、肌酸激酶、高密度脂蛋白胆固醇、胆固醇、甘油三酯、转铁蛋白、C反应蛋白、肌钙蛋白、皮质醇、游离甲状腺素、游离三碘甲状腺原氨酸、促甲状腺激素和铁蛋白的测定。
因此，尽管它们具有前凝血剂特性，但是基于它们的蛋白水解活性将降解被测量的分析物(例如当分析物是蛋白时)或将降解在测量分析物水平的反应中所用的蛋白(例如当分析物测试包括使用蛋白例如葡萄糖氧化酶时)，这些蛇毒凝血酶原激活剂从未被认为适于在用于分析物测试的血清管中使用。
凝血酶管
尽管含有凝血酶的管作为“较快”凝结管近来已经可以获得，并且凝血酶具有前凝血剂和蛋白水解活性两者，但是凝血酶已知对剪切血纤蛋白原、活化的蛋白C(APC)和因子Va中的键具有高特异性。因此，不像所报道的蛇毒凝血酶激活剂的类胰蛋白酶活性，预期凝血酶干不扰分析物测试。
在为本发明做准备的工作中，发现含有凝血酶的管不能与所有血液样品一起使用。凝血酶已知被肝素化的血液样品中存在的肝素-抗凝血酶III复合物迅速并且完全地抑制。在研究BD RST管时，发现这些管在含有高剂量肝素的凝结患者样品中无效(Dimeski etal.,2010)。
本发明的开发
令人惊讶地，发明人发现当用于血液收集装置包括管时，凝血酶原激活剂通常能够在可接受的时间内从各种各样血液样品(包括从进行高浓度抗凝结治疗包括肝素的患者采集的那些)产生高品质血清，降低血清样品制备时间以及归因于由于细胞和细胞成分的不完全凝结和污染的分析问题的风险。
而且，发明人同样令人惊讶地发现通过加入凝血酶原激活剂从血液样品获得的血清样品作为在现有血液收集管中产生的血清样品在大范围标准生物化学分析测试中给出相同结果。
如下文所描述的这些发现表明凝血酶原激活剂将适于为了测量大范围分析物的目的生产血清，并且已经被还原以在制备测试分析物中所用的血清样品的血液收集容器、相关用途和方法中实行。
发明概述
因此，在一个方面，本发明提供了凝结组合物在适于检测分析物的血清样品的制备中的用途，所述凝结组合物包含凝血酶原激活剂，基本由凝血酶原激活剂组成或由凝血酶原激活剂组成。
凝血酶原激活剂(有时称为凝血酶原酶)适合地显示出类胰蛋白酶活性并且活化凝血酶原(即将凝血酶原转化为凝血酶)。
本发明同样提供用于制备适于检测样品中存在的感兴趣的分析物的血清样品的容器，其中所述容器含有凝结组合物，所述凝结组合物包含如本文定义的凝血酶原激活剂，基本由如本文定义的凝血酶原激活剂组成或由如本文定义的凝血酶原激活剂组成。
在另一个方面，本发明提供凝结组合物在制备或制造用于制备适于检测分析物的血清样品的容器中的用途，所述凝结组合物包含本文所定义的凝血酶原激活剂，基本由本文所定义的凝血酶原激活剂组成或由本文所定义的凝血酶原激活剂组成。在另一个方面，本发明提供了包含凝结组合物和血液样品用于制备适于检测分析物的血清样品的容器，所述凝结组合物包含本文所定义的凝血酶原激活剂，基本由本文所定义的凝血酶原激活剂组成或由本文所定义的凝血酶原激活剂组成。
在本发明的另一个方面提供了制备用于检测所感兴趣的分析物的血清样品的方法，所述方法包括将血液样品与凝结组合物在足以制备血清样品的条件下接触一段时间，所述凝结组合物包含本文所定义的凝血酶原激活剂，基本由本文所定义的凝血酶原激活剂组成或由本文所定义的凝血酶原激活剂组成。适合地，在如上文所广义限定的容器中实现所述方法。适合地，将所述血液与所述凝结组合物在足以制备血清样品的条件下接触一段时间以制备血清样品和凝结的细胞。适合地，所述方法还包括将血清样品从所述凝结的细胞分离。在某些实施方案中，所述方法包括通过提供含有血液样品的容器并且将所述凝结组合物加至所述容器中或通过提供含有所述凝结组合物的容器或将所述血液样品加入或收集到所述容器将所述凝结组合物和血液样品混合
本发明同时提供通过将血液样品与如本文广义定义的凝结组合物在足以产生所述凝结样品的条件下接触一段时间所生产的血清样品。
本发明还提供检测感兴趣的分析物的方法。这些方法通常包含分析通过本发明的方法制备的血清样品的感兴趣的分析物的存在或量。
本发明同样提供诊断受试者中疾病或病况的存在、不存在或严重度的方法，其中所述疾病或病况的存在、不存在或严重度与所述受试者中感兴趣的分析物的存在、不存在或不正常的量相关。这些方法通常包括提供根据本文广义描述的方法制备的血清样品并且检测所述血清样品中分析物的存在、不存在或不正常的量以由此确定受试者中疾病或病况的存在、不存在或严重度。
序列简述
下文提供序列表中序列的简述
Figure GDA0001572940870000061
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Figure GDA0001572940870000091
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附图简述
图1显示如实施例1a所描述的使用Superdex 200柱上的凝胶过滤从锯鳞蝰毒液分离蛇静脉酶、carinactivase-1和carinactivase-2的洗脱概况。将锯鳞蝰毒液(157mg，122A280单位)经历使用pH 8.0的0.05M Tris-HCl缓冲液的Superdex 200(2.5x 95cm)上的凝胶过滤。条指示三种凝血酶原激活剂(蛇静脉酶、carinactivase-1和carinactivase-2)的混合级分(28.3A280单位)
图2显示如实施例1a所描述的来自Superdex 200凝胶过滤层析的活性(前凝血剂)级分的Blue Sepharose层析的洗脱概况(同样示于图1中)。将活性级分经历BlueSepharose柱并且用线性梯度的NaCl洗脱。收集3mL的级分。条指示的级分被分别混合为carinactivase-1、carinactivase-2和蛇静脉酶。
图3显示如实施例1b中所描述的重构的东部拟眼镜蛇毒液(50mg溶于5mL)在0.05Tris-HCl缓冲液pH 7.4中Sephacryl S-300柱(2.5x 95cm)上的层析的洗脱概况；4℃；流速，17mL/h；A280(●)；S-2222特异性活性(○)；‘A’和‘B’分别代表空隙体积(167mL)和S-2222活性峰的洗脱体积(250mL)。
图4表示使用实施例1b中所描述Con A-Sepharose亲和层析法的东部拟眼镜蛇毒液(1g:30mL)的洗脱概况。箭头表示用0.2M甲基-α-D-吡喃甘露糖苷洗脱PtPA的位置(标为“a”)。
图5显示图4中标为“a”的混合级分的pH8.6的非变性PAGE的结果，其中道A是25μg而道B是50μg。
图6显示如实施例1b中所描述的纯化的PtPA的pH8.6的非变性PAGE的结果，其中凝胶用考马斯蓝染色并且将一式两份的凝胶切成5cm的薄片，其每一个用1mL的S-2222测定混合物平衡以将活性定位。图表显示S-2222活性(Y轴表示：“S-222(ΔA410/min)的水解速度”)对凝胶薄片数目(X轴表示：“凝胶薄片数目”)的作图。
图7显示如实施例1b中所描述的在还原和非还原条件下PtPA和OsPA的亲和纯化制备的SDS-PAGE结果，其中各道为(从左至右)：标志物；OsPA red.(1mg/mL)；PtPA red.(1mg/mL)；OsPA red.(2mg/mL)；PtPA red.(2mg/mL)；OsPA unred.(1mg/mL)；PtPA unred.(1mg/mL)；OsPA unred.(2mg/mL)；PtPA unred.(2mg/mL)；标志物‘其中“red.”表示在β巯基乙醇存在时的组分(即还原的)而“unred.”表示在β巯基乙醇不存在时的组分(即未还原的)。
图8显示如实施例1c所描述的使用Sephacryl S-300层析从虎蛇毒液分离notecarin中的洗脱概况。notecarin的混合级分由标着“PA”的条指示。
图9显示实施例1a、1b和1c中制备的下列凝血酶激活剂的pH8.9的非变性PAGE的结果：carinactivase-1、carinactivase-2、蛇静脉酶、PtPA、OsPA、和notecarin。在这一图中，标记代表下列：(I)凝血酶原；(II)α-凝血酶；(III)蛇静脉酶；(IV)carinactivase-1；(V)carinactivase-2；(VI)PtPA；(VII)OsPA；(VIII)notecarin(每种凝血酶原激活剂上样20μg)
图10显示β巯基乙醇存在时实施例1a、1b和1c中制备的凝血酶原激活剂的SDS-PAGE表征，其中各道如下：(1)carinactivase-1；(2)carinactivase-2；(3)蛇静脉酶；(4)PtPA；(5)OsPA；(6)notecarin；(7)凝血酶和(M)分子量标记。
图11显示β巯基乙醇不存在时实施例1a、1b和1c中制备的凝血酶原激活剂的SDS-PAGE表征，其中各道如下：(1)carinactivase-1；(2)carinactivase-2；(3)蛇静脉酶；(4)PtPA；(5)OsPA；(6)notecarin；(7)凝血酶和(M)分子量标记。
图12显示在5mM Ca2+存在时于室温用下列凝血酶原激活剂孵育5分钟的样品的无β巯基乙醇(A)和有β巯基乙醇(B)的SDS-PAGE：carinactivase-1(道2)；carinactivase-2(道3)；蛇静脉酶(道4)；PtPA(道5)；OsPA(道6)；notecarin(道7)。道1含有缓冲液中单独的人凝血酶原的样品(无凝血酶原激活剂)而道8含有高度纯化的α-凝血酶的样品(无凝血酶原激活剂)而“m”表示分子量标记。这一实验更详细地描述于实施例2a中。
图13显示实施例2b中描述的经由PtPA(6nM)和notecarin(6nM)的凝血酶原(14μM)至凝血酶活化的时间过程的SDS-PAGE。
图14是图13中部分SDS-PAGE结果的注释图，其中将所选的条带洗脱并且经受使用质谱分析的N末端测序以便指定特定的分子结构域。
图15是如实施例2d中所描述的经过155秒通过不同的凝血酶浓度从S-2238产生的pNA的吸收的图表。图表右手边的计算结果与图表的每一行对应，例如顶部计算结果是最高线，等等
图16是来自图15中的结果的标准曲线的图表，尤其是将图15中每个反应直到180秒的方程的斜率对凝血酶浓度做图以提供图16中所示的线性回归方程。
图17是显示如实施例2d中所描述的经过180秒通过0.6nM浓度的下列凝血酶原激活剂生成凝血酶的速度的图表：PtPA、OsPA、蛇静脉酶(Ecr)、notecarin(Ntcr)、carinactivase-1(CA-1)和carinactivase-2(CA-2)
图18显示如实施例2e所描述的S-2238的凝血酶催化水解的曲线拟合分析。凝血酶浓度标注在发展曲线上。
图19如实施例2e中所述将凝血酶原的PtPA活化对PtPA浓度做图。
图20如实施例2e中所述将凝血酶原的OsPA活化对OsPA浓度做图。
图21如实施例2e中所述将凝血酶原的蛇静脉酶活化对蛇静脉酶浓度做图。
图22如实施例2e中所述将凝血酶原的carinactivase-1活化对carinactivase-1浓度做图。
图23如实施例2e中所述将凝血酶原的carinactivase-2活化对carinactivase-2浓度做图。
图24如实施例2e中所述将凝血酶原的notecarin活化对notecarin浓度做图。
图25显示如实施例章节中所讨论的采用所标记的凝结参数的TEG曲线图(凝块形成部分)的实例。
图26如实施例3g中所描述的绘制正常柠檬酸盐血浆中经过5分钟孵育时间段的一式两份45-225nM不同凝血酶浓度的S-2238水解的发展曲线。
图27显示对数形式的来自在5分钟孵育标记图26中的反应斜率的凝血酶标准曲线，其中x轴显示斜率ln(吸收单位/分钟)；而y轴显示ln(凝血酶的摩尔浓度)。
图28显示如实施例3g中所描述的三种不同PtPA浓度产生的血浆中凝块去除之后剩余的凝血酶的测定(一式两份)。
图29显示如实施例3g中所描述的三种不同OsPA浓度产生的血浆中凝块去除之后剩余的凝血酶的测定(一式两份)。
图30如实施例3g中所描述的将来自图28的斜率(与凝血酶浓度的比例)对PtPA浓度作图。
图31如实施例3g中所描述的将来自图29的斜率(与凝血酶浓度的比例)对OsPA浓度作图。
图32显示如实施例3g中所描述的在4300nM(10IU)肝素存在时凝块去除后血浆中剩余的凝血酶水解S-2238的发展曲线。凝血酶是通过PtPA和OsPA生成的或加入的。
图33显示如实施例3g中所描述的使用1.5nM PtPA的含有不同肝素浓度的样品反应曲线。
图34显示如实施例3g中所描述的使用1.5nM OsPA的含有不同肝素浓度的样品反应曲线。
图35显示如实施例3h中所描述的，在混合的“正常”柠檬酸盐血浆中经过5分钟时间段的吸光度的变化，每条线代表用不同体积正常的混合的柠檬酸盐血浆填充的BD RST管。
图36显示如实施例3h中所描述的，从图35测量的斜率和相应的来自图16中标准曲线的凝血酶浓度读数之间的关系。
图37显示如实施例3h中所描述的，在混合的“正常”柠檬酸盐血浆中经过5分钟时间段的吸光度的变化，每条线代表用1mL或4mL正常的混合的柠檬酸盐血浆和不同浓度肝素填充的BD RST管。
图38显示如实施例4c中所描述的比较普通管、可商业获得的血清管和含PtPA的管的TEG示踪。
图39显示实施例5a中结果的TEG作图。
图40显示实施例5c中志愿者“W1”的结果的TEG作图。
图41显示实施例5c中志愿者“W2”的结果的TEG作图。
图42显示如实施例5d中所描述的采用PtPA或OsPA凝结来自肝素化的参与者的再钙化的柠檬酸盐血液的TEG示踪。
图43显示实施例5e结果的TEG示踪。
图44显示实施例6a结果的TEG作图。
图45显示实施例6b结果的TEG作图。
图46如实施例7中所描述的将含有凝血酶原激活剂的来自下列物种的不同浓度的蛇毒液的凝结时间作图：东部拟眼镜蛇(Pt),太攀蛇(Os),内陆太攀蛇(Om)、虎蛇(Ns)和锯鳞蝰(Ec)。
图47显示如实施例8中所描述的具有胶状沉淀物的Greiner血浆管。
图48显示如实施例8中所描述的多个管中的离心后(潜在的)凝结。
图49显示如实施例8中所描述的不同管中血清样品的比较。
图50显示如实施例9a中所描述的来自48位随机选择的需要分析物测定的患者的在Greiner血清管中测量的血纤蛋白原/fdp/FDP浓度的范围。条表示17.5μg/mL的平均值并且范围是4.4-32μg/mL。
图51显示如实施例9b中所描述的使用加入或未加入PtPA的Greiner血清(GS)管制备的36个正常血清样品中通过ELISA测量的血纤蛋白原/fdp/FDP浓度的比较。
图52显示如实施例9b中所描述的来自在下列四种不同的血清管中收集的9个正常血液样品的血清中通过ELISA测量的血纤蛋白原/fdp/FDP浓度的比较：Greiner血清(GRS)、BD血清(BDS)、BD RST和PtPA(300ng/mL)。
图53显示如实施例9b中所描述的来自在Greiner血清管(GRS)、具有300ng/mL的PtPA的Greiner无添加管(PTPA)、含有125ng/mL OsPA的Greiner无添加管(OSPA)和含有0.16U/mL的纯化蛇静脉酶的Greiner无添加管(ECARIN)中收集的5个正常血液样品的血清中通过ELISA测量的血纤蛋白原/fdp/FDP浓度。条表示平均值±标准差。
图54显示如实施例9c中所描述的通过来自在Greiner血清管(GRS)、BD SSTII管(BDS)、BD RST管(BDRST)和具有所加入的1.2μg/4mLPtPA的Greiner无添加管(PTPA)中收集来自3个肾透析患者的血清的ELISA测量的血纤蛋白原/fdp/FDP浓度。
图55显示如实施例9c中所描述的通过来自Greiner血浆管(GRLH)、Greiner血清管(GRS)、BD RST管(BDRST)、具有所加入的300ng/mL PtPA的Greiner VacuetteTM无添加管(PTPA)、具有所加入的125ng/mL OsPA的Greiner VacuetteTM无添加管(OSPA)、具有所加入的0.31U/mL蛇静脉酶的Greiner VacuetteTM无添加管(EC1)和具有所加入的0.63U/mL蛇静脉酶的Greiner VacuetteTM无添加管(EC2)中收集的2个心脏病患者的血浆和血清ELISA测量的血纤蛋白原/fdp/FDP浓度。
图56显示Giemsa染色的Cytospin切片。所述切片显示如实施例9b中所描述的凝胶屏障以上的细胞含量，其中从左至右的切片是：(P)-PtPA血清；(S)-Greiner血清；(LH)-稀释的Greiner肝素锂血浆和(LH)-未稀释的Greiner肝素锂血浆。
图57显示如实施例12a中所描述的在标准Pathology Queensland程序下对标准血清和血浆样品(n＝26)、所有血清和血浆样品(n＝61)和心脏病患者样品(n＝11)进行的总蛋白测定。
图58显示如实施例15a中所描述的当在不同温度储存时经过两周的时间段(336小时)在所选择的时间点两种不同PtPA浓度凝结血浆所花费的时间。
图59显示如实施例15b中所描述的在Greiner普通管(P)以及含有二氧化硅和表面活性剂的Greiner血清管(siP)中辐射后OsPA对发色底物S-2765的活性。
图60显示如实施例15b所描述的在Greiner普通管(P)以及含有二氧化硅和表面活性剂的Greiner血清管(siP)中OsPA的柠檬酸盐血浆凝结活性。
图61显示如实施例15c中所描述的与储存液的新鲜稀释液相比在23℃经过多达14天的时间段OsPA对发色底物S-2765的活性(A405/mm)。
图62显示如实施例17所描述的设计以生产用于分析的高品质血清的装置的实例(注射器形式的即时装置)。
发明详述
1.定义
除非另有指明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文描述的相似或等同的任何方法和材料均可用于实施或测试本发明，但是描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，下文定义了下列术语。
如本文所用的，冠词“一(a)”和“一(a n)”是指一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法客体。举例来讲，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。
“约”意指数量、水平、数值、数字、频率、百分率、尺寸、大小、量、重量或长度比参考数量、水平、数值、数字、频率、百分率、尺寸、大小、量、重量或长度改变30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。
用于参考或全长多核苷酸或多肽序列的片段的术语“生物活性片段”是指具有参考序列的至少大约0.1、0.5、1、2、5、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99％的活性的片段。生物学活性片段包括在本发明的范围内，包括长度为至少约18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000个核苷酸或残基的那些，其包含或编码参考多核苷酸或多肽的活性。代表性的生物活性片段一般参与相互作用，例如分子内或分子间相互作用。分子间相互作用可以是特异性结合相互作用或酶的相互作用(例如相互作用可以是瞬时的并且共价键形成或断开)。全长多肽的生物活性片段可以包含与全长(推定的)多肽的氨基酸序列足够相似或来源于全长(推定的)多肽的氨基酸序列的氨基酸序列。通常，生物活性片段含有具有全长多肽至少一种活性的结构域或基序。适合地，生物活性片段具有不少于其所来源的全长多肽的约1％、10％、25％、50％的活性。
“编码序列”是指对基因的多肽产物的编码做出贡献的任何核酸序列。相反，术语“非编码序列”是指不对基因的多肽产物的编码做出贡献的任何核酸序列。
整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”“包括(comprising)”将被理解为意指包括所述的步骤或元素或步骤或元素的组，但不排除任何其它的步骤或元素或步骤或元素的组。因此，使用术语“包括(comprising)”等表示所列的元素是需要的或强制性的，但是其它元素是可选的并且可以存在或不存在。“由……组成”意思是包括并且局限于词组“由……组成”之后跟随的任意词。因此，词组“由……组成”是指所列的元素是需要的或强制性的并且不存在其它任何元素。“基本上由……组成”意思是包括该词组后所列的任何元素，并且局限于不干扰或不贡献于本公开中的所列元素的特定活性或作用的其它元素，因此，词组“基本上由……组成”是指所列的元素是需要的或强制性的，但是所述其它元素是可选的并且可以取决于它们是否影响所列元素的活性或作用存在或不存在。
术语“互补的”和“互补性”是指因碱基配对规则而相关的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”是互补的。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸碱基根据碱基配对规则是匹配的。或者，在核酸之间可以有“完全”或“全部”互补性。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间的杂交的效率和强度具有显著影响。
“对应于(corresponds to)”或“对应于(corresponding to)”意指(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或部分实质上相同或互补的核苷酸序列或编码与肽或蛋白中的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多核苷酸；或(b)具有与参考肽或蛋白中的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列的肽或多肽。
如本文所用的，术语“检测分析物”是指确定样品中一种或多种分析物的存在、不存在、量或浓度。
“基因”是指遗传单位，其在染色体上占有特定的基因座并且由转录和/或翻译调控序列和/编码区和/或非翻译序列(即，内含子、5’和3’非翻译序列)组成。
“同源性”是指相同或组成型保守取代的核酸或氨基酸的百分比数目。可以使用序列比对程序例如GAP(Devereux et al.,1984)确定同源性，其通过引用并入本文。按照这个方式，可以通过将空位插入比对中而进行与本文所列的序列相似或实质上不同长度的序列的比较，这样的空位通过例如GAP所用的比较算法确定。
术语“宿主细胞”包括可以是或已经是本发明任意的重组载体或分离的多核苷酸的受体的个体细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，由于天然、偶然或人为的突变和/或改变，该子代不一定与最初的母代细胞完全相同(形态学或总DNA补体上)。宿主细胞包括在体内或体外用本发明的重组载体或多核苷酸转染或感染的细胞。包含本发明的重组载体的宿主细胞是重组宿主细胞。
“杂交”在本文中用于表示互补性核苷酸序列的配对以产生DNA-DNA杂交体或DNA-RNA杂交体。互补的碱基序列是因碱基配对规则而相关的那些序列。在DNA中，A与T配对；C与G配对。在RNA中，U与A配对；C与G配对。在这个意义上，本文使用的术语“匹配”和“错配”是指互补性核酸链中配对的核苷酸的杂交潜力。匹配的核苷酸有效地杂交，例如如上所述的经典的A-T和G-C碱基对。错配是未有效杂交的核苷酸的其它组合。
“分离的”是指实质上或基本上不含在其天然状态中通常伴随其的成分的材料。例如，本文使用的“分离的多核苷酸”是指已经从天然存在状态中其两侧的序列纯化而来的多核苷酸，例如，已经从通常临近片段的序列中移出的DNA片段。或者，本文使用的“分离的肽”或“分离的多肽”等是指在从天然细胞环境或从与细胞的其它成分的结合中体外分离和/或纯化的肽或多肽分子，即，其不与体内物质结合。
“从……获得”是指多肽或复合物，例如，是从特定来源分离或获得的。
本文使用的术语“寡核苷酸”是指由经由磷酸二酯键连接的多个核苷酸残基(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相关的结构变体或合成类似物)组成的聚合物(或其相关的结构变体或合成类似物)。因此，虽然术语“寡核苷酸”通常是指其中的核苷酸残基和残基之间的键是天然存在的核苷酸聚合物，但是应该理解的是该术语在其范围内还包括各种类似物，包括但不限于，肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(phosphorothioate)、甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核酸等等。分子的精确大小可以根据特定的应用而变化。寡核苷酸通常长度上很短，一般是约10至30个核苷酸残基，但是该术语可以指任意长度的分子，尽管术语“多核苷酸”或“核酸”通常用于大的寡核苷酸。
本文使用的术语“可操作连接”是指将结构基因置于启动子的调控控制之下，然后启动子控制基因的转录和任选的翻译。在异源启动子/结构基因组合的构建中，一般优选使遗传序列或启动子与基因转录起始点的距离大体上等于天然环境即该遗传序列或启动子所源自的基因中遗传序列或启动子与其控制的基因之间的距离。本领域中已知可以接受该距离的一些变化而不丧失功能。类似地，调控序列元件相对于有待置于其控制之下的异源基因的优选位置由天然环境即该元件所源自的基因中元件的位置决定。
术语“患者”，“受试者”和“个体”可互换使用，是指人类或其它哺乳动物患者、受试者和个体，包括需要使用本发明检测分析物水平或诊断疾病或病况的存在、不存在或严重度的治疗的任何一个。但是，应该理解“患者”不意味着存在症状。落入本发明范围的合适的哺乳动物包括但不限于，灵长类(例如人类、猩猩)，家畜动物(例如，绵羊、牛、马、驴、猪)，实验室测试动物(例如，兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、宠物(例如，猫、犬)和被捕获的野生动物(例如，狐狸、鹿、澳洲野犬)。
本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。该术语通常指长度为至少10个碱基的核苷酸，不论是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式，的聚合物形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。
术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指显示出与参考多核苷酸序列基本上的序列同一性的多核苷酸或与参考序列在下文定义的严格条件下杂交的多核苷酸。这些术语还涵盖因添加、缺失或替换至少一个核苷酸而与参考多核苷酸不同的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸已经被添加或缺失或被不同核苷酸取代的多核苷酸。在这个意义上，本领域中广泛理解的是可以对参考多核苷酸进行包括突变、添加、缺失和取代的某些改变而改变的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物学功能或活性。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体。
“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸(例如相应的天然产生的氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物。
术语“多肽变体”是指因添加、缺失或取代至少一个氨基酸残基而与参考多肽不同的多肽。在一些实施方案中，多肽变体因一个或多个取代而与参考多肽不同，所述取代可以是保守性或非保守性的。在一些实施方案中，多肽变体包括保守取代，在此意义上，本领域广泛理解的是一些氨基酸可以改变为具有大体上相似性质的其它氨基酸而不改变多肽活性的性质。多肽变体还涵盖其中一个或多个氨基酸被添加或缺失或被不同氨基酸残基替换的多肽。
“引物”是当与DNA的一条链配对时，在合适的聚合剂存在的情况下，能够启动引物延伸产物的合成的寡核苷酸。引物优选是单链的以获得最大扩增效率，但也可以是双链的。引物必须足够长以在聚合剂存在的情况下启动延伸产物的合成。引物的长度取决于很多因素，包括应用、要使用的温度、模板反应条件、其它试剂和引物来源。例如，取决于靶序列的复杂程度，寡核苷酸引物通常包含15至35个或更多个核苷酸残基，尽管其可以包括更少的核苷酸残基。引物可以是大的多核苷酸，例如从约200个核苷酸残基至几千个碱基或更多。可以将引物选择为与该引物设计用于杂交的模板上的序列“基本上互补”，并且作为合成的起始位点。“基本上互补”意指引物互补性足以与靶多核苷酸杂交。优选地，引物不含有与该引物设计用于杂交的模板的错配，但这不是必须的。例如，非互补性核苷酸残基可以与引物的5’末端连接，而引物序列的其余部分与模板是互补的。或者，非互补性核苷酸残基或非互补性核苷酸残基的一段序列可以散布于引物内，只要引物序列与其要杂交的模板序列具有足够的互补性，从而与其杂交并由此形成用于合成引物的延伸产物的模板。
“探针”是指与另一个分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指明，否则术语“探针”通常是指通过互补性碱基配对与另一个多核苷酸(通常称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。探针可以与缺少与探针完全序列互补性的靶多核苷酸结合，这取决于杂交条件的严格度。探针可以进行直接或间接标记。
术语“参考结果”包括在不同时间从相同受试者获取的结果，来自正常的受试者或一组受试者的结果或者分析实验中所用的参考标准。
“调控元件”或“调控序列”意指在特定宿主细胞中表达可操作连接的编码序列所必需的核酸序列(例如DNA)。适合于原核细胞的调控序列例如包括启动子和任选的顺式作用序列，例如操纵子序列和核糖体结合位点。适合于真核细胞的控制序列包括启动子、多腺苷化信号、转录增强子、翻译增强子、调节mRNA稳定性的引导或尾随序列以及将转录的多核苷酸编码的产物靶向细胞中的细胞内腔室或细胞外环境的靶向序列。
本文使用的术语“序列同一性”是指在比较窗口中序列基于一个核苷酸一个核苷酸或基于一个氨基酸一个氨基酸的相同程度。因此，“序列同一性百分比”通过在比较窗口比较两个最佳比对的序列，确定两个序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位点的数目以生成配对位点的数目，将配对位点的数目除以比较窗口中总的位点数目(即窗口大小)并且将结果乘以100以产生序列同一性百分比来计算。为了本发明的目的，“序列同一性”可被理解为意指通过DNASIS计算机程序(用于Windows的2.5版；可从Hitachi Software Engineering Co.,Ltd.,South San Francisco,California,USA获得)使用如软件所附饿参考材料中所用的标准缺省值计算的“配对百分比”。
术语“序列相似性”是指相同的或如下文表2中定义的组成型保守取代的氨基酸数目的百分率。可以使用序列比对程序例如GAP(DNASIS computer program(Version 2.5forWindows；available from Hitachi Software Engineering Co.,Ltd.,South SanFrancisco,California,USA)来确定相似性。按照这个方式，可以通过将空位插入比对中而进行与本文所列的那些相似或实质上不同长度的序列的比较，这样的空位通过例如GAP所用的比较算法确定。
用于描述两个或两个以上多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本上相同”。“参考序列”的长度为至少12个但通常为15-18个，常常为至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸每个可以包含(1)在两个多核苷酸之间相似的序列(即，仅仅全部多核苷酸序列的一部分)，和(2)在两个多核苷酸之间不同的序列，所以，两个(或两个以上)多核苷酸之间的序列比较通常通过将两个多核苷酸的序列与“比较窗口”进行比较以鉴别并比较序列相似性的局部区域。“比较窗口”是指概念上的至少6个，通常为约50至约100个，更通常为约100至约150个连续位点的片段，其中，在将两个序列优化比对之后，将一个序列与具有相同数目的连续位点的参考序列进行比较。比较窗口与参考序列(参考序列不包含添加或缺失)相比可以包含约20％或更少的添加或缺失(即空位)，以进行两个序列的优化比对。可以通过算法(Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Drive Madison，WI，USA)的计算机执行或通过检验和所选的不同方法中的任意一个所产生的最佳比对(即，在对比窗口产生最高的同源性百分比)来进行用于比对对比窗口的序列的优化比对。还可以参考BLAST程序家族，如例如由Altschul et al.,1997公开的。可以在Ausubel et al.,“Current Protocols inMolecular Biology”,John Wiley&Sons Inc,1994-1998,Chapter 15中找到序列分析的详细讨论。
本文使用的“严格度”是指杂交和洗涤程序中的温度和离子强度条件、存在或不存在某些有机溶剂。严格度越高，固定的靶核苷酸序列和洗涤之后保持与靶杂交的标记的探针多核苷酸序列之间的互补程度越高。术语“高度严格”是指只有那些具有高频互补性碱基的核苷酸序列才杂交的温度和离子条件。所需的严格度依赖于核苷酸序列并取决于杂交过程中存在的各种成分。一般地，将严格条件选择为比特定序列在确定的离子强度和pH下的热熔解温度(Tm)低大约10-20℃。Tm是50％的靶序列与互补探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。
术语“转化”意思是通过引入外源或内源核酸改变生物(例如细菌、酵母、哺乳动物、鸟类、爬行类、鱼类或植物)的基因型。
“载体”是可以插入或克隆入多核苷酸的多核苷酸分子，优选为源自例如质粒、噬菌体、酵母或病毒的DNA分子。载体优选含有一个或多个独特的限制性位点，并且能够在确定的宿主细胞(包括靶细胞或组织或其前体细胞或组织)中自主复制，或可以整合进入确定的宿主基因组中以使所克隆的序列可以复制。因此，载体可以是自主复制的载体，即以染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如线性或闭合环状质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可以包含任意确保自我复制的方式。或者，载体可以是在被引入宿主细胞时整合进入基因组中并且与其所整合进入的基因组一起复制的载体。载体系统可以包含单一载体或质粒、两个或两个以上载体或质粒(其一起包含需要引入宿主细胞基因组的总DNA)或转位子。载体的选择通常取决于载体与该载体要被引入的宿主细胞的相容性。在本例中，载体优选是病毒或源自病毒的载体，其在动物并且优选在哺乳动物细胞中是可操作地有功能的。这样的载体可以源自痘病毒、腺病毒或酵母。载体还可以包括选择性标记，例如可用于选择合适的转化子的抗生素抗性基因。这样的抗性基因的例子是本领域技术人员已知的，包括赋予抗生素卡那霉素和G418
Figure GDA0001572940870000221
抗性的nptII基因和赋予对抗生素潮霉素B抗性的hph基因。
术语“野生型”和“天然产生的”可互换使用，是指具有从天然存在的来源分离时的基因或基因产物的特性的基因或基因产物。野生型基因或基因产物(例如多肽)是在群体中最常见到的，因此被人为地指定为该基因的“正常的”或“野生型”形式。
2.凝血酶原激活剂
本发明部分基于尽管凝血酶原激活剂已知的蛋白水解活性但其对于制备用于检测分析物的血清来说仍是适合的凝结剂的发现。凝血酶原激活剂(有时称为凝血酶原酶)表现出类胰蛋白酶活性并且活化凝血酶原(即将凝血酶原转化为凝血酶，其反过来将血纤蛋白原转化为血纤蛋白并由此导致凝块形成)。
在一些实施方案中，凝血酶原激活剂是外源凝血酶原激活剂。如本文所用的，“外源凝血酶原激活剂”意指从除了有待从其制备血清样品的血液样品之外的来源获得的凝血酶原激活剂。
2.1野生型或天然存在的凝血酶原激活剂
在本发明中使用的凝血酶原激活剂可包含野生型或天然存在的凝血酶原激活剂，包括从任何适合的生物(包括蛇、人类、牛)获得的那些和细菌凝血酶原激活剂。凝血酶原激活剂可包含全场的野生型或天然存在的多肽。
在某些实施方案中，凝血酶原激活剂是蛇凝血酶原激活剂。适合地，凝血酶原激活剂是蛇毒液凝血酶原激活剂。蛇毒液凝血酶原激活剂通常根据它们的结构、功能和对辅因子的需要而分为四组(A、B、C和D)。
适合地，蛇毒液凝血酶原激活剂是组A凝血酶原激活剂。组A凝血酶原激活剂是由三个结构域组成的金属蛋白酶：金属蛋白酶、解聚素和富含Cys的结构域。金属蛋白酶结构域含有共有序列HEXXHXXGXXH，对应于锌螯合活性位点。这些凝血酶原激活剂已至少在若干毒蛇毒液中发现并且包括来自锯鳞蝰毒液的蛇静脉酶和来自三色矛头蝮毒液的basparin。
适合地，蛇毒液凝血酶原激活剂是组B凝血酶原激活剂。组B凝血酶原激活剂是由共价维持的两个亚基组成的金属蛋白酶：金属蛋白酶和C型凝集素样二硫键连接的二聚体。这些凝血酶激活剂已在若干毒蛇毒液中发现并且包括来自锯鳞蝰毒液的multactivase、carinactivase-1和carinactivase-2以及来自Echis multisquamatus毒液的multactivase。
适合地，蛇毒液凝血酶原激活剂是组C凝血酶原激活剂。组C凝血酶原激活剂是丝氨酸蛋白酶并且类似哺乳动物因子Xa-因子Va复合物。Pseutarin C(或PtPA)和oscutarinC(或OsPA)是分别来自东部拟眼镜蛇和太攀蛇的毒液的组C凝血酶原激活剂。Omicarin C是来自内陆太攀蛇毒液的凝血酶原激活剂。
适合地，蛇毒液凝血酶原激活剂是组D凝血酶原激活剂。组D凝血酶原激活剂是丝氨酸蛋白酶并且功能上与哺乳动物因子Xa类似。Porpharin D(来自红腹伊澳蛇)、notecarin D(来自Notechis scutatus scutatus)、trocarin D(来自粗鳞澳东蛇)、hopsarin D(来自黄环盔头蛇)和notenarin D(来自半岛黑虎蛇(Notechis ater niger))都是组D凝血酶原激活剂。
蛇凝血酶原激活剂的综述提供于Kini,R.M.(2005)中并且特别地来自澳大利亚眼镜蛇的毒液的那些(组C和D凝血酶原激活剂)的综述在St.Pierre et al.(2005)中，其每一篇的内容通过引用全文并入本文。这两个综述使用将蛇凝血酶原激活剂分为上文所描述的组A-D的分类。这一分类代替了如较早的综述文章中所描述的之前使用组I-III(组I涵盖组A和B；组II是现在的组D而组III是现在的组C)以及有时另外的组IV(剪切凝血酶原中的肽键但是未将凝血酶原转化为酶活性产物-即凝血酶或中间凝血酶的蛇毒液激活剂)和V(细菌凝血酶原激活剂)的分类系统，包括Rosing,J.et al.(1991)和Rosing,J.et al.(1992)，其每一篇的内容通过引用全文并入本文。为了解释分类系统的变化，参见Kini,R,M.,etal.(2001)，其内容通过引用全文并入本文。
在特定的实施方案中，从眼镜蛇科家族获得蛇凝血酶原激活剂，其示例性的实例包括来自褐眼镜蛇属(Demansia)，盔头蛇属(Hoplocephalus)，虎蛇属(Notechis)，尖尾蛇属(Oxyuranus)、拟蝮蛇属(Pseudechis)、拟眼镜蛇属(Pseudonaja)，澳西蛇属(Rhinoplocephalus)和澳东蛇属(Tropidechis)的物种，包括但不限于迅猛澳蛇、黄环盔头蛇、Notechis ater humphreysi、半岛黑虎蛇、恰波岛虎蛇(Notechis ater serventyi)、Notechis flinders、Notechis humphreysi、Notechis niger、Notechis occidentalis、虎蛇、Notechis scutatus scutatus、Notechis serventyi、内陆太攀蛇、太攀蛇、红腹伊澳蛇、斑点拟眼镜蛇(Pseudonaja affinis)、Pseudonaja inframaculata、西部拟眼镜蛇、东部拟眼镜蛇、小眼澳西蛇(Rhinoplocephalus nigrescens)和粗鳞澳东蛇。
在特定的实施方案中，蛇凝血酶原激活剂从蝰蛇科家族获得，其示例性的实例包括来自矛头腹属(Botrhops)、小蝰属(Echis)和竹叶青属(Trimeresurus)的物种，包括但不限于美丽矛头蝮(Bothrops alternatus)、三色矛头蝮、矛头蝮(Bothrops atrox)、Bothrops atrox asper、Bothrops brasili、南美矛头蝮(Bothrops castelnaudi)、Bothrops columbiensis、红黑矛头蝮(Bothrops erythromelas)、丰氏矛头蝮(Bothropsfonsecai)、海岛矛头蝮(Bothrops itapetiningae)、美洲矛头蝮(Bothrops jararaca)、诺维特矛头蝮(Bothrops neuwiedi)、委内瑞拉矛头蝮(Bothrops venezuelensis)、锯鳞蝰、彩锯鳞蝰(Echis coloratus)、Echis multisquamatus和Trimeresurus okinavensis。
在特定的实施方案中，蛇凝血酶原激活剂从游蛇科家族获得，其示例性的实例包括来自非洲树蛇属(Colubridae)、颈槽蛇属(Rhabdophis)和藤蛇属(Thelotornis)的物种，包括但不限于非洲树蛇(Dispholidus typus)、Rhabdophis tigrinus tigrinus、克氏树蛇(Thelotornis kirtlandii)和鸟藤蛇(Thelotornis capensis)。
在某些实施方案中，蛇凝血酶原激活剂来自或获得自蛇毒液。来自东部拟眼镜蛇蛇毒液的PtPA的纯化和表征描述于Masci(1986)和Masci et al.,(1998)中而来自太攀蛇毒液的OsPA描述于Speijer et al.,(1986)中，其均通过引用全文并入本文。来自锯鳞蝰毒液的蛇静脉酶的纯化和表征描述于Morita,T et al.(1981)和Nishida,S et al.(1995)中，来自锯鳞蝰毒液的carinactivase描述于Yamada,D et al.(1996)中，来自Echismultisquamatus的multactivase描述于Yamada,D.et al.,(1997)中，并且来自虎蛇的notecarin描述于Tans,G et al.,(1985)中，其均通过引用全文并入。
在某些实施方案中，凝血酶原激活剂是哺乳动物凝血酶原激活剂。哺乳动物凝血酶原激活剂包括来自人血液和/或组织的那些以及来自牛血液和/或组织的那些。
在某些实施方案中，凝血酶原激活剂是细菌凝血酶原激活剂。细菌凝血酶原激活剂包括来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、产吲哚消化球菌(Peptococcusindolicus)、产黑素拟杆菌(Bacteroides melaninogenicus)和绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(Rosing,J.et al.(1991)。
本领域那些技术人员应理解的是凝血酶原激活剂可包含一种或多种多肽、基本由一种或多种多肽组成或由一种或多种多肽组成。在某些实施方案中，凝血酶原激活剂包含单一多肽，基本由单一多肽组成或由单一多肽组成。在其他的实施方案中，凝血酶原激活剂包含多于一种多肽，基本由多于一种多肽组成或由多于一种多肽组成，所述多于一种多肽包括但不限于多肽的复合物。当凝血酶原激活剂包含多于一种多肽，基本由多于一种多肽组成或由多于一种多肽组成时，每种多肽可来自来源于相同或不同属，和/或相同或不同物种的生物。
在某些实施方案中，凝血酶原激活剂包含选自在SEQ ID NO:1、2、3、4、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51和52中展示的那些的氨基酸序列或包含由选自在SEQ ID NO:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47和49中展示的那些的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
2.2嵌合凝血酶原激活剂和融合多肽
本发明同样预期包含嵌合多肽的凝血酶原激活剂的用途。如本文所用的，“嵌合多肽”包括包含从第一生物获得的多肽的第一多肽的组分，其与从第二生物获得的第二多肽组分连接。在一些实施方案中，所述第一生物和所述第二生物来自不同的属。在其他实施方案中，所述第一生物和所述第二生物是相同属的不同物种。在某些实施方案中，凝血酶原激活剂包含类似因子Xa-因子Va复合物的嵌合多肽，其中第一多肽包含因子Xa样多肽而第二多肽包含因子Va样多肽。在某些特定实施方案中，所述第一多肽包含选自SEQ ID NO:26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48和50中展示的那些的氨基酸序列或包含选自SEQ ID NO:19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47和49中展示的那些的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，而所述第一多肽包含选自在SEQ ID NO:7、8、11、12、13、16和18中展示的那些的氨基酸序列或包含选自SEQ ID NO:5、6、9、10、14、15和17中展示的那些的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。
本发明同样预期包含融合多肽的凝血酶原激活剂的用途。如本文所用的，“融合多肽”包括第一多肽组分，其与第二多肽组分连接。所述第一多肽组分可从第一生物获得而所述第二多肽组分可从第二生物获得。在某些实施方案中，所述第一生物和所述第二生物来自不同属。在其他实施方案中，所述第一生物和所述第二生物是相同属的不同物种。所述融合多肽的第一多肽组分或第二多肽组分可相应于野生型或天然存在的氨基酸序列的全部或部分(例如如本文所描述的片段)。第二多肽组分可与第一多肽组分的N端或C端融合。
2.3野生型或天然存在多肽的片段
凝血酶原激活剂可包含全长野生型或天然存在的多肽的片段，其中凝血酶原激活剂表现凝血酶原活化活性。
通常，全长多肽的片段可参与相互作用，例如分子内或分子间相互作用。这些片段包括包含SEQ ID NO:2、3、4、51,和52中所示的氨基酸序列的肽和包含足够相似于或来源于(推定的)全长多肽的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48和50中所示的氨基酸序列或选自SEQ ID NO:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47和49中展示的那些的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，其包括比全长多肽更少的氨基酸)的多肽并显示该多肽的一种活性。
2.4天然存在的凝血酶原激活剂(多肽)的变体
本发明同样预期包含为野生型或天然存在的一种或多种多肽的一种或多种变体的一种或多种多肽的凝血酶原激活剂。本发明涵盖的包含一种或多种变体多肽的凝血酶原激活剂是生物活性的，也就是说，它们继续具有凝血酶原活化活性。
这些“变体”凝血酶原激活剂包括来源于天然多肽的多肽，其中所述多肽通过向一种或多种天然多肽的N端和/或C端末端缺失(所称的截短)或添加一种或多种氨基酸；在一种或多种多肽中一个或多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸或在一种或多种多肽中一个或多个位点取代一个或多个氨基酸而来源于相应的一种或多种天然多肽。这些变体凝血酶原激活剂可来自于例如遗传多态性或人为处理。
变体多肽的另外的非限制性实例包括前体全长的加工形式的多肽或酶原形式的多肽或者多肽或酶原形式的多肽。
野生型或天然存在的多肽的变体与野生型或天然存在的多肽的氨基酸序列具有至少40％、50％、60％、70％，一般为至少75％、80％、85％，经常为大约90％、91％、92％、93％、94％、95％或更多，通常为大约96％、97％、98％或更多(以及之间的所有整数百分比)的序列相似性或同一性，包括但不限于SEQ ID NO:1、2、3、4、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51和52中的序列或SEQ ID NO:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47和49中的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，如本文其它地方描述的序列比对程序(使用缺省参数)所测定。落入变体多肽范围内的野生型或天然存在的多肽的变体可通常与多肽具有多达200、100、50或20个氨基酸残基的差异或者适宜地，仅有1-15个氨基酸残基、仅有1-10个氨基酸残基、例如6-10个、仅5个、仅4、3、2个或甚至1个氨基酸残基的差异。在某些实施方案中，变体多肽与相应的SEQ ID NO：1、2、3、4、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51或52的序列或SEQ ID NO:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47或49中的核苷酸序列所编码的氨基酸序列具有至少1个但是少于15、10或5个氨基酸残基的差异。在其它具体实施方案中，它与相应的SEQ ID NO：1、2、3、4、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51或52的序列或SEQ ID NO:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47或49中的核苷酸序列所编码的氨基酸序列具有至少一个残基但少于20％、15％、10％或5％的残基的差异。
多肽可以多种方式变化，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。这些处理的方法通常是本领域中已知的。例如，多肽的氨基酸序列变体可通过DNA中的突变来制备。突变的方法和核苷酸序列变化是本领域中熟知的。参见例如Kunkel(1985),Kunkel et al.,(1987),US patent 4,873,192,Watson et al.,(1987)和其中所引用的文献。不会影响感兴趣的蛋白的生物活性的适合的氨基酸取代的指导可在Dayhoff et al.(1978)的模型中找到。筛选通过点突变或截短所产生的组合文库的基因产品和筛选具有所选择的特性的基因产物的cDNA文库的方法是本领域中已知的。这些方法可适用于通过多肽的组合突变产生的基因文库的快速筛选。递归集合突变(REM)，一种增强文库中功能突变的频率的技术，可与筛选测定组合用于确定多肽变体，参见例如Arkin et al.(1992)和Delagrave et al.(1993)。如下文中详细讨论的，保守取代，例如将一种氨基酸用具有相似特性的另一种交换，可能是所期望的。
与母本(例如天然存在的或参照的)氨基酸序列相比，变体多肽可沿它们的序列在不同位点含有氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替的一种取代。本领域中已经定义了具有相似侧链氨基酸残基的家族，其通常可如下再细分类：
酸性的：残基由于在生理pH时丧失H离子而带有负电荷，并且当肽处于生理pH的水性介质中时，残基被水溶液吸引从而寻找包含该残基的肽的构象中的表面位置。具有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。
碱性的：残基由于在生理pH或其一个或两个pH单位之内(例如组氨酸)与H离子结合而带有正电荷，并且当肽处于生理pH的水性介质中时，残基被水溶液吸引从而寻找包含该残基的肽的构象中的表面位置。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
带电的：残基在生理pH时是带电的，因此，包括具有酸性或碱性侧链的氨基酸(即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)。
疏水性的：残基在生理pH时是不带电的，当肽处于水性介质中时，残基被水溶液排斥从而寻找包含该残基的肽的构象中的内部位置。具有疏水性侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
中性的/极性的：残基在生理pH时是不带电的；但是，当肽处于水性介质中时，残基未被水溶液足够地排斥从而它将寻找包含该残基的肽的构象中的内部位置。具有中性/极性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
本说明书还将某些氨基酸描述为“小的”，因为它们的侧链不够大(即使缺少极性基团)，不能赋予疏水性。除了脯氨酸之外，“小的”氨基酸是指当至少一个极性基团位于侧链时具有四个或四个以下碳以及当侧链上无极性基团时具有三个或三个以下碳的那些。具有小的侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。基因编码的二级氨基酸脯氨酸是特殊情况，归因于其已知的对肽链的二级构象的影响。脯氨酸的结构与所有其它天然产生的氨基酸的不同之处在于其侧链与α-氨基基团的氮以及α-碳结合。但是，几个氨基酸相似性矩阵(例如，Dayhoff et al.(1978)和by Gonnet et al.(1992)公开的PAM120矩阵和PAM250矩阵)将脯氨酸与甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸包括在相同的组中。因此，为了本发明的目的，脯氨酸被分类为“小的”氨基酸。
分类为极性或非极性所需的吸引或排斥程度是人为设定的，因此，本发明特别预期的氨基酸被分类为一类或另一类。多数没有经过特别命名的氨基酸可以基于其已知行为进行分类。
氨基酸残基可以进一步被再细分为环形或非环形的、以及芳香族或非芳香族的(一看即知是根据残基的侧链取代基团进行的分类)以及小的或大的。如果残基含有总共4个或4个以下碳原子(包括羧基碳)则认为该残基是小的，只要存在另一个极性取代基；如果不存在，则为3个或3个以下。当然，小的残基一定是非芳香族的。取决于其结构特征，氨基酸残基可以被分成两类或更多类。对于天然存在的蛋白氨基酸，根据该方案进行的再细分显示于表1。
表1
氨基酸再细分
Figure GDA0001572940870000301
保守氨基酸取代还包括基于侧链的分组。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。例如，可以合理预计以异亮氨酸或缬氨酸替代亮氨酸、以谷氨酰胺替代天冬酰胺、以丝氨酸替代苏氨酸或者以结构相关的氨基酸类似地替代某氨基酸将不会对产生的变体多肽的性质产生重要影响。可以通过测定其活性而容易地确定氨基酸变化是否产生功能性多肽。保守性取代示于表2中示例性和优选取代的表头下。一般来讲，落入本发明范围内的氨基酸取代是通过选择那些对于维持(a)取代区域的肽骨架结构，(b)靶位点分子的电荷或疏水性或(c)侧链的大小的影响上没有显著差异的取代进行的。引入取代物之后，筛选变体的生物活性。
表2
示例性的和优选的氨基酸取代
Figure GDA0001572940870000311
可选择地，用于进行保守取代的类似氨基酸可以基于对侧链的鉴定归为三类。第一组包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸，其均具有带电侧链；第二组包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；第三组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸，如Zubay,G.(1993)所描述的。
因此，多肽中预测为非必需的氨基酸残基通常被另一个来自相同侧链家族的氨基酸残基替代。可选择地，可以通过例如饱和诱变沿着全部或部分多肽基因编码序列随机引入突变，并且可以筛选所产生的突变体的母本多肽活性以鉴别那些保持该活性的突变体。编码序列的诱变之后，可以重组表达所编码的肽并且可以测定肽的活性。“非必需”氨基酸残基是可以从多肽的野生型序列加以改变而不消除或实质上改变其一个或多个活性的残基。适宜地，所述改变不实质上改变这些活性中的一个，例如，活性至少是野生型的20％、40％、60％、70％或80％。示例性的非必需氨基酸残基包括在图7所示的野生型蛇毒FV多肽之间相同位置(例如，如上文定义的残基X1-X66)上不同的一个或多个氨基酸残基的任一个。“必需”氨基酸残基是当从参考多肽的野生型序列进行改变时引起母本分子的活性的消除(例如存在20％以下的野生型活性)的残基。
因此，本发明还预期天然存在的多肽序列或其生物活性片段的变体，其中所述变体通过添加、缺失或取代一个或多个氨基酸残基而与天然存在的序列相区别。一般地，变体将显示出与母本或参考多肽序列例如SEQ ID NO:1、2、3、4、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51或52中所展示的或母本或参考多肽序列例如SEQ ID NO:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47或49中所示的核苷酸序列所编码的至少大约30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的相似性。所期望地，变体将具有与母本或参考多肽序列例如SEQID NO:1、2、3、4、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51或52中所展示的或母本或参考多肽序列例如SEQ ID NO:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47或49中所示的核苷酸序列所编码的至少30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的序列同一性。此外，预期通过添加、缺失或取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸而与天然或母本序列相区别但是保留母本多肽特性的序列。多肽还包括在本文定义的严格条件下(特别是高度严格条件下)与母本编码多核苷酸序列或其非编码链(如下所述)杂交的多核苷酸所编码的多肽。示例性的母本多肽序列如SEQ ID NO：5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47和49所示。
在某些实施方案中，变体多肽与参考序列因至少一个但少于50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2个氨基酸残基而不同。在其他实施方案中，变体多肽与SEQ ID NO:1、2、3、4、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51或52的相应序列或SEQ ID NO:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47或49的核苷酸序列所编码的氨基酸序列因至少1％但少于20％、15％、10％或5％的残基而不同。(如果这一比较需要对比，应当以最大相似性对比序列。来自缺失或插入的“环”出序列或错配被认为是不同的)。所述不同是，适合地，在非必需残基上的不同或变化或者保守取代。
可以通过筛选蛋白的突变体(例如截短的突变体)的组合文库来鉴别蛋白的变体。蛋白编码序列的文库或片段(例如N末端的、C末端的或内部的片段)可用于产生片段的多样化群体以筛选然后选择蛋白的变体。
筛选通过点突变或截短而制备的组合文库的基因产物的方法以及筛选cDNA文库以获取具有选定的特征的基因产物的方法在本领域是已知的。这样的方法可适用于迅速筛选通过蛋白的组合诱变产生的基因文库。
蛇凝血酶原激活剂蛇静脉酶的某些变体描述于美国专利6,413,737中。
2.5天然存在的凝血酶原激活剂的变体(核苷酸)
本发明还预期包含由编码野生型或天然存在的一种或多种多核苷酸的野生型或天然存在的一种或多种多核苷酸的变体编码的一种或多种多肽的凝血酶原激活剂。
野生型或天然存在的多核苷酸的变体将具有与野生型或天然存在的多核苷酸的核苷酸序列的至少40％、50％、60％、70％，一般至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％，通常约90％、91％、92％、93％、94％、95％或更多或以及典型地约96％、97％、98％或更多(以及之间的所有整数百分比)的序列相似性或同一性，包括但不限于SEQ ID NO:1、2、3、4、7、8、11、12、13、16、18、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、51或52的序列或SEQ ID NOs:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47和49的序列或其补体所编码的序列，如本文其他地方描述的使用缺省参数的序列比对程序所测定的。
编码多肽的示例性的核苷酸序列包括全长基因以及基因的全长的部分或基本上全长的核苷酸序列，或它们的转录物或这些转录物的DNA副本。核苷酸序列的部分可编码多肽的部分或片段。其保留了天然多肽的生物活性。编码多肽的生物活性片段的核苷酸的一部分可编码全长多肽中存在的至少约20,21,22,23,24,25,30,40,50,60,70,80,90,100,120,150,300或400个连续的氨基酸残基或几乎多达全部氨基酸。
本发明还预期核苷酸序列的变体。核酸变体可以是天然存在的，例如等位基因变体(相同的基因座)、同源物(不同的基因座)和直系同源物(不同的生物)，或者可以是非天然存在的。天然存在的变体(例如这些)可以通过使用熟知的分子生物学技术(例如本领域已知的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术)加以鉴别。非天然存在的变体可以通过诱变技术制备，包括适用于多核苷酸、细胞或生物的那些。变体可以包含核苷酸取代、缺失、倒置和插入。变异可以发生在编码区和非编码区中的一个或同时发生于二者中。变异可以同时产生保守性和非保守性氨基酸替换(在编码产物中比较)。对于核苷酸序列，保守变体包括由于遗传密码的简并性而编码参考多肽的氨基酸序列的那些。变体核苷酸序列还包括合成来源的核苷酸序列，诸如通过例如使用定点诱变产生但仍然编码多肽的那些。一般地，特定核苷酸序列的变体将与该特定核苷酸序列具有至少约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％，一般至少约75％，80％、85％、86％、87％、88％、89％，所期望地约90％、91％、92％、93％、94％、95％或更高，并且更适合地约96％、97％、98％或更高的序列同一性，如本文其它地方描述的使用缺省参数的序列比对程序所测定的。
核苷酸序列可用于从其它生物(特别是其它蛇类)分离相应的序列和等位基因。可以在本领域中容易地获得用于核酸序列杂交的方法。可以根据熟知的技术基于其序列与本文所示的编码序列的同一性分离来自其它生物的编码序列。在这些技术中，已知的编码序列的全部或一部分用作探针，其与来自选定生物(例如蛇)的克隆的基因组DNA片段或cDNA片段的群体(即基因组或cDNA的文库)中存在的其它编码序列选择性杂交。因此，本发明还预期与参考核苷酸序列或与其互补体在下文描述的严格条件下杂交的多核苷酸。本文使用的术语“在低严格度、中严格度、高严格度或非常高的严格度的条件下杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。
可以在Ausubel et al.,supra,sections 6.3.1-6.3.6部分中找到进行杂交反应的指导。在该参考文献中描述了水性和非水性的方法，每个都可以使用。本文中提及的低严格度条件包括并涵盖用于42℃杂交的至少约1％v/v至至少约15％v/v甲酰胺和至少约1M至至少约2M的盐，用于42℃洗涤的至少约1M至至少约2M的盐。低严格度条件还可以包括用于65℃杂交的1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS，和用于室温洗涤(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、5％SDS。低严格度条件的一个具体实施方案包括：在大约45℃以6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)进行杂交，然后在至少50℃以0.2×SSC、0.1％SDS洗涤两次(对于低严格度条件洗涤温度可以升高至55℃)。中严格度条件包括并涵盖用于42℃杂交的至少约16％v/v至至少约30％v/v甲酰胺和至少约0.5M至至少约0.9M的盐，用于55℃洗涤的至少约0.1M至至少约0.2M的盐。中严格度条件还可以包括用于65℃杂交的1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)、7％SDS和用于60-65℃洗涤的(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mMNaHPO4(pH 7.2)、5％SDS。中严格度条件的一个具体实施方案包括：在约45℃以6x SSC进行杂交，然后在60℃以0.2×SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。高严格度条件包括并涵盖用于42℃杂交的至少约31％v/v至至少约50％v/v甲酰胺和约0.01M至约0.15M的盐，用于55℃洗涤的约0.01M至约0.02M的盐。高严格度条件还可以包括用于65℃杂交的1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS和用于65℃以上的温度洗涤的(i)0.2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、1％SDS。高严格度条件的一个具体实施方案包括：在约45℃以6x SSC进行杂交，然后在65℃以0.2×SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。
在一些具体实施方案中，多肽由低、中等、高或非常高的严格度条件下与所公开的核苷酸序列杂交的多核苷酸所编码。非常高严格度的条件的一个具体实施方案包括：在65℃以0.5M磷酸钠、7％SDS进行杂交，然后在65℃以0.2×SSC、1％SDS洗涤一次或多次。
其它的严格度条件在本领域是熟知的，技术人员将认识到可以操作各种因素以使杂交的特异性优化。最终洗涤的严格度的优化可用于确保高程度的杂交。对于具体的例子，参见Ausubel et al.,supra at pages 2.10.1to 2.10.16和Sambrook,J.et al.(2001)atsections 1.101to 1.104。
虽然严格洗涤通常是在大约42℃至68℃的温度进行，但是本领域技术人员将理解的是其它温度可以适合于严格条件。最大杂交速率通常发生于形成DNA-DNA杂交体的Tm之下大约20℃至25℃。本领域中熟知的是Tm是熔解温度，或两个互补的多核苷酸序列解离的温度。评估Tm的方法在本领域是熟知的(参见Ausubel et al.,supra at page 2.10.8)。一般地，完全匹配的DNA双链的Tm可以根据以下公式预测为近似值：
Tm＝81.5+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-(600/长度)。
其中：M是Na+的浓度，优选在0.01摩尔至0.4摩尔的范围内；％G+C是鸟苷和胞苷碱基之和占碱基总数目的百分率，在30％至75％G+C的范围内；％甲酰胺是甲酰胺的体积百分比浓度；长度是DNA双链中碱基对的数目。随机错配的碱基对数目每升高1％，双链DNA的Tm大约降低1℃。对于高严格度，一般在Tm-15℃进行洗涤，对于中严格度为Tm-30℃。
在杂交程序的一个实例中，在42℃将含有固定的DNA的膜(例如硝酸纤维素膜或尼龙膜)在含有标记探针的杂交缓冲液(50％去离子甲酰胺，5×SSC，5×Denhardt溶液(0.1％菲可(ficoll)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％牛血清白蛋白)，0.1％SDS和200mg/mL变性的鲑鱼精子DNA)中杂交过夜。然后将膜依次进行两次中严格度的洗涤(即，在45℃2×SSC，0.1％SDS洗涤15分钟，然后在50℃2×SSC、1％SDS洗涤15分钟)，然后依次进行两次较高严格的洗涤(即，在55℃0.2×SSC、0.1％SDS洗涤12分钟，然后在65-68℃0.2×SSC和0.1％SDS溶液中洗涤12分钟)。
3.制备凝血酶原激活剂
凝血酶原激活剂可通过本领域技术人员已知的任何适合的程序来制备。
例如，凝血酶原激活剂可通过任何方便的方法例如通过从天然存在的贮库(包括但不限于蛇毒液、血液和血液来源的产品(例如血清))纯化多肽来制备。纯化的方法包括亲和层析，包括凝集素(例如麦胚凝集素)亲和层析或其他分离。所获得的凝血酶原激活剂的鉴定和纯化可通过例如SDS-聚丙烯酰胺电泳或层析例如通过高效液相色谱(HPLC)来确定。例如，来自东部你眼镜蛇蛇毒液的pseutarin C(也简写为PtPA)的纯化和表征描述于Masci(1986)和Masci et al.(1988)中，而来自太攀蛇毒液的oscutarin C(OsPA)描述于Speijeret al.(1986)，这两者均通过引用全文并入本文。来自锯鳞蝰毒液的蛇静脉酶的纯化描述于Morita,T et al.(1981)中，其内容也通过引用全文并入本文。
可选择地，凝血酶原激活剂可从使用本领域已知的方法培养的毒腺细胞生产，包括例如Yamanouye,N.,et al.(2007)中描述的方法，其描述了用于体外毒液生产的来自美洲矛头蝮的毒腺的分泌细胞的初级培养，其内容通过引用全文并入本文。
可选择地，凝血酶原激活剂可通过化学合成例如使用如诸如Atherton和Shephard(1989)的第9章和Roberge et al.(1995)中描述的溶液合成或固相合成来合成。
可选择地，凝血酶原激活剂可通过重组技术来制备。例如，本发明中所用的凝血酶原激活剂可通过包括下列步骤的程序来制备：(a)制备包含编码多肽并且可与调控元件可操作地连接的多核苷酸序列的构建体；(b)将所述构建体引入宿主细胞；(c)培养所述宿主细胞表达多肽；(d)从所述宿主细胞分离所述多肽。如果凝血酶原激活剂包含复合物或两种多肽，那么凝血酶原激活剂可通过包括下列步骤的程序来制备：(a)制备包含编码第一多肽并与调控元件可操作地连接的多核苷酸的构建体；(b)将所述构建体引入宿主细胞；(c)培养所述宿主细胞表达所述第一多肽；(d)从所述宿主细胞分离多肽；为第二多肽重复步骤(a)至(d)；并且将所述第一多肽和所述第二多肽连接。在示例性的实例中，编码多肽的核苷酸序列编码SEQ ID NO:5、6、9、10、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或其变体中展示的序列的至少生物活性部分。
重组凝血酶原激活剂可使用如例如Sambrook,J.et al.(2001)(尤其是第16和17章)，Ausubel et al.(1994,supra)(尤其是第10和16章)以及Coligan et al.,CurrentProtocols in Protein Science(John Wiley&Sons,Inc.1995-1997)(尤其是第1、5和6章)中描述的标准程序来方便地制备。例如，可用于生产组C和组D凝血酶原激活剂的蛇因子V和蛇因子X的重组生产描述于Filippovic,I.et al(2005)和Bos,M.H.A.et al(2009)中，其每篇通过引用全文并入本文。重组生产蛇静脉酶和蛇静脉酶变体的示例性过程提供于Yonemura,H.et al.(2004)和美国专利6,413,737中，其每一篇的全部内容通过引用并入本文。
4.容器
本发明涵盖用于制备适合的血清样品的任何适合的容器。许多适合的容器是本领域熟知的，包括美国专利4,227,620；美国专利4,256,120；美国专利6,416,717；美国专利6,592,613；美国专利6,686,204；美国专利7,488,287；美国专利7,699,828；欧洲专利0 628816中描述的那些和可商业获得的容器(包括在本说明书实施例中使用的那些)。
在某些实施方案中，根据本发明使用的容器是管，包括玻璃和塑料管。适合的塑料包括聚氯乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙酯和聚苯乙烯。
容器可被抽真空并且用适合的可穿刺的隔膜或盖子密封末端。这使得可以使用双端引出的针头，其中一端插入患者静脉而针头的另一端之后穿过覆盖管末端的隔膜或盖子以便管中的真空将血液样品通过针头抽取至管中。
容器可具有任何适合的大小。在某些实施方案中，容器可被设计容纳50μL和10mL之间的血液样品。适合地，容器被设计以容纳至少50μL、100μL、150μL、200μL、250μL、300μL、350μL、400μL、450μL、500μL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、8mL或10mL的血液样品。
在某些实施方案中，所述容器含有凝结组合物，所述凝结组合物包含0.01至100μg的凝血酶原激活剂，基本由0.01至100μg的凝血酶原激活剂组成或由0.01至100μg的凝血酶原激活剂组成。适合地，所述容器含有凝结组合物，所述凝结组合物包含0.1至10μg的凝血酶原激活剂，基本由0.1至10μg的凝血酶原激活剂组成或由0.1至10μg的凝血酶原激活剂组成。在代表性的实施方案中，所述容器含有凝结组合物并容纳4mL血液样品，提供4mL血液样品样品中25ng/mL至2.5μg/mL的凝血酶原激活剂最终浓度，所述凝结组合物包含0.1至10μg的凝血酶原激活剂，基本由0.1至10μg的凝血酶原激活剂组成或由0.1至10μg的凝血酶原激活剂组成。
在某些实施方案中，所述容器含有凝结组合物，所述凝结组合物包含0.0005至15μg的凝血酶原激活剂，基本由0.0005至15μg的凝血酶原激活剂组成或由0.0005至15μg的凝血酶原激活剂组成。适合地，所述容器含有凝结组合物，所述凝结组合物包含0.005至10μg的凝血酶原激活剂，基本由0.005至10μg的凝血酶原激活剂组成或由0.005至10μg的凝血酶原激活剂组成。
在某些实施方案中，所述容器含有凝结组合物，所述凝结组合物包含0.0005至15U/mL的凝血酶原激活剂，基本由0.0005至15U/mL的凝血酶原激活剂组成或由0.0005至15U/mL的凝血酶原激活剂组成。适合地，所述容器含有凝结组合物，所述凝结组合物包含0.0015至10U/mL的凝血酶原激活剂，基本由0.0015至10U/mL的凝血酶原激活剂组成或由0.0015至10U/mL的凝血酶原激活剂组成。在某些实施方案中，单位测量是如下定义的凝血酶原激活剂单位测量：1个单位应当活化凝血酶原以生产在pH 8.4于37℃的1个单位的酰胺分解活性而1个酰胺分解活性单位将在pH 8.4于37℃每分钟水解1.0μmole的N-p-tosyl-Gly-Pro-Arg-对硝基苯胺。
在某些实施方案中，凝结组合物可在血液样品被加入容器中之前被包含在容器中。在某些实施方案中，凝结组合物可在血液样品被加入容器中之后被加至容器中。
当凝结组合物可在血液样品被加入容器中之前被包含在容器中时，其可通过本领域中已知的任何适合的方法加至容器中。在某些实施方案中，凝结组合物被溶解于适合的溶剂中并且之后被加至容器中并且干燥至容器的内表面上。溶剂可以是中性缓冲液。溶于溶液的凝结组合物可以通过喷雾干燥或冷冻干燥或通过本领域中已知的任何其他适合的方法干燥至容器的内表面。在某些实施方案中，所述凝结组合物被溶解于适合的溶剂中并且加至容器中而不干燥以便容器含有包含凝结组合物的水溶液。所述溶剂可以是中性缓冲液。
在某些实施方案中，小珠用所述凝结组合物包被并且这些小珠被加至容器。小珠是玻璃珠或合成的树脂珠，包括聚苯乙烯珠和丙烯珠。小珠可具有球状形状。在某些实施方案中，小珠的平均直径在0.1mm和1mm之间。
在某些实施方案中，容器提供在凝结发生后从所凝结的细胞分离血清。在某些实施方案中，容器包含或含有在凝结的细胞和血清样品之间提供屏障的凝胶。在某些实施方案中，容器具有适合的形状和适合的材料以允许离心以分离或帮助维护所凝结的细胞和血清样品的分离。在某些实施方案中，将血清样品从凝结的细胞移除或者将凝结的细胞从血清样品移除。
在某些实施方案中，容器可包含一种或多种另外的成分。其他成分可包括例如一种或多种辅因子、一种或多种表面活性剂和/或除了所述凝结组合物之外的一种或多种凝结剂。
5.另外的组分
本文描述的凝结组合物由本文定义的凝血酶原激活剂组成，基本由本文定义的凝血酶原激活剂组成或包含本文定义的凝血酶原激活剂。
如上文陈述以及本说明书中其他地方的相似的陈述中所用的，术语“包含”(以及类似的)意指凝结混合物包括凝血酶原激活剂并且还可包括任何一种或多种另外的组分。因此，凝血酶原激活剂是强制性组分而任何其他组分是任选的并且可以存在或可以不存在。其他的组分可包括例如一种或多种辅因子、一种或多种表面活性剂和/或一种或多种另外的凝结剂。
如上文陈述以及本说明书中其他地方的相似的陈述中所用的，术语“基本由……组成”(以及类似的)意指凝结混合物包括凝血酶原激活剂并且还可包括任何一种或多种另外的组分，条件是这些组分不会干扰或促进凝血酶原激活剂的活性或行为。因此，凝血酶原激活剂是强制性组分而任何其他组分是任选的并且可以存在或可以不存在，取决于它们是否影响凝血酶原激活剂的活性或行为。
如上文陈述以及本说明书中其他地方的相似的陈述中所用的，术语“由……组成”(以及类似的)意指凝结混合物包括并且限于凝血酶原激活剂。因此，词组“由……组成”表示凝血酶原激活剂是强制性组分而不可以存在其他组分(例如辅因子或凝结剂)。
因此，在某些实施方案中，所述凝结剂可包含蛇毒液，包括但不限于粗制蛇毒液。在某些实施方案中，所述凝结剂可包含通过蛇毒液的部分或完全纯化制备的凝血酶原激活剂的制剂。这样的制剂可通过本领域中已知的任何适合的方法制备，包括层析和凝胶过滤方法，包括本文和其他地方所描述的那些。在某些实施方案中，凝结组合物可包含纯化的凝血酶原激活剂或分离的凝血酶原激活剂。纯化和分离的凝血酶原激活剂可通过本领域中已知的任何适合的方法包括本文和其他地方描述的那些来制备。
5.1辅因子
本文所定义的凝血酶原激活剂将凝血酶原活化为凝血酶的能力可通过加入辅因子来改进，包括但不限于钙、磷脂和包含FVa活性的多肽。
5.2表面活性剂
适合的表面活性剂包括任何适合的表面活性剂，包括但不限于十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸铵、十二烷基醚硫酸钠(sodium laureth sulphate)和肉豆蔻醇聚醚硫酸钠(sodium myreth sulphate)。
5.3凝结剂
凝结剂或凝固剂可根据所激发的血液级联分类为内在凝结剂或外在凝结剂(参见例如美国专利6,686,204)。
适合的凝结剂包括但不限于硅藻土、无机硅酸盐微粒或颗粒、硅微粉、玻璃微粒、鞣花酸、凝血酶、肝素、促凝血酶原激酶、巴曲酶、hydroyapitite、高岭土、高岭土颗粒、凝血酶原(包括微粒化的凝血酶原)、血纤蛋白原和解聚的胶原蛋白
6.血清样品
如上文所讨论的，本发明部分依据在本文所定义的凝血酶原激活剂是适于制备适于检测分析物的血清样品的凝结剂的发现。适于检测分析物的血清样品是具有本文所讨论的适合的品质和/或在本文讨论的适合的时间内制备的。
6.1血清品质
制备适于检测分析物的血清样品的制备中的重要因素是凝结过程从血清除去血纤蛋白原的程度。含有残余的血纤蛋白原或部分降解的血纤蛋白原或作为不完全凝结的结果的血纤蛋白的血清可导致分析准确性问题，因为沉淀的形成(微凝块或串)，离心后和血清储存时潜在的凝结。因此，完全或基本完全的凝结在确保获得最高质量的血清和随后的结果精确度中是重要的。
因此，本发明的某些实施方案提供凝结组合物在用于检测分析物的血清的制备中的用途，所述凝结组合物包含凝血酶原激活剂、基本由凝血酶原激活剂组成或由凝血酶原激活剂组成，其中血清包含≤30μg/mL的血纤蛋白原或血纤蛋白原/血纤蛋白相关产品。在某些特定的实施方案中，血清包含≤25μg/mL、≤20μg/mL、≤15μg/mL、≤10μg/mL、≤8μg/mL或≤6μg/mL的血纤蛋白原或血纤蛋白原/血纤蛋白相关产物。
在某些实施方案中，血清包含≤30％、≤20％、≤10％、≤9％、≤8％、≤7％、≤6％、≤5％、≤4％、≤3％、≤2％、≤1％、≤0.5％、≤0.2％、≤0.1％的从其生产血清的原始样品中存在的血纤蛋白原或血纤蛋白原/血纤蛋白相关产物。
血纤蛋白原和/或血纤蛋白原/血纤蛋白相关产物的水平可通过本领域中已知的任何适合的方法检测，包括使用来自MP Biomedical的抗体和从NIBSC,Potters Bar,Hertsfordshire,London,UK购买的标准血纤蛋白原制剂的三明治免疫测定。
制备适于检测分析物的血清样品中另一个重要因素是凝结后残留在血清中的细胞或细胞碎片的活性或数目。细胞的存在在血清或血浆的储存和分析期间可具有两种影响。首先，细胞可以溶解，将细胞内含物(例如钾、乳酸脱氢酶)释放至血清或血浆中。这可导致离心后立即进行的测量和储存一段时间之后的测量之间的显著不同。第二，细胞继续代谢活性并且可消耗显著量的营养物(例如葡萄糖)并在储存时释放代谢产物(例如乳酸盐)。当样品来自健康参与者时，在样品被储存通常推荐的30分钟凝结时间时甚至可在多管样品中观察到变化。因此细胞污染的程度对于血清样品来说是至关重要的品质标准并且是使用血清超过血浆的重要优点。
因此，在某些实施方案中，血清样品包含少于其所被制备的血液样品中50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％的细胞。
在某些实施方案中，血清样品中包含经过24小时、12小时、8小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时或30分钟的时间段后<25％、<20％、<15％或<10％的乳酸脱氢酶活性或磷酸盐浓度(通常分别以U/L和mmol/L测量)的变化。在某些实施方案中，血清样品包含经过24小时、12小时、8小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时或30分钟的时间段(例如从制备血清样品的时间开始)后<5％、<4％、<3％、<2％、<1％、<0.5％或<0.1％的葡萄糖浓度或钾浓度(通常都以mmol/L测量)。测量乳酸脱氢酶活性的方法是本领域中熟知的，参见例如Dimeski,G.,et al.(2004)，其内容通过引用全文并入本文。
血清样品的血红蛋白浓度同样可用于确定血清样品是否适于检测分析物。因此，在某些实施方案中，血清样品包含<150mg/L、<100mg/L、<90mg/L、<80mg/L、<70mg/L、<60mg/L、<50mg/L、<40mg/L、<30mg/L、<20mg/L或<10mg/L的血红蛋白浓度。
6.2凝结时间
作为测试的样品，血清通常优于血浆，除非需要紧急结果并且因此血清管的凝结时间被认为过长时。延长凝结时间的另一个消极面是其可导致临床上显著的分析物浓度变化，归因于血液样品中的细胞活性，这一问题在白细胞增多中最显著。
因此，在某些实施方案中，本发明提供产生用于检测感兴趣的分析物的血清样品的方法，所述方法包括将血液样品与凝结组合物接触，所述凝结组合物包含本文定义的凝血酶原激活剂，基本由本文定义的凝血酶原激活剂组成或由本文定义的凝血酶原激活剂组成，其中血液样品在与凝结组合物接触开始25、20、15、10、8、6、5、4、3、2、1或0.5分钟内制备。
7.血液样品
如本文所讨论的，有提供适于从所有的血液样品生产血清样品的凝结组合物或包含将在适合的时间内凝结所有血液样品的凝结组合物的容器的需要。
期望进行测试的不同类型的血液样品的实例包括来自健康个体的血液、柠檬酸盐血液，加入EDTA的血液，来自处于抗凝结治疗例如肝素、华法林、柠檬酸盐或利伐沙班的患者、接受抗凝血剂包括阿司匹林的患者、血小板减少的患者(具有低血小板计数的患者)和患有延长的aPTT的患者。
在某些实施方案中，血液样品是全血液样品。在某些其他的实施方案中，血液样品是来源于全血样品的血清样品。在这一实例中示例性的血清样品包括其中需要较好质量的血清样品的血清样品，包括其中血纤蛋白原或血纤蛋白原/血纤蛋白相关产物的量和/或血清样品中细胞或细胞材料的量和/或血红蛋白的量被认为对于血清样品来说过高而不能成为适合检测分析物的样品。例如，血清样品可表现出微凝块或潜在的凝结。在某些其他的实施方案中，血液样品是来源于全血样品的血浆样品。例如，血浆样品可显示出微凝块或潜在的凝结。
8.检测分析物
在某些实施方案中，本发明还提供检测分析物的方法，所述方法包括为了感兴趣的分析物的存在或量分析通过本发明的方法制备的血清样品
在具体的实施方案中，通过本发明的方法制备的血清样品适于多于一种分析物，以便血清样品可被用于检测多于一种分析物。如本文所讨论的，临床医师常常期望在来自患者的血清样品上进行多于一种分析物测试而一个血清样品被用于至少20个测试或甚至更多，有时50-60或甚至70-80个测试并不寻常。本领域那些技术人员应当理解的是在具体的实施方案中本发明提供血清样品的生产，其中血清样品具有足够的体积和质量以使得所有期望的分析物测试能够在一个血清样品上进行。这样的优点在于从受试者采集的血液的体积和进行分析物测试所花费的时间都减少了。
示例性的分析物测试描述于下文。进行这些分析物测试的方法以多种方式进行并且是本领域中熟知的。
8.1钠(Na+)
这一测试测量血清和血浆样品中钠的量。钠在体内盐和水的平衡中起到重要作用。低钠水平可指示过多的水摄入、心脏衰竭、肾衰竭或归因于腹泻或呕吐的钠从身体的流失。高钠水平可只是过多的盐摄入或不足的水摄入。8.2钾(K+)
这一测试测量血清和血浆样品中钾的量。过高的钾的水平(高钾血)可以是肾病、糖尿病、酮酸中毒或降低从身体排泄的钾的量的药物的结果。过低的钾的水平(低钾血)可由脱水(例如来自腹泻或呕吐或过度出汗)而导致。钾的水平同样可以作为接受导致肾失去钾的药物例如利尿剂的结果而是低的。
在接受利尿剂和心脏药物的那些患者、患有高血压或肾病、紧急的酸中毒和碱中毒病况的那些和接受肾透析或静脉滴注疗法的那些中常常监测钾水平。
8.3氯化物(Cl-)
这些测试测量血清和血浆中的氯化物的量。通常测量氯化物以评估患者中电解质平衡。低氯化物和正常的钠可指示呕吐或胃液的流失。.
8.4碳酸氢盐(HCO3-)
这一测试测量血清或血浆中三种形式的二氧化碳(碳酸氢盐、碳酸和溶解的二氧化碳)的量。如果患者有呼吸问题那么常常进行这些测试。高水平的二氧化碳由某些疾病导致。包括慢性阻塞性肺疾病、肺气肿、肺炎、库欣综合征或酒精中毒症或呕吐。低水平可由某些疾病包括肺炎、肝硬化、通气过度、糖尿病、脱水、肾衰竭或心脏衰竭导致。
8.5葡萄糖(Gluc)
这一测试测量血清或血浆中葡萄糖的量。经常在表现出高血糖(血糖过高)或血糖过低症状的那些患者、怀孕的那些、患有糖尿病的那些中测试葡萄糖水平，.
8.6尿素(Urea)
这一测试测量血清或血浆中尿素的量。这一测试可帮助评估肾功能并且监测透析的有效性。
肌酸酐(Creat)
这一测试测量血清或血浆中肌酸酐的量。这一测试在帮助评估肾功能并监测对肾疾病的治疗中是关键的。
尿酸盐(Urate)
这一测试测量血清或血浆中尿酸盐(或尿酸)的量。高尿酸水平可能是痛风的预兆。在经历化疗或放疗的肿瘤患者中同样监测尿酸水平以检测肿瘤溶解综合征。
总蛋白(TP或T Prot)
这一测试测量血清或血浆中蛋白的总量。虽然总蛋白检测的结果并不能指示特定的疾病，但高或低蛋白水平往往指示着需要额外的测试来确定是否有问题。总蛋白测试经常被用来筛选某些肝脏疾病，肾脏疾病，多发性骨髓瘤和水合状态。
白蛋白(Alb)
这一测试测量血清或血浆中白蛋白的量。常常测量白蛋白水平以筛选肝或肾疾病或评价营养状况，特别是在住院的病人中。
总胆红素(T Bili)
这一测试测量血清或血浆中胆红素的量。测量胆红素水平以筛选和监测肝脏障碍例如黄疸或肝脏疾病例如肝硬化。也在婴儿中测量胆红素水平来帮助检测某些罕见的遗传性疾病并避免患有黄疸的婴儿中的脑损伤。
碱性磷酸酶(ALP)
这一测试测量血清或血浆中碱性磷酸酶的量。通常进行这种测试筛选肝肝脏障碍或骨疾病或监测肝脏障碍或骨疾病的治疗。
γ-谷氨酰转移酶(GGT)
这一测试测量血清或血浆中γ-谷氨酰转移酶的量。这个测试是用来筛选肝脏疾病和酒精滥用。它也可以被用来确定碱性磷酸酶水平升高是否归因于肝脏疾病或骨疾病。
丙氨酸氨基转移酶(ALT)
这一测试测量血清或血浆中丙氨酸氨基转移酶的量。这个测试被用来筛选肝脏疾病。
天冬氨酸转氨酶(AST)
这一测试测量血清或血浆中天冬氨酸转氨酶的量。这个测试被用来检测肝损伤，肌肉损伤和所述酶在许多器官和组织细胞中存在的其他病况。
乳酸脱氢酶(LD)
这一测试测量检测血清或血浆中乳酸脱氢酶量。这个测试通常被用来确定在体内组织损伤，组织局部缺血，的原因和位置并监测其进展。
肌酸激酶(CK)
这一测试测量血清或血浆中肌酸激酶的量。在胸痛或肌肉疼痛或虚弱的病人中测量肌酸激酶以测定他们是否有心脏病发作和身体中的其他肌肉是否已被损害。
总钙量(TCa)
这一测试测量血清或血浆中钙的量。常常在患有肾疾病、骨疾病或神经疾病的患者或当存在具有显著提高或降低的钙的症状时测量钙水平。
磷酸盐(Pi或Phos)
这一测试测量血清或血浆中的磷酸盐的量。磷酸盐水平可以在随访时测量被测量为不正常的钙水平的测试结果。也在患有肾疾病，未控制的糖尿病，或病人在接受钙或磷酸盐补充剂时的病人中测量磷酸盐水平。
镁(Mg2+)
这一测试测量血清或血浆中的镁的量。如果病人有过多或过少的镁的症状，包括虚弱、易激惹、心律失常、恶心或腹，则可进行这一测试。如果已经检测到异常的钙或钾水平，也可测量镁水平。
脂肪酶(Lipase)
这一测试测量血清或血浆中脂肪酶的量。这个测试通常被用于诊断胰腺炎或其他胰腺疾病。
胆固醇(Chol)
这一测试测量血清或血浆中胆固醇的量。测量胆固醇水平以筛选发展心脏病的风险。
甘油三酸脂(Trig)
这一测试测量血清或血浆中甘油三酸酯的量。如同胆固醇水平，这一测试通常被用来筛选发展心脏病的风险。
高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C或HDL)
这一测试测量血清或血浆中HDL胆固醇的量。这个测试通常被用来确定发展心脏疾病的风险。
铁(Fe2+)
这一测试测量血清或血浆中铁的量。测量铁以检查病人是否有低或高铁水平。低的铁水平会导致贫血并且通常是归因于长期或大量出血，妊娠或快速生长(儿童)。高铁水平可能是由于遗传因素或大量输血。
转铁蛋白(Trf)
这一测试测量血清或血浆中转铁蛋白的量。转铁蛋白是一种血浆蛋白，其将铁通过血液转运到肝脏、脾脏和骨髓。因此，测试血转铁蛋白水平以确定贫血的原因，检查铁代谢(例如，在缺铁性贫血中)并确定血液携带铁的能力。
C反应蛋白(CRP)
这一测试测量血清或血浆中C反应蛋白的量。这个测试被用来确定炎症的存在以确定其严重程度并监测对治疗的反应。
皮质醇(Cortisol)
这一测试测量血清或血浆中皮质醇的量。测量皮质醇水平以帮助诊断库欣氏综合征或艾迪生病。
游离甲状腺素(fT4)
这一测试测量血清或血浆中游离甲状腺素的量。这个测试通常被用于诊断甲状腺功能减退或甲状腺功能亢进。
Thyroid Stimulating Hormone(TSH)
这一测试测量血清或血浆中促甲状腺激素的量。这个测试通常被用来筛选，诊断和监测甲状腺疾病。
铁蛋白
这个测试被用来测定血清或血浆中的铁蛋白。低铁蛋白水平表明铁缺乏。升高的水平指示铁过载例如在血色病中(haematochromatosis)。
肌钙蛋白(TnI)
这一测试测量血清或血浆中肌钙蛋白的量。这个测试通常被用于患有胸痛的患者以确定病人是否有心肌损害。
溶血指数
溶血指数测试测量红细胞溶解的程度。溶血是生物化学实验室中遇到的最常见的干扰。测试主要是用于检测体外溶血和样品是否适合报告某些或所有分析物以及溶血性贫血(遗传性球形红细胞增多症、自发性溶血、RBC酶缺乏)的检测中。溶血或溶血指数(血清或血浆中游离血红蛋白的浓度)目前由所有普通化学分析者来估计。然后将所述值用作确定哪种分析物可在什么溶血水平受到影响或不被报道。
黄疸指数
黄疸指数测试通过纯粹的分光光度法返回指示检测样本中胆红素相对水平的值。其被用来确定样品对于报告某些分析物的适应度和在罕见的总胆红素光度估计方法受到干扰的实例中交叉检查胆红素结果的精确度。黄疸指数已显示在检测癌症副蛋白对Roche总胆红素方法(Sheppard et al.,2005)的干扰(沉淀和假的高总胆红素)中具有价值，其中黄疸指数保持不受影响。如Dimeski et al.,2008中讨论的，胆红素可以在高浓度(例如>200μM/L)干扰肌酐检测。
血脂指数
血脂指数已被用来预测由于血脂的对检测可能的干扰。.
9.诊断方法
本发明还提供在受试者中诊断疾病或病况的存在、不存在或严重度的方法。其中所述疾病或病况的存在、不存在或严重度与受试者中感兴趣的分析物的存在、不存在或量有关。这些方法通常包括提供根据上文广义描述的方法制备血清样品并且检测血清样品中所述分析物的存在、不存在或量以由此确定所述受试者中诊断所述疾病或病况的存在、不存在或严重度。
在某些实施方案还总，本发明的方法包括将所述分析物测试的结果与参照结果比较以便获得诊断。
疾病或病况可以是可使用血清样品诊断的任何适合的疾病或病况，包括但不限于与不同分析物测试有关的上文概略描述的疾病或病况。
在某些实施方案中，所述方法可包括诊断受试者中之前不存在疾病或病况的存在或不存在。在其他实施方案中，所述方法可包括诊断所述受试者之前已经存在的疾病或病况的存在、不存在或严重度。所述方法可包括参照在较早的时间从受试者获得的结果。可选择地，参照结果可以是标准的分析参照。.
在某些实施方案中，所述方法在测试机构例如病理学实验室中进行。在某些其他的实施方案中，所述方法是即时方法。如本文所用的。“即时方法”意指所述方法在病人保健处或附近进行。即时方法在医院和存在获得快速结果需要的其他环境下正在变得普遍并且常常通过使用可运输的、便携的和手提式仪器和测试试剂盒来完成。
即时测试的优点包括在医院中在床旁获得迅速的分析结果的能力，尤其是在紧急情况下以及在家或在医生手术室获得分析结果的能力(例如使用通过皮肤穿刺获得的毛细血管血的微滴)
目前市场上可得的用于即时装置的装置包括Siemens出售的免疫测试分析仪，称作Siemens’DCA Vantage Analyzer；Millenium Biotechnology,Inc出售的Retro-STATUSHIV/CD4 350快速检测装置，其被用于同时测定患者的HIV感染状况以及他们目前的免疫状况；以及Alere International出售的Triage PLGF测试，其用于检测早期发作的先兆子痫。
10.研究工具
本发明同样预期使用根据本发明生产的血清样品的研究工具的用途。这些方法通常包括提供根据上文广义描述的方法制备的血清样品并将所述血清样品用于研究工具研究，包括但不限于基因组学、蛋白组学、代谢组学、系统生物学、分子成像或检测研究。
适合的研究工具是本领域中熟知的并且包括Scaros,O.et al.,2005中描述的那些，其全部内容通过引用并如本文。基因组学包括研究就治疗而言的遗传学和基因表达模式之间的相关性的药物基因组学。蛋白组学使得可以分析系统中蛋白的丰度和分布。代谢组学或生物化学概况是对系统中代谢物的研究。系统生物学将整个生物系统看作一个功能单位，产生可有可能预测所述系统将如何应对刺激的行为模式。分子成像技术具有证明特定分子靶的水平和该靶的体内功能状态的能力并且可被用作诊断方法。
为了容易理解本发明并产生实际效果，特别优选的实施方案现在将通过下列非限制性实例的方式来描述。
实施例
实施例1:来自蛇毒液的凝血酶原激活剂的纯化和表征
实施例1a：来自锯鳞蝰毒液的蛇静脉酶、carinactivase-1和carinactivase-2的 纯化和表征
这一实施例描述了来自锯鳞蝰毒液的称作蛇静脉酶的组A凝血酶原激活剂和称为carinactivase-1(CA-1)和carinactivase-2(CA-2)的两个组B凝血酶原激活剂的纯化和表征。
将冷冻干燥的锯鳞蝰毒液(157mg；Sigma Chemical Co,USA；cat no.V8250)溶于8mL的0.05M Tris-HCl pH 8.0缓冲液中并静置以使其溶解30分钟并且之后离心(1000g和10分钟)除去不溶解的材料。将7.7mL体积重构的澄清溶液上样至Superdex 200凝胶过滤层析柱(cat no 17-1043-02)(2.5x 95cm)GE Healthcare Bio-Sciences,Sweden)上，使用相同的缓冲液洗脱。柱流速为20mL/hr并收集4mL的级分(15分钟级分)。如下文中更详细地描述的用正常的柠檬酸盐血浆通过它们的凝结活性测定活性级分。显示凝血酶原激活剂活性的混合的级分含有总共100mL，具有总公共28.3个单位的A280。图1显示如上文所述的使用Superdex 200柱上的凝胶过滤从锯鳞蝰毒液分离蛇静脉酶carinactivase-1,和carinactivase-2的洗脱概况。在图1中用条表示三种凝血酶原激活剂(蛇静脉酶、carinactivase-1,和carinactivase-2)的混合的级分。
将这些混合的级分立即应用于用相同的0.05M Tris-HCl缓冲液pH 8.0预平衡的Blue Sepharose(2.0x 12cm)(Cibacron Blue 3G attached to Sepharose 6Fast Flow；cat no.17-0948-01)(GE Healthcare Bio-Sciences,Sweden)的柱。用约2个柱体积的初始缓冲液清洗后，用溶于相同缓冲液的线性梯度的NaCl(0-1.0M；每烧杯200mL)洗脱结合的材料。在未结合的级分中回收Carinactivase-1并且分别以0.2和0.5M NaCl洗脱carinactivase-2和蛇静脉酶。在如下文更详细描述的通过正常的柠檬酸盐血浆凝结测定存在30mM钙和不存在另外的钙的条件下确定血酶原激活剂活性。具有特定的凝血酶原激活剂活性的级分(每个3mL)通过它们各自的凝结时间的特定的凝结活性混合，之后使用YM 10膜在Amicon搅拌釜浓缩器模型第42号中浓缩至1mg/mL。所有的层析在4℃使用Gilson蠕动泵使用设置在所需的流速的黑紫色室和设置在280nm的两个衰减的Altex双波长UV检测仪和使用基于时间的级分收集的LKB 7000ULTRORAC级分收集器进行。图2显示这一BlueSepharose层析的洗脱概况且条指示carinactivase-1、carinactivase-2和蛇静脉酶的洗脱概况。所获得的级分于4℃-20℃储存于缓冲液中或于-20℃储存于50％甘油缓冲液中。除了另外说明的以外，这些含有凝血酶原激活剂的级分(制剂)被用于所有后续试验。
使用Masci et al.,1988所描述的方法测定凝血酶原激活剂活性。基本上，这一测定方法包括如Austen,D.E.,et al.1975所描述的使用Hyland-Clotek设备进行的凝结测定。新鲜混合的来自正常志愿者的柠檬酸盐血浆被用于每组实验。基于Kini,R.M.,2005中所定义组A和组B凝血酶原激活剂标准进行这些制剂的凝结时间测定。所述测定在钙(30mMCa2+)存在的条件下进行以确定组B凝血酶原活性剂(carinactivase-1和carinactivase-2)和在不存在加入的钙的情况下进行以确定组A凝血酶原激活剂(蛇静脉酶)。对肽对硝基苯胺S-223的水解活性，测量经由凝血酶原激活剂的凝血酶生成的形成，通过于25℃在分光光度计(Hitachi U2800)的隔室中0.90mL的0.02M Tris-HCl缓冲液，pH 7.4，具有或不具有10mM CaC12以及100μL的S-2238(3mM溶于水)平衡来确定。通过向凝血酶原(250nM)加入25μL等份的凝血酶原激活剂制剂来起始反应并且在405nm测量对硝基苯胺的释放。一个单位的活性相当于水解1pmol的底物/分钟。以相同的方式进行使用其他肽硝基苯胺作为底物的测定，以100μM的最终浓度。
实施例1b：来自东部拟眼镜蛇毒液的PtPA和来自太攀蛇毒液的OsPA的纯化和表征
这一实施例描述来自东部拟眼镜蛇和太攀蛇的毒液的组C凝血酶原激活剂的纯化和表征。这些凝血酶原激活剂分别缩写为PtPA和OsPA。
将冷冻干燥的东部拟眼镜蛇毒液重构于具有pH 7.4的0.05M Tris-HCl中。图3提供了重构的东部拟眼镜蛇毒液在Sephracryl S-300柱上于0.05M Tris-HCl缓冲液pH7.4中的洗脱概况。‘A’是指空隙体积而‘B’表示PtPA的洗脱位置(Ve)，其在这一柱上位250mL并且相当于约250kDa的分子量。‘B’下280nm(A280)的吸收代表应用于柱的总A280单位的40％。使用太攀蛇毒液的相似的凝胶过滤实验显示250kDa峰(相应于凝血酶原激活剂)中洗脱上样的总A280的大约10％。
使用0.05M Tris-HCl，pH 7.4中的Con A-Sepharose 4B的亲和层析被用于纯化来自粗制东部拟眼镜蛇和太攀蛇毒液的凝血酶原激活剂。洗脱缓冲液为具有0.01％叠氮化钠的0.2M甲基α-D-吡喃甘露糖苷。Con A-Sepharos上对PtPA的洗脱概况示于图4中。箭头指示洗脱缓冲液的应用并且“a”指示所收集的提供凝血酶原激活剂的级分。图5显示pH8.6的非变性PAGE的结果。来自图4的峰“a”显示每道25μg(A)和50μg(B)上样的主要的蛋白条带和痕量最小条带。将250kDa条带从并行实验的凝胶上切下并且显示具有对显色底物S-2222的因子Xa样活性，证实其确定为PtPA(图6)。从OsPA获得相似的洗脱模式。
进一步通过β-巯基乙醇存在(标为“red”)或不存在(标为“unred”)的情况下的SDS-PAGE表征PtPA和OsPA。明显的是PtPA和OsPA两者的代表组分多肽链的条带都存在。
除了以其他方式表明之外，根据本方法制备的含有PtPA和OsPA的制剂被用于所有随后的实验中。
实施例1c：来自虎蛇毒液的notecarin的纯化和表征
以与上文实施例1b中所描述的用于组C凝血酶原激活剂的相似的方式使用Sephacryl S-300凝胶过滤层析(5.0x 9.5cm)从虎蛇的毒液纯化称为notecarin的组D凝血酶原活性剂。洗脱概况示于图8中，其中“PA”是指含有notecarin的级分。
根据本方法制备的含有Notecarin的制剂被用于所有随后的实验，除了以其他方式表明之外。
实施例1d：carinactivase-1、carinactivase-2、蛇静脉酶、PtPA、OsPA和 notecarin的进一步的表征
如下进一步表征实施例1a、1b和1c中制备的凝血酶原活性剂。
在pH8.9进行凝血酶原、α-凝血酶原和凝血酶原激活剂的非变性PAGE并且结果示于图9，其中标记如下：(I)凝血酶原；(II)α-凝血酶原；(III)蛇静脉酶；(IV)carinactivase-1；(V)carinactivase-2；(VI)PtPA；(VII)OsPA；(VIII)notecarin(每种凝血酶原激活剂上样20μg)。
凝血酶原激活剂制剂还通过存在(图10)和不存在(图11)β-巯基乙醇时的SDS-PAGE来表征。在每幅图中，各道如下：(1)carinactivase-1；(2)carinactivase-2；(3)蛇静脉酶；(4)PtPA；(5)OsPA；(6)notecarin；(7)凝血酶；和(M)分子量标记。道(4)中含有PtPA的样品和道(5)中含有OsPA的样品与用于图7中所示的结果的相同。
SDS-PAGE显示在每个实例中蛋白条带存在于预期区域中而且制剂是不均匀的。使用1mg/mL溶液具有1的A280的关系计算凝血酶原激活剂制剂的蛋白浓度而通过将蛋白浓度除以分子量的文献值计算摩尔浓度。因此本文描述的随后的使用这些制剂的实验中引用的摩尔浓度是上界估计，因为制剂不是均匀的。
实施例2:凝血酶原经由凝血酶原激活剂向凝血酶的转化
实施例2a：五分钟孵育期
这一实验的目的在于确定实施例1中制备的来自蛇毒液的六种不同凝血酶原激活剂，即含有蛇静脉酶、carinactivase-1、carinactivase-2、PtPA、OsPA和notecarin的制剂，在于室温孵育5分钟后将多少凝血酶原转化为凝血酶，
如下进行实验。
制备20mM HEPES缓冲液pH 7.4、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.05％surfactant p20。
通过用蒸馏水1/50稀释纯化的人类凝血酶原的储存液(17.8mg/mL；#HCP-0200；HTI,USA)制备溶于0.05M Tris-HCl pH 7.4的人类凝血酶原溶液以提供0.36mg/mL的工作液，提供72μg/mL或0.99μM的管中的终浓度。使用0.36mg/L凝血酶原溶液用于凝胶上样。
将如较早的描述所制备的凝血酶原激活剂制剂的储存液稀释提供6nM的终浓度。
将储存液α-凝血酶(10mg/mL,#HCT-0020；HTI,USA)用含有0.01％Tween20的蒸馏水稀释(1/30)以提供用于在SDS-PAGE凝胶上上样的0.33mg/L的工作凝血酶溶液。
制备具有表3中所示的体积的样品并且于室温孵育五分钟。
表3：用于孵育的每个样品的体积
样品 1 2 3 4 5 6 7 8
HEPES缓冲液(μL) 80 60 60 60 60 60 60 80
凝血酶原(μL) 20 20 20 20 20 20 20 0
凝血酶原激活剂 0 50 50 50 50 50 50 0
α-凝血酶(μL) 0 0 0 0 0 0 0 20
总体积(μL) 100 100 100 100 100 100 100 100
上文样品中的凝血酶原激活剂如下：(1)无凝血酶原激活剂(仅人凝血酶原溶于缓冲液)；(2)carinactivase-1；(3)carinactivase-2；(4)蛇静脉酶；(5)PtPA；(6)OsPA；(7)notecarin；和(8)高度纯化的α-凝血酶(无凝血酶原激活剂)。
所用的SDS PAGE是nUView Precast Mini Gels(#NB10-420,4-20％)，以及运行缓冲液Tris-Glycine(#BG-143)。获得样品缓冲液(#BG-145)(NuSEP,Australia)(即非还原的样品缓冲液)并且制备具有5％β-巯基乙醇(#44143,BDH,UK)的样品缓冲液的还原的样品缓冲液。
五分钟孵育之后，来自每种样品40μL等份被转移至相等体积的非还原样品缓冲液或还原性样品缓冲液中。之后将样品在加热块中于100℃孵育10分钟。将每种样品的25μL等份和12μL的预先染色的分子量标记(#SM0671Page Ruler Prestained Protein Ladder,Fermentas,Hanover,MD,USA)上样于凝胶上。使用Mini-Protein II Cell PAGE设备(Bio-Rad)于100V运行凝胶直到前端染料到达凝胶的低端。将凝胶用Commassie Brilliant BlueG(#B-0770，Sigma)(0.25％w/vCommassie Brilliant Blue G，45％甲醇，10％乙酸)染色，并且通过脱色液(45％甲醇,45％水和10％乙酸)除去过量的染料。
结果示于图12，其中图12A显示使用没有β-巯基乙醇的样品缓冲液(非还原性样品缓冲液)的SDS-PAGE凝胶而图12B显示使用含有5％β-巯基乙醇的样品缓冲液(还原性样品缓冲液)的SDS-PAGE凝胶。上文图3中所用的样品编号与图12中凝胶中的道编号相同，并且“m”代表分子量标记。
这一实验显示在五分钟内凝血酶原通过PtPA和OsPA完全转化为凝血酶，但是在这些条件下其他的凝血酶原激活剂制剂转化得非常少。
实施例2b：经由PtPA和经由notecarin的转化的时间过程
确定经由PtPA和经由notecarin将凝血酶原(14μM)转化为凝血酶的时间过程并且SDS-page凝胶结果示于图13中，其中每道根据下文图4中所示的孵育时间编码，使用与实施例2a相似的方法。
表4：图13中所示的每道的孵育时间。
Figure GDA0001572940870000541
Figure GDA0001572940870000551
这些结果显示在将凝血酶原转化为凝血酶上PtPA比notecarin更有效，但是notecarin将在较长的反应时间后仍获得凝血酶原的完全剪切。
实施例2c：从实施例2b结果选择的条带的N末端测序
将从实施例2b中的SDS-PAGE结果选择的条带，通过PtPA和notecarin对凝血酶原的作用(即凝血酶原断裂为凝血酶)产生的，洗脱并经历使用质谱分析的N末端测序以便确定特定的分子结构域。这些结果示于图14中。如具有相应于α凝血酶重链的N末端序列IVEGSDA的主要条带显示的，SDS-PAGE N末端测序证实凝血酶原通过PtPA和notecarin转化为α凝血酶。
实施例2d：通过动力学分析产生的凝血酶评估
设计这一实验以通过动力学分析的方式确定通过凝血酶原激活剂中的每一种:蛇静脉酶；carinactivase-1；carinactivase-2；PtPA；OsPA和notecarin以0.6nM的浓度生产的凝血酶的量。
对含有不同浓度的凝血酶的样品和含有上文所列的凝血酶原激活剂中的一种的样品，在405nm持续监测从显色凝血酶底物S-2238产生的对硝基苯胺(pNA)的吸收。
对于凝血酶研究，每个试管含有50μL的S-2238底物(134μM)，50μL不同浓度的凝血酶(0.25-30nM的范围)和900μL的HEPES缓冲液。图15显示通过图16中所示的用于产生标准曲线的凝血酶原的S-2238水解的发展曲线。
对于凝血酶原激活剂的研究，每个试管含有50μL的凝血酶原(247nM)、10μL(0.6nM)的凝血酶原激活剂(蛇静脉酶、carinactivase-1、carinactivase-2、PtPA、OsPA或notecarin)，100μL(267μM)S-2238底物和840μL的HEPES缓冲液。在155秒确定每种凝血酶原活性剂的反应斜率并且从图16中的标准曲线读取155秒时产生的凝血酶的量，如图12和表5中所示。
表5：通过0.6nM的凝血酶原激活剂经过155秒产生的凝血酶的量。
Figure GDA0001572940870000552
Figure GDA0001572940870000561
所有凝血酶原激活剂制剂如所期望的产生凝血酶，但是再一次，PtPA和OsPA是最有效的。
这些结果表明，组C凝血酶原活性剂(PtPA和OsPA)在将凝血酶原水解为凝血酶上是最有效的酶。这通过所形成的能够水解S-2238底物以形成有色产物pNA的凝血酶的量来证实。其次最有效的凝血酶原激活剂是蛇静脉酶，其显示其水解～4％的S-2238，之后是carinactivase-2(2.5％)然后是carinactivase-1而最后的notecarin(<1％)为这一纯化系统中最不有效的凝血酶原活性剂。组D凝血酶原激活剂(例如notecarin)需要因子Va、钙和磷脂，其在所述系统中不存在，但是所有都存在于血液中。
实施例2e：经由凝血酶原激活剂从凝血酶生成凝血酶的比较率的动力学研究设计这一实验以确定通过凝血酶原激活剂制剂中的每一种从纯的凝血酶原生成的凝血酶形成的速度。
每个试管含有50μL额凝血酶原(247nM)、10μL的不同的凝血酶原激活剂、100μL(267μM)的S-2238底物和840μL的HEPES缓冲液。
于范围从0.006-6nM的3-5个不同浓度测定每种凝血酶原激活剂的S-2238水解(凝血酶活性)的进行曲线。使用DynaFit 4.04.64Enzyme Kinetic Data Analysis Software(BioKin Ltd,Watertown,MA,USA)(Kuzmic,P.,1996)分析数据。
拟合分析的凝血酶催化的S-2238水解曲线示于图18中。
之后如下计算动力学参数：
模型:B→B+pNA+P(S-2238的凝血酶水解的假定一阶速率常数),其中:
B＝凝血酶；
pNA＝对硝基苯胺；
P＝抑制生产；和
S-2238是过量的并且因此不包括在反应中。
微分方程如下：
d[B]/dt＝-kb[B]+kb[B]；
d[pNA]/dt＝+kb[B]；和
d[P]/dt＝+kb[B].
表6显示估计的凝血酶的动力学参数。
表6：估计的凝血酶的动力学参数
单位 参数 初始 拟合 CV％
s<sup>-1</sup> kb 61.3(Sonder,et al.,1986) 66.2 0.4
凝血酶原激活剂速率常数的评估：:
模型:
A+Z→A+B:ka(凝血酶原活化的二阶速率常数)；
B→B+pNA+P:kb；其中
A＝凝血酶原激活剂.
微分方程如下：
d[A]/dt＝-ka[A][Z]+ka[A][Z]；
d[Z]/dt＝-ka[A][Z]；
d[B]/dt＝+ka[A][Z]-kb[B]+kb[B]；
d[pNA]/dt＝+kb[B]；和
d[P]/dt＝+kb[B].
评估PtPA的动力学参数并且示于表7中。
Table 7:评估的PtPA动力学参数
单位 参数 初始 拟合 CV％
s<sup>-1</sup> kb 66.2
s<sup>-1</sup>nM<sup>-1</sup> ka 0.001 6.722e-4 1.8
s<sup>-1</sup>M<sup>-1</sup> ka 6.72x 10<sup>5</sup> 1.8
凝血酶生成速率：
＝ka(s-1M-1)x 60(s)x 10-6
＝40.3μM凝血酶/min/M凝血酶原/M激活剂
＝40.3nmol凝血酶/mL/min/μmol凝血酶原/μmol激活剂
表19将凝血酶原的活化作图，证明不同PtPA浓度(0.006-0.24nM)与凝血酶原哦以及所生成的凝血酶与显色底物S-2238的反应速率，以及对凝血酶原的PtPA活化的最佳拟合曲线。虚线是实验性的结果而实线是按照最佳拟合计算的那些。这些实验性和计算的发展曲线显示良好的一致性。
之后评估OsPA的动力学参数并且之后示于表8。
表8：OsPA的评估的动力学参数
单位 参数 初始 拟合 CV％
s<sup>-1</sup> kb 66.2
s<sup>-1</sup>nM<sup>-1</sup> ka 0.001 7.325e-4 3.3
s<sup>-1</sup>M<sup>-1</sup> ka 7.33x 10<sup>5</sup> 3.3
凝血酶生成的速率：
＝44.0nmol凝血酶/mL/min/μmol凝血酶原/μmol激活剂
图20将凝血酶原的OsPA活化作图，证明不同OsPA浓度(0.006-0.24nM)与凝血酶原的以及所生成的凝血酶与显色底物S-2238的反应速率，以及对凝血酶原的OsPA活化的最佳拟合曲线。虚线是实验性的结果而实线是按照最佳拟合计算的那些。这些实验性和计算的发展曲线显示良好的一致性。
之后评估蛇静脉酶的动力学参数并且之后示于表9。
表9：评估的蛇静脉酶的动力学参数
单位 参数 初始 拟合 CV％
s<sup>-1</sup> kb 66.2
s<sup>-1</sup>nM<sup>-1</sup> ka 0.001 4.607e-005 1.2
s<sup>-1</sup>M<sup>-1</sup> ka 4.61x 10<sup>4</sup> 1.2
凝血酶生成的速率：
＝2.76μM凝血酶/min/μM凝血酶原/μM激活剂
＝2.76nmol凝血酶/mL/min/μmol凝血酶原/μmol激活剂
图21将凝血酶原的蛇静脉酶活化作图，证明不同蛇静脉酶浓度(0.24-1.2nM)与凝血酶原的以及所生成的凝血酶与显色底物S-2238的反应速率，以及对凝血酶原的蛇静脉酶活化的最佳拟合曲线。虚线是实验性的结果而实线是按照最佳拟合计算的那些。这些实验性和计算的发展曲线显示良好的一致性。
之后评估carinactivase-1的动力学参数并且之后示于表10。
表10：评估的carinactivase-1的动力学参数
Figure GDA0001572940870000581
Figure GDA0001572940870000591
凝血酶生成的速率：
＝0.24μM凝血酶/min/μM凝血酶原/μM激活剂
＝0.24nmol凝血酶/mL/min/μmol凝血酶原/μmol激活剂
图22将凝血酶原的carinactivase-1活化作图，不同证明carinactivase-1浓度(0.24-1.2nM)与凝血酶原的以及所生成的凝血酶与显色底物S-2238的反应速率，以及对凝血酶原的carinactivase-1活化的最佳拟合曲线。虚线是实验性的结果而实线是按照最佳拟合计算的那些。这些实验性和计算的发展曲线显示良好的一致性。
之后评估carinactivase-2的动力学参数并且之后示于表11。
表11：评估的carinactivase-2的动力学参数
单位 参数 初始 拟合 CV％
s<sup>-1</sup> kb 66.2
s<sup>-1</sup>nM<sup>-1</sup> ka 0.001 3.183e-005 1.8
s<sup>-1</sup>M<sup>-1</sup> ka 3.18x 10<sup>4</sup> 1.8
凝血酶生成的速率：
＝1.91μM凝血酶/min/μM凝血酶原/μM激活剂
＝1.91nmol凝血酶/mL/min/μmol凝血酶原/μmol激活剂
图23将凝血酶原的carinactivase-2活化作图，证明不同carinactivase-2浓度(0.24-1.2nM)与凝血酶原以及所生成的凝血酶与显色底物S-2238的反应速率，以及对凝血酶原的carinactivase-2活化的最佳拟合曲线。虚线是实验性的结果而实线是按照最佳拟合计算的那些。这些实验性和计算的发展曲线显示良好的一致性。
之后评估notecarin的动力学参数并且之后示于表12。
表12：评估的notecarin的动力学参数
Figure GDA0001572940870000592
Figure GDA0001572940870000601
凝血酶生成的速率：
＝0.043μM凝血酶/min/μM凝血酶原/μM激活剂；
＝0.043nmol凝血酶/mL/min/μmol凝血酶原/μmol激活剂.
图24将凝血酶原的notecarin活化作图，证明不同notecarin浓度(0.24-6.0nM)与凝血酶原的以及所生成的凝血酶与显色底物S-2238的反应速率，以及对凝血酶原的notecarin活化的最佳拟合曲线。虚线是实验性的结果而实线是按照最佳拟合计算的那些。这些实验性和计算的发展曲线显示良好的一致性。
凝血酶原激活剂中的每一种的评估的活化速率常数和凝血酶生成速率的概括提供于表13中。
表13：对不同凝血酶原激活剂所评估的活化速率常数和凝血酶生成速率的概括
Figure GDA0001572940870000602
不同的凝血酶原激活剂和凝血酶底物S-2238之间没有反应，凝血酶原与S-2238之间也没有任何反应。活化速率数据常数证实组C凝血酶原激活剂(PtPA和OsPA)在将凝血酶原水解为凝血酶上是最有力的。事实上，它们比蛇静脉酶和carinactivase-2更加有效超过20倍，比carinactivase-1更加有效超过200倍而和比notecarin更加有效大约1000倍。所评估的凝血酶生成速率同样地显示相同的有效率，组C激活剂能够生成最大量的凝血酶，之后是蛇静脉酶、carinactivase-2、carinactivase-1而notecarin是最无效的。如实施例2d中所注意到的，notecarin的活性需要辅因子。
下列实施例中所用的材料和方法
当在下列实施例中指示时，使用了下列材料和方法。
(A)用于制备样品的容器
用于制备血清样品或血浆样品的典型的容器(例如管)包含：(1)离心期间将细胞(以及血清实例中的凝块)从血浆或血清分离并确保没有后续的再次混合的凝胶屏障；(2)包被内壁的表面活性剂以阻止细胞和蛋白粘附在管壁上以将随后的细胞溶解最小化；和(3)用于制备血清样品的增强凝结过程的前凝血剂(例如二氧化硅颗粒)或用于制备血浆样品的抗凝结剂(例如肝素钠、柠檬酸盐或EDTA)。
在实施例中，如下文所示的许多商业上可获得的管被用于制备血清样品或血浆样品。
Greiner VacuetteTM血浆管。这是由Greiner以参考号456083提供的血浆分离器。管的内壁包被起到抗凝结剂作用的喷雾干燥的肝素锂(89IU)。管还包含管底部的分离胶。Greiner声称这一凝胶起到在血浆和血细胞中形成稳定屏障的作用，使得参数能够保持稳定直到48小时。满载体积是5.0mL。
Becton Dickinson(BD)VacutainerTM血浆管(BD PST II)。这是BD以参考号367375提供的血浆分离管。每只管含有77IU/mL作为抗凝结剂的肝素锂(0.2-1.0mg)。所述管含有离心过程中形成细胞和血浆之间的屏障的丙烯酸凝胶(0.8-1.9g)。BD声称这一凝胶提供由血纤蛋白以及可测量的白细胞、红细胞和血小板的减少证实的增加的血浆纯度以及增强的分析物稳定度(因为大多数分析物在所述管中于25℃稳定24小时)。满载体积是4.0mL。
Greiner VacuetteTM血清管。这种管是由Greiner以参考号456078提供的。该管含有作为凝结激活剂的二氧化硅颗粒。满载体积是4.0mL。这种管中建议的凝结时间是30分钟。
Becton Dickinson(BD)VacutainerTM血清管(BD SST II)。这一管是由BD以参考号367954提供的。这一管被用于获得和分离血清样品。每只管含有0.20-2.56mg作为凝结剂的无定型(或融合的)二氧化硅以及离心后在凝块和血清之间形成屏障的凝胶(0.90-3.50g)。BD对这种管建议30分钟的凝结时间。满载体积是4.0mL。
Becton Dickinson(BD)VacutainerTM快速血清管(BD RST)。这种管是由BD以参考号368771提供的。该管含有基于凝血酶的医学凝结剂和凝胶。BD声称这些管将在五分钟之内提供凝结的样品(即比标准的商业可获得的血清管更快的凝结)并且将具有“最小量的血纤蛋白形成”。满载体积是4.0mL。
Greiner VacuetteTM无添加管。这些是由Greiner以参考号45400提供的平底塑料管，如上文实施例中所描述的向其加入特定浓度的凝血酶原激活剂。
Sarstedt血清管。这种管以目录号5092503提供，具有亮棕色的顶盖并且具有4.7mL的满载体积。这些管含有二氧化硅颗粒和凝胶屏障。
Terumo平底管。这种管以VENOSAFE商标以目录号VF-076SP提供并具有6.0mL的满载体积。这些管含有二氧化硅颗粒和凝胶屏障。
Terumo Red Top(RT)管。这种管以VENOSAFE商标以目录号VF-108SAS提供并具有8.0mL的满载体积。这些管内部包被二氧化硅并具有凝胶屏障。
Greiner VacuetteTM柠檬酸盐管。这种塑料管含有3.2％的柠檬酸盐并具有4.0mL的满载体积。该管以目录号454327出售。
Greiner VacuetteTMK2EDTA管。这种塑料管含有8mM EDTA并具有8.0mL的满载体积。该管以目录号454023出售。
(B)样品分析–CLOTEK分析仪
Clotek分析仪(Hyland,USA)使用含有在管被插入机器中时垂直振动的磁性球的样品管。磁性不锈钢球在管振动时通过磁场保持位置。加入样品、缓冲液、±钙和前凝血剂并且触发计时器。凝血酶将血纤蛋白原转化为可凝结的血纤蛋白而形成可检测的凝块所需的时间是凝结时间。在凝块形成时，将不锈钢球从磁悬浮场和光程移除，导致光束打击光电池并停止计时器(Austen,D.E.,et al.1975和Starr,H.,et al.,1980)。
(C)样品分析–凝血弹性描记法
凝血弹性描记法(TEG)通过确定血凝块形成和溶解的速度以及其形成和溶解期间血凝块的弹性特性来测量全血的凝结。当下文实施例指明时，进行TEG分析。
使用
Figure GDA0001572940870000621
5000(TEG,Haemoscope Corporation Pty Ltd,Niles,IL,USA)以及TEG Analytical Software版本4进行TEG分析。
本文所用的用于TEG分析的凝结参数如下：
R–反应时间(秒/分钟)：从分析开始直到TEG轨迹振幅达到2mm的时间，指示可检测的凝块形成；
α–角度：血纤蛋白形成速率和交联的测量(即凝块强度)；
MA-最大振幅(mm)：凝块的最大长度；
TMA–从分析开始直到达到MA的时间(秒/分钟)；
K–时间(s)：从凝块形成开始的时间到曲线达到20mm振幅的时间。
使用上文标记的凝结参数的TEG曲线(凝块形成部分)的实例提供于图25中。仅显示凝结参数因为凝块水解参数未被包括。
实施例3：通过毒液凝血酶原激活剂凝结血浆样品
实施例3a：经由PtPA对比牛凝血酶的正常柠檬酸盐血浆的凝结时间
以一式两份样品测量具有或不具有所加入的钙(10mM)时经由PtPA(如实施例1d中概述而制备的)和牛α-凝血酶(3276U/mg；Sigma Chemical Co.)的混合的柠檬酸盐血浆的凝结时间(来自6个正常参与者的组合的血浆)。
结果示于表14中，其中值是一式两份实验的平均值。
表14：在Hyland-Clotek仪器中测量的采用PtPA和牛凝血酶的柠檬酸盐血浆的凝结时间(秒)
Figure GDA0001572940870000631
#观察到弱的凝结。
PtPA在低至0.1pM的浓度具有或不具有再钙化时有效地凝结柠檬酸盐血浆。1nM的浓度获得约6秒的凝结时间，接近在100nM时获得的4.2秒的最小凝结时间。
这些结果同样显示PtPA在凝结柠檬酸盐血浆上(具有或不具有再钙化)以摩尔基准比牛凝血酶更有效约3x 104倍。例如，在存在10mM加入的钙时，1pM PtPA产生与30nM凝血酶相同的凝结时间而0.1pM具有与3nM凝血酶非常相似的凝结时间(表14中加粗的值)。
实施例3b：经由凝血酶原激活剂的正常柠檬酸盐血浆的凝结时间
这一实验使用与实施例3a中相同的血浆。
每只Clotek管含有100μL正常的“混合的”柠檬酸盐血浆，100μL的Tris缓冲剂(150mM Tris HCl，150mM NaCl，pH 7.4)，50μL 0.2M CaCl2或盐水和50μL的每种前凝血剂(either凝血酶原激活剂制剂或凝血酶)。
来自每种凝血酶原激活剂制剂和凝血酶以及正常的“混合的”柠檬酸盐血浆(具有或不具有再钙化)的结果示于表15和16中。在这些表中(以及别处)，CA-1是carinactivase-1和CA-2是carinactivase-2。
表15：采用不同凝血酶原激活剂制剂和凝血酶以及钙的正常的“混合的”柠檬酸盐血浆的凝结时间
Figure GDA0001572940870000641
表16：采用不同凝血酶原激活剂制剂和凝血酶而无钙的正常的“混合的”柠檬酸盐血浆的凝结时间
Figure GDA0001572940870000642
Figure GDA0001572940870000651
结果显示在存在加入的钙时所有的凝血酶原激活剂(代表组A-D)有效凝结正常的柠檬酸盐血浆。
柠檬酸盐血浆不是完全贫钙的。正常柠檬酸盐血浆中总的钙浓度是～1.3mmol/L而离子化钙浓度是不可测量的(<0.25mmol/L)。然而，柠檬酸盐是钙的螯合剂，与样品中的钙结合以使游离的钙不容易被用于凝块形成。钙是凝血酶原酶复合物的一部分并且在将凝血酶原催化为凝血酶中起到重要作用。柠檬酸盐同样结合其他金属离子包括镁和锌离子。管中存在的柠檬酸盐的量，0.109mol/L远足以螯合管中的所有金属离子。
这些结果显示蛇静脉酶，组A凝血酶原激活剂，存在加入的钙时在凝结血浆上高于两倍有效并且因此钙显著增强蛇静脉酶加速凝块形成的能力。钙不存在对组B凝血酶原激活剂、carinactivase-1和carinactivase-2有强烈影响，活性降低～4倍，证实钙增强这些凝血酶原激活剂的凝结活性。Notecarin，组D凝血酶原激活剂，的活性受到加入的钙的存在的刺激并且对钙的需要最明显，notecarin浓度降低而钙的加入增加其活性～30％。
不存在加入的钙对凝血酶自身影响较小。凝血酶自身经由需要钙的凝血酶原的凝血级联在样品中产生凝血酶形成。因此，从样品凝血酶原形成的凝血酶的量因钙不存在而降低。
前凝血剂的钙依赖性在它们处于高浓度时由于它们的效力而较少。结果显示组C凝血酶原激活剂PtPA和OsPA在存在或不存在加入的钙时在凝结正常的“混合的”柠檬酸盐血浆上都是最有效的。事实上，钙不存在在这两种前凝血剂的凝结能力上产生最小差异。所加入的钙存在或不存在时，组C凝血酶原激活剂需要～0.1nM来达到<5分钟内的凝结。
实施例3c：经由PtPA的柠檬酸盐血浆样品和血纤蛋白原的凝结时间
在下列一式二份样品中测定PtPA凝结下列再钙化的柠檬酸盐血浆样品和纯化的血纤蛋白原样品的能力：
(i)柠檬酸盐血浆；
(ii)Al(OH)3吸附的柠檬酸盐(经由Al(OH)3的吸附去除凝血酶原和其他含γ-羧基谷氨酸的蛋白)；
(iii)来自处于长期华法林治疗的患者的柠檬酸盐血浆(具有大于4.0的国际标准化比率(INR))；
(iv)Al(OH)3吸附的来自处于长期华法林治疗的患者的柠檬酸盐血浆(具有大于4.0的国际标准化比率(INR))；
(v)从先天性不足的患者获得的柠檬酸盐的因子X不足的血浆；
(vi)从先天性不足的患者获得的柠檬酸盐的因子V不足的血浆；和
(vii)纯化的人血纤蛋白原(2mg/mL溶于等渗盐水)，用Al(OH)3吸附的(以移除痕量的凝血酶原)。
就(iii)和(iv)而言，华法林抑制肝γ-羧化酶，将γ-羧基基团插入凝血酶原的10个N末端谷氨酸残基的酶。华法林血浆因此含有凝血酶原的非羧基化前体，去羧基化凝血酶原，其未通过采用Al(OH)3的吸附而移除。.
就(v)和(vi)而言，因子Xa和因子Va是人凝血酶原酶复合物的必要组分。因子X不足和因子V不足的血浆由Ortho–Diagnostics,USA提供。
结果示于表17中。
表17：柠檬酸盐(i)-(vi)和血纤蛋白原样品(vii)的凝结时间.
Figure GDA0001572940870000661
Figure GDA0001572940870000671
*在这一实施方案中，使用不同的PtPA制剂，说明比上文表14中更低的凝结活性。
n.d.意指未确定的测量结果。
#其中未加入PtPA，将0.1单位的牛凝血酶(Parke-Davis,now Pfizer,USA)作为阳性对照加入所有样品。加入凝血酶时观察到迅速的凝结证实所有样品中血纤蛋白原的存在。
表17中的结果显示：
(1)凝血酶原对于经由PtPA的凝结来说是必须的，因为Al(OH)3吸附的柠檬酸盐血浆(样品(ii))未被PtPA凝结；
(2)PtPA凝结华法林血浆(样品(iii)和(iv))，指示去羧基凝血酶原可由PtPA转化为α-凝血酶；
(3)Al(OH)3吸附的华法林血浆(样品(iv))的结果证实去羧基凝血酶原被转化为α-凝血酶，因为华法林血浆中痕量的正常凝血酶原被Al(OH)3去除；
(4)经由PtPA的凝结不需要因子Xa(样品(v)的结果)；
(5)经由PtPA的凝结不需要因子Va(样品(vi)的结果)；和
(6)PtPA不能够凝结血纤蛋白原溶液并且因此不能作为凝血酶样酶起作用。
总之，这些结果表明PtPA诱导的凝结归因于凝血酶原活化；去羧基的凝血酶原经由PtPA充分转化为凝血酶；以及经由PtPA的凝血酶原活化不需要因子Xa和Va；而PtPA在这些条件下没有将血纤蛋白原转化为血纤蛋白。
实施例3d：EDTA处理的血浆的凝结
为生物化学分析接受的少量但明显的百分比的样品(血清或肝素锂血浆样品)被EDTA污染。因此确定凝血酶原激活剂在凝结EDTA血浆和EDTA全血中是否有效是重要的。这一实施例因此作为下文的实施例5b而提供，以使得可进行EDTA血浆和EDTA全血的研究的比较。
实施例3e：经由凝血酶原激活剂凝结来自华法林治疗的参与者的柠檬酸盐血浆
华法林是常用的抗凝结剂并且因此这一实验的目的是确定华法林治疗是否影响下列凝血酶原激活剂凝结来自用华法林治疗的患者的样品的能力：蛇静脉酶；carinactivase-1；carinactivase-2；PtPA；OsPA和notecarin。
基于INR(1.1-7.6)选择具有不同凝结时间(与华法林剂量有关)的参与者血浆样品并且用不同的前凝血剂(凝血酶原激活剂和凝血酶)测试。
Clotek管含有100μL的肝素锂血浆、100μL的Tris缓冲液(150mM Tris HCl，150mMNaCl，pH 7.4)、50μL的0.2M CaCl2和50μL的每种前凝血剂。
结果示于表18和19中。如这些表中和其他地方所用的，CA-1是carinactivase-1而CA-2是carinactivase-2。
表18：经由凝血酶原激活剂的来自华法林治疗的患者的再钙化的柠檬酸盐血浆的凝结时间(秒)
Figure GDA0001572940870000681
表19：经由PtPA和凝血酶的来自华法林治疗的患者的再钙化的柠檬酸盐血浆的凝结时间(秒)。
Figure GDA0001572940870000682
华法林导致正常因子-X(FX)和凝血酶原从它们的活性前体(去羧基因子-X和去羧基凝血酶原)的合成的下降。凝血酶原和去羧基凝血酶原是凝血酶原激活剂靶定的底物。凝血酶原的减少意味着通过凝血酶原激活剂生成较少的凝血酶，因此观察到延长的凝结时间。凝血酶自身并不受华法林的抑制因此如这一实验中所观察到的采用凝血酶的凝结时间不受影响。这一实验中的结果显示carinactivase-1是唯一不能以INR≥2.9凝结血浆样品的凝血酶原激活剂。结果显示对于来自接受华法林的患者的血浆来说PtPA和OsPA是最有效的前凝血剂。
实施例3f：经由凝血酶原激活剂的FV不足和FX不足的血浆的凝结
使用Clotek分析仪(Hyland USA)测试凝血酶原激活剂制剂凝结商业上可获得的FV不足的血浆(#0008466150)和FV不足的血浆(#0008466350)(InstrumentationLaboratory,Lexington,MA,USA)的能力
Clotek管含有100μL的FV-或FX-不足的血浆、100μL的Tris缓冲液(150mM TrisHCl，150mM NaCl，pH 7.4)、50μL 0.2M CaCl2和50μL的每种前凝血剂。所有前凝血剂为30nM的浓度并且还测试了含有100nM浓度的carinactivase-1的另外的样品。
结果示于表20中。
表20：经由凝血酶原激活剂制剂和凝血酶的FV-或FX-不足的血浆的凝结时间(秒)
Figure GDA0001572940870000691
“ND”意指未被测定。
Notecarin不能在5分钟内凝结FV不足的血浆并且其凝结效率同样在FX不存在时减少。而且，组A和组B凝血酶原激活剂的凝结活性同样在FV或FX不存在时减少。组C凝血酶原激活剂，PtPA和OsPA，在凝结血浆上明显是最有效的并且不需要来自血浆的FV或FX。
在FV-和FX不足血浆中凝血酶凝结时间显著增加至与正常的“混合的”柠檬酸盐血浆的凝结时间相比长超过3倍。
实施例3g：正常和肝素化的柠檬酸盐血浆中经由PtPA和OsPA产生的凝血酶的量的 评估
设计这一实验提供对经由不同浓度的PtPA和OsPA并在肝素存在时生成的凝血酶的量的评估。
从健康参与者获得正常的柠檬酸盐血浆至许多管(Greiner柠檬酸盐)中。其被立即离心并且混合柠檬酸盐血浆。
所用的凝血酶是Thrombin-JMI,Topical(Bovine)5000USP(GenTrac Inc,KingPharmacia,Middleton,WI,USA)。USP单位相当于IU，而一IU相当于9nM。所用的凝血酶底物是S-2238(25mg储存液MW 626Da被溶解于15mL以提供2.67mM(#820324Chromogeinix ILLexington MA,USA)。所用的肝素是5000IU/5mL(1000IU/mL)，肝素锂，Pfizer,NZ。对于肝素，190.9IU＝1mg(Camenzind,et al.1997)；～12000Da的MW被用于计算摩尔浓度。所用的缓冲液是：20mM Hepes缓冲液；150mM NaCl；pH 7.4；0.05％表面活性剂p20。
对于血浆孵育，管含有0.5mL柠檬酸盐血浆，50μL的0.5M CaCl2和5-40μL凝血酶或凝血酶原激活剂加上20μL的肝素以提供860、4300和8600nM(2、10和20IU)的浓度或盐水。将管于室温孵育5分钟。5分钟时间段过后立即将凝块使用两个木制敷药棒环绕，去除并且丢弃。
对于凝血酶活性测定，每个分光光度测量管含有930μL的缓冲液、50μL的S-2238和20μL的澄清的血浆，其为在将凝块从上文孵育中的每个管去除之后剩余的。于405nm监测吸光度变化五分钟。
图26显示已经加入不同浓度凝血酶的这些管中剩余的凝血酶的活性。对于每条曲线，使用250-300秒的时间范围测定275秒的斜率并且这些斜率连同凝血酶浓度之后被用于以对数形式发展标准曲线以提供较高凝血酶浓度的线性关系，如图26和27中所示的。
再钙化的血浆(无前凝血剂)于室温花费～37分钟凝结。所有含有凝血酶的样品表现出潜在的凝结。最低浓度的凝血酶最慢显示出潜在的凝结(～3分钟)。潜在的凝结的时间随凝血酶浓度增加而降低。具有>200nM凝血酶浓度的样品在凝结因血浆被等分而移除之后立即表现出潜在的凝结。此时，第二次凝块去除是必须的以确保从用于光量分析的管获得足够的样品。
对于含有不同浓度凝血酶原激活剂PtPA和OsPA但是无肝素的样品，结果如下。含有不同浓度的PtPA的样品的分光光度测量的结果示于图28中而含有不同浓度的OsPA的样品的分光光度测量的结果示于图29中。
之后将PtPA生成的凝血酶浓度对5分钟的斜率作图并且结果示于图30中，而将OsPA生成的凝血酶浓度对5分钟的斜率作图并且结果示于图31中。
评估不同PtPA和OsPA浓度生成的在血清中保持活性的凝血酶的浓度并示于表21中。
表21：从标准曲线回归方程确定的不同浓度的PtPA和OsPA生成的血浆中存在的活性凝血酶的评估，图27。
Figure GDA0001572940870000711
结果显示甚至由1.2nM PtPA和OsPA生成非常显著的量的凝血酶。非常小量的PtPA和OsPA能够在<5分钟内完全凝结再钙化的正常的柠檬酸盐血浆。未观察到潜在的凝结，表明所产生的凝血酶的量足以完全催化血纤蛋白原并且防止潜在的凝结，其相当于非常高品质的血清。
对于含有不同浓度的肝素的样品，结果如下。
首先，4300nM(10IU)肝素存在时来自凝血酶、PtPA和OsPA的活性的血清组分中残留的凝血酶浓度被确定并且示于图32中(y轴上S-2238水解/分钟的A405上的变化与凝血酶浓度成比例)。135nM凝血酶未能完全凝结血浆样品，观察到仅较小的2-3mm“绒毛样”凝块。6.1nM浓度的两种凝血酶原激活剂在大约一分钟内凝结含有4300nM(10IU)肝素的样品并且甚至在于室温储存24小时后未观察到潜在的凝结。
之后研究使用不同肝素浓度的反应是否具有相似的性质。因为来自正常参与者的血浆不足，从Coagulation Laboratory,Pathology Queensland,Princess AlexandraHospital获得正常的混合的柠檬酸盐血浆。结果示于图33(PtPA)和图34(OsPA)。
评估血清中保持活性的1.5nM PtPA和OsPA浓度产生的凝血酶的量并且示于图22中。
表22：通过从标准曲线回归方程确定的1.5nM的PtPA和OsPA生成的血清中存在的活性凝血酶的评估，图27。
Figure GDA0001572940870000721
含有860和4300nm(2和10IU)肝素的样品在两分钟内凝结并且显示没有潜在的凝结。凝块是固体但是不像在不含有肝素的样品中观察到的那些固体。含有860nM(2IU)肝素的样品产生不含有肝素的血浆样品的约25％的凝血酶活性。相反，含有8600nM(20IU)肝素的样品在3分钟内产生“果冻样”凝块(与在含凝血酶样品中形成的凝块更相似)，之后样品在5分钟内显示潜在的凝结。在图33和34中，较高肝素浓度的进行曲线形状的原因是未知的。
实施例3h：使用正常混合的柠檬酸盐血浆的由BD RST管生成的凝血酶的量的评估 和肝素的影响
这一实验的目的在于提供由装有不同体积血浆的BD RST管中以活性形式生成并存在的凝血酶的量的评估。此外，还研究了肝素对BD RST管的凝结能力的影响。
从Coagulation Laboratory,Pathology Queensland,Princess AlexandraHospital获得正常的混合的柠檬酸盐血浆(<24小时长)。
对于标准曲线，BD RST管含有1、2、3和4mL柠檬酸盐血浆和50μL的0.5M CaCl2。将管颠倒8-10次混合并孵育5分钟。将凝块使用两根木制敷药棒环绕，去除并丢弃。
分光光度测量管含有930μL的缓冲液、50μL的S-2238和20μL的从上文的每个BDRST管除去凝块之后剩余的澄清的血清。在405nM监测吸光度变化5分钟并且将结果示于图35中。使用图16中的标准曲线从斜率估算凝血酶浓度并且对来自图35的斜率作图。在来自四个样品的无血清凝块中初始的BD RST管凝血酶浓度和剩余的凝血酶浓度如下：分别为135对比4.3；67.5对比1.4；45对比0.5和33.8对比0.3nM。可能的是大多数凝血酶因其将与凝块血纤蛋白结合而在凝块去除过程中被除去。
不像实施例3g中所描述的具有纯凝血酶的样品，每个BD RST管中的每种样品在一分钟内凝结并且未观察到潜在的凝结。然而，凝块强度比在实施例3g中描述的用PtPA或OsPA观察到的那些弱得多。
对于含有不同体积柠檬酸盐血浆和不同肝素浓度的样品，于405nM监测每种样品的吸光度变化5分钟并且结果示于图37中。较高肝素浓度的进行曲线形状的原因是未知的。
在三个肝素浓度中的任一个存在时没有产生完全的凝结的样品。用含有830nM(2IU)肝素和1mL血浆的样品观察到最强的凝块，尽管通过与肝素不存在时的固体凝固相比凝块是相同的，但用含有830nM(2IU)肝素和1mL血浆的样品观察到最强的凝块。所形成的最弱的凝块是装有4mL血浆并含有8600nM(20IU)肝素的管中的那些。凝块是“棉花糖”样的并且仅在样品的一部分中。5分钟后所有含有肝素的管显示出某些潜在的凝结。采用4300和8600nM(10和20IU)肝素的实际曲线形状与用PtPA和OsPA观察到的非常相似。
存在不同肝素浓度和不同凝血酶浓度时活性凝血酶的斜率和评估示于表23中。
表23：使用来自图36中的标准曲线的回归方程，对存在来自BD RST管的不同肝素浓度和不同凝血酶浓度时活性凝血酶的评估。
Figure GDA0001572940870000731
Figure GDA0001572940870000741
结果显示相同的标定凝血酶浓度(列2中)在存在不同肝素浓度时产生相似的活性凝血酶浓度。凝结后测量的凝血酶浓度比标定的浓度低7倍。
实施例4：经由凝血酶原激活剂凝结来自健康参与者的全血样品
实施例4a：经由蛇静脉酶的凝结
对于这一实验，从锯鳞蝰毒液纯化的蛇静脉酶是从Sigma(目录号EO 504-1VL；批号128K 1536)购买的。柠檬酸盐血(具有正常的凝结概况的三个样品的混合)获得自Pathology Queensland,Princess Alexandra Hospital,Queensland,Australia。
将一小瓶蛇静脉酶(50单位)重构于100μL的H2O，产生500单位/mL贮液浓度。将这一贮液在蒸馏水中的稀释液(1:100，即5单位/mL；1:1000，即0.5单位/mL；1:10000，即0.05单位/mL)用于TEG测定。每个测定混合物由310μL柠檬酸盐血、20μL 0.2M CaCl2和10μL盐水(对照)或蛇静脉酶稀释液组成。因此，测定混合物中蛇静脉酶的浓度范围是0至0.15单位/mL。所有试验一式两份进行。结果示于表24中。
表24：通过蛇静脉酶凝结再钙化的柠檬酸盐血的TEG结果。
Figure GDA0001572940870000742
向再钙化的柠檬酸盐血加入蛇静脉酶产生R-时间和TMA上的浓度依赖性降低和MA上小的增加。在所测试的最高浓度，0.15单位/mL，蛇静脉酶将R-时间从6.95减小至2.1分钟而TMA从26.45至15.75分钟。所测试的最低蛇静脉酶浓度，0.0015单位/mL，对凝结时间和凝块强度没有显著影响然而0.015单位/mL的浓度的蛇静脉酶具有中间效应。
这些结果表明蛇静脉酶同样是有效的凝血酶原活性剂以迅速产生用于临床实验室中分析物测量的血清。
实施例4b：通过六种凝血酶原激活剂凝结正常的“混合的”再钙化的柠檬酸盐血
使用如实施例1中所述制备的蛇静脉酶、carinactivase-1、carinactivase-2、PtPA、OsPA和notecarin的纯化制剂。如实施例4a中所描述的，通过TEG研究经由六种凝血酶原激活剂、经由凝血酶和在BD RST管中的正常的混合的柠檬酸盐血的凝结(如实施例4a中)。
结果提供于表25。
表25：采用正常的混合的柠檬酸盐血以及不同前凝血剂的TEG凝结研究。
Figure GDA0001572940870000751
Figure GDA0001572940870000761
这些结果为所有的凝血酶激活剂都非常有效地凝结血液并且组C凝血酶原激活剂((PtPA和OsPA)在凝结正常的“混合的”再钙化柠檬酸盐全血上最有效的血浆凝结发现(实施例3)提供了进一步的支持。例如，9pM PtPA和OsPA获得约5分钟的R时间和通过MA结果证实的最大凝块强度。其次最有效的凝血酶原激活剂是notecarin，组D凝血酶原激活剂，其能够产生5分钟的R时间和具有0.09和0.009nM之间的最小浓度的最大凝块强度。尽管notecarin自身不含有FVa，但是血浆中存在的FV通过由notecarin FXa形成的少量的凝血酶转化为活性形式。其后最有效的凝血酶原激活剂是蛇静脉酶，组A凝血酶原激活剂，其能够达到期望的R时间和具有0.9和3.2nM之间的最小浓度的最大凝块强度。最不有效的凝血酶原激活剂是组B凝血酶原激活剂carinactivase-1和carinactivase-2，其分别需要≥9和≥3nM之间的浓度以达到<5分钟的R时间和最大凝块强度。达到所期望的R时间和最大凝块强度所需的最小凝血酶浓度是≥3nM。
实施例4c：商业上可获得的血清管和含PtPA的管的比较
使用插入式蝶翼型针头将来自健康参与者的血液顺序抽取至下列管中：
(1)4.0mL Greiner VacuetteTM无添加管；
(3)Greiner VacuetteTM血清管；
(4)BD VacutainerTM血清管；
(5)Sarstedt血清管；
(6)Terumo RT管；和
(7)Terumo平底管。
将管装满新鲜收集的血液至所需要的填充标记并且之后通过轻柔颠倒8-10次立即混合30秒。之后将340μL样品转移至TEG杯中用于直接分析。这一种血液收集方法允许迅速转移血液样品以便在商业上可获得的管中混合后立即进行TEG分析以使在TEG分析中不需要抗凝剂或再钙化。一个等份，330μL来自平底管的血液(1)被立即转移至TEG杯中并加入10μL(1.41μg)的PtPA(2)并立即开始分析。
一式两份进行所有的TEG测定。TEG参数(一式两份样品的平均值)示于下文表26中。
表26：不同管中来自健康参与者的血液的TEG结果
样品 R(min) TMA(min) α(度) MA(mm)
(1)平底管 14.3 46.5 26.9 49.8
(2)PtPA 0.8 12.2 70.8 54.9
(3)Greiner 3.0 23.5 71.2 68.2
(4)BD血清 4.9 25.3 71.0 68.1
(5)Sarstedt 5.1 23.8 70.8 69.1
(6)Terumo RT 9.6 22.5 63.2 58.1
(7)Terumo 13.4 31.2 38.2 54.6
表26的TEG参数示于图38中的TEG图中，其中：轨迹A代表平底塑料管(1)；轨迹B代表具有所加入的PtPA的平底管(2)；轨迹C代表Greiner血清管(3)；轨迹D代表BD血清管(4)；轨迹E代表Sarstedt血清管(5)；轨迹F代表Terumo RT tube(6)；而轨迹G代表Terumo血清管(7)。
PtPA管(2)中的血液样品在TEG杯中凝结最迅速(R时间＝0.8分钟)。商业化的管(3)-(7)的R时间从Greiner管(3)的3.0分钟变化到Terumo管(7)的13.4分钟。将这些R时间与平底管(1)的14.3分钟的R时间相比。据信商业化的管之间R时间上的差异反应这些管中不同前凝血剂和添加剂的存在和/或前凝血剂或添加剂的不同的量。
还肉眼观察所有管中的凝块形成。使得商业上可获得的管凝结30分钟的标准时间。使得PtPA样本静置5分钟。在上样至离心机之前肉眼检查管的凝块形成。将所有管于20℃在3000g离心10分钟。将样本于室温，～21℃储存多达6小时并且每小时检查潜在的凝块形成。包括含有PtPA的管在内的所有管形成固体凝块，含有PtPA的管在2分钟内形成固体的固定的凝块。收集后多达6小时没有在任何管中观察到潜在的凝结。
这一实施例显示包含小量PtPA导致比任何商业化管中更快的凝结，证明迅速生产血清以为临床实验室中的分析物测量提供更快的运转时间的可能性。
实施例4d：通过PtPA、OsPA、蛇静脉酶和一些商业化管凝结正常的柠檬酸盐血
这一实验的目的在于研究如何将三种凝血酶原激活剂:PtPA、OsPA和蛇静脉酶与三种常规使用的商业化凝结管：Greiner血清、BD SST II和BD RST比较。
将来自健康参与者的血液收集至含柠檬酸盐的管中。
对于凝血酶原激活剂，将30μL的激活剂(TEG杯中PtPA和OsPA浓度0.56nM；蛇静脉酶5.3nM)、20μL的0.2M CaCl2和290μL的柠檬酸盐血加至TEG杯。
对于商业化血清管，加入1mL的蒸馏水并在滚筒上混合～2小时以溶解管的内含物。BD RST含有135nM牛凝血酶(33.8nM/mL的血)，然而TEG杯中这一实验所使用的浓度为53nM/mL。对于商业化血清管，将5μL溶解的内含物，20μL的0.2M CaCl2和275μL of柠檬酸盐血加至TEG杯中。
结果示于表27。
表27：使用PtPA,OsPA,蛇静脉酶和常规使用的商业化血清管以及来自健康参与者的血液的TEG数据。
Figure GDA0001572940870000781
Figure GDA0001572940870000791
结果证明常规使用的商业化血清管在通过TEG检测到显著的凝块形成的时间(R时间)上变化，来自健康参与者的再钙化的柠檬酸盐血具有0.5-6.4分钟的范围。这些管的制造商建议离心血清管之前30分钟的最小凝结时间。结果还证明0.5nM的PtPA和OsPA获得<2分钟的R时间，以及相当的凝块强度，这使得它们对于作为前凝血剂被用于迅速生产血浆来说非常适合。
实施例5：通过凝血酶原激活剂凝结含有抗凝结剂的全血样品
从正在用抗凝血剂例如肝素、华法林和柠檬酸盐治疗的患者采集许多血液样品。此外，将一些血液样品收集至含有抗凝结剂例如EDTA和柠檬酸盐的管中或者在收集过程中用抗凝结剂污染。进行下列实验以研究经由凝血酶原激活剂的含抗凝结剂的血液样品的凝结。
实施例5a：来自健康参与者的柠檬酸盐的或EDTA处理过的血液的浓度依赖性凝结
进行TEG分析，其中每个TEG测定混合物由310μL的柠檬酸盐或EDTA处理过的血液，20μL的CaCl2(0.2M)和10μL的盐水或处于一定范围浓度的凝血酶原激活剂溶液(储存液-PtPA，4.8mg/mL或OsPA，2.0mg/mL)组成。结果示于图39和表28和29(PtPA)以及表30和31(OsPA)中
表28：采用PtPA凝结正常柠檬酸盐血的TEG结果
Figure GDA0001572940870000792
Figure GDA0001572940870000801
表29:采用PtPA凝结再钙化的EDTA处理过的血液的TEG结果_
PtPA(μg/mL) R(min) TMA(min) α(度) MA(mm)
0 9.8 39.2 25.8 54.6
0.00141 9.1 31.5 34.9 60.9
0.0141 6.8 27.0 62.4 64.4
0.141 5.5 25.3 62.0 64.4
1.41 1.3 19.8 72.1 66.3
14.1 0.3 21.2 70.1 60.9
表30：采用OsPA凝结正常柠檬酸盐血的TEG结果
OsPA(μg/mL) R(min) TMA(min) α(度) MA(mm)
0 9.0 31.3 29.5 55.0
0.000588 9.0 24.0 34.2 49.0
0.00588 5.9 21.3 54.3 62.0
0.0588 2.8 15.3 65.9 54.8
0.588 0.8 17.9 73.6 64.2
5.88 0.3 19.8 72.3 58.2
表31:采用OsPA凝结再钙化的EDTA处理过的血液的TEG结果
OsPA(μg/mL) R(min) TMA(min) α(度) MA(mm)
0 13.9 40.8 31.2 50.7
0.000588 16.3 45.4 29.8 53.7
0.00588 9.8 30.0 36.2 62.4
0.0588 3.3 18.3 64.3 70.7
0.588 0.8 17.0 73.1 64.0
5.88 0.3 20.8 77.0 61.1
未加入凝血酶原激活剂的再钙化的血液的R时间约为10分钟，其在1.41μg/mLPtPA存在时降低至1分钟或1.3分钟(表28和29)。凝结速度迅速(角度＝54-72o)(在0.0141和1.41之间)并且获得具有60-70mm的MA值的满强度凝块。未加入凝血酶原激活剂的再钙化血液的约10分钟的R时间在0.59μg/mL OsPA存在时降低至0.8分钟(表30和31)。
据信加入PtPA或OsPA时观察到的非常短的R时间和大的α可由大量凝血酶的爆炸式生成来解释，而下游反应(血纤蛋白原转化为血纤蛋白，因子XIII的活化，血纤蛋白单体的交联)是限速的并且导致相对较小的TMA的改进。
来自表28、28、30和31的TEG结果示于图39，其中TEG图A显示表28结果(柠檬酸盐血液和PtPA)；TEG图B显示表29结果(EDTA处理的血液和PtPA)；TEG图C显示表30结果(柠檬酸盐血液和OsPA)而TEG图D显示表31结果(EDTA处理的血液和OsPA)。
在图39中，每个TEG图中标记A的轨迹表示14.1μg/mL的PtPA和5.88μg/mL的OsPA；标记B的轨迹表示1.41μg/mL的PtPA和0.588μg/mL的OsPA；标记C的轨迹表示0.141μg/mL的PtPA和0.0588μg/mL的OsPA；标记D的轨迹表示0.0141μg/mL的PtPA和0.00588μg/mL的OsPA；标记E的轨迹表示0.00141μg/mL的PtPA和0.000588μg/mL的OsPA而标记F的轨迹表示0μg/mL的PtPA和0μg/mL的OsPA。
总之，PtPA和OsPA都以高度有效的浓度依赖性方式凝结再钙化的柠檬酸盐的和EDTA处理的血液。因此实际上，EDTA管中收集的血液可通过加入PtPA或OsPA迅速凝结以产生血清用于生物化学和其他实验室分析。
实施例5b：获得自健康参与者的EDTA血浆和血液的凝结
如上文实施例3d中所提及的，将为生物化学分析接受的小但显著的百分比的样品(血清或肝素锂血浆样品)用EDTA污染。因此确定凝血酶原激活剂在凝结EDTA血浆和EDTA全血上是否有效是重要的。这一实验的目的在于这样做并进行EDTA血浆和EDTA全血的比较。
来自健康患者的血液被收集至含有1.8mg/mL(6.2mmol)EDTA的Greiner EDTA管中，填充至填充标记。在这一浓度，EDTA能够结合管中存在的所有金属离子(包括Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+和Cu2+)。为了获得EDTA血浆，将每个样品的一部分在标准程序下离心。
Clotek管含有100μL的EDTA血浆、100μL的Tris缓冲液(150mM Tris HCl，150mMNaCl，pH 7.4)、50μL的0.2M CaCl2或Tris缓冲液和50μL的每种前凝血剂。
TEG杯含有20μL的0.2M CaCl2或盐水、60μL的前凝血剂和260μL的EDTA血液。
对于BD RST实验来说，两个管的内含物分别溶于1和4mL的蒸馏水，混合5分钟并且在TEG杯中使用60μL的内含物作为前凝血剂。
血浆凝结研究的结果示于表32和表33。
表32：从健康参与者获得的EDTA血浆与不同浓度的不同前凝血剂(凝血酶原激活剂和凝血酶)以及钙一起的凝结时间。
Figure GDA0001572940870000821
“ND”意指其未被确定。
表33：从健康参与者获得的EDTA血浆与不同浓度的不同前凝血剂(凝血酶原激活剂和凝血酶)但未有钙的凝结时间。
Figure GDA0001572940870000822
BD RST血浆凝结研究的结果示于表34中。
表34：BD RST管的凝结时间，有钙或无钙
BDRST管(nM) 有Ca<sup>2+</sup>(秒) 无Ca<sup>2+</sup>(秒)
1mL(23) 12.3 44.9
4mL(6) 34.3 101
EDTA是螯合钙并且反过来防止正常凝结过程发生的金属螯合剂。
这些结果显示钙依赖性凝血酶原激活剂carinactivase-1(CA-1)和carinactivase-2(CA-2)在<5分钟的前提时间中未凝结EDTA血浆，甚至是在50nM浓度，尽管它们在再钙化之后可以。对蛇静脉酶的影响是显著的：未再钙化时，凝结时间超过5分钟。加入过量的钙仅导致使用PtPA和OsPA的凝结时间上适度降低(例如0.1nM的PtPA，190秒至98.6秒)。尽管本文描述的其他实施例已经表明notecarin作为前凝血剂不如PtPA和OsPA有效，但结果显示其是受到钙不存在的影响最小的凝血酶原激活剂。加入过量的钙导致采用凝血酶凝结血浆上3倍的增加。
来自全血凝结研究的结果显示表35。
表35：显示钙存在或不存在时不同前凝血剂对EDTA血液的影响的TEG结果。
Figure GDA0001572940870000831
Figure GDA0001572940870000841
*意指测量被终止而ND意指未被测定。
这一实验显示EDTA全血代表对前凝血剂来说困难的挑战。与EDTA血浆不同，前凝血剂中没有能够在不存在再钙化时凝结EDTA血液。甚至用高PtPA浓度(690nM)也未能获得凝结。然而，所有前凝血剂能够在EDTA血液被再钙化时将其凝结。甚至用非常低的PtPA浓度(1nM)获得迅速并完全的凝结。EDTA是为保留细胞形态选择的抗凝结剂并且通过螯合钙，EDTA也阻止血小板活化和血小板凝集。
进行使用30nM PtPA的另外两个血浆凝结实验。在第一个中，将水而不是Tris缓冲液加至Clotek管并且样品仍旧在6.4秒内凝结。在第二个中，未使用缓冲液，仅使用200μLEDTA加上50μL PtPA并且凝结时间是5.4秒。对于TEG研究，将下列溶液加至TEG杯：50μLTris缓冲液、60μL PtPA、230μL EDTA血液并且仍未观察到凝结。此外，将BD RST管用EDTA血液填充至填充标记并且在60分钟后其显示非常局部的凝结。从这些实验来看明显的是无论EDTA是否存在，应当考虑加入钙以及前凝血剂以获得凝结。
实施例5c：来自华法林治疗的参与者的血液的凝结
测定PtPA和OsPA对来自接受华法林的两个参与者(“W1”和“W2”)的血液样品的凝结的影响
每个参与者的凝结参数，通过标准凝结程序测定，示于表36中，其中：
aPTT＝活化部分凝血激酶时间；
PT＝凝血酶原时间；；
INR＝国际标准化比率；和
Fib-D＝凝血酶原时间衍生的血纤蛋白原.
表36:处于抗凝血剂治疗的参与者的凝结参数
Figure GDA0001572940870000851
表36中的结果证实来自参与者W1和W2的血液如所期望的被凝结。
之后进行TEG分析。每个TEG测定混合物由310μL的柠檬酸盐血，20μL的CaCl2(0.2M)和10μL的盐水或凝血酶原激活剂(PtPA或OsPA)溶液组成，产生0和14.1μg/mL之间的凝血酶原激活剂的最终测定浓度。
TEG结果示于下文表37、38和39中。其中的值来源于图40和41中所示的TEG数据。
表37：用OsPA凝结W1的柠檬酸盐血的TEG结果
OsPA(μg/mL) R(min) TMA(min) α(deg) MA(mm)
0 12.2 35.5 23.6 50.4
0.0588 4.4 22.9 68.1 59.5
0.588 1.6 16.7 73.8 60.8
5.88 0.6 17.8 67.5 53.0
表38：用PtPA凝结W1的柠檬酸盐血的TEG结果
Figure GDA0001572940870000852
Figure GDA0001572940870000861
表39：用PtPA凝结W2的柠檬酸盐血的TEG结果
PtPA(μg/mL) R(min) TMA(min) α(deg) MA(mm)
0 12.3 37.6 49.1 60.8
0.0141 7.7 26.1 62.9 66.4
1.41 1.3 17.9 77.7 73.3
14.1 0.4 18.4 79.6 69.4
表37和38中结果的TEG图提供于图40中，其中TEG图A显示来自表37(OsPA)的结果而TEG图B显示来自表38(PtPA)的结果。在图40中，对于A图，标记(i)的轨迹显示5.88μg/mLOsPA的结果，标记(ii)的轨迹为0.588μg/mL OsPA；标记(iii)的轨迹为0.0588μg/mL OsPA和标记(iv)的轨迹为0μg/mL OsPA。在图40中，对于B图，标记(i)的轨迹显示14.1μg/mLPtPA的结果，标记(ii)的轨迹为1.41μg/mL PtPA；标记(iii)的轨迹为0.0141μg/mL PtPA和标记(iv)的轨迹为0μg/mL。
在图41中，标记(i)的轨迹显示14.1μg/mL PtPA的结果，标记(ii)的轨迹为1.41μg/mL PtPA；标记(iii)的轨迹为0.0141μg/mL PtPA和标记(iv)的轨迹为0μg/mL。
总之，PtPA和OsPA两者都在低浓度迅速凝结来自处于华法林治疗的参与者的血液样品，具有与使用来自健康参与者的可比较的实验中的那些相似的R时间、α值和MA值(参见上文表28-31)。这些结果证明在实施例3c中对华法林血浆的观察。
实施例5d：使用PtPA和OsPA凝结来自高剂量肝素化参与者的血液
从在采集血液样品之前已经被给予35,000IU的肝素30分钟的参与者(“H1”)采集血液。肝素的浓度被计算为约7IU/mL血液。将血液收集到平底注射器中并且之后被转移至Greiner VacuetteTM柠檬酸盐管
测量参与者的凝结参数并且示于表40中。
表40:肝素化参与者的凝结参数。
Figure GDA0001572940870000862
表40中的所有凝结参数是本领域中已知的，为：aPTT＝活化部分凝血激酶时间；PT＝凝血酶原时间；INR＝国际标准化比率；TT＝凝血酶时间；PTNH＝硫酸鱼精蛋白时间；REPT＝蛇毒凝血酶时间；Fib-D＝凝血酶原时间来源的血纤蛋白原
表40中的结果在重度肝素化样品的所期望的结果的范围内。
之后进行TEG分析。每个TEG测定混合物由310μL的柠檬酸盐血、20μL的CaCl2(0.2M)和10μL的盐水或凝血酶原激活剂的溶液(PA)组成。
TEG结果示于下文表41和图42中。
表41：凝结来自处于高剂量肝素的参与者的血液的TEG结果。
Figure GDA0001572940870000871
在上文表41中，“n.c.”表明没有凝结。
表41中的结果的TEG轨迹提供于图42中，其中标记A的轨迹显示无凝血酶原激活剂的结果；标记B的轨迹显示14.1μg/mL PtPA的结果，以及标记C的轨迹显示5.9μg/mL OsPA的结果。
在所测试的浓度，PtPA和OsPA都能够迅速凝结来自肝素化的参与者的柠檬酸盐血。将所监测的TEG参数(R时间、TMA、角度、MA)的值与从健康参与者的血液获得的结果相比，表明凝血酶原激活剂的活性并未受到血液样品中存在的肝素的浓度的抑制。
实施例5e：采用含有PtPA的管和BD RST管凝结来自充分肝素化的参与者的血液
从在样品收集之前已经被给予38,000IU的肝素30分钟的经历心脏手术的参与者收集10mL血液样品。将血液收集在平底注射器中并且在10分钟内转移至实验室用于分析。
填充BD RST管至填充标记，颠倒/混合30秒并且将340μL的这种血液转移至通道1中的TEG杯。
通道2中TEG杯中向330μL的原始的肝素化的参与者血液样品加入10μL的PtPA(终浓度1.41μg/mL)。
TEG分析的结果示于表42和图43中。
表42：BD RST管中和采用PtPA的肝素化血液的TEG分析结果
Figure GDA0001572940870000881
对于BD RST管，R时间是6.2分钟，具有11.5mm的最大振幅(MA)值，表明仅获得部分凝结。这一凝块强度在2小时的分析时间段内没有另外增加。
使用PtPA，R时间是0.7分钟，最大振幅(MA)是43.8mm，达到最大振幅的时间是9.8分钟，表明迅速获得强并且稳定的凝块。
来自表42的结果同样作为TEG图示于图43中，其中轨迹“A”是通道2中TEG杯的轨迹(PtPA)而轨迹“B”是通道1中TEG杯的轨迹(BD RST管)
还肉眼监测平底注射器中收集的血液和BD RST管中的血液的凝结。在平底注射器中直到2天未观察到凝结。BD RST管中的血液显示30分钟的部分凝结和24小时内的完全凝结。
总之，重度肝素化的样品在含有PtPA的管中迅速并且完全凝结而在BD RST管中仅非常缓慢且不完全的凝结。
实施例5f：经由凝血酶原激活剂凝结含有肝素的血液样品
使用TEG分析确定毒液凝血酶原激活剂凝结来自健康参与者收集在Greiner肝素锂管(18IU肝素每mL血液)中的血液的能力并且结果示于表43中。收集柠檬酸盐样品用于MA值的比较。
表43：使用来自健康参与者的收集在Greiner肝素锂管中的血液的TEG结果。
Figure GDA0001572940870000891
*意指测量被终止而ND意指未被测定。
采用肝素锂全血的这一实验的结果显示某些前凝血剂能够以较低的前凝血剂浓度凝结肝素化的血液，而在这一实验中，其他前凝血剂未能凝结血液，甚至是在所测试的最高浓度范围。结果显示组C前凝血剂(PtPA和OsPA)在凝结收集在Greiner肝素锂管中的血液上最有效，对于OsPA和PtPA来说需要≥9nM达到5分钟内的R时间。这显著低于在再钙化的柠檬酸盐血中获得的MA(～61)。尽管不希望受到理论的限制，据信可能的是ATIII-肝素复合物抑制所形成的凝血酶并且随后防止固有的或更强的凝块形成。其他凝血酶原激活剂所需的最小浓度为>56nM的蛇静脉酶和carinactivase-2，>100nM的carinactivase-1和>32nM的notecarin。来自BDRST的6和25nM的凝血酶浓度根本未能凝结血液。
再次，尽管不希望受到理论的限制，据信可能的是组C凝血酶原激活剂(OsPA和PtPA)产生大得多并且多得多的凝血酶的持续爆发以压倒抑制凝血酶和FXa两者以及随后的凝结过程的ATIII-肝素复合物。
实施例5g：掺有不同浓度的肝素的正常的“混合的“柠檬酸盐血的凝结
进行这一实施例以确定凝结掺有不同浓度的肝素的血浆所需要的不同凝血酶原激活剂的浓度以模仿可能存在于来自肝素化患者的血浆中的水平。
正常的“混合的“柠檬酸盐血浆具有调节至2.71mmol/L的总钙以及之后加入等份的肝素以获得Clotek管中0.8,2.0,10和20IU/mL的最终肝素浓度，其是可在患者血液样品中遇到的范围。此外，将柠檬酸盐血浆的1mL等份分配于Greiner肝素锂管中并且之后在滚筒上混合15分钟以产生90IU/mL的肝素锂浓度。Clotek管含有100μL的肝素钠或锂血浆、100μL的Tris缓冲液(150mM Tris HCl，150mM NaCl，pH 7.4)和50μL的每种前凝血剂。
掺有肝素的血浆的每种凝血酶原激活剂的凝结结果示于表44-49中而凝血酶的示于表50中。
表44：经由PtPA凝结掺有肝素或分配于Greiner肝素锂管中的正常的“混合的”柠檬酸盐血浆
Figure GDA0001572940870000901
Figure GDA0001572940870000911
表45：经由OsPA凝结掺有肝素或分配于Greiner肝素锂管中的正常的“混合的”柠檬酸盐血浆
Figure GDA0001572940870000912
表46：经由notecarin凝结掺有肝素或分配于Greiner肝素锂管中的正常的“混合的”柠檬酸盐血浆
Figure GDA0001572940870000913
表47：经由蛇静脉酶凝结掺有肝素或分配于Greiner肝素锂管中的正常的“混合的”柠檬酸盐血浆
Figure GDA0001572940870000921
表48：经由carinactivase-1凝结掺有肝素或分配于Greiner肝素锂管中的正常的“混合的”柠檬酸盐血浆
Figure GDA0001572940870000922
表49：经由carinactivase-2凝结的掺有肝素或分配于Greiner肝素锂管中的正常的“混合的”柠檬酸盐血浆
Figure GDA0001572940870000923
Figure GDA0001572940870000931
表50：经由凝血酶凝结掺有肝素或分配于Greiner肝素锂管中的正常的“混合的”柠檬酸盐血浆
Figure GDA0001572940870000932
如之前的实验(实施例5f)中所示，肝素(以及归因于ATIII-肝素复合物的凝血酶抑制)的存在对前凝血剂防止血液的部分或完全凝结提出了重要挑战。这一实验的结果显示前凝血剂在肝素化血浆凝结中的相对效用。
结果显示PtPA和OsPA在克服来自ATIII-肝素复合物的抗凝效应上是最有效的。PtPA需要最低浓度(12-20nM)凝结含有在患者样品中可能遇到的最高肝素浓度的血浆。一个令人感兴趣的发现是PtPA是唯一能够以所有但是12nM的最低PtPA浓度在<5分钟内有效凝结来自Greiner肝素锂管的肝素化血浆，即便与含有20IU/mL肝素的掺杂的样品相比，肝素浓度是90IU/mL。很有可能仅PtPA受到Greiner肝素锂管中含有的表面活性剂的帮助。OsPA需要>36nM而蛇静脉酶>60nM以能够凝结含有20IU肝素的血浆并且两者都不能在<5分钟内凝结来自Greiner肝素锂管的肝素化的血浆。Carinactivase-2和notecarin不能凝结含有≥10IU的肝素的血浆而carinactivase-1不能在<5分钟的前提时间内凝结含有>0.8IU的肝素的血浆，甚至是在浓度为120nM时。凝血酶研究显示100nM的凝血酶浓度仅能够凝结掺有最低肝素浓度0.8IU/mL的样品。因此，当考虑含有135nM的凝血酶的BD RST管时，在5分钟的前提时间内凝结含有>2IU/mL的肝素的样品是不可能的。
实施例5h：来自健康参与者的肝素锂血浆的凝结
Greiner肝素锂管中收集的样品可能是实验室能收到的最高度肝素化的样品，尤其是如果管未被填充至所建议的填充体积时。这一实验的目的是提供对前凝血剂凝结从肝素抗凝结化的患者接收到的所有其他样品并且产生高品质的血清所需的最小浓度的指导。
将Greiner肝素锂管填充至建议的填充标记，产生18IU/mL的肝素浓度。Clotek管含有100μL的肝素锂血浆，100μL的Tris缓冲剂(150mM Tris HCl，150mM NaCl，pH 7.4)和50μL的每种前凝血剂。TEG杯含有60μL前凝血剂和260μL的收集在肝素锂管中的参与者血液。
对于BD RST管，向两个管中加入去离子水(BDRST1-1mL；BDRST2-4mL)，在滚筒上混合30分钟以将凝血酶溶解并且将内含物与其他前凝血剂一起使用。
采用肝素锂血浆的每种前凝血剂的凝结结果示于表51。
表51：采用收集在Greiner肝素锂管中的肝素锂血浆的凝结研究。
Figure GDA0001572940870000941
设计这一实验以显示前凝血剂在凝结来自血液收集管的肝素化血浆上的效率。发现对于蛇静脉酶和carinactivase-2，获得<5分钟的凝结所需要的最小浓度范围是12至36nM，对于carinactivase-1是>120nM而对于notecarin是4至12nM。对于凝血酶，>120nM的浓度是必须的。还用7.7和27nM的凝血酶测试BD RST管并且两个浓度都产生>5分钟的凝结时间，其表明BDRST在凝结来自处于高剂量肝素的患者的样品上无效。结果显示组C凝血酶原激活剂(PtPA和OsPA)在凝结从收集在Greiner肝素锂管中的从健康参与者的血液获得的肝素锂血浆上最有效，分别需要0.1至1nM之间的PtPA和1至4nM之间的OsPA来达到<5分钟内的凝结。
实施例5i：凝结从“充分肝素化的”心脏手术参与者获得的血液和血浆
静脉内给予的最高浓度的肝素在复杂的外科手术程序例如心脏手术内。如果在最大肝素化期间收集样品用于生物化学，结果通常需要在尽可能短的时间内提供。如果使用血清，将需要前凝血剂在这些血清样品达到实验室时也就是<10分钟内完成凝结。
给予患者的肝素是肝素钠而在血液收集管或注射器中是肝素锂。在这些患者中注入的最大量的肝素是～45000IU。这些患者同样是血稀释的(即血浆体积增加至～4L)，产生～10IU每mL血浆的肝素浓度。
设计这一实验以确定所选择的前凝血剂浓度食肉能够凝结“充分”肝素化的心脏手术患者血液并产生高品质的血清。参与者已经接受37000IU的肝素并且样品在肝素注入后～30分钟收集，相当于～9.3IU的肝素每mL血浆。离心部分血液样品获得血浆。
对于血浆凝结，Clotek管含有100μL的心脏参与者血浆，100μL的Tris缓冲剂(150mM Tris HCl，150mM NaCl，pH 7.4)和50μL的每种前凝血剂。
对于全血凝结，TEG杯含有60μL的前凝血剂和260μL的参与者血液。充分肝素化时血液自身不凝结。
对于BD RST-1实验，两种BDRST管的内含物分别用1和4mL的蒸馏水溶解并且60μL溶液作为前凝血剂用于TEG杯中。
对于BD RST-2实验，管分别填充1和4mL的血液，将管颠倒10次(～30秒)并且将340μL的血液转移至TEG杯。
采用患者血浆的每种前凝血剂的凝结结果示于表52中而全血结果示于表53中。
表52：采用不同浓度的不同凝血酶原激活剂、凝血酶和BD RST管内含物的来自“充分肝素化”的心脏手术参与者的血浆的以秒记的凝结时间。
Figure GDA0001572940870000951
Figure GDA0001572940870000961
ND意指未被确定。
来自这一实验的结果显示在<5分钟的前提时间内凝结血浆所需的每种前凝血剂的浓度。给出约5分钟的凝结时间的最大激活剂浓度是：PtPA4nM、OsPA1-3nM、notecarin3nM、carinactivase-2>12nM、蛇静脉酶>36nM、carinactivase-1>60nM和凝血酶>120nM。令人惊吓地注意到notecarin效力可与组C激活剂相比。
表53：采用来自“充分肝素化”的心脏手术参与者的血液以及不同前凝血剂的TEG凝结研究的结果
Figure GDA0001572940870000962
Figure GDA0001572940870000971
*意指测量被终止而ND意指未被测定。
从不同凝血酶原激活剂的这些结果确定获得<5分钟的R时间和最大凝块强度的浓度是：PtPA 6nM、OsPA 2.3nM、notecarin 3-11nM、蛇静脉酶11-34nM、carinactivase-2 11-34nM和carinactivase-1 57-112nM。
令人惊讶地，notecarin产生具有比组A和B凝血酶原激活剂更高的MA的凝块，并且不希望受到理论的限制，假设这些患者血液中的添加剂具有辅助凝结的效力。
如MA所指示的所形成的最强的凝块采用PtPA和OsPA而最弱的采用PtPA和OsPA。
BD RST管中的凝血酶(采用135nM的凝血酶的BDRST-2实验)产生不完全的凝结和如MA指示的弱的凝块。这些样品非常可能在离心后在血清中形成潜在的凝结。
实施例5j：掺有利伐沙班的正常的“混合的”柠檬酸盐血浆的凝结
设计这一实验以检查新的因子Xa抑制剂抗凝结剂中的一种，利伐沙班，对前凝血剂的凝结能力的影响。
将一片利伐沙班(10mg,Mol Wt 435,Xarelto,Bayer Schering Pharm,Germany)片剂在5mL去离子水中粉碎(2mg/mL)，允许混合30分钟并且之后离心除去不溶解的颗粒。所给出的典型的治疗剂量是每天一次10-40mg。对于70kg的人(～3000mL血浆)，总量是0.14-0.57mg/kg，0.0033-0.013mg/mL血浆。Clotek管中所制备和测试的浓度是：0.0033、0.0083、0.017、0.033和0.17mg/mL。
Clotek管含有50μL的Tris缓冲剂(150mM Tris HCl,150mM NaCl,pH 7.4)，50μL0.2mM CaCl2，100μL正常的“混合的”柠檬酸盐血浆，50μL的Tris缓冲剂或不同浓度的抗凝结剂和50μL的凝血酶原激活剂(30nM)。
The凝结时间示于表54。
表54：采用正常的“混合的”柠檬酸盐血浆和利伐沙班的凝结时间
Figure GDA0001572940870000981
结果显示利伐沙班在可在患者中遇到的血浆的治疗浓度范围0.0033-0.013mg/mL内对前凝血剂具有极小的影响。然而，在较高浓度，利伐沙班在前凝血剂中每一种存在时对凝结具有显著的抑制影响。这一影响可被归因于经由前凝血剂产生的凝血酶对血浆中从人FX产生的因子Xa的抑制。
实施例5k：来自经历柠檬酸盐抗凝的血液的凝结
在之前的实验中，已经显示凝血酶原激活剂能够凝结收集在Greiner柠檬酸盐管中的柠檬酸盐血。这一实验的目的是证实体内柠檬酸化并未给采用凝血酶原激活剂带来凝结问题。
在这一实施例中，患者处于3.0mmol柠檬酸盐每升血流。将血液收集在用于常规病理学测试的50mL平底注射器中(BD Plastipak#300866)，从其留下<3mL进行仅采用PtPA的非常有限的研究。
凝结参数是：PT 13s(RR 9-13)，INR 1.3，APTT 45s(RR 24-39)，血纤蛋白原(衍生的)7.2g/L(RR 1.7-4.5)，证明抗凝结。
TEG杯含有20μL的0.2M CaCl2或盐水，5μL的PtPA和320μL的柠檬酸盐血。
结果示于表55。
表55：柠檬酸盐抗凝结的参与者的TEG结果
柠檬酸盐抗凝结的参与者 R(min) MA(mm) TMA(min)
仅再钙化的柠檬酸盐血 4.8 77.1 18.0
2.8nM PtPA再钙化的 0.6 74.7 15.8
2.8nM PtPA非再钙化的 0.8 76.2 18.9
结果表明用于患者的抗凝结的柠檬酸盐浓度在PtPA被用作再钙化和非再钙化血液中的前凝血剂时未带来凝结问题。收集在Greiner柠檬酸盐管中的血液中的柠檬酸盐浓度是3.2％或109mM，其是患者接受的浓度的约36倍。另外，未预期当持续监测柠檬酸盐化患者的离子化钙时会有任何凝结问题并且离子化钙如所需要的被补充。与这一患者中的4.8分钟相比，正常的“混合的”柠檬酸盐血中的R时间是6.4分钟(如表43中所示)。再钙化增加了超过需要的钙并且因此其理论上对差异没有贡献。假设差异归因于较高的凝结因子浓度，包括7.2g/L的血纤蛋白原。
实施例6：来自具有延长的凝结概况或低血小板计数的参与者的全血样品的凝结
作为药物治疗或遗传因素(例如血友病)的结果某些患者具有延长的凝结参数和/或减少的血小板计数。进行下列实验以测定PtPA或OsPA是否能够迅速凝结来自这些患者的血液样品。
实施例6a：具有延长的凝结时间的参与者
来自具有表明内在通路上的缺陷的延长的aPTT的4名参与者(“A”、“B”、“C”和“D”)的血液从Pathology Queensland,Princess Alexandra Hospital,Queensland,Australia获得。每个参与者的凝结参数被确定并且示于表56中。
表56：每个参与者的凝结参数*
参与者 aPTT(s) PT(s) INR TT(s) Fib-D(g/L) plat(x109/L)
A 48 16 1.6 19 7.1 453
B 44 34 3.0 16 4.1 97
C >200 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
D 45 16 1.5 15 1.5 96
参考间隔 25-38 8-14 0.9-1.3 10-15 1.5-4.0 140-400
*aPTT＝活化部分凝血激酶时间；PT＝凝血酶原时间；INR＝国际标准化比率；TT＝凝血酶时间；Fib-D＝凝血酶原时间来源的血纤蛋白原；Plat＝血小板，n.d.＝未能测定。参考间隔获得自Pathology Queensland。
进行TEG分析。每个TEG测定混合物由来自A-D参与者样品的310μL柠檬酸盐血液，20μL的CaCl2(0.2M)和10μL的盐水或PtPA(终浓度1.41μg/mL)组成。在零点时间加入CaCl2以起始凝结。
四个样品的TEG轨迹示于图44中而来自这些轨迹的TEG参数示于表57中。
表57：凝结来自具有不正常的凝结参数的患者的血液样品的TEG结果
R(min) TMA(min) α(度) MA(mm)
A >35 n.d. n.d. n.d.
A+PtPA 1.3 16.6 70.9 67.4
B 23.0 >39 17.0 n.d.
B+PtPA 0.9 21.3 70.0 59.0
C >52 n.d. n.d. n.d.
C+PtPA 2.1 24.5 67.6 60.4
D 16.1 43.3 26.4 31.7
D+PtPA 1.4 19.2 52.0 40.8
“n.d.”表明未被测量。
四个样品的TEG图示于图44中，其中TEG图A代表参与者A并且在该图中两个标记(i)的轨迹代表具有所加入的钙的盐水对照；两个标记(ii)的轨迹是具有PtPA的样品。TEG图B代表参与者B并且在该图中两个标记(i)的轨迹代表具有所加入的钙的盐水对照；两个标记(ii)的轨迹是具有PtPA的样品。TEG图C代表参与者C并且在该图中标记(i)的轨迹是盐水对照；而四个标记(ii)的轨迹是具有加入的PtPA的样品。TEG图D代表参与者D并且在该图中两个标记(i)的轨迹是盐水对照；而两个标记(ii)的轨迹是具有PtPA的样品。由于非常不正常的凝结参数，对患者C实行一式三份的测定。表57中的数据代表来自TEG数据的平均值。
总之，来自参与者A-D的血液样品显示从44至>200秒的aPTT时间范围，表明内在凝结通路上的缺陷。没有PtPA，样品没有凝结或产生非常弱的凝块。在所有实例中，PtPA(1.41μg/ml)导致迅速的凝结，减少凝结时间至1-2分钟。因此PtPA在迅速凝结来自具有这一凝结通路上的缺陷的患者的血液上是有效的。
实施例6b：具有低血小板计数的参与者
具有低血小板计数的参与者中，凝结时间与来自健康人群的血液相比显著增加。这是因为血小板为凝血酶原酶复合物的形成提供磷脂表面并且加速血液凝结。
来自具有低血小板计数的四个参与者的血液样品(“E”、“F”、“G”和“H”)获得自Princess Alexandra Hospital,Queensland,Australia。确定每个参与者的凝结参数并示于表58中，证实低的血小板计数。
表58：每个参与者的凝结参数
参与者 aPTT(s) PT(s) INR TT(s) fib(g/L) plat(x10<sup>9</sup>/L)
E 31 10 1.1 n.d. 4.5 10
F 29 14 1.4 n.d. 1.2 29
G 34 12 1.2 n.d. 2.7 18
H 54 11 1.2 21 6.4 46
参考间隔 25-38 8-14 0.9-1.3 10-15 1.5-4.0 140-400
n.d.表示测量结果未被确定。
进行TEG分析。每个TEG测定混合物由来自E-H参与者样品的310μL柠檬酸盐血液、20μL的CaCl2(0.2M)和10μL的盐水或凝血酶原激活剂的溶液(1.41μg/mL或14.1μg/mL终浓度的PtPA或0.59μg/mL或5.9μg/mL终浓度的OsPA)组成。
TEG轨迹示于图45而TEG参数列于表59和60中。
表59：采用PtPA凝结来自具有低血小板计数的参与者的血液样品的TEG结果
Figure GDA0001572940870001021
表60：采用OsPA凝结来自具有低血小板计数的参与者的血液样品的TEG结果
Figure GDA0001572940870001022
TEG图示于图45，其中图A显示参与者E的结果；图B显示参与者F的结果；图C显示参与者G的结果并且图D显示参与者H的结果。在每个图中，标记(i)的轨迹代表无PtPA或OsPA；标记(ii)的轨迹代表14.1μg/mL PtPA；标记(iii)的轨迹代表1.41μg/mL PtPA；标记(iv)的轨迹代表5.88μg/mL OsPA；而蓝色轨迹代表0.588μg/mL OsPA。
总之，PtPA和OsPA都迅速凝结来自具有低血小板计数的参与者的血液以提供高强度凝块。
实施例7：含有凝血酶原激活剂的毒液的凝结活性的比较
来自蛇东部拟眼镜蛇(Pt)、太攀蛇(Os)、内陆太攀蛇(Om)、虎蛇(Notchisscutatus)(Ns)和锯鳞蝰(Ec)的五个新鲜重构的毒液以50mg/mL的储存浓度重构于蒸馏水中。新鲜配制6mg/mL的工作储存稀释液并且测量它们凝结再钙化的柠檬酸盐血浆时的凝结活性。在测定中以每种浓度一式两份从2mg/mL至500pg/mL系列稀释毒液。所显示的结果是一式两份测量结果的平均值。测定由具有所加入的10mM钙的100μL的0.02M Hepes缓冲液pH7.4加上100μL的柠檬酸盐血浆组成而从加入毒液稀释液的时间起测量凝结时间(以秒计)。
结果示于表61和图46。
表61：含有不同浓度的凝血酶原活性剂的蛇毒液的凝结时间
Figure GDA0001572940870001031
Figure GDA0001572940870001041
如可在表61和图46中所见的，所有五种毒液非常有效地将再钙化的柠檬酸盐血浆凝结降至500pg/mL的浓度。含组C凝血酶原激活剂的毒液(Pt、Os和Om)是最有效的，在500pg/mL的浓度获得少于50秒的凝结时间。
实施例8：使用商业上可获得的管或使用PTPA制备的血浆和血清样品中的沉淀和 潜在的凝结以及对肌钙蛋白I评估的影响
如在本说明书的较早部分中所讨论的，许多问题与商业化血清和血浆管的使用有关，例如潜在凝结或无凝结(血清管)、微凝块和血纤蛋白原串(血清或血浆管)以及蛋白的沉淀和细胞物质的泄露。为了调查含有凝血酶原激活剂的管是否显示出这些问题中的某些，肉眼检查商业上可获得的管中的血液样品并且与含有PtPA管中的血液样品比较。结果示于图47-49中。
实施例8a：沉淀和潜在凝结
图47显示来自收集在商业上可获得的Greiner血浆(含有肝素锂)管中收集的血液样品的血浆制剂的结果。管的四个部分被标记(从图的顶部至底部)：血浆、胶状沉淀、分离凝胶、通过离心成团的细胞。胶状沉淀由血纤蛋白原和其他血浆蛋白组成并且在管于2-8℃储存时形成。这一沉淀具有干扰仪器功能和分析物确定的潜力。这些沉淀在～5％的肝素锂血浆样品中发生。
图48显示三种商业上可获得的血清管中血清制备的结果：左边的管(GS)是Greiner血清管；中间的管(BDS)是BD血清管和右边的管(BDT)是BD RST管。管的四部分被标记(从图的顶部至底部)：成团的细胞、分离凝胶、潜在的凝结、血清。离心后(潜在的)凝结在所有三个管的上清液或血清组分中是明显的。将管颠倒以说明凝块的存在。这些潜在的凝块具有干扰仪器和功能测定的潜力。
图49分两部分。左边一半显示从来自三个商业上可获得的管以及具有加入的PtPA的Greiner VacuetteTM无添加管中相同的充分肝素化患者的单个血液样品的血清制剂的结果，三个商业上可获得的管(左至右)：Greiner VacuetteTM血清管(GS)、BD VacutainerTM血清管/SST II(BDS)和BD RST管(BDT)。管的三个部分被标记(从图的顶部至底部)：血清、分离胶、成团的细胞。来自图49的所有四个管被离心之后静置过夜，之后每管中的血清被转移至透明玻璃管中并且如图49的右半部分所示拍照(左至右：GS、BDS、BDT和PtPA管)。通过管侧壁上的凝块形成和血纤蛋白串的观察，来自所有三个商业上可获得的血清显示明显的凝结，但是没有含有PtPA管中制备的血清中沉淀的证据，其具有大大超过用其他样品观察到的澄清度。
实施例8b：肌钙蛋白I水平
已经观察到显示升高肌钙蛋白I(心脏事件的最特别的标记之一)的至少一些假阳性结果归因于血清和血浆样品中的沉淀/潜在的凝结。
使用在商业上可获得的管和含有PtPA的管中制备的血清和血浆样品测量来自64名参与者的血液样品中肌钙蛋白I水平。
在五个商业上可获得的管以及BD RST,和在含有PtPA(1.2μg/4mL)的GreinerVacuetteTM无添加管中制备每个参与者的血清和血浆样品，五个商业上可获得的管为：Greiner VacuetteTM血浆；BD PST II；Greiner VacuetteTM血清；BD SST II，并且使用Beckman Coulter AccuTnI测定分析肌钙蛋白I(TnI)。
如表62中所表明的获得参与者18、20、38和63的四个有差异的结果。参与者18和38是健康的而参与者20和63都是经历心脏手术并接受肝素的患者。获得三个假阳性的结果(参与者18、20和38)。将来自一级管中的等份再离心之后再测定给出阴性结果，如与来自相同血液样品的其他管的结果相比所期望的。另外的结果特别高(参与者63)。等份的再离心和再测定给出可与其他管相比的结果。
样品的离心解决差异的事实强烈表明有差异的结果归因于导致不正确的取样的可能的凝结/沉淀形成。采用PtPA血清未获得有差异的结果。
表62：显示差异的肌钙蛋白I测定结果
Figure GDA0001572940870001051
Figure GDA0001572940870001061
总之，在商业上可获得的管中制备血浆和血清样品期间观察到的沉淀和潜在的凝结代表分析物确定上的显著问题。当PtPA被用于制备血清样品时未观察到沉淀或微凝块形成的证据。
实施例9：血浆和血清样品中血纤蛋白原、降解的血纤蛋白原和血纤蛋白水平
可溶的血纤蛋白原，可溶的部分降解的血纤蛋白原(fdp)和未聚合的血纤蛋白(FDP)是用于本说明书较早部分中讨论的分析物测定的血清和血浆样品中不期望的组分。简单地说，血纤蛋白原/fdp/FDP在高质量血清样品中是极少的以避免在标准血清制备条件之后尤其是静置时进一步转化为不可溶的血纤蛋白(微凝块)。微凝块或血纤蛋白串可干扰仪器并且影响分析物测定。对于通过标准方法制备的血清样品，样品中血纤蛋白原/fdp/FDP的浓度据信取决于患者/个体抗凝结的程度，患者的健康状态(例如肝疾病的存在)、样品收集容器的类型以及在罕见的实例中管中样品的不充分的混合。在这一实例中，研究使用不同管制备的血清和血浆样品中的血纤蛋白原/fdp/FDP的浓度以帮助建立制备“高质量”血清样品的条件。
如下文所描述的通过三明治酶免疫测定(ELISA)测量血清和血浆血纤蛋白原/fdp/FDP浓度。这一测定使用识别可溶的血纤蛋白原、fdp和FDP的抗血纤蛋白原的多克隆抗血清。
ELISA方法需要抗血纤蛋白原抗血清(作为纯化的IgG级分：AHFAS)和抗血纤蛋白原抗血清-辣根过氧化物酶轭合物(AHFAS-HRP)。每种的制剂从MP Biochemical,USA购得。国际血纤蛋白原标准品从NIBSC,London购得并从1mg/mL溶于50％甘油/盐水的工作贮液稀释。
清洗缓冲液由0.05M磷酸盐缓冲液，pH 7.4、0.5M NaCl、0.05％Tween 20和1％BSA组成，而所用的结合缓冲液是0.1M碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6。
通过将AHFAS和AHFAS-HRP贮液1:500稀释在结合缓冲液中来制备抗体的工作稀释液。50mL反应溶液中的HRP底物溶液由20mM四甲基联苯胺、0.4mL的30％H2O2和50μL的0.05M柠檬酸盐缓冲液组成。
通过于4℃将板和AHFAS一起孵育过夜将Nunc ELISA IMMUNOSORB 96孔板(ThermoFisher Scientific,R℃hester,NY)用每孔100μL的AHFAS工作稀释液包被。之后将板用100μL溶于清洗缓冲液中的2％牛血清白蛋白(Sigma Chemical,Co)于4℃封闭过夜并且随后用清洗缓冲液清洗三次。
来自健康志愿者(健康)和患者(心脏病和肾病)的血液样品收集至下列管中：
Greiner血清管(GS或GRS)；
BD血清管(BDS)；
BD RST管(BDT或BD RST)；
具有所加入的来自PtPA储存液4.8mg/mL的1.2μg PtPA的Greiner无添加管(PtPA)；
具有所加入的来自OsPA储存液2.0mg/mL的0.5μg OsPA的Greiner无添加管(OsPA)；
具有所加入的0.6U蛇静脉酶的Greiner无添加管；
具有所加入的1.2U蛇静脉酶的Greiner无添加管；
具有所加入的0.63U/4mL蛇静脉酶的Greiner无添加管(实施例9b)；
具有所加入的1.25U/4mL蛇静脉酶的Greiner无添加管(实施例9c)；
具有所加入的2.5U/4mL蛇静脉酶的Greiner无添加管(实施例9c)；
Greiner VacuetteTM血浆管(GRLH)；
BD VacutainerTM血浆(PST II)管(BDLH)；
用于血浆的Greiner VacuetteTM柠檬酸盐管(3.2％柠檬酸盐)(CIT)；和
用于血浆的Greiner VacuetteTM K2EDTA管(1.5-2.2mg/mL的EDTA)(EDTA)。
上文每管中制备的血浆和血清样品是在标准病理学Queensland(Australia)分析物样品制备程序下制备的，其中将血液收集至每个管中并且将管在于3,000g离心之前静置。将BD RST管，含有PtPA、OsPA和蛇静脉酶的管静置5分钟，而对于所有其余的管，正常血液的静置30分钟而抗凝结血液的精制60分钟。
对于每个管，一式三份放置100μL等份的血浆或血清样品(分别为稀释的1/1,000稀释液和1/10稀释液)。一式两份进行血纤蛋白原标准品的系列稀释液(覆盖1,000ng/mL至10ng/mL浓度范围的11个稀释液)。将板于4℃孵育过夜。
将板用清洗缓冲液清洗六次以将未结合的成分去除并且于4℃与每孔100μL的AHFAS-HRP工作溶液一起孵育过夜。在加入每孔100μL HRP底物溶液之前将板用清洗缓冲液再清洗6次。
在黑暗环境中监测蓝色的显色直到A450nm在1μg/m的血纤蛋白原浓度达到1.0的吸光度。之后通过加入每孔100μL的1.0M硫酸溶液中止反应，产生黄色。之后在ThermoScientific Multiskan Ascent平板读数仪上用Ascent软件于A450nm将板读数。
实施例9a：来自患者的在Greiner血清管(GS)中收集的48个血清样品中的血纤蛋 白原/fdp/FDP水平
使用上文概述的ELISA方法测量来自48个随机选择的需要为了他们的临床病况的分析物测定的患者的来自Greiner血清(GS)管的血清样品中血纤蛋白原/fdp/FDP浓度。
图50显示结果。与这些血浆样品中2.0-5.0mg/mL的血纤蛋白原浓度相比，这些样品中血纤蛋白原/fdp/FDP的浓度范围从4.4-32μg/mL。这些数据显示通过标准的商业上可获得的血清管中的凝结程序除去了大于或等于99％的血纤蛋白原。这些数据还提供了来自医院人群的血清样品的Greiner血清管中血清制剂中血纤蛋白原的参考间隔范围。
实施例9b：正常血清和血浆样品中的血纤蛋白原/fdp/FDP水平
选择36个正常血清样品(通过凝血酶原时间、aPTT和血纤蛋白原测定确定的)研究加入PtPA(300ng/mL或1.2μg/4mL管)对血纤蛋白原/fdp/FDP水平的影响。在Greiner血清管(第一管)中在标准病理学Queensland程序下在将来自每个Greiner血清管的两个相等的1mL血清样品等分至平底塑料管(第二管)中之前制备血清。向一个管中加入PtPA(300ng/mL或1.2μg/4mL管)而向第二个管中加入等体积(50μL)的盐水以提供成对的第二管。
使用上文概述的ELISA方法测量每个第二管中的血纤蛋白原/fdp/FDP浓度并且结果示于图51中。在两个第二管中，残留的血纤蛋白原减少至少于血液中存在的1％。然而加入PtPA将血纤蛋白原/fdp/FDP水平从12.8μg/mL的平均值进一步减少至11.8μg/mL。这一减少在成对的t检验分析中是显著的(p<0.04)。因此，PtPA甚至能够在残留血纤蛋白原/fdp/FDP水平非常低的正常的个体血清中进一步减少血清血纤蛋白原/fdp/FDP。非常少量的残余(<1.0％)可能是与抗体反应但是未能聚合形成不溶凝块的分子。
之后将9个正常血液样品收集至四个不同的血清管中：Greiner血清管、BD血清管、BD RST和含有PtPA的Greiner VacuetteTM无添加管。使用上文概述的ELISA方法测量每个第二管中的血纤蛋白原/fdp/FDP浓度并且结果示于图52中。在含有PtPA的GreinerVacuetteTM无添加管中制备的血清中血纤蛋白原浓度低得多。
之后研究了使用OsPA和蛇静脉酶生产的血清中血纤蛋白原/fdp/FDP的浓度。Greiner血清管(GRS)和含有OsPA(0.50μg/4mL管)、蛇静脉酶(0.63单位/4mL管)和PtPA(1.2μg/4mL管)的Greiner无添加管中从5名正常参与者的血液制备血清样品。使用上文概述的ELISA方法测量每管的血清中血纤蛋白原/fdp/FDP浓度。结果示于图53。在所有实例中，残留的血纤蛋白原/fdp/FDP水平小于血液或血浆中的1％。
实施例9c：从肝素化患者制备的血清样品中的血纤蛋白原/fdp/FDP水平
经历肾透析的患者需要适度的肝素化水平(治疗期间1,000-10,000U的肝素)以避免透析期间的血栓前事件。选择来自这一类别的3名患者检测PtPA管(1.2μg/4mL管)和BDRST管在5分钟孵育时间内有效凝结来自透析患者的血液的能力，与30分钟凝结时间段内在Greiner血清(GRS)和BD血清(BD SST II)收集管中发生的血液凝结相比较。通过使用上文概述的ELISA方法测量各个血清中的血纤蛋白原/fdp/FDP浓度确定凝结的有效性。
结果示于图54中并且显示来自肝素化血液的PtPA生产的血清中血纤蛋白原/fdp/FDP的残留水平可与来自正常血液的PtPA生产的血清中的那些值相比(图51和53)。相反，在GRS、BDS和BD RST管中生产的血清中残留血纤蛋白原/fdp/FDP水平高得多。在这些水平上，潜在的凝块形成和微凝块在肝素存在时是非常有可能的。图54中GRS、BDS和BD RST的值是基于样品单个稀释液的最小估计。
将来自2名心脏手术患者(用25,000-41,000单位的肝素治疗过)的血液样品收集至下列管中：Greiner血浆管、Greiner血清管、BD血清管、BD RST管、具有加入的PtPA(1.2μg/4mL管)的Greiner VacuetteTM无添加管、具有加入的OsPA(0.50μg/4mL管)的GreinerVacuetteTM无添加管、每4mL管具有加入的1.25单位/L的蛇静脉酶的Greiner VacuetteTM无添加管(EC1)或每4mL管具有加入的2.5单位/L的蛇静脉酶的Greiner VacuetteTM无添加管(EC2)。
使用上文概述的ELISA方法确定每管的血清和血浆中的血纤蛋白原/fdp/FDP浓度并且结果示于图55。与血浆和其他血清管相比，在使用含有凝血酶原激活剂的管中获得血清中血纤蛋白原/fdp/FDP浓度大大下降。而且，与其他管中的30分钟和抗凝结血液的管中的60分钟相比，使用含有凝血酶原激活剂的管的凝结的时间仅为五分钟。
总之，含有凝血酶原激活剂的管能够生产具有比使用商业上可获得的血清或血浆管生产的血清样品中更低浓度的残留血纤蛋白原/fdp/FDP的血清样品。对于正常样品来说，影响相对小。然而，对于肝素化样品，与在商业化血清管中制备血清相比凝血酶原激活剂能够生产具有低残留血纤蛋白原的血清。结果表明通过使用凝血酶原激活剂可获得足够低浓度的残留血纤蛋白原/fdp/FDP以避免所有血清样品中潜在的凝结或沉淀。这一从处于高抗凝剂剂量的患者(例如心脏保健、透析)和在来自经历心脏手术的患者的“完全肝素化”的样品生产“高品质”血清的能力是有用的。
实施例10：血浆和血清样品中的血红蛋白浓度
溶血指数通常作为对血清和血浆样品中存在的血红蛋白以及由此细胞溶解的程度的测量用于化学病理学中。所有类型的血液细胞包括红血球、白细胞和血小板的溶解可在体内、血液收集以及血清/血浆制备和放置过程中发生。体外细胞溶解通常在使用小口径针头或通常处于压力下的转移设备的样品收集或样品转移期间发生。体内红细胞降解仅在溶血性贫血中发生。在细胞体外降解期间，细胞内含物释放至血清或血浆中，错误地改变某些分析物的结果；如果大范围溶血的话细胞内含物的释放甚至可以导致其他分析物的稀释。血浆或血清中的血红蛋白可在分析期间导致光谱问题并且其他细胞内含物可交叉反应。血清正常包含比肝素锂血浆稍高的血红蛋白并且这被认为是归因于随着凝块膨胀和收缩而水解少量细胞的凝结过程。因此低血红蛋白浓度是“高品质”血清样品的重要标准。
进行下列实验将在PtPA存在和不存在时生产的血清的血红蛋白含量与使用肝素锂生产的血浆中的相比。从经历柠檬酸盐抗凝结治疗的2名患者和9名健康参与者收集血液样品。将样品收集在Greiner血浆管、Greiner血清管和含有PtPA(1.2μg/4mL的血液)的Greiner VacuetteTM无添加管中。收集后将Greiner血浆管和具有PtPA的GreinerVacuetteTM无添加管离心5分钟而将Greiner VacuetteTM无添加管(无PtPA)离心30分钟。在离心后30分钟内分析样品的血红蛋白。结果示于表63。
表63：血浆和血清样品中的血红蛋白浓度。
Figure GDA0001572940870001111
如根据文献所预期的，血浆样品中平均血红蛋白浓度是55mg/L，Greiner血清中发现的比67mg/L稍低。PtPA血清的平均值是46mg/L，比在Greiner血清中发现的低得多并且甚至比在血浆中发现的更低。平均值的标准偏差大，因为人与人之间的个体差异。他们没有给出用于任何一个人的这三种类型的管之间的差异显著性的评估。为了检查这些差异的显著性，使用来自11个血液样品的数据进行成对的双尾t检验。结果如下：
Greiner血浆比Greiner血清：p＝0.1243
Greiner血清比具有PtPA的Greiner VacuetteTM无添加管：p＝0.0188(统计学上显著的P<0.05)
Greiner血浆比具有PtPA的Greiner VacuetteTM无添加管：p＝0.1038
从这一实施例可得出的结论为：
(1)如根据文献预期的，在Greiner血浆管中制备的血浆样品中的血红蛋白浓度比在Greiner血清管中制备的血清中更低；
(2)具有PtPA的Greiner VacuetteTM无添加管中制备的血清中的血红蛋白浓度比Greiner血清中明显更低。这些血清样品中较低的血红蛋白水平可反应快得多的凝结速度，限制在凝结过程中发生的细胞溶解的量；并且
(3)PtPA血清样品中的平均血红蛋白浓度比血浆样品中更低并且差异具有临界显著性(p＝0.1038)
因此使用PtPA管产生就血红蛋白含量而言比使用商业化的Greiner血清管更高品质的血清。
实施例11：血浆和血清样品中细胞和细胞内含物的存在
在商业上可获得的管中制备的肝素锂血浆含有悬浮的或在离心后与血浆接触的凝胶屏障的顶部的血沉棕黄层中的残留细胞。从商业中可获得的管中的健康参与者样品制备的血清含有更少的与血清接触的细胞(与血浆相比)。血浆和血清在2-8℃储存至少7天是在再分析或需要另外的分析的实例在澳洲的国家病理学实验室注册咨询委员会(NPACC)的常规要求。细胞的存在在血清或血浆的储存和分析期间有两个影响。首先，细胞可以溶解，将细胞内含物(例如K+、乳酸脱氢酶)释放至血清或血浆中。这可导致在离心后立即进行的测量和存储一段时间后的测量之间的显著差异。第二，细胞持续代谢活性并且可在储存时耗尽大量的营养物(例如葡萄糖)并且释放代谢产物(例如乳酸)。当在样品来自于健康参与者时储存通常所建议的30分钟凝结时间，甚至在许多管的血液样品中可观察到变化。
因此细胞污染的程度是血清样品的重要质量标准和使用血清优于血浆的重要优点。
进行下列实验以将使用PtPA制备的血清与使用Greiner血清管制备的血清和使用Greiner血浆管制备的肝素锂血浆比较。血清和血浆样品被细胞和细胞内含物污染的程度可使用几种污染的标记来测定。本文所用的三种细胞污染的标记为：储存时乳酸脱氢酶活性的增加；储存时葡萄糖浓度的降低和对细胞的直接观察。
实施例11a：将PtPA血清与在商业上可获得的管中制备的来自健康参与者的肝素 锂血浆相比较
从10名健康参与者收集血液至Greiner血浆管和含有PtPA的Greiner血清管，如下制备。通过用无菌去离子水充满，颠倒～20次，静置10分钟并且之后将内壁和管帽的内侧部分用无菌棉头擦洗而不破坏凝胶屏障来清理Greiner血清管的内部以除去Greiner前凝血剂/添加剂。丢弃内含物并且将管用去离子水另外充满/颠倒/冲洗3次。将清理后的管最终放置在40℃干燥炉中以在分配PtPA(1.2μg/4mL血液)之前彻底干燥任何水微滴。将来自每个参与者的两个管(Greiner血浆和PtPA)离心并且立即分析乳酸脱氢酶(LD)和葡萄糖(零点时间)水平。将样品(21℃)在室温静置并在～8小时后在同一个分析仪上再次分析。结果示于表64和65。
表64：离心后于21℃储存0和8小时的来自10名参与者的样品的LD活性(U/L)。
Figure GDA0001572940870001131
*＝8小时和0小时之间的差异以及8小时和0小时之间的百分比差异。
表65：离心后于21℃储存0和8小时的来自10名参与者的样品的葡萄糖浓度(mmol/L)。
Figure GDA0001572940870001132
*＝8小时和0小时之间的差异以及8小时和0小时之间的百分比差异。
在来自PtPA管的血清样品中，分别与来自Greiner血浆管样品的12.5％和9.1％的变化相比，LD和葡萄糖结果显示经过8小时时间段的0.6％和1.5％的变化。在血浆样品中，细胞的存在导致葡萄糖消耗而归因于来自溶解的细胞的渗泄露的增加的LD。
结果证实用PtPA凝结血液有效移除细胞并且这避免多达8小时的最受影响的分析物，葡萄糖和LD，上任何显著的变化。因此，血清管中包括PtPA提供来自健康参与者血液样品的高品质稳定血清。
实施例11b：从抗凝结的患者制备的血清和血浆的细胞污染
从恰在血液收集前(肝素灌注后15分钟内)已经接受P1–30000和P2–35000单位的肝素的经历心脏手术的两个参与者(P1和P2)收集血液样品。将样品收集在50mL平底注射器(BD Plastipak REF#300866)中，填充～30mL血液。将注射器在收集的15分钟内运送至实验室。用血液填充下列管：Greiner血浆管、Greiner血清管和含有PtPA(1.2μg/4mL血液)的Greiner血清管(如上文程序预清洁的)。将含有血浆和PtPA的管在到达实验室后立即离心。离心之前将Greiner血清管静置60分钟。分析样品，之后于室温(21℃)静置并且24小时后在相同的分析仪上再分析。结果示于表66和67。
表66:离心后于21℃储存0和24小时测量的来自2名心脏手术参与者的样品的LD活性(U/L)。
Figure GDA0001572940870001141
表67:于21℃储存的离心后0和24小时测量的来自2名心脏手术参与者的样品的葡萄糖浓度(mmol/L)of样品。
Figure GDA0001572940870001142
在PtPA生产的血清样品中，分别与肝素锂血浆中9％,和-14.8％的变化以及血清样品的13％和-13.9％的变化相比，LD和葡萄糖结果显示24小时时-3和-0.9％的变化。与实施例11a的健康参与者组相似，血浆中细胞的存在导致葡萄糖消耗并且随着细胞溶解，LD的活性增加。如所预期的，Greiner血清管显示类似血浆的结果，因为样品从未凝结。
在Greiner血清管中，没有观察到血液凝结，离心后24小时肉眼检测或通过分析仪也没有观察到任何延迟的凝结。含有PtPA的管中的样品在3-5分钟内凝结。将参与者P1的3个管拍照以表明凝结屏障顶部细胞的存在。在PtPA管中，非常少的细胞存在于凝胶屏障之上或之内，与细胞可见在凝胶屏障之中或之上的其他两管相反。
从3个管中的每一个轻柔移除血浆或血清内含物的大部分而没有破坏凝结屏障顶部的层，留下管中约0.5mL的血浆或血清。每管中残留的血浆或血清与血沉棕黄层再混合并且转移至玻片离心机，Cytospin(Shandon-Elliott Cytospin,Shandon-ElliottInstruments Limited)以浓缩细胞并产生细胞、细胞间质等的Giemsa染色玻片，用于显微镜检查。玻片(示于图56中)清楚表明细胞在血浆中大量存在Greiner血清中稍少以及PtPA生产的血清中最少量的细胞。
这些结果证实用PtPA凝结血液在所谓“充分肝素化的”参与者中实现，在非常短的时间(<5分钟)内。离心后，残留细胞的数目很小并且不足以对LD活性和葡萄糖浓度产生影响。
实施例11c：来自一名心脏手术参与者的血清和血浆样品的延长的储存对分析物 的影响
室温(21℃)24小时后来自心脏手术参与者的3个样品于4℃在第一管中储存另外13天(收集后共14天或336小时)并且之后再分析K+、葡萄糖、LD个磷酸盐(Pi)。结果示于表68中。
表68：离心后0、24、336小时测量的来自心脏手术参与者的血清和血浆样品中的分析物浓度
Figure GDA0001572940870001151
Figure GDA0001572940870001161
与肝素锂血浆和来自Greiner管的“血清”不同，PtPA血清样品显示出K+和葡萄糖结果上不显著的变化，而LD和Pi结果显示极小的变化。
在这一极端实例中，使用PtPA生产的血清容易地提供最稳定的样品类型，其允许实验室在较晚时期提供另外的分析物测试并且具有结果将会准确的信心。PtPA样品中LD活性上20％的下降可能归因于储存时已存在的LD的缓慢变性。
整体结论
PtPA生产的血清提供分析物浓度上突出的稳定性，其最可能受到在所有患者中凝结和/或离心过程中从凝胶屏障上方的血浆或血清成分不彻底去除细胞的影响。我们的结果还显示通过直接观察，与从健康参与者或处于高剂量肝素的患者制备的Greiner肝素锂血浆相比，PtPA生产的血清中细胞相对不存在。
实施例12：商业上可获得的管中制备的血浆和血清样品和使用毒液凝血酶原激活 剂(蛇静脉酶、PTPA和OSPA)制备的血清样品中生物化学分析物的测量
在本说明书的较早部分中所讨论的，现有的商业上可获得的血液收集管不能以及时的方式从所有血液样品生产完全凝结的血清以满足来自生物化学实验室的因最佳患者保健而对质量和出报告时间的期望。上文实施例中的结果证明凝血酶原激活剂可被用于在来自各种各样的患者/个体的血液中迅速生产具有低水平血纤蛋白原/fdp/FDP并且没有细胞污染的高品质血清样品(如通过肉眼检测、血清的澄清度和分析所确定的)。
因此重要的是确定凝血酶原激活剂是否能够干扰通常用于患者临床管理的分析物的分析。凝血酶原激活剂是原则上可剪切血清蛋白或参与分析方法的蛋白由此影响分析物结果的蛋白水解酶。蛋白作为感兴趣的分析物或作为用于测量感兴趣的分析物的反应物(例如酶、抗体)参与分析方法。
这一实施例的目的在于研究使用凝血酶原激活剂制备的血清是否给出与使用现有的商业化方法在现有的商业上可获得的管中制备的血浆和血清相同的分析结果。
对从单个血清或血浆管要求并进行超过30种生物化学分析物是不同寻常的。随着分析物的范围增加以及每种分析物的分析体积随技术进步减少，来自单个管的分析的数目将进一步增加。因此，管添加物，尤其是前凝血剂是惰性的并且不对分析物施加任何分析上的影响的但为最精确的分析物评估提供最高品质的样品是必须的。
标准分析测试程序被用于下文所列的33个测定中的每一个的下列实验中：
测试1：钠(Na+)
测试2：钾(K+)
测试3：氯化物(Cl-)
测试4：碳酸氢盐(HCO3 -)
测试5：葡萄糖(Gluc)
测试6：尿素(尿素)
测试7：肌酸酐(Creat)
测试8：尿酸盐(尿酸盐)
测试9：总蛋白(TP或T Prot)
测试10：白蛋白(Alb)
测试11：总胆红素(T Bili)
测试12：碱性磷酸酶(ALP)
测试13：γ-谷氨酰基转移酶(GGT)
测试14：丙氨酸氨基转移酶(ALT)
测试15：天冬氨酸氨基转移酶(AST)
测试16：乳酸脱氢酶(LD)
测试17：肌酸激酶(CK)
测试18：总钙(TCa)
测试19：磷酸盐(Pi或Phos)
测试20：镁(Mg2+)
测试21：脂肪酶(脂肪酶)
测试22：胆固醇(Chol)
测试23：甘油三酸酯*
测试24：高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C或HDL)
测试25：铁(Fe2+)
测试26：转铁蛋白(Trf)
测试27：C反应蛋白(CRP)
测试28：皮质醇测试(Cortisol)
测试29：游离甲状腺素(FT4)
测试30：促甲状腺素(TSH)
测试31：铁蛋白(Ferritin)
测试32：肌钙蛋白(TnI)
测试33：溶血指数(Haem index)**
测试34：黄疸指数*
测试35：脂血指数*
*因为PtPA制剂中甘油的存在，在这些实验中未测量甘油三酸酯。在这一研究中同样未测量黄疸指数和脂血指数。
**还参见实施例10.
测试分析
在Beckman DxC800综合化学分析仪和DxI800免疫测定分析仪(Beckman Coulter,Fullerton,CA,USA)上进行分析。除了遇到再现的潜在凝结时之外，在同一时间并且离心后1-2小时内将样品上样在同一仪器上。
所测试的分析物加上半定量的溶血水平列于结果表格中。分别在Beckman DxC800分析仪和DxI800分析仪上测试35种分析物的两个和三个内部质量控制浓度的轮间系数变量(CV)的不精确度的上限示于表69中。我们也在ACTOPS(Instrumentation Laboratory,Lexington MA,USA)上测量了活化部分凝血激酶时间(aPTT)，因为在于心脏监护病房和和透析参与者的样本收集时难以确定参与者血液样品中精确的抗凝剂浓度。在所有实例中，结果与所列的抗凝结的程度一致。
数据分析
获得每个测试的结果并且之后如下进行数据分析。计算每种管的每个测试的平均和标准偏差。还测量每个测试不同管之间的每个结果对(例如PtPA管结果对比Greiner血清结果类型)之间的差异(实际的和％)。％差异之后与在分析仪上获得的轮间精确值(表69)相比以确定不同血清管之间和不同血清管对比血浆管是否具有分析上显著的差异。参与者数据同样分成健康参与者和抗凝结参与者并且进行相同的分析。如果从三个管中的任一个中没有获得分析物的测量结果(由于重新出现的凝结导致不足够的样本，不足够的样本收集、未在分析仪上要求或不足够的试剂)，那么结果不包含在计算中，说明了每个测试所分析的样本的数目上的变异性。
表69：Beckman DxC800和DxI800分析仪(*DxI800)的品质控制(QC)不精密性
Figure GDA0001572940870001191
Figure GDA0001572940870001201
实施例12a：将PtPA血清与商业化管中制备的血清和肝素锂血浆相比较
共招募61名参与者。所有的61名参与者都是成人，超过18岁，有男性也有女性。参与者由两组组成：26名健康志愿者和35名抗凝结患者。
35名抗凝结患者中，1名是出于低剂量华法林治疗的门诊病人而34名是住院病人。
34名住院病人中，11名经历心脏手术，8名是心脏监护病房患者而15名在透析。
经历心脏手术的11名住院病人在肝素灌注后30分钟内的血液收集时已经接受共25,000-41,000单位的肝素。在患者采用旁路(血液通过机器而不是通过心脏泵送时)时收集样本。
8名心脏监护病房参与者在样本收集前一晚招募并且通过IV灌注接受肝素，每小时950-1450单位的肝素。7名在收集样本时保持IV肝素灌注(在IV肝素灌注开始后≥12小时收集血液)而另一名因为当天的手术而在收集样本(在IV灌注开始后>9小时而IV肝素灌注停止后～3小时收集样品)前大约三小时停止灌注。从患者记录中的信息可知，对参与者来说，注入液中的肝素浓度和输注速度在IV肝素灌注开始和血液收集之间的时间段是不变的。
透析的15名住院患者中，12名处于肝素IV灌注而1名接受华法林/肝素(～1750-7000单位的肝素，初始推注加上每小时注满剂量)而2名接受克赛。在透析开始后至少一个小时时收集来自这些患者的血液。
通过标准化的抽取秩序抽取血液。通过静脉穿刺从健康志愿者抽取血液，经由旁路口从心脏患者抽取血液而通过动脉穿刺针从透析患者抽取血液。使用下列管：
Greiner VacuetteTM柠檬酸盐管(用于凝结研究)；
具有所加入的PtPA(1.2μg/4mL)的Greiner VacuetteTM无添加管(PtPA)；
Greiner VacuetteTM血浆管(GLH)；
BD VacutainerTM血浆/PST II管(BDLH)；
Greiner VacuetteTM血清管(GRS)；
BD血清管/SST II(BDS)；和
BD RST管(BD RST).
用于含有PtPA的管的血液收集在平底注射器中并且之后无需针头从注射器转移至含有PtPA的Greiner管中以使细胞溶解最小化。
允许Greiner血清和BD SST管凝结，健康参与者为30分钟标准时间而抗凝结参与者为60分钟。在上样至离心机之前肉眼检查这些管的凝块形成。
在5分钟时在收集位点(放血或临床病房)肉眼检查所有参与者的凝块形成。将在5分钟形成固体凝块的健康参与者和抗凝结患者的BD RST样本在刚递送至实验室(<20分钟)时离心。如果凝结是不完全的，那么每10-15分钟再次检查样品凝结并且将样品静置凝结最多60分钟。肝素锂和PtPA管在递送至实验室时立即离心(从收集开始<20分钟)。
将所有管于20℃以3000g在swing bucket离心机中离心10分钟并且之后储存于～21℃。离心后立即肉眼检查管的潜在的凝结并且在上样至分析仪之前再次检查。，除了观察到潜在的凝结的实例中以外，这些管(第一管)被用于分析。在观察到潜在的凝结的管中，将第一管中的血清转移至等份管，再离心以除去凝块并且将澄清的血清转移至用于分析的另一个等份管(第二管)中。Greiner无添加管不含有血清凝胶屏障，因此PtPA生成的血清同样转移至用于分析的第二管中以防止与细胞的再混合和长时间接触。
结果
结果示于表70。同样，结果的实例提供于总蛋白(TP)的测量结果的图57中。左边图表显示每种管类型的所有正常患者结果(n＝26)的平均值以及标准偏差值。中间图表显示每种管类型的所有患者结果(n＝61)的平均值。右边图表显示每种管类型的心脏患者结果(n＝11)的平均值。y轴单位是g/L蛋白。误差条是标准偏差。
来自健康和抗凝结参与者的PtPA血清与商业化管血清的比较。未观察到分析物中的任一种的显著差异。这一结论基于表70中平均测试值的比较和上文描述的成对统计学分析。
来自健康和抗凝结参与者的PtPA血清与商业化管肝素锂血浆的比较。如所期望的在一些分析物(K+、TP、AST和Pi)中观察到显著差异，因为血浆和血清之间已经明确的差异。在商业上可获得的血清管中制备的血清显示与用PtPA血清所示的那些相似的与血浆的分析差异。
表70：血清和血浆样品的32种分析物的分析数据。.
Figure GDA0001572940870001221
Figure GDA0001572940870001231
Figure GDA0001572940870001241
*在DxI800免疫测定分析仪上进行的分析。
§表明所用的非参数的分布。p值通过Wilcoxen Matched-Paris Ranks检验来确定。
实施例12b：PtPA、OsPA和蛇静脉酶血清与商业化管中制备的血清和血浆的比较
超募7名参与者，由4名男性和1名女性共5名健康志愿者和经历心脏手术的2名患者(所有均为超过18岁的成人)组成。两名心脏患者在肝素输注后30分钟内已经接受34,000和43,000单位的肝素。
通过使用标准抽取秩序的静脉穿刺抽取来自健康参与者的血液：Greiner柠檬酸盐血浆管；Greiner血清管；Greiner血浆管；用于含有PtPA,OsPA或蛇静脉酶的Greiner无添加管(这些4mL管中凝血酶原激活剂的浓度为PtPA 1.2μg，OsPA 0.5μg和蛇静脉酶0.625单位(用于健康参与者)和1.25单位(用于心脏手术参与者))的平底注射器(Thermo 10mL#CE0197)。来自注射器的血液被转移至含有凝血酶原激活剂的Greiner无添加管中，未用针头以将细胞溶解最小化。
对于心脏参与者，当采用旁路时将血液收集在平底注射器(30mL)中。将血液在15分钟内递送至实验室并且分配于上文所列的不同管中。
允许Greiner血清管凝结，健康参与者为30分钟标准时间而心脏手术参与者为60分钟，并且之后在上样至离心机之前肉眼检查这些管的凝块形成。在收集位点(健康参与者的放血和心脏手术参与者的临床病房中)于3和5分钟标记肉眼检查所有参与者的PtPA、OsPA和蛇静脉酶样本的凝块形成。肝素锂、PtPA、OsPA和蛇静脉酶管在递送至实验室时立即离心(从收集开始<30分钟)。
将所有管于20℃以3000g在swing bucket离心机中离心10分钟并且之后储存于～21℃。离心后立即肉眼检查管的潜在的凝结并且在上样至分析仪之前再次检查。Greiner第一管被用于分析。Greiner无添加管不含有血清凝胶屏障，因此使用凝血酶原激活剂生成的血清转移至等份(第二)管中以防止与细胞的再混合和长时间接触。
结果
结果示于表71并且支持下列结论：
1、比较通过凝血酶原激活剂生产的血清对比Greiner血清—未观察到任何分析物上的显著差异。
2、比较通过凝血酶原激活剂生产的血清对比Greiner肝素锂血浆—如所期望的观察到某些分析物(K+,TP,AST和Pi)上的显著差异，因为以已经明确的血浆和血清之间的差异。在商业化血清管中制备的血清显示与用凝血酶原激活剂血清所示的那些相似的与血浆的分析差异。
表71：来自三种不同的蛇前凝血剂和Greiner管的每种分析物的数据。
Figure GDA0001572940870001251
Figure GDA0001572940870001261
Figure GDA0001572940870001271
§表明所用的非参数的分布。p值通过Wilcoxen Matched-Paris Ranks检验来确定。
*在DxI800免疫测定分析仪上进行的分析。
实施例12的概括
所有健康参与者和范围从最低剂量至最高的“充分”肝素化的参与者的抗凝结的参与者的血液在含PtPA,OsPA和蛇静脉酶的管中在5分钟内凝结以产生坚实稳固的凝块。肉眼观察或通过分析仪检测均未在由凝血酶原激活剂生产的任何血清中观察到潜在的凝结。尽管凝血酶原激活剂是蛋白水解酶，但它们没有对所测量的任何分析物产生分析或临床上的影响，无论分析物是否是蛋白或者蛋白是否被用作分析方法中的反应化合物。在商业化管制备的血清和使用凝血酶原激活剂制备的血清之间未观察到任何分析物上的显著差异。商业化管中制备的肝素锂血浆和使用凝血酶原激活剂制备的血清之间观察到分析物上的分析和临床差异与所公开的数据一致。
实施例13：商业化管中制备的血浆和血清样品和使用毒液凝血酶原激活剂 (notecarin和carinactivase-2)制备的血清样品中生物化学分析物的进一步测量
这一实施例从实施例12而来并且使用其中所描述的相同的方法。
实施例13a：分析物测量
来自5名健康参与者的血液被收集至Greiner无添加管(Cat No 454001)，所述管已经加入25μL的notecarin或carinactivase-2以分别产生12nmol/mL和45nmol/mL的浓度。Greiner Vacuette血清管(Cat No 456078；GS)被用作对照。离心前使GS管按照制造商的建议凝结30分钟。加入血液时立即观察含有凝血酶原激活剂的管的凝结。
Notecarin和carinactivase-2管在2分钟内凝结并且所述管在收集的7至15分钟内被带至实验室并离心。含有激活剂的管中形成的凝块是固体并且未观察或检测到潜在的凝块形成。
之后分析样品的31种分析物并且结果示于表72。对于27种分析物，所获得的值在实验误差内相等，具有少于最少显著变化(LSC％)的成对结果之间的差异。可如下文解释其中差异大于所述LSC(高亮的)的结果：
(1)对于LD，两个凝血酶原激活剂样品中稍低的活性可能反应与Greiner血清相比这些降低的细胞污染；
(2)Notecarin样品中高的甘油三酸酯(Trig)水平归因于储存Notecarin的甘油的干扰。
(3)Notecarin血清产生较高的AST水平，然而该差异是临床上不显著的；
(4)对于精确区分来说五名患者的肌钙蛋白结果过低。
表72：由notecarin和carinactivase-2产生的血清样品的分析结果。
Figure GDA0001572940870001281
Figure GDA0001572940870001291
在Beckman DxC800和*DxI800免疫测定仪上进行分析。
§＝不止是LSC和/或CAL不同的那些结果。
实施例13b：分析物稳定性
清洗Greiner血清管(用蒸馏水X5)除去表面活性剂和前凝血剂但保留凝胶屏障，之后烘干。将Notecarin和carinactivase-2(25μL等份)加至管中分别产生12nmol/mL和45nmol/mL的浓度。从健康志愿者收集血液(5mL)至含有notecarin的一个管和含有carinactivase-2的一个管中。5分钟后将管离心。血清制备后以3倍间隔确定K+、葡萄糖、LD和磷酸盐水平。将样品于23℃储存5小时，之后于4℃储存5至26.5小时。同样测量血红蛋白的水平。
结果示于表73。
表73:通过Notecarin和carinactivase-2生成的血清样品中分析物的稳定性
Figure GDA0001572940870001292
Figure GDA0001572940870001301
50mg/L的血红蛋白水平被认为是临床上不显著的。因此这些结果表明通过凝血酶原激活剂生产的血清样品实际上不含血红蛋白(因此，在凝结过程中有非常少的溶血)并且不含细胞污染物。如果细胞或细胞碎片存在，那么预期在储存时K+、LD和磷酸盐的浓度增加而葡萄糖的浓度减少。获取血清样品并且使用Cytospin方法分析细胞。检测到非常少的细胞。
总之，基于凝结的完全性、分析结果和细胞污染物的不存在，使用组B凝血酶原激活剂(carinactivase-2)和组D凝血酶原激活剂(notecarin)制备的血清样品具有高品质。
实施例14：在商业化管中制备的血浆和血清样品以及使用含有凝血酶原激活剂的 毒液制备的血清样品中生物化学分析物的测量
这一实施例使用实施例12和13中所描述的相同的分析物分析方法。
在前述实施例中获得的发现令人惊讶地证实蛇毒液凝血酶原激活剂将适于用作临床环境中的前凝血剂。那么这提出了含有这些凝血酶原激活剂的粗制毒液是否可被用于血液凝结装置而无需之前的凝血酶原激活剂的纯化的问题。
因此设计并且进行下列实验以显示毒液是否可被用于从人血液样品迅速生产高品质血清。所用的毒液的量大约是在前述实验中所用的纯化的凝血酶原激活剂的量的四倍，反应出毒液除了凝血酶原激活剂还含有其他蛋白的事实。
实施例14a：粗制东部拟眼镜蛇和太攀蛇毒液作为凝结管中前凝血剂的使用
从2名健康志愿者收集血液至含有2和4μg(4μg太攀蛇毒液一式两份)的东部拟眼镜蛇或太攀蛇毒液的10个Greiner无添加管(#454001,Griener Bio-One,Kremsmuster,Austraia)(4mL容量)。同样将血液样品收集至Greiner标准血清管(#456071,Greiner Bio-One,Kremsmuster,Austraia)用于比较。
在2分钟内通过肉眼观察含有毒液的管中的凝结似乎是完全的。15分钟后将含有毒液的管中的样品离心而30分钟后将Greiner血清管中的离心。于20℃在3000g将样品离心10min(Hereaus 1S-R centrifuge,Germany)。来自Greiner无添加管的血清立即转移至Beckman平底塑料管(#448778,Beckman coulter,Brea,CA,USA)用于观察和分析。在大约一半(10个中的6个)含有毒液的管中观察到潜在的凝结而在Greiner血清管中均未见到。这表明在某些管中，凝结在所用的毒液浓度是不完全的。将平底塑料管中的样品再离心除去细胞、细胞间质和潜在的凝结并且在2小时内对所获得的澄清血清分析31种分析物。在离心后两小时内在Beckman DxC800综合化学分析仪和DxI800免疫分析仪(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)上进行对31种分析物的样品分析。在所测试的浓度水平从12个血清获得的结果之间没有临床上显著的差异(4个东部拟眼镜蛇血清和6个太攀蛇血清和2个Greiner血清).
结果示于表74中。
Figure GDA0001572940870001321
Figure GDA0001572940870001331
Figure GDA0001572940870001341
§＝不止是CAL不同的结果。
在Beckman DxC800和*DxI800分析仪上进行分析，Br2–褐蛇毒液2.0μg；Br4–褐蛇毒液4.0μg；T2–太攀蛇毒液2.0μg；T4和T4R–太攀蛇毒液4.0μg。
总之，我们已经发现粗制东部拟眼镜蛇和太攀蛇毒液是用于在血液凝结管中生产血清的有力的前凝血剂。需要确定最佳浓度以避免潜在的凝结并维持分析完整性。
实施例14b：粗制锯鳞蝰毒液作为凝结管中的前凝血剂的使用
进行下列实验以显示锯鳞蝰毒液是否可被用于从人血液样品迅速产生高品质血清。
从2名健康志愿者收集血液至含有4μg锯鳞蝰毒液的10个Greiner无添加管(#454001,Griener Bio-One,Kremsmuster,Austraia)(4mL容量)。同时将血液样品收集至Greiner标准血清管(#456071,Greiner Bio-One,Kremsmuster,Austraia)用于比较。
在3分钟内通过肉眼观察含有毒液的管中的凝结似乎是完全的。10分钟后将含有毒液的管中的样品离心而30分钟后将Greiner血清管中的离心。于20℃在3000g将样品离心10min(Hereaus 1S-R centrifuge,Germany)。来自Greiner无添加管的血清立即转移至Beckman平底塑料管(#448778,Beckman coulter,Brea,CA,USA)用于观察和分析。在含有毒液的管或Greiner血清管中均未观察到潜在的凝结。将平底塑料管中的样品再离心以在血清转移期间除去任何细胞并且在2小时内对所获得的澄清血清分析31种分析物。在离心后两小时内在Beckman DxC800综合化学分析仪和DxI800免疫分析仪(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)上进行对31种分析物的样品分析。结果示于表75中，在所测试的浓度水平锯鳞蝰和Greiner血清获得的结果之间AST和HDL有临床上显著的差异而其他分析物没有。
表75：通过锯鳞蝰毒蛇毒液产生的血清样品的分析结果。
Figure GDA0001572940870001351
Figure GDA0001572940870001361
Figure GDA0001572940870001371
§＝结果不止是CAL不同。
在Beckman DxC800和*DxI800分析仪上进行分析，EC4-锯鳞蝰毒液4.0μg。
因为有初步结果，需要进一步的研究明确AST和HDL结果上为何有临床上显著的差异。
总之，我们已经显示粗制锯鳞蝰毒液在血液凝结管中作为前凝血剂的使用是可行的。需要精确确定最佳浓度和对分析物干扰的进一步研究以避免潜在的凝结并维持分析完整性。
实施例15：稳定性研究
对于用作血液收集装置的组分的毒液凝血酶原激活剂，其必须满足三种类型的稳定性需要：
(1)批量储存期间的稳定性：其在纯化后在所述管的制造中使用前的时间段需要是稳定的。为了供给的确定性，这一储存期间可以是几个月。储存可以是作为浓缩的水溶液或者是冷冻干燥的固体。如果需要储存可以是冷冻条件下。
(2)制造期间的稳定性：其需要在血液收集装置制造过程中稳定。这一过程可能包括向已经含有其他组分例如分离凝胶、表面活性剂和可能的微粒前凝血剂的管加入等份的凝血酶原激活剂储存液。之后是干燥获得凝血酶原激活剂的表面层、真空下密封管并且通过放射灭菌。
(3)装置在其使用之前储存期间的稳定性：对与激活剂来说于室温，例如23℃，保持接近完全活性至少12个月的时间段是必须的，优选地在更高温度更长时间。
迄今为止进行的实验表明将找到满足毒液凝血酶原激活剂中的一些的这些需要的条件。
实施例15a：批量储存期间的稳定性
确定当维持在一定范围的温度时在平底塑料Eppendorf管中作为pH 7的磷酸盐缓冲的盐水中的稀释溶液的PtPA的稳定性。血浆凝结测定的结果示于图58中。结果显示于4或25℃两周(336小时)后凝结活性没有明显的凝结活性损失。当测量PtPA对因子Xa显色底物S-2222的活性时获得相似的结果。在37℃，PtPA在168小时候损失显著的量的活性。
在相关实验中，证实pH 7.4是储存的最佳温度并且向储存缓冲液加入钙离子稳定血浆凝结活性。
这些实验表明发现PtPA和紧密相关的OsPA的批量储存条件以使它们在储存延长的时间段时保留所有或几乎所有活性是可能的。
实施例15b：制造期间的稳定性
进行实验以确定γ放射对作为稀释溶液加至血液收集管的OsPA的影响。
将储存的OsPA(1.089mg/mL；4.36mM)用0.02M Hepes缓冲液pH 7.4以1：25溶液稀释。将50μL加至5个没有其他添加物的被γ放射(16megaBeq)的平底血液管中的每一个以及未被放射的5个相似的管。相似地，将50μL的稀释OsPA加至10个Greiner含有二氧化硅的血液收集管(Greiner血清管)并且这些管中的5个被放射。
γ放射之后，所有管用0.02M Hepes缓冲液pH 7.4补充至2.0mL。之后采集等份并测试对S-2765的水解活性并且使用具有所加入的10mM钙的正常柠檬酸盐血浆测试凝结活性。
结果示于图59和60，并且显示放射对于对再钙化的柠檬酸盐血浆的凝结活性或抗显色底物S-2765的水解活性没有影响。
向平底血液收集管加入OsPA(1.5nM)显示与新鲜稀释的OsPA相比活性的显著损失。其可通过OsPA与平底塑料管的疏水结合来解释。向含有二氧化硅的血液收集管加入OsPA显示恢复超过95％的水解和凝结活性。再次，用γ放射处理观察到没有损失活性。
总之，血液收集管中OsPA的γ放射没有影响水解或凝结活性。向含有二氧化硅、凝胶屏障和表面活性剂的凝结管加入OsPA是迄今为止确定的在不到1分钟内凝结正常血液的最有效的组合。
实施例15c：装置储存期间的稳定性
将OsPA在0.02M Hepes缓冲液，pH 7.4中的稀释溶液(1.5nM)的等份(50μL)放置在Greiner标准血清管。将每个管旋转以用OsPA包被表面并且将管放置在真空提取器中并且在于23℃应用低真空3天干燥之前通过无水氮气流清洗。打开提取器，用氮气冲洗并且再密封管。之后将管维持在室温(23℃)。特定时间之后，将三个管打开，将内含物再溶解于2mL水中并且对因子Xa特异性底物S-2222测定。结果示于图61中，并且显示OsPA对S-2222的活性(如A405/min中的增加所表示的)在于23℃作为Greiner血清管中的无水表面层储存14天实际上未改变。一式三份进行所有测定。在图61中，右手边条是OsPA储液的新鲜稀释的样品(4.05uM)的活性并且其活性与在管中发现的相同，显示被用于制备管过程没有导致OsPA活性的任何显著损失。
实施例16：血液收集管的制备
所有商业化血清和血浆管现在都是塑料的并且含有已经由供应者开发以增强在其中制备的样品的品质的多种组分。如上文所讨论的，用于制备血清样品或血浆样品的一些容器(例如管)包含：
(1)帮助在离心后将细胞与上清液(血清或血浆)分离并限制再混合的凝胶屏障。将凝胶作为温热的液体加入，其在冷却至室温时凝固；
(2)喷涂在塑料管内表面上在凝胶屏障之上的表面活性剂，以减少细胞、碎片和凝结材料的附着以及细胞溶解；以及
(3)前凝血剂/抗凝剂，通常是微粒，作为悬浮液喷涂在管内表面上在表面活性剂之上。
本发明考虑包含如上文所描述的组分(1)、(2)和(3)的血清管(例如塑料管)，其中所述管通过首先向管加入组分(1)和(2)并且随后向管加入组分(3)制备。组分(3)包含前凝血剂，其包含凝结组合物，所述凝结组合物包含如本文所定义的凝血酶原激活剂、基本由如本文所定义的凝血酶原激活剂组成或由如本文所定义的凝血酶原激活剂组成，例如组分(3)可包含在某些商业化血清管中使用的现有的微粒前凝血剂。每管中凝血酶原激活剂的量可使用上文详细描述的实验性结果和本领域中的常规技术来确定。之后将管抽空并且无菌加盖。之后将管于室温储存。
同样预期含有组分(3)并且任选地含有组分(1)和/或(2)的血清管(例如塑料管)。每管中凝血酶原激活剂的量可使用上文详细描述的实验性结果和本领域中的常规技术来确定。将管抽空并且无菌加盖。之后将管于室温储存。
实施例17：即时实施方案
如上文所“即时”测试意指测试在患者护理处位点处或附近进行。即时测试在医院和需要快速结果的其他环境中变得越来越流行。其使用多种装置来实现，其中一些是相对便宜，小的并且便携的。
在现有的实行中，许多即时装置如下工作：将一微滴血液放置在保留血液细胞但允许血浆扩散通过膜进入具有进行许多分析的许多通道的微流体装置中的膜上。如其他地方所讨论的，作为生物化学和其他病理学测定的样品，血清优选于血浆。在这一实施方案中，本发明预期使用包含凝血酶原激活剂，基本由凝血酶原激活剂组成或由凝血酶原激活剂的凝结组合物的以在设计用于即时测试的装置中生产血清。
在一个这样的装置中，适于医院和医生手术使用，通过静脉穿刺获得的血液样品被收集至含有包含凝血酶原激活剂，基本由凝血酶原激活剂组成或由凝血酶原激活剂组成的凝结组合物的注射器(或类似物)中，所述组合物在～30秒内获得。设计装置以允许过滤或离心以迅速将血清从凝块分离。如此获得的血清被用于现有的用于生物化学或其他病理学测定的微流体装置中，具有随所分析的样品是血清而不是现有即时装置中所用的血浆而增加的分析物的范围。而且，可保留血清的样品以允许病理学实验室中另外的分析。
本文描述的注射器中的过滤装置可包含允许将血浆在5分钟后推动通过的过滤装置用于分析。适合地，如图62中所说明的，将注射器分为隔室，具有如下标记的注射器：
A–具有血液收集针头接器的入口，所述针头接器被拧松以将突出的组件降至最低；
B–分配血清的口或即时样品针头的进入点；
C–允许血液单向进入并阻止血液被推进血清隔室的瓣膜；
D–允许血清被推出进入血清隔室的活塞过滤器(注射器的前部分)；
E–为血液打开以进入血液隔室。
F–凝结发生的隔室。
在图62中，G被所述凝结组合物在内部包被以设定适当的凝结过程。之后将其推动以强迫血清通过过滤器(D)。
在另一个这样的装置中，即时装置包括毛细管系统，其中装置的一部分被包含凝血酶原激活剂和将血清吸取至用于分析的反应室中的被吸收物，基本由凝血酶原激活剂和将血清吸取至用于分析的反应室中的被吸收物组成或由凝血酶原激活剂和将血清吸取至用于分析的反应室中的被吸收物组成的凝结组合物包被。
在另一个这样的装置中，包含凝血酶原激活剂，基本由凝血酶原激活剂组成或由凝血酶原激活剂组成的凝结组合物与微流体装置的膜偶联以便获得放置在膜上的血液微滴的迅速凝结。如此形成的血清扩散至装置中并且取代在这些装置中现在分析的血浆而被分析。
实施例的概述
以及时的方式获得适于分析的样品在临床化学服务供应中是关键的。血清被认为是更干净的样品但是因为需要完全的凝结所需的时间(标准程序中确保大多数现在可获得的商业化管中完全凝结的30分钟加上分析时间)以及抗凝结治疗的患者数目的不断增加，通常使用血浆，尤其是在医院环境中。然而，潜在的凝结(离心后的凝结)可在血浆样品中发生，导致分析误差和重要结果的延迟提交。这些问题中的一些在上文实施例中说明。
上文实施例中的结果同样显示使用凝血酶原激活剂可从来自各种各样患者的血液样品中迅速获得高品质的血清，包括用抗凝剂处理的患者。它们为肝素锂血浆和常规血清管提供适合的可选方案，通过：
–使得凝结过程在～<5分钟(将样品递送至实验室所花费的时间)内完成，允许在血液样品收集后迅速分析并且由此可与血浆管的时间相比较并且好于最常用的血清管的那些的迅速的解决时间；
–同时为来自健康的和可在临床环境中遇到的所有抗凝结个体的血液提供高品质血清样品，其具有最小的来自细胞碎片的分析物干扰和/或潜在的微凝结；和
–产生适于通常用于临床环境中的非常宽范围的测定的单个血清样品，所述血清样品在分析物分析上优于血浆并且单个样品减少不足资源(危重患者中的血液、收集较少的血液管的工作人员时间和消耗品)的负荷。
整个说明书中目的在于描述本发明的优选的实施方案而未将本发明限制于任何一个实施方案或特征的特定集合。本领域那些技术人员应当理解的是根据本公开内容，可在所示例的实施方案中进行各种修改和变化而不脱离本发明的范围。所有这样的修改和变化预期包含在所附的权利要求的范围内。
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Claims (28)

1.一种真空血液采集容器，用于制备用于检测血清样品中存在的感兴趣的分析物的所述血清样品，其中所述容器含有至少部分纯化的蛇毒凝血酶原激活剂，其中所述容器是抽真空的以用于将受试者的血液采集到所述容器中。
2.根据权利要求1所述的真空血液采集容器，还具有可穿刺的隔膜或盖子。
3.根据权利要求1所述的真空血液采集容器，还含有表面活性剂。
4.根据权利要求1所述的真空血液采集容器，其中所述凝血酶原激活剂是组A凝血酶原激活剂。
5.根据权利要求4所述的真空血液采集容器，其中所述组A凝血酶原激活剂选自蛇静脉酶和basparin。
6.根据权利要求1所述的真空血液采集容器，其中所述凝血酶原激活剂是组B凝血酶原激活剂。
7.根据权利要求6所述的真空血液采集容器，其中所述组B凝血酶原激活剂选自carinactivase-1和、carinactivase-2和multactivase。
8.根据权利要求1所述的真空血液采集容器，其中所述凝血酶原激活剂是组C凝血酶原激活剂。
9.根据权利要求8所述的真空血液采集容器，其中所述组C凝血酶原激活剂选自pseutarin C、oscutarin C和Omicarin C。
10.根据权利要求1所述的真空血液采集容器，其中所述凝血酶原激活剂是组D凝血酶原激活剂。
11.根据权利要求10所述的真空血液采集容器，其中所述组D凝血酶原激活剂选自porpharin D、notecarin D、trocarin D、hopsarin D和notenarin D。
12.至少部分纯化的蛇毒凝血酶原激活剂用于制备用于检测分析物的血清样品的用途，其中所述凝血酶原激活剂是组A凝血酶原激活剂。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述组A凝血酶原激活剂选自蛇静脉酶和basparin。
14.至少部分纯化的蛇毒凝血酶原激活剂用于制备用于检测分析物的血清样品的用途，其中所述凝血酶原激活剂是组B凝血酶原激活剂。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述组B凝血酶原激活剂选自carinactivase-1和、carinactivase-2和multactivase。
16.至少部分纯化的蛇毒凝血酶原激活剂用于制备用于检测分析物的血清样品的用途，其中所述凝血酶原激活剂是组C凝血酶原激活剂。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述组C凝血酶原激活剂选自pseutarin C、oscutarin C和Omicarin C。
18.至少部分纯化的蛇毒凝血酶原激活剂用于制备用于检测分析物的血清样品的用途，其中所述凝血酶原激活剂是组D凝血酶原激活剂。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述组D凝血酶原激活剂选自porpharin D、notecarin D、trocarin D、hopsarin D和notenarin D。
20.一种制备用于检测所感兴趣的分析物的血清样品的方法，所述方法包括将血液样品与至少部分纯化的蛇毒凝血酶原激活剂在足以制备所述血清样品的条件下接触一段时间，其中所述凝血酶原激活剂是组A凝血酶原激活剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述组A凝血酶原激活剂选自蛇静脉酶和basparin。
22.一种制备用于检测所感兴趣的分析物的血清样品的方法，所述方法包括将血液样品与至少部分纯化的蛇毒凝血酶原激活剂在足以制备所述血清样品的条件下接触一段时间，其中所述凝血酶原激活剂是组B凝血酶原激活剂。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述组B凝血酶原激活剂选自carinactivase-1和、carinactivase-2和multactivase。
24.一种制备用于检测所感兴趣的分析物的血清样品的方法，所述方法包括将血液样品与至少部分纯化的蛇毒凝血酶原激活剂在足以制备所述血清样品的条件下接触一段时间，其中所述凝血酶原激活剂是组C凝血酶原激活剂。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述组C凝血酶原激活剂选自pseutarin C、oscutarin C和Omicarin C。
26.一种制备用于检测所感兴趣的分析物的血清样品的方法，所述方法包括将血液样品与至少部分纯化的蛇毒凝血酶原激活剂在足以制备所述血清样品的条件下接触一段时间，其中所述凝血酶原激活剂是组D凝血酶原激活剂。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述组D凝血酶原激活剂选自porpharin D、notecarin D、trocarin D、hopsarin D和notenarin D。
28.一种检测感兴趣的分析物的方法，所述方法包含提供根据权利要求20-27任一项的方法制备的血清样品和分析所述血清样品的所述感兴趣的分析物的存在或量。
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