KR20140014071A - 혈청 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 병리학 및 다른 생물학적 분석법을 위한 고품질의 혈액 혈청 샘플을 생산하기 위한 프로트롬빈 활성제를 함유하는 응고 조성물의 용도, 및 이러한 응고 조성물을 함유하는 용기 및 관련된 사용 방법에 관한 것이다.

Description

혈청 제제{SERUM PREPARATION}

본 출원은 전체 내용이 본 명세서에서 참조로 인용된 2010년 9월 20일에 출원된 "혈청 제제"라는 제목의 호주 가출원 제2010904233호의 우선권을 주장한다.

본 발명은 일반적으로 병리학 및 다른 생물학적 분석법을 위해 고품질의 혈액 혈청 샘플을 생산하기 위한 응혈원(procoagulant)을 사용하는 방법에 관한 것이다.

튜브를 포함한 혈액 수집 장치는 혈청(serum) 또는 혈장(plasma)을 생산하기 위해 혈액을 수집하는데 사용되고, 이들은 차례로 생화학적 또는 다른 병리학적 분석법을 위해 사용된다.

혈청은 혈액 샘플을 응고되게 둔 후, 샘플을 원심분리시켜 혈청으로부터 세포를 포함한 혈전(blood clot)을 분리시킴으로써 생성된다. (유리 대신) 플라스틱 튜브가 현재 전형적으로 사용되고, 응고 과정을 향상시키기 위해 (종종 미크론화된 실리카 입자인) 응혈원을 필요로 한다. 혈청 튜브에서 응고시간이 지나치게 길다고 여겨지는 경우인 긴급 결과를 필요로 하는 경우가 아닌 한, 혈청은 보통 생물학적 실험에서 혈장보다 선호된다. 응혈원이 존재하는 경우에도, 대부분의 시판중인 튜브에서 제조사에 의해 권장된 최소 요구 응고시간은 정상 환자로부터 수득한 혈액 샘플에 대해 30분이고, 와파린 또는 헤파린과 같은 항-응고 치료제를 복용하는 환자로부터 수득한 샘플에 대해 훨씬 길다(전형적으로 60분 이상). 응급 상황(응급실, 집중 치료, 수술실 등)에서는, 환자 샘플을 위한 상기 시간은 지나치게 길기 때문에, 훨씬 빨리 생산될 수 있는 혈장이 종종 혈청에 비해 선호된다. 이러한 문제를 해결하기 위한 주장된 대안은 혈액 샘플에서 혈액 응고의 속도 및 정도를 증가시키기 위해 고안된 트롬빈을 함유하는 벡톤-디킨슨(Becton-Dickinson)에 의해 최근 개발된 혈청 생산을 위한 혈액 수집 튜브(BD 래피드(rapid) 혈청 튜브, BDT 또는 BD RST라고 표기됨)이다.

혈장은 항응고제를 함유하는 튜브에서 혈액을 수집한 후, 이어서 수집 직후 수행되어 세포를 분리하고, 이로써 분석용 혈장을 수득할 수 있는 원심분리에 의해 형성된다. 리튬 헤파린은 이러한 튜브에서 가장 흔히 사용되는 항응고제이다. 시트레이트, 나트륨 플루오라이드/칼륨 옥살레이트 및 EDTA가 소수의 다른 분석물질의 측정을 위해 혈장을 생산하기 위한 일부 튜브에서 사용될 수 있는 다른 항응고제이다.

불완전 응고

혈청 샘플을 생산하기 위한 응고 과정은 피브리노겐(fibrinogen)을 소모하고, 피브린(fibrin)의 망 내에 혈소판 및 다른 세포를 잡아 둔다. 원심분리시, 혈청은 수집 장치 내의 혈청 분리기에 의하거나 또는 2차 용기로 혈청을 분취(aliquoting)함으로써 혈전으로부터 분리되어 세포와의 접촉이 방지된다. 상기 분리는 샘플이 연장된 시간 동안 안정하게 유지되도록 해준다. 상기 안정성은 샘플이 즉시 분석되지 않거나, 재분석 또는 추가 분석이 요구되는 경우 특히 중요하다.

일부 혈청 샘플의 경우, 권장된 대기시간 후에도 응고가 불완전하다. 이 불완전 응고의 문제는 항응고 치료를 받는 환자 또는 항응고화된 탭(tap)이나 캐뉼라(cannula)로부터 수집되는 표본(specimen)에서 특히 우세하다. 수집 동안 항응고제로 표본이 오염될 수도 있다. 이러한 혈액은 응고까지 제조자의 권장 대기시간보다 훨씬 오래 걸리거나, 또는 실은 표준 혈청 튜브에서 완전히 응고되지 않을 수도 있다(예를 들어, 완전히 헤파린화된 심장 수술 환자로부터 얻은 혈액). 혈청 샘플이 응고가 완결되기 전에 원심분리되면, 응고가 혈청에서 계속되어, 혈전, 마이크로혈전 또는 분석기 또는 분석물질 특이적 문제를 야기할 수 있는 피브린 스트링 형성을 야기할 수 있다. 샘플 조제 동안 마이크로혈전 및 피브리노겐 스트링의 형성은, 특히 낮은 온도에서 저장 후 단계에서, 혈장 튜브에서 발생할 수 있다. 혈액 수집 후 리튬 헤파린 튜브의 역전(inversion)이 시기적절하게 없으면 고무 마개 주위로 작은 혈전 형성이 야기될 수 있다. 시기적절한 방식으로 헤파린화되지 않은 혈액의 작은 방울이 응고될 것이고, 혈전은 헤파린화시 분해되지 않는다.

가장 작은 혈전조차도 임상적으로 유의미한 오차를 일으킬 수 있다. 따라서, 정확성을 위해, 샘플은 피브린 가닥 또는 혈전이 없는지 확인하기 위해 허용된다면 자동 탐지 시스템을 사용하여 또는 눈으로 수동적으로 확인되어야 한다. 불용성 물질의 가닥 또는 혈전이 존재한다면, 샘플은 테스트 분석 전에 새로운 용기로 서브-샘플링(sub-sampling) 및 재-원심분리를 필요로 한다. 반복되는 잠재적 응고를 나타내는 샘플은 리튬 헤파린 튜브로 옮겨 발생하는 응고를 멈출 필요가 있다. 이러한 행위는 추가적인 시간이 걸린다. 게다가, 피브린 가닥 또는 혈전은 항상 탐지되는 것은 아니며(예를 들어, 이들은 심지어 분석기 샘플링 후에서 발생할 수 있다), 이어지는 샘플링 오차는 부정확한 결과를 근거한 환자 치료 결정을 야기할 것이다.

혈장 튜브에서 세포 오염

혈장 튜브에서 수득한 표본, 리튬 헤파린 혈장은 구체적으로 세포로 오염될 수 있다. 원심분리시 리튬 헤파린 겔 튜브는 항상 혈장의 바닥에서 겔의 상부 상에 작은 "연막(buffy coat) 유사층"을 나타낼 것이다. 이 층은 피브린, 세포 및 세포 간질(stroma)을 함유한다. 원심분리 동안 빠른 겔 이동은 혈장에 일부 세포를 남긴다. 혈장 표본이 혼합된다면(예를 들어, 서브-샘플링 또는 핸들링 동안), 세포-함유 물질 및 피브린의 현탁액에 기인하여 탁해질 것이고, 이는 표본의 완전성(integrity)을 감소시킨다. 또한, 혈소판 응집체가 형성될 수 있고, 이는 피브린 및/또는 백혈구를 함유할 수 있다. 이들 응집체는 육안으로 볼 수 있을 정도로 충분히 크고, 전형적인 백색 색상 때문에 "백색 입자 물질(white particulate matter)"로 불리며, 전술한 불완전 응고와 유사한 문제를 나타낸다.

샘플에서 세포의 존재는 분석물질 농도에 영향을 줄 수 있다. 특정 분석물질(예, 글루코즈)은 세포 활성에 의해 감소될 수 있고, 다른 것들은 누출 또는 세포 용해에 의해 증가될 수 있다(예, 락테이트 디하이드로게나아제, 칼륨, 포스페이트).

분석물질 간섭

일반적으로 혈청 또는 혈장 튜브에서 측정되는 분석물질의 농도에서 차이가 없음에도 불구하고, 일부 예외가 존재한다.

헤파린을 사용하는 혈장 튜브는 헤파린 분석 또는 세포-기반 분석에 적합하다. 리튬 헤파린 혈장 튜브는 리튬 분석에 적합하지 않다. 혈장은 세포의 존재 및 2 내지 8℃에서 장기 저장시 불용성 피브린 형성 때문에 추가 테스트 또는 재테스트에 대하여 신뢰성이 없을 수 있다.

또한, 튜브 내에서 응혈원 또는 항응고제와의 상호작용에 기인하여 또는 다른 방식으로 분석물질의 농도에 대한 부정확한 결과를 나타내는 일부 혈청 튜브 또는 혈장 튜브가 보고되었다(Ciuti et al ., 1989; Cowley et al ., 1985; Davidson et al ., 2006; Dimeski et al ., 2004; Dimeski et al ., 2005; Dimeski et al ., 2010; Hartland et al ., 1999; Miles et al ., 2004; O'Keane et al ., 2006; Wannaslip et al ., 2006).

샘플 크기

환자로부터 얻는 혈액의 부피를 감소시키기 위하여, 특히 위독한 환자, 수혈을 받는 환자, 및 영유아에서, 테스트에 필요한 샘플 크기를 감소시키는 것이 바람직하다. 따라서, 단일 혈액 수집 튜브에서 취해진 샘플을 사용하여 모든 필요한 테스트를 시행할 수 있는 것이 가장 적절하다. 이를 달성하기 위해, 테스트 방법은 매우 작은 샘플 부피(예, 2 ㎕)를 사용하여 개발되어, 전형적으로 하나의 혈청 튜브 또는 혈장 튜브가 적어도 21개의 테스트를 위해 사용되지만, 각각의 테스트에 필요한 샘플의 부피에 따라 50 내지 60개 또는 심지어 70 내지 80개의 테스트를 위해 사용될 수 있다. 그러나, 혈청 또는 혈장 튜브에서 입자 분석물질 측정의 정확도에 대한 의문이 존재하는 경우, 환자로부터 혈청 튜브 및 혈장 튜브를 모두 취하는 것이 필요할 것이고, 이로써 환자로부터 취한 혈액의 부피를 줄이는 목적을 무산시킨다.

혈액으로부터 혈청 및 혈장 제제를 위한 최신 방법의 사용으로 제기되는 문제점은 일반적으로 폭넓은 다양한 혈액 샘플로부터 제때에 신뢰할만한 분석 결과를 달성하기 위해 개선이 필요하다는 사실을 보여준다.

뱀독 프로트롬빈 활성제

많은 뱀독은 뱀들의 먹이의 혈액을 빨리 응고시킬 목적으로 프로트롬빈 활성제(prothrombin activator)를 함유한다. 이들 프로트롬빈 활성제는 혈액에 존재하는 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시켜 응고를 야기하는 단백질분해 효소이다.

뱀독 프로트롬빈 활성제가 응혈원으로 공지되어 있지만, 이들은 또한 단백질분해 트립신-유사 활성을 가지는 것으로 알려져 있다(Schieck et al., 1972; Parker, H. W. and Grandison A. G. C., 1977; Masci, P. P., 1986; Nicholson et al ., 2006; Lavin and Masci, 2009). 프로트롬빈 활성제는 이들은 먹이를 죽이고 소화시키는 역할을 한다는 점에서 응혈원 및 단백질분해 특성을 모두 가지는 진화론적 이유가 존재할 것으로 추정되어 왔다(Masci, P. P., 1986, page 143). 예를 들어, 에카린(Echis carinatus 독으로부터 정제된 프로트롬빈 활성제)은 응혈원 활성뿐만 아니라, 피브리노겐 분해, 젤라틴 분해, 카제인 분해, 및 출혈과 같은 여러 다른 단백질분해 활성을 가지는 것으로 나타났고(Schieck et al ., 1972), Pseudonaja textilis 독으로부터 정제된 프로트롬빈 활성제(PtPA)는 다른 단백질분해 효소에 대해 고안된 다양한 발색 펩타이드 기질에 대하여 활성이다(Masci, P.P., 1986).

혈액, 혈청 또는 혈장 샘플 상에서 수행될 수 있는 많은 분석물질 테스트는 단백질을 포함하고, 분석물질로서 단백질(예, 총 단백질, 알부민)을 측정하는 테스트; 혈액 단백질(예, 감마-글루타밀 트랜스퍼라아제에 대한 테스트에 사용되는 감마-글루타밀 트랜스펩티다아제, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제, 락테이트 디하이드로게나아제, 크레아틴 키나아제, 리파아제)의 효소 활성을 측정하는 테스트; 시약으로 단백질을 사용하는 테스트(예, 면역분석); 분석방법에서 효소(예, 글루코즈 옥시다아제)를 사용한 테스트를 포함한다. 단백질을 포함하는 다른 통상 사용되는 테스트는 글루코즈, 유레아, 유레이트, 알라닌, 아미노트랜스퍼라아제, 크레아틴 키나아제, 고밀도 지단백질 콜레스테롤, 콜레스테롤, 트라이글리세라이드, 트랜스페린, C 반응성 단백질, 트로포닌, 코르티솔, 유리 티록신, 유리 트라이아이오도타이로닌, 갑상선 자극 호르몬 및 페리틴에 대한 분석을 포함한다.

따라서, 상기 뱀독 프로트롬빈 활성제는, 그들의 응혈원 특성에도 불구하고, 그들의 단백질분해 활성이 측정되는 분석물질(예, 분석물질이 단백질인 경우)을 분해시키거나, 또는 분석물질 농도를 측정하기 위한 반응에서 사용되는 단백질(예, 분석물질 테스트가 글루코즈 옥시다아제와 같은 단백질의 사용을 포함하는 경우)을 분해시킬 것이라는 점에 근거하여 분석물질 테스트를 위한 혈청 튜브에서 사용하기에 적합한 것으로 한번도 여겨지지 않았다.

트롬빈 튜브

최근 트롬빈-함유 튜브가 '더 빠른' 응고 튜브로서 시판되었고, 트롬빈은 응혈원 및 단백질분해 활성을 모두 가지나, 트롬빈은 피브리노겐, 활성 단백질 C(APC, activated protein C) 및 Va인자에서 결합을 끊기 위한 높은 특이성을 가지는 것으로 알려져 있다. 따라서, 뱀독 프로트롬빈 활성제의 보고된 트립신-유사 활성과 달리, 트롬빈은 분석물질 테스트를 방해하지 않는 것으로 기대된다.

본 발명을 도출하는 연구에서, 트롬빈-함유 튜브는 모든 혈액 샘플과 사용될 수 없다는 것이 밝혀졌다. 트롬빈은 헤파린화된 혈액 샘플에 존재하는 헤파린-항트롬빈 III 복합체에 의해 빠르고 완전하게 억제되는 것으로 알려져 있다. BD RST 튜브 조사에서, 이들 튜브는 고용량의 헤파린을 함유하는 혈전응고 환자 샘플에서 효과적이지 않다는 것이 밝혀졌다(Dimeski et al., 2010).

본 발명의 개발

놀랍게도, 본 발명자들은 튜브를 포함하는 혈액 수집 장치에서 사용되는 경우, 프로트롬빈 활성제가 세포 및 세포 성분에 의한 오염 및 불완전 응고에 기인한 분석 문제의 위험 및 혈청 샘플 준비시간을 둘 다 줄이면서,(헤파린을 포함하는 고농도의 항응고 치료를 받는 환자로부터 취해진 혈액 샘플을 포함한) 폭넓은 다양한 혈액 샘플로부터 허용가능한 시간 내에 고품질의 혈청을 일반적으로 생산할 수 있는 것을 밝혀냈다.

더욱이, 본 발명자들은 또한 놀랍게도, 프로트롬빈 활성제의 추가에 의해 혈액 샘플로부터 수득된 혈청 샘플이 존재하는 혈액 수집 튜브에서 생산된 혈청 샘플과 폭넓은 표준 생화학 분석 테스트에서 동일한 결과를 나타낸다는 것을 밝혀냈다.

이러한 발견은 프로트롬빈 활성제가 폭넓은 분석물질을 측정하는 목적으로 혈청을 생산하기에 적합할 것이고, 감소되어 이후 설명하는 분석물질의 탐지, 관련된 용도 및 방법에 유용한 혈청 샘플 조제용 혈액 수집 용기에서 실시되는 것을 제안하였다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 분석물질을 탐지하는데 유용한 혈청 샘플의 조제에서 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 이루어거나, 또는 프로트롬빈 활성제로 이루어지는 응고 조성물의 용도를 제공한다.

(때로는 프로트롬비나아제로 알려진) 프로트롬빈 활성제는 트립신-유사 활성을 적절하게 나타내고 프로트롬빈을 활성화시킨다(즉, 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시킨다).

본 발명은 또한 샘플 내에 존재하는 관심의 대상이 되는 분석물질을 탐지하기에 적합한 혈청 샘플을 조제하기 위한 용기를 제공하고, 상기 용기는 상술한 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 이루어지거나, 또는 프로트롬빈 활성제로 이루어지는 응고 조성물을 함유한다.

다른 양태에서, 본 발명은 분석물질을 탐지하는데 적합한 혈청 샘플을 조제하기 위한 용기의 제조 또는 생산에서 상술한 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 이루어지거나, 또는 프로트롬빈 활성제로 이루어지는 응고 조성물의 용도를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 분석물질을 탐지하는데 적합한 혈청 샘플을 조제하기 위해 혈액 샘플 및 상술한 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 이루어지거나, 또는 프로트롬빈 활성제로 이루어지는 응고 조성물을 포함하는 용기를 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 관심의 대상이 되는 분석물질을 탐지하기 위한 혈청 샘플을 조제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 혈청 샘플을 조제하는데 충분한 조건에서 및 시간 동안 상술한 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 이루어지거나, 또는 프로트롬빈 활성제로 이루어지는 응고 조성물과 혈액 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 적합하게는, 방법은 상기에서 폭넓게 정의된 바와 같이 용기에서 수행된다. 적합하게는, 혈액은 혈청 샘플 및 응고된 세포를 조제하기에 충분한 조건에서 및 시간 동안 응고 조성물과 접촉된다. 적절하게는, 방법은 응고된 세포로부터 혈청 샘플을 분리시키는 단계를 더욱 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 혈액 샘플을 함유하는 용기를 제공하고 용기에 응고 조성물을 첨가함으로써, 또는 응고 조성물을 함유하는 용기를 제공하고 용기에 혈액 샘플을 추가하거나 수집함으로써, 응고 조성물 및 혈액 샘플을 혼합하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 혈액 샘플을 생산하기 충분한 조건에서 및 시간 동안 상기에서 폭넓게 기술한 바와 같이 응고 조성물과 혈액 샘플을 접촉시킴으로써 생산된 혈청 샘플을 제공한다.

본 발명은 관심의 대상인 분석물질을 탐지하는 방법을 또한 제공한다. 이들 방법은 일반적으로 관심의 대상인 분석물질의 존재 및 양에 대하여 본 발명의 방법에 의해 조제된 혈액 샘플을 분석하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 대상에서 질병 또는 질환의 존재, 부재 또는 심각성을 진단하는 방법을 제공하고, 상기 질병 또는 질환의 존재, 부재 또는 심각성은 대상에서 관심의 대상인 분석물질의 존재, 부재 및 비정상적인 양과 연관된다. 이들 방법은 일반적으로 상술한 방법에 따라 조제된 혈청 샘플을 제공하는 단계; 및 혈청 샘플에서 분석물질의 존재, 부재 또는 비정상적인 양을 탐지함으로써 대상에서 질병 또는 질환의 존재, 부재 또는 심각성을 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 명세서에 포함되어 있음.

도 1은 실시예 1a에 개시된 수퍼덱스(Superdex) 200 컬럼 상에서 겔 여과를 사용한 E. carinatus 독으로부터 에카린, 카린액타바아제-1, 및 카린액타바아제-2의 단리에서 용출 프로파일을 나타낸다. E. carinatus 독(157 mg, 122 A₂₈₀ 단위)은 pH 8.0에서 0.05 M Tris-HCl 버퍼를 사용하여 수퍼덱스 200(2.5 x 95 cm) 상에서 겔 여과되었다. 세 개의 프로트롬빈 활성제(에카린, 카린액타바아제-1, 및 카린액타바아제-2)의 모인 분획(28.3 A₂₈₀ 단위)은 바(bar)로 표시된다.
도 2는 실시예 1a에 개시된 (도 1에도 개시된) 수퍼덱스 200 겔 여과 크로마토그래프로부터 수득된 활성 (응혈원) 분획의 블루 세파로즈(Blue Sepharose) 크로마토그래피의 용출 프로파일을 나타낸다. 활성 분획은 블루 세파로즈의 컬럼에서 NaCl의 선형 구배로 용출되었다. 3개의 mL 분획이 수집되었다. 바(bar)로 표시된 분획은 각각 에카린, 카린액타바아제-1, 및 카린액타바아제-2로 모아졌다.
도 3은 pH 7.4, 0.05 M Tris-HCl 버퍼에서 세파크릴 S-300의 컬럼(2.5 x 95 cm) 상에서 복원(reconstitution)된 P. textilis 독(5 mL 중 50 mg)의 크로마토그래피에 대한 용출 프로파일을 나타내고; 4℃; 유동 속도 17 mL/h; A₂₈₀(●); S-2222 고유 활성(specific activity)(○); 'A' 및 'B'는 실시예 1b에서 개시된 바와 같이, 각각 S-2222 활성의 피크의 보이드 부피(167 mL) 및 용출 부피(250 mL)를 나타낸다.
도 4는 실시예 1b에 개시된 콘 A-세파로즈(Con A-Sepharose) 친화도 크로마토그래피 방법을 사용한 P. textilis 독(1 g: 30 mL)의 용출 프로파일을 나타낸다. 화살표는 PtPA를 용출("a"로 표시됨)하는 0.2 M 메틸 α-D-만노피라노사이드의 적용 위치를 나타낸다.
도 5는 도 4에서 "a"로 표시된 모은 분획의 pH 8.6에서 네이티브(native) PAGE의 결과를 나타내고, 여기서 레인(lane) A는 25㎍이고, 레인 B는 50㎍이다.
도 6은 정제된 PtPA의 pH 8.6에서 네이티브 PAGE의 결과를 나타내고, 여기서 겔은 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 착색되었고, 듀플리케이트 겔(duplicate gel)은 5 mm 슬라이스로 절단되었고, 이는 각각 S-2222 분석 혼합물 1 mL와 평형을 이루어, 실시예 1b에서 개시된 바와 같이, 활성의 위치를 나타낸다. 그래프는 겔 슬라이스 번호(X축은 "겔 슬라이스 번호"로 읽음)에 대한 S-2222 활성(Y축은 S-2222의 가수분해 속도(ΔA₄₁₀/min))의 플롯(plot)을 도시한다.
도 7은 실시예 1b에 개시된 환원(reducing) 조건 및 비환원(non-reducing) 조건 하에서 PtPA 및 OsPA의 친화도 정제된 제제의 SDS-PAGE 결과를 도시하고, 여기서 레인은 (왼쪽에서 오른쪽으로): 마커(marker); OsPA red.(1 mg/mL); PtPA red.(1 mg/mL); OsPA red.(2 mg/mL); PtPA red.(2 mg/mL); OsPA unred.(1 mg/mL); PtPA unred.(1 mg/mL); OsPA unred.(2 mg/mL); PtPA unred.(2 mg/mL); 마커이고, 이때 "red."은 β-머캅토에탄올의 존재시(즉, 환원된) 성분을 나타내고, "비환원"은 β-머캅토에탄올의 부재시(즉, 비환원된) 성분을 나타낸다.
도 8은 실시예 1c에서 개시된 바와 같이 세파크릴 S-300 크로마토그래피를 사용한 N. scutatus 독으로부터 노테카린의 단리에서 용출 프로파일을 도시한다. 노테카린의 모인 분획은 "PA"로 표지된 바(bar)로 표시된다.
도 9는 실시예 1a, 1b 및 1c에서 제조된 프로트롬빈 활성제인, 카린액타바아제-1, 카린액타바아제-2, 에카린, PtPA, OsPA 및 노테카린의 pH 8.9에서 네이티브 PAGE의 결과를 도시한다. 상기 도에서, 라벨은 다음을 나타낸다: (I) 프로트롬빈; (II) α-트롬빈; (III) 에카린; (IV) 카린액타바아제-1; (V) 카린액타바아제-2; (VI) PtPA; (VII) OsPA; (VIII) 노테카린(각 프로트롬빈 활성제는 20㎍씩 로딩되었다.).
도 10은 β-머캅토에탄올의 존재하에서 실시예 1a, 1b 및 1c에서 제조된 프로트롬빈 활성제의 SDS-PAGE 특성분석(chracterization)을 도시하고, 여기서 레인은 다음과 같다: (1) 카린액타바아제-1; (2) 카린액타바아제-2; (3) 에카린; (4) PtPA; (5) OsPA; (6) 노테카린; (7) 트롬빈; 및 (M) 분자량 마커.
도 11은 β-머캅토에탄올의 부재하에서 실시예 1a, 1b 및 1c에서 제조된 프로트롬빈 활성제의 SDS-PAGE 특성분석(chracterization)을 도시하고, 여기서 레인은 다음과 같다: (1) 카린액타바아제-1; (2) 카린액타바아제-2; (3) 에카린; (4) PtPA; (5) OsPA; (6) 노테카린; (7) 트롬빈; 및 (M) 분자량 마커.
도 12는 하기 프로트롬빈 활성제 및 5 mM Ca^{2 +}의 존재하에서 실온에서 5분동안 배양된 샘플의 β-머캅토에탄올의 부재(A) 및 β-머캅토에탄올의 존재(B)시 SDS-PAGE를 도시한다: 카린액타바아제-1(레인 2); 카린액타바아제-2(레인 3); 에카린(레인 4); PtPA(레인 5); OsPA(레인 6); 노테카린(레인 7). 레인 1은 버퍼에 인간 프로트롬빈의 샘플만 함유하고(프로트롬빈 활성제 없음), 레인 8은 매우 정제된 α-트롬빈의 샘플을 함유하고(프로트롬빈 활성제 없음), "m"은 분자량 마커를 나타낸다. 이 실험은 실시예 2a에 더욱 상세하게 기재된다.
도 13은 실시예 2b에 개시된 바와 같이 PtPA(6 nM)에 의한, 및 노테카린(6 nM)에 의한, 프로트롬빈(14 μM)이 트롬빈 활성화의 시간에 따른 SDS-PAGE를 도시한다.
도 14는 도 13에서 SDS-PAGE 결과의 일부에 대한 주석이 달린 이미지로, 여기서 선택된 밴드가 용출되고 특이적 분자 도메인을 부여하기 위해 질량 분석법을 사용하여 N-말단 서열분석이 수행되었다.
도 15는 실시예 2d에 개시된 바와 같이 155초 동안 상이한 트롬빈 농도에 의한 S-2238로부터 생성된 pNA의 흡광도 그래프이다. 그래프의 오른편 측면에 계산식은 그래프의 각 줄과 일치하고, 예를 들어 가장 위쪽 계산식은 가장 높은 쪽 선이고, 이하 동일한 방식이다.
도 16은 도 15의 결과로부터 유도된 표준 곡선의 그래프이고, 특히 도 15에서 180초까지 각 반응에 대한 방정식의 기울기를 트롬빈 농도에 대해 나타내어, 도 16에 도시된 선형 회귀 방정식을 제공한다.
도 17은 실시예 2d에 개시된 바와 같이 180초에 걸쳐, 0.6 nM 농도의 프로트롬빈 활성제인, PtPA, OsPA, 에카린(Ecr), 노테카린(Ntcr), 카린액타바아제-1(CA-1), 및 카린액타바아제-2(CA-2)의 트롬빈 생성 속도를 나타내는 그래프이다.
도 18은 실시예 2e에 개시된 바와 같이 S-2238의 트롬빈 촉매화된 가수분해의 곡선 정합 분석을 도시한다. 트롬빈 농도는 진행 곡선상에 표시된다.
도 19는 실시예 2e에 개시된 바와 같이 다양한 PtPA의 농도에서 프로트롬빈의 PtPA 활성화를 표시한다.
도 20은 실시예 2e에 개시된 바와 같이 다양한 OsPA의 농도에서 프로트롬빈의 OsPA 활성화를 표시한다.
도 21은 실시예 2e에 개시된 바와 같이 다양한 에카린의 농도에서 프로트롬빈의 에카린 활성화를 표시한다.
도 22는 실시예 2e에 개시된 바와 같이 다양한 카린액타바아제-1의 농도에서 프로트롬빈의 카린액타바아제-1 활성화를 표시한다.
도 23은 실시예 2e에 개시된 바와 같이 다양한 카린액타바아제-2의 농도에서 프로트롬빈의 카린액타바아제-2 활성화를 표시한다.
도 24는 실시예 2e에 개시된 바와 같이 다양한 노테카린의 농도에서 프로트롬빈의 노테카린 활성화를 표시한다.
도 25는 실시예 부분에서 논의되는 바와 같이, 라벨링된 응고 파라미터(parameter)와 TEG 플롯(plot)(응고 형성 부분)의 예를 도시한다.
도 26은 실시예 3g에 개시된 바와 같이 정상 시트레이트 처리된 혈장에서 5분 배양 시간에 걸쳐 45-225 nM에서 2회씩 상이한 트롬빈 농도에 의한 S-2238의 가수분해에 대한 진행 곡선을 표시한다.
도 27은 로그 유형로 표시된 5분 배양에서 도 26의 반응의 기울기로부터 유도된 트롬빈 표준 곡선을 도시하고, 여기서 x축은 기울기 ln(흡광도 단위/분)을 나타내고, y축은 ln(트롬빈의 몰 농도)를 나타낸다.
도 28은 실시예 3g에 개시된 바와 같이, 3개의 상이한 PtPA 농도(2회씩)에서 생성된 혈청에서 응고 제거 후 남은 트롬빈 분석을 도시한다.
도 29는 실시예 3g에 개시된 바와 같이, 3개의 상이한 OsPA 농도(2회씩)에서 생성된 혈청에서 응고 제거 후 남은 트롬빈 분석을 도시한다.
도 30은 실시예 3g에 개시된 바와 같이, PtPA 농도에 대한(트롬빈 농도에 비례하는) 도 28에서 수득한 기울기를 표시한다.
도 31은 실시예 3g에 개시된 바와 같이, OsPA 농도에 대한(트롬빈 농도에 비례하는) 도 29에서 수득한 기울기를 표시한다.
도 32는 실시예 3g에 개시된 바와 같이, 4300 nM(10 IU) 헤파린의 존재하에서 응고 제거 후 혈청에 남은 트롬빈에 의한 S-2238의 가수분해에 대한 진행 곡선을 도시한다. 트롬빈은 PtPA 및 OsPA에 의해 생성되거나, 또는 첨가되었다.
도 33은 실시예 3g에 개시된 바와 같이, 1.5 nM PtPA를 사용하여 상이한 헤파린 농도를 함유하는 샘플과의 반응 곡선을 도시한다.
도 34는 실시예 3g에 개시된 바와 같이, 1.5 nM OsPA를 사용하여 상이한 헤파린 농도를 함유하는 샘플과의 반응 곡선을 도시한다.
도 35는 모아진 "정상" 시트레이트 처리된 혈장에서 5분 동안 흡광도의 변화를 도시하고, 여기서 각 라인은 실시예 3h에 개시된 바와 같이 상이한 부피의 정상적인 모아진 시트레이트 혈장으로 채워진 BD RST 튜브를 나타낸다.
도 36은 실시예 3h에 개시된 바와 같이, 도 35로부터 측정한 기울기 및 도 16의 표준 곡선으로부터 판독한 상응하는 트롬빈 농도 사이의 관계를 도시한다.
도 37은 모아진 "정상" 시트레이트 처리된 혈장에서 5분 동안 흡광도의 변화를 도시하고, 여기서 각 라인은 실시예 3h에 개시된 바와 같이 1 mL 또는 4 mL의 정상 모아진 시트레이트 처리된 혈장 및 상이한 농도의 헤파린으로 채워진 BD RST 튜브를 나타낸다.
도 38은 실시예 4c에 개시된 바와 같이 플레인 튜브, 시판중인 혈청 튜브, 및 PtPA-함유 튜브의 비교를 위한 TEG 트레이스를 나타낸다.
도 39는 실시예 5a에서 결과의 TEG 플롯을 도시한다.
도 40은 실시예 5c에서 자발적인 "W1"에 대한 결과의 TEG 플롯을 도시한다.
도 41은 실시예 5c에서 자발적인 "W2"에 대한 결과의 TEG 플롯을 도시한다.
도 42는 실시예 5d에서 PtPA 또는 OsPA로 헤파린 처리된 참여자로부터 수득된 재석회화된 시트레이트 처리된 혈액의 응고에 대한 TEG 트레이스를 도시한다.
도 43은 실시예 5e 결과의 TEG 트레이스를 도시한다.
도 44은 실시예 6a 결과의 TEG 플롯을 도시한다.
도 45은 실시예 6b 결과의 TEG 플롯을 도시한다.
도 46은 실시예 7에 개시된 바와 같이 상이한 농도에서 종, Pseudonaja textilis(Pt), Oxyuranus scutellatus(Os), Oxyuranus microlepidotus(Om), Notechis scutatus(Ns) 및 Echis carinatus(Ec)로부터 수득한 프로트롬빈 활성제 함유 뱀독의 응고 시간을 표시한다.
도 47은 실시예 8에 개시된 바와 같이 젤라틴화된 침전물을 가진 그레이너(Greiner) 혈장 튜브를 도시한다.
도 48은 실시예 8에 개시된 바와 같이 수많은 튜브에서 원심분리 후 (잠재적인) 응고를 도시한다.
도 49는 실시예 8에 개시된 바와 같이 상이한 튜브에서 혈청 샘플의 비교를 도시한다.
도 50은 실시예 9a에 개시된 바와 같이 분석물질 측정을 필요로 하는 48명의 무작위로 선택된 환자로부터 그레이너 혈청 튜브에서 측정된 피브리노겐/fdp/FDP 농도의 범위를 도시한다. 바(bar)는 17.5 ㎍/mL의 평균을 나타내고, 범위는 4.4-32 ㎍/mL이다.
도 51은 실시예 9b에 개시된 바와 같이 PtPA 첨가 또는 미첨가한 그레이너 혈청(GS) 튜브를 사용하여 제조된 36개의 정상 혈청 샘플에서 ELISA에 의해 측정된 피브리노겐/fdp/FDP 농도의 비교를 도시한다.
도 52는 실시예 9b에 개시된 바와 같이 4개의 상이한 혈청 튜브: 그레이너 혈청(GRS), BD 혈청(BDS), BD RST 및 PtPA(300 ng/mL)에서 수집된 9개의 정상 혈액 샘플로부터 수득한 혈청에서 ELISA에 의해 측정된 피브리노겐/fdp/FDP 농도를 도시한다.
도 53은 실시예 9b에 개시된 바와 같이 그레이너 혈청 튜브(GRS), 300 ng/mL의 PtPA와 그레이너 무첨가제 튜브(PTPA), 125 ng/mL의 OsPA를 함유하는 그레이너 무첨가제 튜브(OSPA), 및 0.16 U/mL의 정제된 에카린을 함유하는 그레이너 무첨가제 튜브(ECARIN)에서 수집된 5개의 정상 혈액 샘플로부터 수득된 혈청에서 ELISA에 의해 측정된 피브리노겐/fdp/FDP 농도를 도시한다. 바는 평균±표준편차를 나타낸다.
도 54는 실시예 9c에 개시된 바와 같이 그레이너 혈청 튜브(GRS), BD SST II 튜브(BDS), BD RST 튜브(BDRST) 및 1.2 ㎍/4 mL 튜브 PtPA를 첨가한 그레이너 무첨가제 튜브(PTPA)에서 수집한 3명의 신장 투석 환자로부터 수득한 혈청의 ELISA에 의해 측정된 피브리노겐/fdp/FDP 농도를 도시한다.
도 55는 실시예 9c에 개시된 바와 같이 그레이너 혈장 튜브(GRLH), 그레이너 혈청 튜브(GRS), BD RST 튜브(BDRST), 300 ng/mL의 PtPA가 첨가된 그레이너 배큐엣(Greiner Vacuette, 상표명) 무첨가제 튜브(PTPA), 125 ng/mL의 OsPA가 첨가된 그레이너 배큐엣 무첨가제 튜브(OSPA), 0.31 U/mL의 에카린이 첨가된 그레이너 배큐엣 무첨가제 튜브(EC1), 및 0.63 U/mL의 에카린이 첨가된 그레이너 배큐엣 무첨가제 튜브(EC2)에서 수집한 2명의 심장질환 환자로부터 수득한 혈장 및 혈청의 ELISA에 의해 측정된 피브리노겐/fdp/FDP 농도를 도시한다.
도 56은 실시예 9b에 개시된 바와 같이 겔 배리어(gel barrier) 위의 세포 함량을 나타내는 김자(Giemsa) 착색된 사이토스핀 슬라이드를 도시하고, 여기서 슬라이드는 왼쪽에서 오른쪽으로: (P)-PtPA 혈청; (S)-그레이너 혈청; (LH)-희석된 그레이너 리튬 헤파린 혈장; 및 (LH)-미희석된 그레이너 리튬 헤파린 혈장이다.
도 57은 실시예 12a에 개시된 바와 같이 정상 혈청 및 혈장 샘플(n=26), 모든 혈청 및 혈장 샘플(n=61), 및 심장질환 환자 샘플(n=11) 상에서 퀸즐랜드 표준 병리학 절차 하에서 수행된 총 단백질 측정을 도시한다.
도 58은 실시예 15a에 개시된 바와 같이 상이한 온도에 저장 시, 2주(336시간)에 걸쳐 선택된 시점에서 혈장을 응고하기 위해 두 개의 상이한 PtPA 농도에서 걸린 시간을 도시한다.
도 59는 실시예 15b에 개시된 바와 같이, 그레이너 플레인 튜브(P) 및 실리카 및 계면활성제를 함유하는 그레이너 혈청 튜브(SiP)에서 방사 후 발색 기질 S-2765에 대한 OsPA의 활성을 도시한다.
도 60은 실시예 15b에 개시된 바와 같이, 그레이너 플레인 튜브(P) 및 실리카 및 계면활성제를 함유하는 그레이너 혈청 튜브에서 OsPA의 시트레이트 처리된 혈장 응고 활성을 나타낸다.
도 61은 실시예 15c에 개시된 바와 같이, 스톡의 신선한 희석액에 대하여 23℃에서 최대 14일까지의 기간에 걸쳐 발색 기질 S-2765에 대한 OsPA의 활성(A₄₀₅/min)을 도시한다.
도 62는 실시예 17에 개시된 바와 같이, 분석을 위한 고품질의 혈청을 생산하기 위해 고안된 장치(주사기 형태인 현장 진단 장치)의 예를 도시한다.

서열의 간단한 설명

서열 목록에서 서열의 간단한 설명은 하기에 제공된다.

1. 정의

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 개시된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 및 실험에 사용될 수 있음에도 불구하고, 바람직한 방법 및 재료가 기술된다. 본 발명의 목적을 위하여, 하기 용어가 아래와 같이 정의된다.

관사 "a" 및 "an"은 본 명세서에서 그 관사의 문법적 대상이 하나 또는 그 이상(즉, 적어도 하나)인 경우를 모두 의미한다. 예시적으로, "하나의 원소"는 하나의 원소 및 하나 이상의 원소를 의미한다.

용어 "약"은 참고 수량(quantity), 수준(level), 값(value), 숫자(number), 횟수(frequency), 백분율(percentage), 치수(dimension), 크기(size), 양(amount), 중량(weight) 또는 길이(length)에 대하여 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1%까지 변하는 수량, 수준, 값, 숫자, 횟수, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

참고 또는 전장(full-length) 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 절편에 적용되는 용어 "생물학적으로 활성인 절편(fragment)"은 참고 서열(reference sequence)의 활성의 적어도 약 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%의 활성을 가지는 절편을 지칭한다. 참고 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 활성을 포함하거나 암호화하는, 길이가 적어도 약 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 2,000 뉴클레오타이드 또는 잔기(residue)인 것을 포함하는, 생물학적으로 활성인 절편이 본 발명의 범위에 포함된다. 대표적인 생물학적으로 활성인 절편은 일반적으로 상호작용, 예를 들어 분자 내 또는 분자 간 상호작용에 참여한다. 분자간 상호작용은 특이적 결합 상호작용 또는 효소의 상호작용일 수 있다(예를 들어, 상호작용은 과도적일 수 있고, 공유결합이 형성되거나 끊어진다). 전장 폴리펩타이드의 생물학적으로 활성인 절편은 (추정상의) 전장 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 충분히 유사하거나, 또는 그로부터 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로 생물학적으로 활성인 절편은 전장 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성을 가지는 도메인(domain) 또는 모티프(motif)를 포함한다. 적절하게는, 생물학적으로 활성인 절편은 유래된 전장 폴리펩타이드의 활성의 약 1%, 10%, 25%, 50% 이상을 가진다.

용어 "암호화 서열"은 유전자의 폴리펩타이드 산물에 대한 암호에 기여하는 임의의 핵산 서열을 의미한다. 대조적으로, 용어 "비-암호화 서열"은 유전자의 폴리펩타이드 산물에 대한 암호에 기여하지 않는 임의의 핵산 서열을 지칭한다.

본 명세서를 통하여, 내용상 달리 요구되지 않는 한, 용어 "포함하다", "포함하는" 및 "포함한"은 언급된 단계, 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 단계, 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소의 그룹을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 용어 "포함하는" 등의 사용은 기재된 구성요소가 필수적이거나 의무적이지만, 다른 구성요소는 선택적이고 존재하거나 존재하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다. 용어 "구성되는"은 상기 "구성되는"이라는 표현 뒤의 것만을 포함하고 그것으로 제한하는 것을 의미한다. 따라서, 표현 "구성되는"은 기재된 구성요소가 필수적이거나 의무적이고 다른 구성요소가 존재하지 않는다는 것을 나타낸다. 용어 "필수적으로 구성되는"은 상기 표현 뒤에 기재된 임의의 구성요소를 포함하고, 기재된 구성요소에 대한 설명에서 구체화된 활성 또는 작용에 대해 방해하거나 기여하지 않는 다른 구성요소로 제한된다는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "필수적으로 구성되는"은 기재된 구성요소가 필수적이거나 의무적이지만, 다른 구성요소가 선택적이고, 그들이 기재된 구성요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치거나 미치지 않는지에 따라 존재하거나 존재하지 않을 수 있다는 것을 의미한다.

용어 "상보적인" 및 "상보성"은 염기쌍 법칙에 관련된 폴리뉴클레오타이드(즉, 뉴클레오타이드 서열)를 의미한다. 예를 들어, 서열 "A-G-T"는 서열 "T-C-A"에 상보적이다. 상보성은 "부분적"일 수 있고, 이는 핵산의 염기의 일부만 염기쌍 법칙에 따라 일치한다. 또는, 핵산 사이에 "완전한" 또는 "전체" 상보성이 존재할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 유의미한 영향을 가진다.

용어 "상응한다" 및 "상응하는"은, (a) 참고 폴리펩타이드 서열의 전부 또는 일부에 실질적으로 동일하거나 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 또는 펩타이드 또는 단백질에서 아미노산 서열에 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 또는 (b) 참고 펩타이드 또는 단백질에서 아미노산의 서열에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "분석물질을 탐지하는"은 샘플에서 하나 이상의 분석물질의 존재, 부재, 양 또는 농도를 측정하는 것을 의미한다.

용어 "유전자"는 염색체 상에 특정한 위치를 차지하고 전사 및/또는 번역 조절 서열 및/또는 암호화 지역 및/또는 비-번역 서열(즉, 인트론, 5' 미번역 서열 및 3' 미번역 서열)로 구성되는 유전 단위를 의미한다.

용어 "상동성"은 동일하거나 보전된 치환을 구성하는 핵산 또는 아미노산의 백분율을 지칭한다. 상동성은 참조로 본 명세서에서 인용된 GAP(Devereux et al ., 1984)와 같은 서열 비교 프로그램을 사용하여 측정될 수 있다. 이 방법에서, 본 명세서에 인용된 것과 유사하거나 실질적으로 상이한 길이의 서열은 배열에 틈(gap)을 삽입함으로써 비교될 수 있고, 이러한 틈은 예를 들어 GAP에 의해 사용된 비교 알고리즘에 의해 측정된다.

용어 "숙주 세포"는 임의의 재조합 백터 또는 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오타이드의 수증자(recipient)일 수 있거나 수증자인, 개별 세포 또는 세포 배양액을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 상기 자손은 자연적이거나, 우연하거나, 의도적인 돌연변이 및/또는 변화 때문에 원래 모세포와 (형태에서 또는 총 DNA 전량(complement)에서) 반드시 완전하게 동일하지는 않을 수 있다. 숙주 세포는 재조합 벡터 또는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드로 생체 내에서(in vivo) 또는 시험관에서(in vitro) 형질 주입되거나 감염된 세포를 포함한다. 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포는 재조합 숙주 세포이다.

용어 "혼성화"는 본 명세서에서 DNA-DNA 혼성체 또는 DNA-RNA 혼성체를 생성하기 위해 상보적 뉴클레오타이드 서열의 짝지음(pairing)을 나타내기 위해 사용된다. 상보적 염기 서열은 염기-쌍 법칙에 관련된 서열이다. DNA에서, A는 T와 쌍을 이루고, C는 G와 쌍을 이룬다. RNA에서 U는 A와 쌍을 이루고, C는 G와 쌍을 이룬다. 이와 관련하여, 본 명세서에서 사용되는 용어 "일치(match)" 및 "불일치(mismatch)"는 상보적 핵산 가닥에서 짝을 이룬 뉴클레오타이드의 혼성화 가능성을 의미한다. 일치된 뉴클레오타이드는 상기 언급된 고전적인 A-T 및 G-G 염기쌍과 같이 효과적으로 혼성화된다. 불일치는 효과적으로 혼성화되지 않는 뉴클레오타이드의 다른 조합이다.

용어 "단리된"은 자연적인 상태에서 보통 동반되는 성분으로부터 실질적으로 또는 필수적으로 분리된 물질을 의미한다. 예를 들어, "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 자연 발생 상태에서 옆에 배치된 서열로부터 정제된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 보통 절편에 인접한 서열을 제거한 DNA 절편을 의미한다. 다르게는, "단리된 펩타이드" 또는 "단리된 폴리펩타이드" 등은 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 자연적인 세포 환경, 및 세포의 다른 성분과의 관계로부터 펩타이드 또는 폴리펩타이드 분자의 시험관내(in vitro) 단리 및/또는 정제를 지칭하고, 즉, 이는 생체 내 물질과 연관되지 않는다.

용어 "~로부터 수득된"은 폴리펩타이드 또는 복합체가, 예를 들어 특정 출처로부터 단리되거나 유래된 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 포스포다이에스터 결합을 통해 연결된 다양한 뉴클레오타이드 잔기(residue)(데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 관련된 구조적 변이체 또는 그의 합성된 유사체)로 이루어진 중합체(또는 관련된 구조적 변이체 또는 그의 합성된 유사체)를 지칭한다. 따라서, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 잔기 및 그 사이의 연결이 자연적으로 발생한 뉴클레오타이드 중합체를 전형적으로 의미하지만, 상기 용어는 또한 그 범위 내에서, 이에 한정되는 것은 아니지만, 펩타이드 핵산(PNA, peptide nucleic acid), 포스포라미데이트(phosphoramidate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 메틸 포스포네이트(methyl phosphonate), 2-O-메틸 리보핵산 등을 포함하는 다양한 유사체를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 분자의 정확한 크기는 특정 용도에 따라 변화할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 약 10 내지 30 뉴클레오타이드 잔기로 전형적으로 길이가 상당히 짧지만, 이 용어는, 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"이 큰 올리고뉴클레오타이드에 대해 전형적으로 사용됨에도 불구하고 임의의 길이의 분자를 의미할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "작동적으로 연결된"은 하나의 프로모터(promoter)의 조절 제어 하에서 구조 유전자(structural gene)를 두어, 유전자의 전사 및 선택적으로 번역을 제어하는 것을 의미한다. 이종 프로모터/구조 유전자 조합의 구성에서, 유전적 서열 또는 프로모터 및 유전자 사이의 거리와 대략적으로 동일한, 유전자 전사 시작 부위로부터 떨어진 위치에 유전적 서열 또는 프로모터를 위치시켜, 이는 자연적인 설정; 즉, 유전적 서열 또는 프로모터가 유래된 유전자와 같은 설정에서 제어되는 것이 일반적으로 바람직하다. 해당 분야에 공지된 바와 같이, 상기 거리에서 다소의 변화가 기능의 손실 없이 수용될 수 있다. 유사하게, 제어 하에 위치시킬 이종 유전자에 대한 조절 서열 요소의 바람직한 위치는 자연적인 설정; 즉, 유래된 유전자와 같은 설정에서 상기 요소의 위치에 의해 정의된다.

용어 "환자", "대상" 및 "개인"은 상호교환적으로 사용되고, 인간 또는 다른 포유동물의 환자, 대상 및 개인을 지칭하고, 본 발명을 사용하여 질병 또는 질환의 존재, 부재 또는 심각성을 진단하거나 또는 분석물질 농도를 탐지하는 것이 요구되는 임의의 생명체를 포함한다. 그러나, "환자"는 증상이 존재하는 것을 암시하지는 않는 것으로 이해될 것이다. 본 발명의 범위 내에 해당되는 적합한 포유동물은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 영장류(예, 인간, 침팬지), 가축(예, 양, 소, 말, 당나귀, 돼지), 실험실 테스트 동물(예, 토끼, 쥐, 래트, 기니피그, 햄스터), 반려 동물(예, 고양이, 개) 및 사냥한 야생 동물(예, 여우, 사슴, 딩고)를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 mRNA, RNA, cRNA, cDNA 또는 DNA를 지칭한다. 용어는 전형적으로 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드, 또는 상기 두 가지 유형의 뉴클레오타이드의 변경된 형태인, 길이가 적어도 10 염기의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 용어는 DNA의 단일 가닥 또는 이중 가닥을 포함한다.

용어 "폴리뉴클레오타이드 변이체" 및 "변이체" 등은, 하술되는 엄격한 조건 하에서 참고 서열과 혼성화되는, 참고 뉴클레오타이드 서열 또는 폴리뉴클레오타이드와 실질적으로 서열 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 이들 용어는 또한 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 참고 폴리뉴클레오타이드로부터 구별되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 따라서, 용어 "폴리뉴클레오타이드 변이체" 및 "변이체"는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 삽입되거나, 결실되거나, 다른 뉴클레오타이드로 치환된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이와 관련하여, 돌연변이, 삽입, 결실 및 치환을 포함하는 특정한 변경이 참고 폴리뉴클레오타이드에 일어날 수 있고, 이에 의해 변경된 폴리뉴클레오타이드는 참고 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 기능 또는 활성을 간직하는 것이 당 분야에 잘 이해된다. 용어 "폴리뉴클레오타이드 변이체" 및 "변이체"는 또한 자연 발생 대립 유전자 변이체를 포함한다.

"폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 아미노산 잔기의 중합체 및 그의 변이체 및 합성된 유사체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 이들 용어는 자연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 합성되는 비자연 발생 아미노산인, 예컨대 상응하는 자연 발생 아미노산의 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다.

용어 "폴리펩타이드 변이체"는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 참고 폴리펩타이드와 구별되는 폴리펩타이드를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩타이드 변이체는 보존적이거나 또는 비보존적일 수 있는 하나 이상의 치환에 의해 참고 폴리펩타이드와 구별된다. 특정 실시양태에서, 폴리펩타이드 변이체는 보존적 치환을 포함하고, 이와 관련하여 당 분야에서 일부 아미노산은 폴리펩타이드의 활성의 특성을 변화시키지 않은 채, 대략 유사한 특성을 가진 다른 것으로 변화될 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 폴리펩타이드 변이체는 또한 하나 이상의 아미노산이 삽입되거나, 결실되거나 또는 다른 아미노산 잔기로 치환된 폴리펩타이드를 포함한다.

용어 "프라이머"는 DNA의 가닥과 짝을 이루는 경우 적절한 중합화제의 존재하에서 프라이머 연장 산물의 합성을 시작할 수 있는 올리고펩타이드를 의미한다. 프라이머는 바람직하게 증폭의 최대 효율을 위해 단일 가닥이지만, 다르게는 이중 가닥일 수 있다. 프라이머는 중합화제 존재 하에서 연장 산물의 합성을 준비하기(priming)에 충분히 길어야 한다. 프라이머의 길이는 용도, 사용되는 온도, 템플릿 반응 조건, 기타 시약 및 프라이머의 원천을 포함하는 많은 인자에 의존한다. 예를 들어, 표적 서열의 복잡함에 따라, 올리고펩타이드 프라이머는, 더 적은 수의 뉴클레오타이드 잔기를 함유할 수 있음에도, 전형적으로 15 내지 35개 이상의 뉴클레오타이드 잔기를 함유한다. 프라이머는 약 200 뉴클레오타이드 잔기 내지 수천 개 이상의 염기(base)를 가진 것과 같이 큰 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 프라이머는 혼성화되도록 고안되고 합성의 시작을 위한 부위로서 역할을 하는 템플릿 상의 서열에 "실질적으로 상보적"이도록 선택될 수 있다. 용어 "실질적으로 상보적"은 프라이머가 표적 폴리뉴클레오타이드와 혼성화하기에 충분히 상보적이다는 것을 의미한다. 바람직하게, 프라이머는 혼성화되도록 고안된 템플릿에 불일치를 포함하지 않지만, 이는 필수적인 것은 아니다. 예를 들어, 비보존적 뉴클레오타이드 잔기는 프라이머의 5' 말단에 부착될 수 있고, 프라이머 서열의 나머지는 템플릿에 상보적이다. 다르게는 비보존적 뉴클레오타이드 잔기 또는 비보존적 뉴클레오타이드 잔기의 신장(stretch)은 프라이머로 배치될 수 있고, 단 프라이머 서열은 이에 혼성화되는 템플릿의 서열과 충분한 상보성을 가짐으로써 프라이머의 연장 산물의 합성을 위한 템플릿을 형성한다.

용어 "프로브"는 특정한 서열 또는 서브서열 또는 다른 분자의 다른 모이어티(moiety)에 결합하는 분자를 의미한다. 달리 지시되지 않는 한, 용어 "프로브"는, 상보적인 염기쌍을 통하여, 종종 "표적 폴리뉴클레오타이드"로 불리는 다른 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 폴리뉴클레오타이드 프로브를 전형적으로 지칭한다. 프로브는 혼성화 조건의 엄격성에 따라 상기 프로브와 완전한 서열 상보성이 부족한 표적 폴리뉴클레오타이드에 결합할 수 있다. 프로브는 직접적으로 또는 간접적으로 라벨링될 수 있다.

용어 "참고 결과"는 다른 시점에서 동일한 대상으로부터 수득한 결과, 정상 대상 또는 정상 대상군으로부터 수득한 결과, 또는 분석 테스트에서 사용된 참고 표준을 포함한다.

용어 "조절 요소" 또는 "조절 서열"은 특정 숙주 세포에서 작동적으로 연결된 암호화 서열의 발현에 필수적인 핵산 서열(예, DNA)을 의미한다. 원핵 세포에 적합한 조절 서열은, 예를 들어 프로모터 및 선택적으로 시스-작용 서열, 예컨대 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포에 적합한 제어 서열은 세포 안에서 세포내 구획(compartment)에 또는 세포외 환경에서 전사된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 산물을 표적으로 하는 표적 서열뿐만 아니라, 프로모터, 폴리아데닐화 시그널, 전사 인핸서(transcriptional enhancer), 번역 인핸서(translational enhancer), mRNA 안정성을 조정하는 리더 서열(leader sequence) 또는 트레일링 서열(trailing sequence)을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "서열 동일성"은 비교의 창에 걸쳐 서열이 뉴클레오타이드 하나하나 또는 아미노산 하나하나를 기준으로 동일한 정도를 지칭한다. 따라서, "서열 동일성의 백분율"은 비교의 창에 걸쳐 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교하고, 동일한 핵산 베이스(예, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 두 개의 서열에서 발생하는 위치의 수를 측정하여 일치된 위치의 수를 수득하고, 일치된 위치의 수를 비교의 창 내의 위치의 총 수(즉, 창의 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득함으로써 계산된다. 본 발명의 이러한 목적을 위해, "서열 동일성"은 DNASIS 컴퓨터 프로그램(윈도우용 버젼 2.5; 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재 히타치 소프트웨어 엔지니어링 사(Hitachi Software Engineering Co., Ltd.)에서 시판중)에 의해 소프트웨어에 첨부된 참고 물질에서 사용된 바와 같이 표준 디폴트를 사용하여 계산된 "일치 백분율"을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.

용어 "서열 유사성"은 동일하거나 하기 표 2에 정의된 보존적 치환으로 구성되는 아미노산의 백분율 수를 의미한다. 유사성은 GAP(Devereux et al ., 1984)과 같은 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 상기 방법에서, 본 명세서에서 인용된 것과 유사하거나 실질적으로 상이한 길이의 서열은 배열에 틈을 삽입함으로써 비교될 수 있고, 상기 틈은 예를 들어 GAP에서 사용되는 비교 알고리즘에 의해 결정된다.

둘 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 사이의 서열 관계를 설명하기 위하여 사용된 용어는 "참고 서열", "비교 창", "서열 동일성", "서열 동일성의 백분율" 및 "실질적인 동일성"을 포함한다. "참고 서열"은 뉴클레오타이드 및 아미노산 잔기를 포함하는 적어도 12개, 종종 15 내지 18개, 자주 적어도 25개인 단량체 단위 길이이다. 두 개의 폴리뉴클레오타이드는 각각 (1) 두 개의 폴리뉴클레오타이드 사이에서 유사한 서열(즉, 완전한 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부만), 및 (2) 두 개의 폴리뉴클레오타이드 사이의 구분되는 서열을 포함할 수 있기 때문에, 두 개(이상)의 폴리뉴클레오타이드 사이의 서열 비교는 전형적으로 "비교 창"에 걸쳐 두 개의 폴리뉴클레오타이드의 서열을 비교함으로써 수행되어 서열 유사성의 국소 지역을 확인하고 비교한다. 용어 "비교 창"은, 두 개의 서열이 최적으로 배열된 후 서열이 인접한 위치의 동일한 수의 참고 서열에 비교되는, 적어도 6개, 보통 약 50 내지 약 100개, 더욱 일반적으로 약 100 내지 약 150개의 인접한 위치의 개념적인 분절을 지칭한다. 비교 창은 두 개의 서열의 최적 배열에 대해 (삽입 또는 결실을 포함하지 않는) 참고 서열에 비교해보면 약 20% 이하의 삽입 또는 결실(즉, 틈)을 포함할 수 있다. 비교 창을 배열하기 위한 서열의 최적 배열은 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA)의 컴퓨터화된 구현에 의해, 또는 선택된 임의의 다양한 방법에 의해 생성되는 (즉, 비교 창에 걸쳐 가장 높은 백분율 상동성을 야기하는) 최적 배열 및 검사에 의해 수행될 수 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Altschul et al ., 1997]에 개시된 프로그램의 BLAST 패밀리를 참고할 수 있다. 서열 분석에 대한 자세한 논의는 문헌 [Ausubel et al ., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15]의 19.3 단원에서 찾아 볼 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "엄격성(stringency)"은, 혼성화 및 세정 과정 동안 온도 및 이온 강도 조건, 및 특정 유기 용매의 존재 또는 부재를 지칭한다. 엄격성이 높을수록, 세정 후 표적에 혼성화된 채 남는, 라벨링된 프로브 폴리뉴클레오타이드 서열 및 고정화된 표적 뉴클레오타이드 서열 사이의 상보성의 정도가 높을 것이다. 용어 "높은 엄격성(high stringency)"은 고빈도의 상보적 염기를 가지는 뉴클레오타이드 서열만이 혼성화될 수 있는 온도 및 이온 조건을 지칭한다. 필요한 엄격성은 뉴클레오타이드 서열 의존적이고, 혼성화 동안 존재하는 다양한 구성성분에 의존한다. 일반적으로 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대하여 열 용융점(T_m)보다 약 10 내지 20℃ 낮도록 선택된다. T_m은 (정의된 이온 강도 및 pH 하에서) 표적 서열의 50%가 상보적 프로브에 혼성화되는 온도이다.

용어 "형질전환(transformation)"은 외래의 또는 내생성 핵산의 도입으로 인해 유기체, 예를 들어 박테리아, 효모, 포유동물, 조류, 파충류, 어류 또는 식물의 유전자형(genotype)의 변경을 의미한다.

용어 "벡터"는 폴리뉴클레오타이드가 그 내부로 삽입되거나 복제될 수 있는, 예를 들어 플라스미드, 박테리오파지, 효모 또는 바이러스로부터 유래된 폴리뉴클레오타이드 분자, 바람직하게 DNA 분자를 의미한다. 벡터는 바람직하게 하나 이상의 독특한 제한 부위(restriction site)를 함유하고, 표적 세포 또는 조직 또는 그의 자손 세포(progenitor cell) 또는 조직을 포함하는 정의된 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있거나, 또는 복제된 서열이 재생산가능하도록 정의된 숙주의 유전체(genome)에 통합될 수 있다. 따라서, 벡터는 자율적으로 복제하는 벡터, 즉 염색체 복제와 독립적으로 복제하는 염색체 외의 독립체(extra-chromosomal entity), 예를 들어 선형 또는 닫힌 원형 플라스미드, 염색체 외 구성요소, 미니 염색체, 또는 인공 염색체로서 존재하는 벡터일 수 있다. 벡터는 자가-복제를 보장하는 임의의 수단을 함유할 수 있다. 다르게는, 벡터는 숙주 세포로 도입되는 경우, 유전체에 통합되고 통합된 염색체와 함께 복제되는 것일 수 있다. 벡터 시스템은 단일 벡터 또는 플라스미드, 숙주 세포의 유전체로 도입될 전체 DNA를 함께 함유하는 두 개 이상의 벡터 또는 플라스미드, 또는 트랜스포존(transposon)을 포함할 수 있다. 벡터의 선택은 벡터가 도입될 숙주 세포와 벡터의 양립성에 전형적으로 의존할 것이다. 본 발명의 경우, 벡터는 바람직하게 바이러스성 또는 바이러스-유래 벡터이고, 이는 동물 및 바람직하게 포유동물 세포에서 작동적으로 기능하는 것이다. 이러한 벡터는 폭스바이러스(poxvirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 효모로부터 유래될 수 있다. 벡터는 또한 적합한 형질전환체의 선택에 사용될 수 있는 항생물질 내성 유전자와 같은 선택 마커를 포함할 수 있다. 이러한 내성 유전자의 예는 당 분야의 통상의 기술을 가진 자에게 알려져 있고, 항생물질 카나마이신 및 G418(제네티신(Geneticin), 등록상표)에 내성을 부여하는 nptII 유전자 및 항생물질 하이그로마이신 B에 내성을 부여하는 hph 유전자를 포함한다.

용어 "야생형" 및 "자연 발생"은 자연 발생 원천으로부터 단리된 경우 유전자 또는 유전자 산물의 특성을 가지는 유전자 또는 유전자 산물을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 야생형 유전자 또는 유전자 산물(예, 폴리펩타이드)은 집단에서 가장 자주 관측되는 것이고, 따라서 유전자의 "정상" 또는 "야생형"은 임의로 정해진다.

2. 프로트롬빈 활성제

본 발명은 프로트롬빈 활성제가 그의 공지된 단백질분해 활성에도 불구하고 분석물질을 탐지하기 위해 사용되는 혈청을 조제하기 위해 적합한 응고제라는 발견에 부분적으로 근거한다. 프로트롬빈 활성제(따로는 프로프롬비나아제로 공지됨)는 트립신-유사 활성을 보이며, 프로트롬빈을 활성화시킨다(즉, 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시키고, 이는 순차적으로 피브리노겐을 피브린으로 전환시키고, 따라서, 혈전 형성을 야기한다).

일부 실시양태에서, 프로트롬빈 활성제는 외인성(exogenous) 프로트롬빈 활성제이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "외인성 프로트론빈 활성제"는 혈청 샘플이 조제되는 혈액 샘플 이외의 출처로부터 수득된 프로트롬빈 활성제를 의미한다.

2.1 야생형 또는 자연 발생 프로트롬빈 활성제

본 발명에서 사용된 프로트롬빈 활성제는 뱀, 인간, 소 및 박테리아 프로트롬빈 활성제를 포함한, 임의의 적합한 유기체로부터 수득된 것들을 포함하는 야생형 또는 자연 발생 프로트롬빈 활성제를 포함할 수 있다. 프로트롬빈 활성제는 전장(full-length) 야생형 또는 자연 발생 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 프로트롬빈 활성제는 뱀 프로트롬빈 활성제이다. 적합하게는, 프로트롬빈 활성제는 뱀독 프로트롬빈 활성제이다. 뱀독 프로트롬빈 활성제는 그들의 구조, 기능 및 보조인자에 대한 필요성에 따라 일반적으로 4개의 그룹(A, B, C 및 D)으로 분류된다.

적합하게는, 뱀독 프로트롬빈 활성제는 그룹 A 프로트롬빈 활성제이다. 그룹 A 프로트롬빈 활성제는 3개의 도메인, 즉 메탈로프로테나아제(metalloproteinase), 디스인테그린(disintegrin) 및 Cys-풍부 도메인으로 구성되는 메탈로프로테나아제이다. 메탈로프로테나아제 도메인은 아연-킬레이트화 활성 부위에 상응하는 공통 서열 HEXXHXXGXXH를 함유한다. 이들 프로트롬빈 활성제는 적어도 여러 개의 독사 독에서 발견되고, Echis carinatus 독에서 수득한 에카린 및 Bothrops asper 독에서 수득한 바스파린을 포함한다.

적합하게는, 뱀독 프로트롬빈 활성제는 그룹 B 프로트롬빈 활성제이다. 그룹 B 프로트롬빈 활성제는 비공유적으로 결합되는 두 개의 서브유닛, 즉 메탈로프로테나아제 및 C-유형 렉틴-유사 다이설파이드 유사 이합체로 구성되는 메탈로프로테나아제이다. 이들 프로트롬빈 활성제는 여러 개의 독사 독에서 발견되고, Echis carinatus 독으로부터 수득한 카린액타바아제-1 및 카린액타바아제-2 및 Echis multisquamatus 독으로부터 수득한 멀택티바아제를 포함한다.

적합하게는, 뱀독 프로트롬빈 활성제는 그룹 C 프로트롬빈 활성제이다. 그룹 C 프로트롬빈 활성제는 세린 프로테아제이고, 포유동물의 인자 Xa-인자 Va 복합체와 비슷하다. 수타린 C(또는 PtPA) 및 오스큐타린 C(또는 OsPA)가 각각 Pseudonaja textilis 및 Oxyuranus scutellatus의 뱀독으로부터 수득된 그룹 C 프로트롬빈 활성제이다. 오미카린 C는 Oxyuranus microlepidotus 독으로부터 수득된 프로트롬빈 활성제이다.

적합하게는, 뱀독 프로트롬빈 활성제는 그룹 D 프로트롬빈 활성제이다. 그룹 D 프로트롬빈 활성제는 세린 프로테아제이고, 기능적으로 포유동물의 인자 Xa와 유사하다. 포르파린 D(Pseudechis porphyriacus로부터 수득), 노테카린 D(Notechis scutatus scutatus로부터 수득), 트로카린 D(Tropidechis carinatus로부터 수득), 호프사린 D(Hoplocephalus stephensi로부터 수득), 및 노테나린 D(Notechis ater niger로부터 수득)가 모두 그룹 D 프로트롬빈 활성제이다.

뱀 프로트롬빈 활성제의 리뷰가 문헌 [Kini, R. M. (2005)]에 제공되고, 호주 코브라과의 독으로부터 특이적으로 수득된 것(그룹 C 및 D 프로트롬빈 활성제)의 리뷰는 문헌 [St. Pierre et al . (2005)]에 제공되며, 각 내용은 본 명세서에서 전체가 참조된다. 이들 두 개의 리뷰는 상술한 그룹 A 내지 D로 뱀 프로트롬빈 활성제의 분류를 사용한다. 이들 분류는 그룹 I 내지 III(그룹 I은 그룹 A 및 B를 포함하고; 그룹 II는 현재 그룹 D이고, 그룹 III은 지금 그룹 C이다)을 사용한 이전 분류 시스템, 및 각 내용이 전체가 참조로 인용된 문헌 [Rosing, J. et al . (1991)] 및 문헌 [Rosing, J. et al . (1992)]을 포함하는 먼저 언급한 리뷰 문헌에 개시된 바와 같이 종종 추가적인 그룹 IV(프로트롬빈에서 펩타이드 결합을 깨지만, 프로트롬빈을 효소적으로 활성인 산물, 즉 트롬빈 또는 메이조트롬빈(meizothrombin)으로 전환시키지 않는 뱀독 활성제) 및 V(박테리아 프로트롬빈 활성제)를 대체한다. 분류 시스템에 변화를 설명하기 위해, 그 내용이 전체가 참조로 인용된 문헌 [Kini, R, M., et al . (2001)]을 참조한다.

특정한 실시양태에서, 뱀 프로트롬빈 활성제는 Elapidae 과로부터 수득되고, 이의 예시적인 예는, 이에 한정되지는 않지만, Demansia vestigiata , Hoplocephalus stephensii , Notechis ater humphreysi , Notechis ater niger , Notechis ater serventyi, Notechis flinkders , Notechis humphreysi , Notechis niger , Notechis occidentalis, Notechis scutatus , Notechis scutatus scutatus , Notechis serventyi, Oxyuranus microlepidotus , Oxyuranus scutellatus , Pseudechis porphyriacus, Pseudonaja affinis , Pseudonaja inframaculata , Pseudonaja nuchalis , Pseudonaja textilis , Rhinoplocephalus nigrescens , 및 Tropidechis carinatus을 포함하는 Demansia , Hoplocephalus , Notechis , Oxyuranus, Pseudechis, Pseudonaja , Rhinoplocephalus , 및 Tropidechis 속에 속하는 종을 포함한다.

특정한 실시양태에서, 뱀 프로트롬빈 활성제는 Viperidae 과로부터 수득되고, 이의 예시적인 예는, 이에 한정되지는 않지만 Bothrops alternatus , Bothrops asper , Bothrops atrox, Bothrops atrox asper , Bothrops brasili , Bothrops castelnaudi , Bothrops columbiensis , Bothrops erythromelas , Bothrops fonsecai , Bothrops itapetiningae , Bothrops jararaca , Bothrops neuwiedi, Bothrops venezuelensis, Echis carinatus , Echis coloratus , Echis multisquamatus , 및 Trimeresurus okinavensis을 포함하는 Botrhops , Echis 및 Trimeresurus 속에 속하는 종을 포함한다.

특정한 실시양태에서, 뱀 프로트롬빈 활성제는 Colubridae 과로부터 수득되고, 이의 예시적인 예는, 이에 한정되지는 않지만, Dispholidus typus , Rhabdophis tigrinus tigrinus , Thelotornis kirtlandii , 및 Thelotornis capensis을 포함하는 Dispholidus, Rhabdophis 및 Thelotornis 속에 속하는 종을 포함한다.

일부 실시양태에서, 뱀 프로트롬빈 활성제는 뱀독이거나 뱀독으로부터 수득된다. P. textilis 독으로부터 PtPA의 정제 및 특성분석은 문헌 [Masci (1986)] 및 문헌 [Masci et al ., (1998)]에 개시되고, O. scutellatus 독으로부터 OsPA는 문헌 [Speijer et al ., (1986)]에 개시되고, 이들 문헌은 모두 전체가 참조로서 인용된다. Echis carinatus 독으로부터 에카린의 정제 및 특성분석은 문헌 [Morita, T et al. (1981)] 및 문헌 [Nishida, S et al . (1995)]에 개시되고, Echis carinatus 독으로부터 카린액타바아제의 정제 및 특성분석은 문헌 [Yamada, D et al. (1996)]에 개시되고, Echis multisquamatus로부터 멀택티바아제의 정제와 특성분석은 문헌 [Yamada, D. et al ., (1997)]에 개시되고, Notechis scutatus로부터 노테카린의 정제 및 특성분석은 문헌 [Tans, G et al ., (1985)]에 개시되며, 각 문헌은 전체가 참조로서 인용된다.

특정한 실시양태에서, 프로트롬빈 활성제는 포유동물 프로트롬빈 활성제이다. 포유동물 프로트롬빈 활성제는 인간 혈액 및/또는 조직으로부터 유래된 것 및 소 혈액 및/또는 조직으로부터 유래된 것들을 포함한다.

특정한 실시양태에서, 프로트롬빈 활성제는 박테리아 프로트롬빈 활성제이다. 박테리아 프로트롬빈 활성제는 Staphylococcus aureus, Peptococcus indolicus , Bacteroides melaninogenicus , 및 Pseudomonas aeruginosa로부터 수득되는 것을 포함한다(Rosing, J. et al . (1991)).

당 분야에서 숙련된 자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 프로트롬빈 활성제는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하거나, 하나 이상의 폴리펩타이드로 필수적으로 구성되거나, 하나 이상의 폴리펩타이드로 구성된다. 일부 실시양태에서, 프로트롬빈 활성제는 단일 폴리펩타이드를 포함하거나, 단일 폴리펩타이드로 필수적으로 구성되거나, 또는 단일 폴리펩타이드로 구성된다. 다른 실시양태에서, 프로트롬빈 활성제는, 이에 한정되지는 않지만, 폴리펩타이드의 복합체를 포함한, 둘 이상의 폴리펩타이드를 포함하거나, 둘 이상의 폴리펩타이드로 필수적으로 구성되거나, 둘 이상의 폴리펩타이드로 구성된다. 프로트롬빈 활성제가 둘 이상의 폴리펩타이드를 포함하거나, 둘 이상의 폴리펩타이드로 필수적으로 구성되거나, 둘 이상의 폴리펩타이드로 구성되는 경우, 각각의 폴리펩타이드는 동일하거나 상이한 속, 및/또는 동일하거나 상이한 종에 속하는 유기체로부터 유래될 수 있다.

특정한 실시양태에서, 프로트롬빈 활성제는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51 및 52에 개시된 것들로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, SEQ ID NO: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 및 49에 개시된 것들로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함한다.

2.2 키메라 프로트롬빈 활성제 및 융합 폴리펩타이드

본 발명은 또한 키메라 폴리펩타이드(chimeric polypeptide)를 포함하는 프로트롬빈 활성제의 사용을 고려한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "키메라 폴리펩타이드"는 제 2 유기체로부터 수득된 제 2 폴리펩타이드 성분과 연결된 제 1 유기체로부터 수득된 폴리펩타이드를 포함하는 제 1 폴리펩타이드 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제 1 유기체 및 제 2 유기체는 상이한 속이다. 다른 실시양태에서, 제 1 유기체 및 제 2 유기체는 동일한 속의 상이한 종이다. 특정한 실시양태에서, 프로트롬빈 활성제는 인자 Xa-인자 Va 복합체를 닮은 키메라 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 제 1 폴리펩타이드는 인자 Xa-유사 폴리펩타이드를 포함하고, 제 2 폴리펩타이드는 인자 Va-유사 폴리펩타이드를 포함한다. 특정한 구체적인 실시양태에서, 제 1 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 및 50에 개시된 아미노산 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 및 49에 개시된 뉴클레오타이드 서열들로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하고, 제 2 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 7, 8, 11, 12, 13, 16 및 18에 개시된 아미노산 서열들로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO: 5, 6, 9, 10, 14, 15 및 17에 개시된 뉴클레오타이드 서열들로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 융합 폴리펩타이드를 포함하는 프로트롬빈 활성제의 사용을 고려한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "융합 폴리펩타이드"는 제 2 폴리펩타이드 성분에 연결된 제 1 폴리펩타이드 성분을 포함한다. 제 1 폴리펩타이드 성분은 제 1 유기체로부터 수득될 수 있고, 제 2 폴리펩타이드 성분은 제 2 유기체로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제 1 유기체 및 제 2 유기체는 상이한 속이다. 다른 실시양태에서, 제 1 유기체 및 제 2 유기체는 동일한 속의 상이한 종이다. 융합 폴리펩타이드의 제 1 폴리펩타이드 성분 또는 제 2 폴리펩타이드 성분은 야생형 또는 자연 발생 아미노산 서열의 전부 또는 일부(예, 본 명세서에서 개시된 바와 같이 절편)에 상응할 수 있다. 제 2 폴리펩타이드 성분은 제 1 폴리펩타이드 성분의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.

2.3 야생형 또는 자연 발생 폴리펩타이드의 절편

프로트롬빈 활성제는 전장(full-length) 야생형 또는 자연 발생 폴리펩타이드의 절편을 포함할 수 있고, 여기서 프로트롬빈 활성제는 프로트롬빈 활성화 활성을 나타낸다.

전형적으로, 전장 폴리펩타이드의 절편은 상호작용, 예를 들어 분자내 또는 분자간 상호작용에 참여할 수 있다. 이러한 절편은, SEQ ID NO: 2, 3, 4, 51, 및 52에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 및 (추정되는) 전장 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 충분히 유사하거나, 이로부터 유래되는 아미노산 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 1, 7, 8, 11, 12, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 및 50에 개시된 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 및 49에 개시된 뉴클레오타이드 서열들로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하고, 이들은 전장 폴리펩타이드보다 훨씬 적은 아미노산을 포함하고, 폴리펩타이드의 하나의 활성을 나타낸다.

2.4 자연 발생 프로트롬빈 활성제의 변이체( 폴리펩타이드 )

본 발명은 또한 야생형 또는 자연 발생 폴리펩타이드의 변이체인 폴리펩타이드를 포함하는 프로트롬빈 활성제를 고려한다. 본 발명에 의해 포함되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 프로트롬빈 활성제는 생물학적으로 활성이며, 즉 상기 프로트롬빈 활성제는 프로트롬빈 활성화 활성을 계속 가지고 있다.

이러한 "변이체" 프로트롬빈 활성제는 자연적인 폴리펩타이드로부터 유래된 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 폴리펩타이드는 자연적인 폴리펩타이드의 N-말단 및/또는 C-말단에 하나 이상의 아미노산의 결실(소위 절단(truncation)) 또는 삽입; 자연적인 폴리펩타이드에서 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 삽입; 또는 자연적인 폴리펩타이드에서 하나 이상의 부위에서 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 상응하는 자연적인 폴리펩타이드로부터 유래된다. 이들 변이체 프로트롬빈 활성제는 예를 들어, 유전적 다형성 또는 인간의 조작으로부터 생성될 수 있다.

변이체 폴리펩타이드의 비한정적인 추가적인 예는 전장(full-length) 또는 전구체(precursor) 폴리펩타이드 또는 효소원(zymogen) 형태인 폴리펩타이드의 형태를 처리한 전구체 폴리펩타이드 또는 효소원 형태인 폴리펩타이드를 포함한다.

야생형 또는 자연 발생 폴리펩타이드의 변이체는, 디폴트 파라미터를 사용하여 본 명세서에 개시된 서열 배열 프로그램에 의해 측정된 바와 같이, 이에 한정되지는 않지만, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 및 52의 서열, 또는 SEQ ID NO: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 및 49의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 야생형 또는 자연 발생 폴리펩타이드의 아미노산과 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 일반적으로 적어도 75%, 80%, 85%, 보통 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상, 및 전형적으로 약 96%, 97%, 98% 또는 그 이상(및 그 사이의 모든 정수 백분율)의 서열 유사성 또는 동일성을 가질 것이다. 변이체 폴리펩타이드의 범위 내에 해당되는 야생형 또는 자연 발생 폴리펩타이드의 변이체는 일반적으로 200, 100, 50 또는 20개의 아미노산 잔기 정도 또는 적합하게는 1 내지 15개 정도의 아미노산 잔기, 1 내지 10개, 예컨대 6 내지 10개, 5개 정도, 4, 3, 2, 또는 심지어 1개의 아미노산 잔기만큼 폴리펩타이드와 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 또는 52에서 상응하는 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 또는 49에서 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열과, 적어도 1개, 그러나 15, 10 또는 5개의 아미노산 잔기보다는 적게 상이하다. 다른 실시양태에서, 이는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 또는 52에 상응하는 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 또는 49에서 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 적어도 1개, 그러나 전체 잔기의 20%, 15%, 10% 또는 5%보다 적게 상이하다.

폴리펩타이드는 아미노산 치환, 결실, 절단 및 삽입을 포함하여 다양한 방식으로 변경될 수 있다. 이러한 조작을 위한 방법은 일반적으로 이 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체는 DNA에서 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이생성 및 뉴클레오타이드 서열 변경에 대한 방법은 이 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어 문헌 [Kunkel (1985)], 문헌 [Kunkel et al., (1987)], 미국 특허 제4,873,192호, 문헌 [Watson et al ., (1987)] 및 본 명세서의 인용된 참조 문헌을 참고한다. 관심의 대상인 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 안내사항은 문헌 [Dayhoff et al . (1978)]에서 발견될 수 있다. 포인트 돌연변이 또는 절단에 의해 만들어진 조합 라이브러리(combinatoryial libraries)의 유전자 산물을 스크리닝(screening)하는 방법, 및 선택된 특성을 가지는 유전자 산물을 위한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 해당 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 폴리펩타이드의 조합 돌연변이생성에 의해 생성되는 유전자 라이브러리의 빠른 스크리닝을 위해 조정될 수 있다. 라이브러리에서 기능성 돌연변이의 빈도를 향상시키는 기법인, 반복 앙상블 돌연변이생성(REM, recursive ensemble mutagenesis)은 폴리펩타이드 변이체를 확인하기 위해 스크리닝 분석법과 함께 사용될 수 있고, 예를 들어 문헌 [Arkin et al. (1992)] 및 문헌 [Delagrave et al . (1993)]을 참조한다. 보존적 치환, 예컨대 한 아미노산을 다른 유사한 특성을 가진 아미노산으로의 교환이 하기에 상세하게 논의되는 바와 같이 바람직할 수 있다.

변이체 폴리펩타이드는 부모(예, 자연 발생 또는 참고) 아미노산 서열에 비교시, 그 서열에 따라 다양한 위치에서 보존적 아미노산 치환을 함유할 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 일원은 당 분야에 정의되어 있고, 이는 일반적으로 하기와 같이 하위 분류될 수 있다:

산성: 잔기는 생리적 pH에서 H 이온의 손실로 인해 음의 전하를 가지고, 펩타이드가 생리적 pH에서 수성 매질내에 존재하는 경우 함유된 펩타이드의 배열에서 표면 위치를 찾기 위해 잔기는 수용액에 의해 끌어 당겨진다. 산성 측쇄를 가진 아미노산은 글루타민산 및 아스파르트산을 포함한다.

염기성: 잔기는 생리적 pH에서 또는 그의 하나 또는 두 개의 pH 단위에서(예, 히스타민) H 이온과 결합으로 인해 양의 전하를 가지고, 펩타이드가 생리적 pH에서 수성 매질 내에 존재하는 경우 함유된 펩타이드의 배열에서 표면 위치를 찾기 위해 잔기는 수용액에 의해 끌어 당겨진다. 염기성 측쇄를 가진 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다.

대전성(charged): 잔기는 생리적 pH에서 대전되고, 따라서 산성 또는 염기성 측쇄를 가진 아미노산을 포함한다(즉, 글루타민산, 아스파르트산, 아르기닌, 라이신 및 히스타민).

소수성: 잔기는 생리적 pH에서 대전되지 않으며, 펩타이드가 수성 매질 내에서 존재하는 경우 함유된 펩타이드의 배열에서 내부 위치를 찾기 위해 잔기는 수용액에 의해 반발된다. 소수성 측쇄를 가진 아미노산은 타이로신, 발린, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판을 포함한다.

중성/극성: 잔기는 생리적 pH에서 대전되지 않지만, 펩타이드가 수성 매질 내에 존재하는 경우 함유된 펩타이드의 배열에서 내부 위치를 찾기 위해 잔기가 수용액에 의해 충분히 반발되지 않는다. 중성/극성 측쇄를 가진 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 히스티딘, 세린 및 트레오닌을 포함한다.

본 명세서는 극성기가 결여된 경우도 측쇄가 소수성을 부여하기에 충분히 크기 않기 때문에 특정 아미노산을 "작은" 것으로 특징화할 수 있다. 프롤린을 제외하고, "작은" 아미노산은 적어도 하나의 극성기가 측쇄에 있는 경우, 4개 이하의 탄소 원자를 가진 것이고, 그렇지 않은 경우, 3개 이하의 탄소 원자를 가진 것이다. 작은 측쇄를 가진 아미노산은 글리신, 세린, 알라닌 및 트레오닌이다. 유전자-암호화된 2차 아미노산 프롤린은 펩타이드 쇄의 2차 배열 상에 알려진 효과 때문에 특별한 경우이다. 프롤린의 구조는 그 측쇄가 α-탄소뿐만 아니라 α-아미노기의 질소에 결합된다는 점에서 다른 모든 자연 발생 아미노산과 상이하다. 그러나, 여러 개의 아미노산 유사성 매트릭스(예, 예를 들어 문헌 [Dayhoff et al . (1978)] 및 문헌 [Gonnet et al . (1992)]에 개시된 PAM120 매트릭스 및 PAM250 매트릭스)는 글리신, 세린, 알라닌 및 트레오닌과 동일한 그룹에 프롤린을 포함한다. 따라서, 본 발명의 목적을 위하여 프롤린은 "작은" 아미노산으로 분류된다.

극성 또는 비극성으로의 분류를 위해 요구되는 끌림 및 반발의 정도는 임의적이고, 따라서 본 발명에 의해 구체적으로 고려된 아미노산은 하나 또는 다른 것으로 분류되었다. 구체적으로 언급되지 않은 대부분의 아미노산은 알려진 거동을 근거로 분류될 수 있다.

아미노산 잔기는 고리형 또는 비고리형, 및 방향족 또는 비방향족, 잔기의 측쇄 치환 기에 대한 자명한 분류 및 작거나 큰 것으로 추가로 하위분류될 수 있다. 잔기는, 추가적인 극성 치환기가 존재한다면 카르복실 탄소를 포함하여 총 4개 이하, 존재하지 않는다면 3개 이하의 탄소 원자를 함유하면 작은 것으로 여겨진다. 작은 잔기는 당연히 항상 비방향족이다. 구조적 특성에 따라, 아미노산 잔기는 두 가지 이상의 분류에 해당될 수 있다. 자연 발생 아미노산에 대한 이 기준에 따르는 하위 분류가 표 1에 제시된다.

표 1: 아미노산 하위 분류

하위 분류	아미노산
산성	아스파르트산, 글루타민산
염기성	비고리형: 알라닌, 라이신; 고리형: 히스티딘
대전성(Charged)	아스파르트산, 글루타민산, 알라닌, 라이신, 히스티딘
작은 아미노산	글리신, 세린, 알라닌, 트레오닌, 프롤린
극성/중성	아스파라긴, 히스티딘, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌
극성/큰 아미노산	아스파라긴, 글루타민
소수성	타이로신, 발린, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판
방향족	트립토판, 타이로신, 페닐알라닌
쇄 배향에 영향을 주는 잔기	글리신 및 프롤린

보존적 아미노산 치환은 또한 측쇄에 근거한 그룹화를 포함한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신이고; 지방족-하이드록시 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이고; 아마이드 함유 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 및 황 함유 측쇄를 가진 아미노산의 그룹은 시스테인 및 트레오닌이다. 예를 들어, 류신의 아이소류신 또는 발린으로 대체, 아스파테이트의 글루타메이트로 대체, 트레오닌의 세린으로 대체, 또는 아미노산의 구조적으로 관련된 아미노산으로 유사한 대체는 생성되는 변이체 폴리펩타이드의 특성상에 주요한 영향을 미치지 않을 것으로 기대하는 것은 합리적이다. 아미노산 변화는 기능성 폴리펩타이드를 야기하는지 여부는 그의 활성을 분석함으로써 쉽게 결정될 수 있다. 보존적 치환은 예시적인 치환 및 바람직한 치환이라는 제목 하에 표 2에 도시된다. 본 발명의 범위 내에 해당되는 아미노산 치환은 일반적으로 (a) 치환의 영역에서 펩타이드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하여 그 효과에서 현저하게 바뀌지 않는 치환을 선택함으로써 수행된다. 치환이 도입된 후에, 변이체는 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.

표 2: 예시적인 아미노산 치환 및 바람직한 아미노산 치환

원래 잔기	예시적인 치환	바람직한 치환
Ala	Val, Leu, Ile	Val
Arg	Lys, Gln, Asn	Lys
Asn	Gln, His, Lys, Arg	Gln
Asp	Glu	Glu
Cys	Ser	Ser
Gln	Asn, His, Lys	Asn
Glu	Asp, Lys	Asp
Gly	Pro	Pro
His	Asn, Gln, Lys, Arg	Arg
Ile	Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleu	Leu
Leu	Norleu, Ile, Val, Met, Ala, Phe	Ile
Lys	Arg, Gln, Asn	Arg
Met	Leu, Ile, Phe	Leu
Phe	Leu, Val, Ile, Ala	Leu
Pro	Gly	Gly
Ser	Thr	Thr
Thr	Ser	Ser
Trp	Tyr	Tyr
Tyr	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe
Val	Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Norleu	Leu

다르게는, 보존적 치환을 만들기 위한 유사한 아미노산은 측쇄의 동일성에 근거하여 3개의 카테고리로 그룹화될 수 있다. 문헌 [Zubay, G. (1993)]에 개시된 바와 같이, 제 1 그룹은 글루타민산, 아스파르트산, 아르기닌, 라이신, 히스티딘을 포함하고, 이들은 모두 대전된 측쇄를 가지고; 제 2 그룹은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 글루타민, 아스파라긴을 포함하고; 및 제 3 그룹은 류신, 아이소류신, 발린, 알라닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌을 포함한다.

따라서, 폴리펩타이드에서 예측된 비필수적 아미노산 잔기는 전형적으로 동일한 측쇄 패밀리에 속하는 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 다르게는, 돌연변이는 예컨대 포화 돌연변이생성에 의해 폴리펩타이드 유전자 암호화 서열의 전부 또는 일부에 따라 무작위적으로 도입될 수 있고, 생성된 돌연변이는 활성이 유지되는 돌연변이를 확인하기 위해 부모 폴리펩타이드의 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 암호화 서열의 돌연변이생성에 따라, 암호화된 펩타이드는 재조합으로 발현될 수 있고, 펩타이드의 활성이 측정될 수 있다. "비필수적" 아미노산 잔기는 하나 이상의 활성을 없애거나 실질적으로 변경하지 않고 폴리펩타이드의 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기이다. 적합하게는, 변경은 이들 활성 중 하나 이상을 실질적으로 변경하지 않아서, 예를 들어, 활성이 야생형의 적어도 20%, 40%, 60%, 70% 또는 80%이다. "필수" 아미노산 잔기는 참고 폴리펩타이드의 야생형 서열로부터 변경시 야생형 활성의 20% 미만으로 존재하도록 부모 분자의 활성의 파괴를 야기한다.

따라서, 본 발명은 또한 자연 발생 폴리펩타이드 서열의 변이체 또는 생물학적으로 활성인 절편을 고려하고, 여기서 변이체는 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 자연 발생 서열과 구분된다. 일반적으로, 변이체는 예를 들어 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 또는 52에 개시된 부모 또는 참고 폴리펩타이드 서열, 또는 예를 들어 SEQ ID NO: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 또는 49에 개시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 부모 또는 참고 폴리펩타이드 서열과 적어도 약 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 유사성을 나타낸다. 바람직하게는, 변이체는 예를 들어 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 또는 52에 개시된 부모 폴리펩타이드 서열, 또는 예를 들어 SEQ ID NO: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 또는 49에 개시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 부모 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 서열 동일성을 가질 것이다. 게다가, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 자연적인 또는 부모 서열과 상이하지만 부모 폴리펩타이드의 특성을 간직하는 서열이 고려된다. 폴리펩타이드는 또한 부모 암호화 폴리뉴클레오타이드 서열에, 본 명세서에서 정의된 엄격한 조건, 특히 높은 엄격성 조건 하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드, 또는 하술되는 그의 비암호화 가닥을 포함한다. 예시적인 부모 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 및 49에 개시된다.

일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩타이드는 적어도 하나 및 50, 40, 30, 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3 또는 2 미만의 아미노산 잔기가 참고 서열과 상이하다. 다른 실시양태에서, 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51 또는 52의 상응하는 서열, 또는 SEQ ID NO: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 또는 49의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 잔기의 적어도 1% 이상이지만, 20%, 15%, 10% 또는 5%보다 적은 정도로 상이하다.(이 비교가 배열을 요구하면, 서열은 최대 유사성으로 배열되어야 한다. 결실 또는 삽입 또는 불일치로 인해 "루프화된" 서열은 차이로 간주된다.) 차이는 적합하게는 비필수적 잔기에서 차이 또는 변화, 또는 보존적 치환이다.

단백질의 변이체는 단백질의 돌연변이, 예를 들어 절단 돌연변이의 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 단백질 암호화 서열의 라이브러리 또는 절편, 예를 들어 N 말단, C 말단 또는 내부 절편은 단백질의 변이체의 스크리닝 및 후속 선택을 하기 위한 절편의 다양한 집단을 생성하기 위해 사용될 수 있다.

포인트 돌연변이 또는 절단에 의해 만들어진 조합 라이브러리의 유전자 산물을 스크리닝하는 방법, 및 선택된 특성을 가진 유전자 산물을 위한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 단백질의 조합 돌연변이생성에 의해 생성되는 유전자 라이브러리의 빠른 스크리닝에 적용될 수 있다.

뱀 프로트롬빈 활성제 에카린의 일부 변이체가 미국 특허 제 6,413,737호에 개시된다.

2.5 자연 발생 프로트롬빈 활성제의 변이체( 뉴클레오타이드 )

본 발명은 야생형 또는 자연 발생 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 야생형 또는 자연 발생 폴리뉴클레오타이드의 변이체에 의해 암호화되는 폴리펩타이드를 포함하는 프로트롬빈 활성제를 고려한다.

야생형 또는 자연 발생 폴리뉴클레오타이드의 변이체는, 디폴트 파라미터를 사용하여 본 명세서 그 밖의 곳에서 개시된 서열 배열 프로그램에 의해 측정된 바와 같이, 이에 한정되는 것은 아니지만, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 또는 52의 서열에 의해 암호화되는 서열, 또는 SEQ ID NO: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 및 49의 서열, 또는 그의 상보체를 포함하는 야생형 또는 자연 발생 폴리뉴클레오타이드에 대한 뉴클레오타이드 서열과 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 일반적으로 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 보통 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상, 및 전형적으로 약 96%, 97%, 98% 이상(및 그 사이의 모든 정수 백분율)의 서열 유사성 또는 동일성을 가질 것이다.

폴리펩타이드를 암호화하는 예시적인 뉴클레오타이드 서열은 유전자 또는 그의 전사 또는 이들 전사의 DNA 복제의 전장 또는 실질적으로 전장 뉴클레오타이드 서열의 일부뿐만 아니라 전장 유전자를 포함한다. 뉴클레오타이드 서열의 일부는 자연적인 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 유지하는 폴리펩타이드 일부 또는 분절을 암호화할 수 있다. 폴리펩타이드의 생물학적으로 활성인 절편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 일부는 적어도 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 300 또는 400개의 인접하는 아미노산 잔기, 또는 거의 전장 폴리펩타이드에 존재하는 총 아미노산까지 암호화할 수 있다.

또한 뉴클레오타이드 서열의 변이체가 고려된다. 핵산 변이체는 예컨대 대립 유전자(동일 위치), 상동 유전자(상이한 위치) 및 이종상동성 유전자(상이한 유기체)와 같이 자연 발생될 수 있고, 또는 비-자연 발생될 수 있다. 이와 같은 자연 발생 변이체는 잘 알려진 분자 생물학 기법, 예를 들어 당분야에서 공지된 중합효소 연속 반응(PCR, polymerase chain reaction) 및 혼성화 기법의 사용으로 확인될 수 있다. 비-자연 발생 변이체는 폴리뉴클레오타이드, 세포 또는 유기체에 적용되는 것을 포함하여 돌연변이생성 기법에 의해 제조될 수 있다. 변이체는 뉴클레오타이드 치환, 결실, 전환 및 삽입을 함유할 수 있다. 변이체는 암호화 또는 비암호화 지역 중 하나 또는 둘 다에서 발생할 수 있다. 변이는 (암호화된 산물에서 비교한 경우) 보존적 및 비보존적 아미노산 치환 둘 다를 만들 수 있다. 뉴클레오타이드 서열에 대해, 보존적 변이체는 유전적 암호의 축퇴(degeneracy)로 인해 참고 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 이들 서열을 포함한다. 변이체 뉴클레오타이드 서열은 또한 예를 들어 부위 특이적 돌연변이생성(site-directed mutagenesis)을 사용함으로써 생성되지만, 폴리펩타이드를 여전히 암호화하는 것들과 같은 합성으로 유래된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일반적으로 특정 뉴클레오타이드 서열의 변이체는 디폴트 파라미터를 사용하여 본 명세서 그 밖의 곳에서 개시된 서열 배열 프로그램에 의해 측정된 바와 같이, 특정 뉴클레오타이드 서열에 적어도 약 30%, 40% 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 일반적으로 적어도 약 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 바람직하게 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 이상, 및 더욱 적합하게는 약 96%, 97%, 98% 이상의 서열 동일성을 가질 것이다.

뉴클레오타이드 서열은 다른 유기체, 특히 다른 뱀으로부터 상응하는 서열 및 대립유전자를 단리시키기 위해 사용될 수 있다. 방법은 핵산 서열의 혼성화에 대하여 당분야에서 쉽게 구할 수 있다. 다른 유기체로부터 암호화 서열은 본 명세서에 개시된 암호화 서열과 서열 동일성을 근거로 공지된 기법에 따라 단리될 수 있다. 이들 기법에서, 공지된 암호화 서열의 전부 또는 일부는 선택된 유기체(예, 뱀)로부터 복제된 유전자 DNA 절편 또는 cDNA 절편의 집단(즉, 유전자 또는 cDNA 라이브러리)에 존재하는 다른 암호화 서열에 선택적으로 혼성화되는 프로브로서 사용된다. 따라서, 본 발명은 또한 하술되는 엄격한 조건 하에서 참고 뉴클레오타이드 서열, 또는 그들의 상보체에 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "낮은 엄격성, 중간 엄격성, 높은 엄격성 또는 매우 높은 엄격성 조건 하에서 혼성화된다"는 혼성화 및 세정에 대한 조건을 설명한다.

혼성화 반응을 수행하기 위한 안내는 문헌 [Ausubel et al ., supra, sections 6.3.1-6.3.6]에서 찾아볼 수 있다. 수성 및 비수성 방법이 참고문헌에 개시되어 있고, 둘 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 본 명세서에서 낮은 엄격성 조건에 대한 지시는 적어도 약 1% v/v 내지 적어도 약 15% v/v의 포름아마이드 및 적어도 약 1 M 내지 적어도 약 2 M의 42℃에서 혼성화를 위한 염, 및 적어도 약 1 M 내지 적어도 약 2 M의 42℃에서 세정을 위한 염을 포함하고 아우른다. 낮은 엄격성 조건은 또한 1%의 소 혈청 알부민(BSA), 1 mM EDTA, 0.5 M NaHPO₄(pH 7.2), 65℃에서 혼성화를 위한 7% SDS, 및 (i) 2 x SSC, 0.1% SDS; 또는 (ii) 0.5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO₄(pH 7.2), 실온에서 세정하기 위한 5% SDS를 포함할 수 있다. 낮은 엄격성 조건의 한 실시양태에서, 약 45℃에서 6 x 나트륨 클로라이드/나트륨 시트레이트(SSC)로 혼성화에 이어서, 적어도 50℃에서 0.2 x SSC, 0.1% SDS에서 두 차례 세정을 포함할 수 있다(세정 온도는 낮은 엄격성 조건에서 55℃로 증가될 수 있다). 중간 엄격성 조건은 적어도 약 16% v/v 내지 적어도 약 30% v/v의 포름아마이드 및 적어도 약 0.5 M 내지 적어도 약 0.9M의 42℃에서 혼성화를 위한 염, 및 적어도 약 0.1 M 내지 적어도 약 0.2 M의 55℃에서 세정을 위한 염을 포함하고 아우른다. 중간 엄격성 조건은 또한 1% 소 혈청 알부민(BSA), 1 mM EDTA, 0.5 M NaHPO₄(pH 7.2), 65℃에서 혼성화를 위한 7% SDS, 및 (i) 2 x SSC, 0.1% SDS; 또는 (ii) 0.5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO₄(pH 7.2), 60 내지 65℃에서 세정을 위한 5% SDS을 포함할 수 있다. 중간 엄격성 조건의 한 실시양태는 약 45℃에서 6 x SSC로 혼성화에 이어서, 60℃에서 0.2 x SSC, 0.1% SDS에서 한 번 이상 세정을 포함할 수 있다. 높은 엄격성 조건은 적어도 약 31% v/v 내지 적어도 약 50% v/v의 포름아마이드 및 약 0.01 M 내지 약 0.15 M의 42℃에서 혼성화를 위한 염, 및 약 0.01 M 내지 약 0.02 M의 55℃에서 세정을 위한 염을 포함하고 아우른다. 높은 엄격성 조건은 또한 1% BSA, 1 mM EDTA, 0.5 M NaHPO₄₍pH 7.2), 65℃에서 혼성화를 위한 7% SDS, 및 (i) 0.2 x SSC, 0.1% SDS; 또는 (ii) 0.5% BSA, 1 mM EDTA, 40 mM NaHPO₄₍pH 7.2), 65℃ 초과의 온도에서 세정을 위한 1% SDS를 포함할 수 있다. 높은 엄격성 조건의 한 실시양태는 약 45℃에서 6 x SSC에서 혼성화에 이어서, 65℃에서 0.2 x SSC, 0.1% SDS로 한 번 이상의 세정을 포함한다.

특정한 실시양태에서, 폴리펩타이드는 낮은, 중간, 높은 또는 매우 높은 엄격성 조건 하에서 개시된 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다. 매우 높은 엄격성 조건의 한 실시양태는 65℃에서 0.5 M 나트륨 포스페이트, 7% SDS에서 혼성화에 이어서, 65℃에서 0.2 x SSC, 1% SDS로 한 번 이상의 세정을 포함한다.

다른 엄격성 조건은 당분야에 공지되어 있고, 숙련자들은 다양한 요인들이 혼성화의 특이성을 최적화하기 위해 조작될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 최종 세정의 엄격성의 최적화는 높은 혼성화 정도를 보장하는 역할을 할 것이다. 자세한 예는 문헌 [Ausubel et al ., supra at pages 2.10.1 to 2.10.16] 및 문헌 [Sambrook, J. et al . (2001), 섹션 1.101 내지 1.104에서]을 참고한다.

엄격한 세정이 전형적으로 약 42℃ 내지 68℃의 온도에서 수행되지만, 당분야의 숙련된 자는 다른 온도가 엄격성 조건에 적합할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 최대 혼성화율은 전형적으로 DNA-DNA 하이브리드의 형성을 위해 T_m 이하인 20℃ 내지 25℃에서 발생한다. 당 분야에서 T_m은 용융 온도, 또는 두 개의 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열이 해리되는 온도로 잘 알려져 있다. T_m을 추정하는 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다(문헌 [Ausubel et al ., supra , at page 2.10.8]을 참고한다). 일반적으로, 완벽하게 일치된 DNA의 이중나선의 T_m은 하기 식에 의해 대략적으로 예측될 수 있다.

T_m = 81.5 + 16.6(log₁₀M) + 0.41(%G+C) - 0.63(% 포름아마이드)-(600/length)

상기 식에서, M은 Na⁺의 농도이고, 바람직하게 0.01 몰농도 내지 0.4 몰농도의 범위이고; %G+C는 염기의 총 숫자의 백분율로서 구아닌 및 사이토신 염기의 합이고, 30% 내지 75%G+C 범위 내이고; % 포름아마이드는 포름아마이드 농도의 부피 백분율이고; 길이(length)는 DNA 이중나선에서 염기쌍의 숫자이다. 이중나선 DNA의 T_m은 무작위하게 불일치된 염기쌍의 숫자에서 1% 증가에 따라 약 1℃씩 감소된다. 세정은 일반적으로 높은 엄격성에 대해 T_m-15℃, 또는 온화한 엄격성에 대해 T_m-30℃에서 수행된다.

혼성화 과정의 한 예에서, 고정화된 DNA를 함유하는 멤브레인(예를 들어, 니트로셀룰로즈 멤브레인 또는 나일론 멤브레인)은 표지된 프로브를 함유하는 혼성화 버퍼(50% 탈이온화된 포름아마이드, 5 x SSC, 5 x 덴하르트 용액(Denhardt's solution)(0.1% 피콜, 0.1% 폴리비닐피롤리돈 및 0.1% 소 혈청 알부민), 0.1% SDS 및 200 mg/mL 변성된 연어 정자 DNA)에서 42℃에서 하룻밤 동안 혼성화된다. 멤브레인은 이어서 두 번의 연속적인 중간 엄격성 세정(즉, 45℃에서 15분 동안 2 x SSC, 0.1% SDS, 이어서 50℃에서 15분 동안 2 x SSC, 0.1% SDS)시킨 후, 두 번의 연속적인 높은 엄격성 세정(즉, 55℃에서 12분 동안 0.2 x SSC, 0.1% SDS에 이어서, 65 내지 68℃에서 12분 동안 0.2 x SSC, 0.1% SDS 용액)시켰다.

3. 프로트롬빈 활성제의 제조

프로트롬빈 활성제는 당 분야에 숙련된 자에게 알려진 임의의 적합한 과정에 의해 제조될 수 있다.

예를 들어, 프로트롬빈 활성제는 임의의 통상적인 방법에 의해, 예컨대 이에 한정되지는 않지만 뱀독, 혈액 및 혈액 유래 산물(예를 들어, 혈청)을 포함하는 자연 발생 저장소로부터 폴리펩타이드를 정제함으로써 제조될 수 있다. 정제의 방법은 렉틴(예를 들어, 밀배아 응집소(agglutinin)) 친화도 크로마토그래피 또는 다른 분리법을 포함하는 친화도 크로마토그래피를 포함한다. 유도된 프로트롬빈 활성제의 확인 및 순도는 예를 들어 SDS-폴리아크릴아마이드 전기영동법에 의해 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, high performance liquid chromatography)와 같이 크로마토그래피적으로 측정될 수 있다. 예를 들어, P. textilis 뱀독으로부터 수타린 C(또한 약어로 PtPA)의 정제와 특성분석은 문헌 [Masci (1986)] 및 문헌 [Masci et al. (1988)]에, O. scutellatus 독으로부터 오스큐타린 C(OsPA)는 문헌 [Speijer et al . (1986)]에 개시되어 있고, 모두 전체가 참조로서 인용된다. E. carinatus 독으로부터 에카린의 정제는 문헌 [Morita, T et al. (1981)]에 개시되어 있고, 이 내용도 전체가 참조로 인용되어 있다.

다르게는, 프로트롬빈 활성제는, 예를 들어 문헌 [Yamanouye, N., et al . (2007)]에 개시된 방법을 포함하여, 당 분야에 알려진 방법을 사용하여 배양액에서 독선 세포(venom gland cell)로부터 생산될 수 있고, 상기 문헌은 시험관 내 독 생산에 대해 Bothrops jararaca의 독선으로부터 분비 세포의 1차 배양을 개시하며, 그 내용은 전체가 참조로 인용된다.

다르게는, 프로트롬빈 활성제는 예를 들어 문헌 [Atherton and Shephard (1989)]의 챕터 9 및 문헌 [Roberge et al . (1995)]에서 개시된 바와 같이 용액 합성 또는 고상 합성을 사용하여 화학 합성에 의해 합성될 수 있다.

다르게는, 프로트롬빈 활성제는 재조합 기법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용된 프로트롬빈 활성제는 (a) 폴리펩타이드를 암호화하고 조절 요소에 작동가능하게 연결되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 구조물을 제조하는 단계; (b) 숙주 세포로 구조물을 도입하는 단계; (c) 숙주 세포를 배양하여 폴리펩타이드를 발현시키는 단계; (d) 숙주 세포로부터 폴리펩타이드를 단리하는 단계를 포함하는 과정에 의해 제조될 수 있다. 프로트롬빈 활성제가 복합체 또는 두 개의 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 프로트롬빈 활성제는 (a) 제 1 폴리펩타이드를 암호화하고 조절 요소와 작동가능하게 연결되는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 구조물을 제조하는 단계; (b) 숙주 세포로 구조물을 도입하는 단계; (c) 숙주 세포를 배양하여 제 1 폴리펩타이드를 발현하는 단계; (d) 숙주 세포로부터 폴리펩타이드를 단리하는 단계; 단계 (a) 내지 (b)를 제 2 폴리펩타이드를 위해 반복하는 단계; 및 제 1 폴리펩타이드 및 제 2 폴리펩타이드를 연결하는 단계를 포함하는 과정에 의해 제조될 수 있다. 예시적인 예에서, 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 SEQ ID NO: 5, 6, 9, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 또는 그들의 변이체에 개시된 서열의 적어도 생물학적으로 활성인 부분을 암호화한다.

재조합 프로트롬빈 활성제는 예를 들어 문헌 [Sambrook, J. et al . (2001), in particular Chapters 16 and 17]; 문헌 [Ausubel et al . (1994, supra), in particular Chapters 10 and 16]; 및 문헌 [Coligan et al ., Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1997), in particular Chapters 1, 5 and 6]에 개시된 바와 같이 표준 과정을 사용하여 통상적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 그룹 C 및 그룹 D 프로트롬빈 활성제를 생산하기 위해 사용될 수 있는 뱀 인자 V 및 뱀 인자 X의 재조합 생산은 문헌 [Filippovic, I. et al (2005)] 및 문헌 [Bos, M. H. A. et al (2009)]에 개시되고, 이들은 각자 전체가 본 명세서에서 인용된다. 에카린 및 에카린의 변이체의 재조합 생산을 위한 예시적인 방법이 문헌 [Yonemura, H. et al . (2004)] 및 미국 특허 제6,413,737호에서 제공되고, 각 이들문헌의 전체 내용은 각자 참조로 본 명세서에서 인용된다.

4. 용기( container )

본 발명은 적합한 혈청 샘플을 제조하기 위해 임의의 적합한 용기를 고려한다. 많은 적합한 용기는 미국 특허 제4,227,620호; 미국 특허 제4,256,120호; 미국 특허 제6,416,717호; 미국 특허 제6,592,613호; 미국 특허 제6,686,204호; 미국 특허 제7,488,287호; 미국 특허 제7,699,828호; 유럽 특허 제0 628 816호에 개시된 것 및 본 명세서의 실시예에서 사용되는 것을 포함하여 시판중인 용기를 포함하여 당 분야에서 잘 알려져 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용된 용기는 유리 또는 플라스틱 튜브를 포함한 튜브이다. 적합한 플라스틱은 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 및 폴리스타이렌을 포함한다.

용기는 비워지고 적절한 구멍을 뚫을 수 있는 중격(septum) 또는 캡으로 밀봉될 수 있다. 이는 바늘의 한 말단은 환자의 정맥으로 삽입되고 다른 말단은 튜브의 말단을 덮는 중격 또는 캡을 뚫어 튜브 내의 진공이 바늘을 통해 튜브로 혈액 샘플을 당기도록 사용되는 이중 말단 바늘을 고려한다.

용기는 임의의 적합한 크기일 수 있다. 일부 실시양태에서, 용기는 50 ㎕ 내지 10 mL의 혈액 샘플을 담도록 설계된다. 적합하게는, 용기는 적어도 50 ㎕, 100 ㎕, 150 ㎕, 200 ㎕, 250 ㎕, 300 ㎕, 350 ㎕, 400 ㎕, 450 ㎕, 500 ㎕, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 8 mL 또는 10 mL의 혈액 샘플을 담도록 설계된다.

일부 실시양태에서, 용기는 0.01 내지 100 ㎍의 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 0.01 내지 100 ㎍의 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 또는 0.01 내지 100 ㎍의 프로트롬빈 활성제로 구성되는 응고 조성물을 함유한다. 적합하게는, 용기는 0.1 내지 10 ㎍의 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 0.1 내지 10 ㎍의 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 또는 0.1 내지 10 ㎍의 프로트롬빈 활성제로 구성되는 응고 조성물을 함유한다. 대표적인 실시양태에서, 용기는 0.1 내지 10 ㎍의 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 0.1 내지 10 ㎍의 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 또는 0.1 내지 10 ㎍의 프로트롬빈 활성제로 구성되는 응고 조성물을 함유하고, 20 ng/mL 내지 2.5 ㎍/mL로 4 mL 혈액 샘플 중에 프로트로빈 활성제의 최종 농도를 제공하는 4 mL의 혈액 샘플을 담는다.

일부 실시양태에서, 용기는 0.0005 내지 15 ㎍/mL의 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 0.0005 내지 15 ㎍/mL의 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 또는 0.0005 내지 15 ㎍/mL의 프로트롬빈 활성제로 구성되는 응고 조성물을 함유한다. 적합하게는, 용기는 0.005 내지 10 ㎍의 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 0.005 내지 10 ㎍의 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 또는 0.005 내지 10 ㎍의 프로트롬빈 활성제로 구성되는 응고 조성물을 함유한다.

일부 실시양태에서, 용기는 0.0005 내지 15 U/mL의 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 0.0005 내지 15 U/mL의 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 또는 0.0005 내지 15 U/mL의 프로트롬빈 활성제로 구성되는 응고 조성물을 함유한다. 적합하게는, 용기는 0.0015 내지 10 U/mL의 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 0.0015 내지 10 U/mL의 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 또는 0.0015 내지 10 U/mL의 프로트롬빈 활성제로 구성되는 응고 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 측정은 하기에 정의된 프로트로빈 활성제 단위 측정이다. 1 단위(unit, 유닛)는 프로트롬빈을 활성화시켜 37℃에서 pH 8.4에서 한 단위의 아미도분해 활성(amidolytic activity)을 생성하고, 1 아미도분해 단위는 37℃에서 pH 8.4에서 분당 1.0μmole의 N-p-토실(tosyl)-Gly-Pro-Arg-p-니트로아닐라이드를 가수분해할 것이다.

일부 실시양태에서, 응고 조성물은 혈액 샘플이 용기에 첨가되기 전에 용기 내에 함유될 수 있다. 일부 실시양태에서, 응고 조성물은 혈액 샘플이 용기에 첨가된 후에 용기에 첨가될 것이다.

응고 조성물이 혈액 샘플이 첨가되기 전에 용기 내에 함유되는 경우, 이는 당 분야에서 알려진 임의의 적합한 방법에 의해 용기에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 응고 조성물은 적합한 용매에 용해된 후, 용기에 첨가되고, 용매의 내부 표면 상에서 건조된다. 용매는 중성 버퍼일 수 있다. 용액 중의 응고 조성물은 분무 건조에 의해 또는 동결 건조에 의해 또는 당 분야에서 알려진 임의의 다른 방법에 의해 용기의 내부 표면 상에서 건조될 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 응고 조성물은 적합한 용매로 용해되고 용기가 응고 조성물을 포함하는 수성 용액을 함유하도록 건조 과정 없이 용기에 첨가된다. 용매는 중성 버퍼일 수 있다.

일부 실시양태에서, 비드(bead)가 응고 조성물로 코팅되고, 이들 비드가 용기로 첨가된다. 비드는 유리 비드 또는 폴리스타이렌 및 프로필렌 비드를 포함하는 합성 수지 비드일 수 있다. 비드는 구형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드의 평균 직경은 0.1mm 내지 1mm이다.

일부 실시양태에서, 용기는 응고가 일어난 후, 응고된 세포로부터 혈청의 분리를 위하여 제공된다. 일부 실시양태에서, 용기는 응고된 세포 및 혈청 샘플 사이의 배리어(barrier)를 제공하는 겔을 포함하거나 함유한다. 일부 실시양태에서, 용기는 응고된 세포 및 혈청 샘플을 분리시키는 원심분리를 허용하거나, 응고된 세포 및 혈청 샘플의 분리를 유지할 수 있게 도와주기에 적합한 형태 및 적합한 재료이다. 일부 실시양태에서, 혈청 샘플은 응고된 세포로부터 제거되거나, 응고된 세포는 혈청 샘플로부터 제거된다.

일부 실시양태에서, 용기는 하나 이상의 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 다른 성분은 예를 들어 하나 이상의 보조인자(co-factor), 하나 이상의 계면활성제, 및/또는 응고 조성물뿐만 아니라 하나 이상의 응고제를 포함할 수 있다.

5. 추가 성분

본 명세서에 개시된 응고 조성물은 본 명세서에서 정의된 프로트롬빈 활성제로 구성되거나, 본 명세서에서 정의된 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 또는 본 명세서에서 정의된 프로트롬빈 활성제를 포함한다.

상기 언급 및 본 명세서에서 그 밖의 유사한 언급에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다" (및 유사 용어)는 응고 조성물이 프로트롬빈 활성제를 포함하고, 또한 임의의 하나 이상의 추가적인 성분을 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 프로트롬빈 활성제는 필수적인 성분이고, 임의의 다른 성분은 선택적이고, 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 다른 성분은 예를 들어 하나 이상의 보조인자(co-factor), 하나 이상의 계면활성제 및/또는 하나 이상의 추가적인 응고제를 포함할 수 있다.

상기 언급 및 본 명세서에서 그 밖의 유사한 언급에서 사용된 바와 같이, 용어 "~로 필수적으로 구성된다"(및 유사 용어)는 응고 조성물이 프로트롬빈 활성제를 포함하고, 하나 이상의 다른 성분을 포함할 수 있지만, 단 이들 성분은 프로트롬빈 활성제의 활성 및 작용을 방해하거나 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 프로트롬빈 활성제는 필수적인 성분이고, 다른 성분은 선택적이며 그들이 프로트롬빈 활성제의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 여부에 따라 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.

상기 언급 및 본 명세서에 그 밖의 유사한 언급에서 사용된 바와 같이, 용어 "~로 구성된다"(및 유사 용어)는 응고 조성물이 프로트롬빈 활성제를 포함하며 이에 한정된다는 것을 의미하다. 따라서, 표현 "~로 구성된다"는 프로트롬빈 활성제가 필수적인 성분이고, 다른 성분(예컨대 보조인자 또는 응고제)이 존재하지 않을 것이다.

따라서, 일부 실시양태에서, 응고 조성물은 이에 한정되지는 않지만 미정제 뱀독을 포함한 뱀독을 포함할 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 응고 조성물은 뱀독의 부분 또는 완전 정제에 의해 제조된 프로트롬빈 활성제의 제제를 포함할 수 있다. 이러한 제제는 본 명세서 및 그 밖의 문헌에 개시된 것을 포함한 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법, 예컨대 크로마토그래피 방법 및 겔 여과 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 응고 조성물은 정제된 프로트롬빈 활성제 또는 단리된 프로트롬빈 활성제를 포함할 수 있다. 정제되고 단리된 프로트롬빈 활성제는 본 명세서 및 다른 문헌에서 개시된 방법을 포함한 당 분야에 알려진 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다.

5.1 보조 인자( Co - factor )

본 명세서에서 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시키는 것으로 정의된 프로트롬빈 활성제의 활성은 이에 한정되는 것은 아니지만, 칼슘, 인지질 및 FVa 활성을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 보조 인자의 첨가에 의해 개선될 수 있다.

5.2 계면활성제

적합한 계면활성제는 이에 한정되는 것은 아니지만 나트륨 도데실 설페이트(SDS, sodium dodecyl sulphate), 암모늄 라우릴 설페이트(ammonium lauryl sulphate), 나트륨 라우레스 설페이트(sodium laureth sulphate), 및 나트륨 미레스 설페이트(sodium myreth sulphate)를 포함하는 임의의 적합한 계면활성제를 포함한다.

5.3 응고제

응고제(clotting agent) 또는 응집제(coagulant)는 자극된 혈액 캐스케이드에 따라 내생성 응고제 또는 외생성 응고제 둘 중 하나로 분류된다(예를 들어 미국 특허 제6,686,204호를 참조한다).

적절한 응고제는 이에 한정되지는 않지만 규조토(diatomaceous earth), 무기 실리케이트의 미세입자 또는 입자, 미세실리카, 유리 미세입자, 엘라그산(ellagic acid), 트롬빈, 헤파리나아제, 트롬보플라스틴, 바트록소빈, 수산화인회석(bydroxyapatite), 카올린, 카올린 입자, 프로트롬빈(미세입자화된 프로트롬빈 포함), 피브리노겐 및 탈중합화된 콜라겐을 포함한다.

6. 혈청 샘플

상기에서 논의한 바와 같이, 본 발명은 본 명세서에서 정의된 프로트롬빈이 분석물질을 탐지하기에 적합한 혈청 샘플을 제조하기 위한 적합한 응고제라는 발견에 어느 정도 예측된다. 분석물질 탐지에 적합한 혈청 샘플은 본 명세서에서 논의된 적합한 품질의 것, 및/또는 본 명세서에서 논의된 적절한 시간 내에 조제되는 것이다.

6.1 혈청 품질

분석물질을 탐지하기에 적합한 혈청 샘플의 조제에서 중요한 인자는 응고 프로세스가 혈청으로부터 피브리노겐을 제거하는 정도이다. 불완전한 응고의 결과로서 잔류 피브리노겐 또는 부분적으로 분해된 피브리노겐 또는 피브린을 함유하는 혈청은 침전물(마이크로혈전 또는 스트링)의 형성, 원심분리 후 잠재적 응고(latent clotting post-centrifugation) 및 혈청의 보관으로 인해 분석 상의 정확성 문제가 야기될 수 있다. 따라서, 완전한 또는 실질적으로 완전한 응고는 높은 품질의 혈청을 확보하는데 중심 역할을 하고, 이어서 결과의 정확성을 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명의 일부 실시양태는, 혈청이 30 ㎍/mL 이하의 피브리노겐 또는 피브리노겐/피브린 관련 산물을 포함하는 경우, 분석물질을 탐지하기 위한 혈청의 조제에서 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 프로트롬빈 활성제로 구성되거나, 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되는 응고 조성물의 용도를 제공한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 혈청은 25 ㎍/mL 이하, 20 ㎍/mL 이하, 15 ㎍/mL 이하, 10 ㎍/mL 이하, 8 ㎍/mL 이하, 또는 6 ㎍/mL 이하의 피브리노겐 또는 피브리노겐/피브린 관련 산물을 포함한다.

일부 실시양태에서, 혈청은 혈청이 생성된 원 샘플에 존재하는 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하, 0.2% 이하, 0.1% 이하의 피브리노겐 또는 피브리노겐/피브린 관련 산물을 포함한다.

피브리노겐 및/또는 피브리노겐/피브린 관련 산물의 수준은 MP 바이오메디컬로부터 입수한 항체 및 NIBSC(Potters Bar, Hertsfordshire, London, 영국)로부터 구입한 표준 피브리노겐 제제를 사용한 샌드위치 면역분석법을 포함한 당 분야에 알려진 임의의 적합한 방법에 의해 탐지될 수 있다.

분석물질의 탐지에 적합한 혈청 샘플의 조제에 또 다른 중요한 인자는 응고 후 혈청에 남은 세포 또는 세포 부스러기의 수 또는 활성이다. 세포의 존재는 혈청 또는 혈장의 보관 및 분석 동안 두 가지 효과를 가질 수 있다. 첫 번째로, 세포는 용혈되어 세포 내용물(예를 들어, 칼륨, 락테이트 데하이드로게나아제)을 혈청 또는 혈장으로 방출할 수 있다. 이는 일정 기간 동안 저장 후 원심분리 및 측정 직후 이루어진 측정 사이의 현저한 차이를 야기할 수 있다. 두 번째로, 세포는 저장 중에 대사적으로 활성을 계속 가질 수 있고, 상당한 양의 영양소(예를 들어, 글루코즈)를 사용해버리고, 대사 산물(예를 들어, 락테이트)를 방출할 수 있다. 샘플이 건강한 참여자로부터 수득한 경우, 샘플은 보통 추천되는 30분의 응고시간 동안 저장 시 많은 튜브의 샘플에서 변화가 관찰될 수 있다. 따라서, 세포 오염의 정도는 혈청 샘플에 대한 중요한 품질 기준이고, 혈장보다 혈청을 사용하는 중요한 장점이다.

따라서, 일부 실시양태에서, 혈청 샘플은 그 혈청 샘플이 제조된 혈액 샘플에 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만의 세포를 포함한다.

일부 실시양태에서, 혈청 샘플은 24시간, 12시간, 8시간, 6시간, 5시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간 또는 30분의 기간 동안 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만 또는 10% 미만의 락테이트 데하이드로게나아제 활성 또는 포스페이트 농도(전형적으로 각각 U/L 및 mmol/L에서 측정됨)의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈청 샘플은 24시간, 12시간, 8시간, 6시간, 5시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간 또는 30 분의 기간 동안(예를 들어, 혈청 샘플의 제조시간 동안) 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 또는 0.1% 미만의 글루코즈 농도 또는 칼륨 농도의 변화를 포함한다. 락테이트 데하이드로게나아제 활성을 측정하기 위한 방법은 당 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 그 내용이 전체적으로 참조로서 인용된 문헌 [Dimeski, G., et al . (2004)]을 참조한다.

혈청 샘플의 헤모글로빈 농도는 또한 혈청 샘플이 분석물질의 탐지에 적합한지 여부를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 혈청 샘플은 150 mg/L 미만, 100 mg/L 미만, 90 mg/L 미만, 80 mg/L 미만, 70 mg/L 미만, 60 mg/L 미만, 50 mg/L 미만, 40 mg/L 미만, 30 mg/L 미만, 20 mg/L 미만, 또는 10 mg/L 미만의 헤모글로빈 농도를 포함한다.

6.2 응고 시간

시험을 위한 샘플로서, 긴급한 결과가 필요하여 혈청 튜브를 위한 응고 시간이 지나치게 긴 것으로 여겨지는 경우가 아니라면, 일반적으로 혈청이 혈장보다 선호된다. 긴 응고 시간에 대한 또 다른 단점은 혈액 샘플 내에서 세포 활성에 기인하여 임상적으로 유의미한 분석물질 농도 변화를 야기할 수 있다는 것으로, 이 문제는 백혈구 증가에서 가장 확연하게 드러난다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 관심의 대상인 분석물질을 탐지하기 위한 혈청 샘플을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 명세서에서 정의된 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 본 명세서에서 정의된 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 또는 본 명세서에서 정의된 프로트롬빈 활성제로 구성되는 응고 조성물과 혈액 샘플을 접촉시키는 단계로서, 이때 혈청 샘플은 응고 조성물과 접촉한 지 25분, 20분, 15분, 10분, 8분, 6분, 5분, 4분, 3분, 2분, 1분 또는 0.5분 내에 제조되는 것인 단계를 포함한다.

7. 혈액 샘플

본 명세서에서 논의된 바와 같이, 모든 혈액 샘플로부터 혈청 샘플을 제조하기에 적합한 응고 조성물 또는 적절한 시간 내에 모든 혈액 샘플을 응고시키기 위한 응고 조성물을 포함하는 용기를 제공하기 위한 요구가 존재한다.

시험이 필요한 혈액 샘플의 상이한 유형의 예는 건강한 개인의 혈액, 시트레이트 처리된 혈액, EDTA 첨가된 혈액, 헤파린, 와파린, 시트레이트 또는 리바록사반과 같은 항응고 치료를 받은 환자, 아스피린을 포함한 항혈전제(anti-thrombotic agent)를 투약하는 환자, 혈소판 감소증 환자(낮은 혈전 수를 가진 환자) 및 연장된 aPTT를 가진 환자의 혈액을 포함한다.

일부 실시양태에서, 혈액 샘플은 전혈 샘플이다. 일부 다른 실시양태에서, 혈액 샘플은 전혈 샘플로부터 유래된 혈청 샘플이다. 이러한 예에서 예시적인 혈청 샘플은 피브리노겐 또는 피브리노겐/피브린 관련 산물의 양 및/또는 혈청 샘플에서 세포 또는 세포 물질의 양 및/또는 헤모글로빈의 양이 분석물질을 탐지하기에 적합한 샘플이 되기에 혈청 샘플치고 지나치게 높은 것으로 여겨지는 경우를 포함하여, 보다 우수한 질의 혈청 샘플이 요구되는 혈청 샘플을 포함한다. 예를 들어, 혈청 샘플은 마이크로혈전 또는 잠재적 응고를 나타낼 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 혈액 샘플은 전혈 샘플로부터 유래된 혈장 샘플이다. 예를 들어, 혈장 샘플은 마이크로혈전 또는 잠재적 응고를 나타낼 수 있다.

8. 분석물질 탐지

일부 실시양태에서, 본 발명은 분석물질을 탐지하는 방법을 추가로 제공하고, 상기 방법은 관심의 대상인 분석물질의 존재 또는 양에 대하여 본 발명의 방법에 의해 제조된 혈청 샘플을 분석하는 단계를 포함한다.

구체적인 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 혈청 샘플은 하나 이상의 분석물질 시험에 적합하고, 따라서 혈청 샘플은 하나 이상의 분석물질을 탐지하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 임상의사는 종종 환자로부터 혈액 샘플 상에 수행되는 하나 이상의 분석물질 테스트를 필요로 하고, 하나의 혈청 샘플이 적어도 20개의 테스트, 또는 심지어 그 이상, 때로는 50 내지 60개, 또는 심지어 70 내지 80 개의 테스트를 위해 사용되는 것은 흔한 일이다. 이는 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자는, 특정한 실시양태에서, 본 발명은 혈청 샘플이 하나의 혈청 샘플 상에 수행되는 모든 바람직한 분석물질 테스트를 가능하게 하는데 충분한 부피 및 질을 가진 혈청 샘플의 생산을 제공한다는 것을 이해할 것이라는 점을 인식할 수 있을 것이다. 이의 장점은 대상으로부터 취해진 혈액의 부피 및 분석물질 테스트를 수행하기 위해 취해진 시간이 모두 감소된다는 것이다.

예시적인 분석물질 테스트가 하기에 개시된다. 분석물질 테스를 수행하기 위한 방법은 당 분야에 잘 알려진 방법이 있다.

8.1 나트륨( Na ⁺ )

이 테스트는 혈청 또는 혈장 샘플 내에 나트륨의 양을 측정한다. 나트륨은 신체에서 염과 물 균형에서 중요한 역할을 한다. 낮은 나트륨 수준은 지나친 수분 섭취, 심장 부전, 신장 부전 또는 설사 또는 구토에 기인한 신체로부터 나트륨의 손실을 나타낸다. 높은 나트륨 수준은 지나친 염의 섭취 또는 부족한 물의 섭취를 나타낸다.

8.2 칼륨(K ⁺ )

이 테스트는 혈청 또는 혈장 샘플 내에 칼륨의 양을 측정한다. 지나치게 높은 칼륨 수준(고칼륨혈증)은 신장 질병, 당뇨병, 케토산증 또는 신체로부터 배설되는 칼륨의 양의 감소의 결과일 수 있다. 지나치게 낮은 칼륨의 수준(저칼륨혈증)은 탈수, 예를 들어 설사 또는 구토, 또는 과도한 땀분출에 의해 야기될 수 있다. 칼륨의 수준은, 신장이 칼륨을 잃도록 하는 약물, 예를 들어 이뇨제의 결과로 낮아질 수 있다.

칼륨 수준은 이뇨제 또는 심장 약제를 복용하는 환자, 고혈압 또는 신장 질병, 심각한 산혈증 및 알칼리혈증 질환을 가진 환자, 및 신장 투석 또는 정맥 링거 주사 치료를 받는 환자들에서 종종 모니터링된다.

8.3 염화물( Cl ^- )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 염화물의 양을 측정한다. 염화물은 환자에게 전해질 불균형이 있는지 여부를 분석하기 위해 전형적으로 측정된다. 낮은 염화물 및 정상 나트륨은 구토 또는 위액의 손실을 나타낼 수 있다.

8.4 중탄산염( HCO ₃ ^- )

이 테스트는 혈청 또는 혈장 내에 세 가지 형태의 이산화탄소(중탄산염, 카본산, 및 용존 이산화탄소)의 양을 측정한다. 이 테스트는 종종 환자가 호흡 문제를 가지는 경우 수행된다. 높은 수준의 이산화탄소는 만성 폐쇄성 폐질환, 폐기종, 폐렴, 쿠싱 증후군 또는 알코올 중독증을 포함하는 질환, 또는 구토에 의해 야기될 수 있다. 낮은 수준은 폐렴, 간경변, 과호흡 증후군, 당뇨병, 탈수, 신장 부전 또는 심장 부전을 포함하는 일부 질병에 의해 야기될 수 있다.

8.5 글루코즈( Gluc )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 글루코즈의 양을 측정한다. 글루코즈 수준은 종종 높은 혈중 글루코즈의 증상(고혈당증) 또는 저혈당증을 나타내는 환자, 임신중인 환자, 당뇨병을 가진 환자에서 테스트된다.

8.6 유레아( Urea )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 유레아의 양을 측정한다. 이 테스트는 신장 기능을 평가하는 것과 투석의 효율성을 모니터링하는 것을 도울 수 있다.

8.7 크레아티닌( Creat )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 크레아티닌의 양을 측정한다. 이 테스트는 신장 기능을 평가하고, 신장 질환의 치료를 모니터링하는 것을 돕는데 중심이 된다.

8.8 유레이트( Urate )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 유레이트(또는 요산)의 양을 측정한다. 높은 수준의 요산은 통풍의 신호일 수 있다. 요산 수준은 또한 종양 용해 증후군(tumour lysis syndrome)을 탐지하기 위해 화학치료 또는 방사능치료를 받는 환자에서 모니터링된다.

8.9 총 단백질( TP 또는 T Prot )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 단백질의 총량을 측정한다. 총 단백질 테스트의 결과는 특정한 질병을 나타내지는 않을 것임에도 불구하고, 높거나 낮은 단백질 수준은 종종 문제가 있는지 여부를 결정하는데에 추가적인 테스트가 필요하다는 것을 나타낸다. 총 단백질 테스트는 간 장애, 신장 장애, 다발성 골수종 및 수화 상태에 대한 검진에 종종 사용된다.

8.10 알부민( Alb )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 알부민의 양을 측정한다. 알부민 수준은 종종 간 또는 신장 질병을 검진하기 위해서, 또는 영양 상태, 특히 입원한 환자의 영양 상태를 평가하기 위해 측정된다.

8.11 총 빌리루빈(T Bili )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 빌리루빈의 양을 측정한다. 빌리루빈 수준은 간 장애, 예컨대 황달, 또는 간 질병, 예컨대 간경변을 검진하기 위해 측정된다. 빌리루빈 수준은 영아에서 특정한 희귀 유전 장애를 탐지하는 것을 돕기 위해 황달이 있는 영아에서 뇌 손상을 피하기 위해 측정된다.

8.12 알칼리성 포스파타아제( ALP )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 알칼린 포스파타아제의 양을 측정한다. 이 테스트는 전형적으로 간 또는 뼈 장애의 치료를 검진하거나 모니터링하기 위해 수행된다.

8.13 감마- 글루타밀 트랜스퍼라아제( GGT )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 감마-글루타밀 트랜스퍼라아제의 양을 측정한다. 이 테스트는 간 질병 및 알코올 남용을 검진하기 위해 사용된다. 이는 또한 상승된 수준의 ALP가 간 또는 뼈 질병에 인한 것인지 결정하는데 사용될 수 있다.

8.14 알라닌 아미노트랜스퍼라아제( ALT )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 알라닌 아미노트랜스퍼라아제의 양을 측정한다. 이 테스트는 간 질병을 검진하는데 사용된다.

8.15 아스파라테이트 아미노트랜스퍼라아제( AST )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 아스파라테이트 아미노트랜스퍼라아제의 양을 측정한다. 상기 효소가 많은 기관 및 조직 세포에 존재하기 때문에 이 테스트는 간 손상, 근육 손상 및 기타 질환을 탐지하는데 사용된다.

8.16 락테이트 데하이드로게나아제( LD )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 락테이트 데하이드로게나아제의 양을 측정한다. 이 테스트는 신체에서 조직 손상, 조직 허혈증의 원인 및 위치를 확인하고 및 이의 진행을 모니터링하는데 전형적으로 사용된다.

8.17 크레아틴 키나아제( CK )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 크레아틴 키나아제의 양을 측정한다. 크레아틴 키나아제는 가슴 통증 또는 근육 통증을 가지거나 또는 허약한 환자에서 심장 발작을 겪었는지 여부, 및 신체에서 기타 근육이 손상을 입었는지 여부를 결정하기 위해 측정된다.

8.18 총 칼슘( TCa )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 칼슘의 양을 측정한다. 칼슘 수준은 신장, 뼈, 또는 신경 질병을 가진 환자에서, 또는 현저하게 증가되거나 감소된 칼슘 증상이 존재하는 경우 종종 측정된다.

8.19 포스페이트( Pi 또는 Phos )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 포스페이트의 양을 측정한다. 포스페이트 수준은 비정상적 칼슘 수준의 테스트 결과에 대한 후속 조치로서 측정될 수 있다. 포스페이트 수준은 또한 신장 장애, 조절되지 않는 당뇨병, 또는 환자가 칼슘 또는 포스페이트 보충제를 섭취하는 경우 측정될 수 있다.

8.20 마그네슘( Mg ^{2 +} )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 마그네슘의 양을 측정한다. 이 테스트는 환자가 허약, 과민성, 심장 부정맥, 메스꺼움 또는 설사를 포함한 지나치게 많거나 지나치게 적은 마그네슘의 증상을 가진 경우 수행될 수 있다. 마그네슘 수준은 또한 비정상적 칼슘 또는 칼륨 수준이 탐지되는 경우 측정될 수 있다.

8.21 리파아제( Lipase )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 리파아제의 양을 측정한다. 이 테스트는 전형적으로 췌장염 또는 기타 췌장 질병을 진단하기 위해 전형적으로 사용된다.

8.22 콜레스테롤( Chol )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 콜레스테롤의 양을 측정한다. 콜레스테롤 수준은 심장 질병 발생의 위험을 검진하기 위해 측정된다.

8.23 트라이글리세라이드( Trig )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 트라이글리세라이드의 양을 측정한다. 콜레스테롤 수준에 대하여, 이 테스트는 전형적으로 심장 질병 발생의 위험을 검진하기 위하여 전형적으로 사용된다.

8.24 고밀도 지단백질 콜레스테롤( HDL -C 또는 HDL )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 HDL 콜레스테롤의 양을 측정한다. 이 테스트는 전형적으로 심장 질병 발생의 위험을 측정하기 위해 전형적으로 사용된다.

8.25 철( Fe ^{2 +} )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 철의 양을 측정한다. 철은 환자가 낮거나 높은 철 수준을 가진 경우 확인하기 위해 측정된다. 낮은 철 수준은 빈혈을 야기할 수 있고, 보통 장기간 또는 심각한 출혈, 임신 또는 빠른 성장(어린이의 경우)에 기인한다. 높은 철 수준은 유전적 질환 또는 광범위한 수혈에 기인할 수 있다.

8.26 트랜스페린( Trf )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 트랜스페린의 양을 측정한다. 트랜스페린은 피를 통하여 철을 간, 지라 및 골수로 운송하는 혈장 단백질이다. 따라서, 혈액 트랜스페린 수준은 빈혈의 원인을 측정하고,(예를 들어, 철 결핍 빈혈에서) 철 대사를 조사하고, 혈액의 철 운반 능력을 측정하기 위해 테스트될 수 있다.

8.27 C 반응성 단백질( CRP )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 C 반응성 단백질의 양을 측정한다. 이 테스트는 염증의 존재를 확인하고, 그의 심각성을 측정하고, 치료에 대한 반응을 모니터링하기 위해 사용된다.

8.28 코르티솔( Cortisol )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 코르티솔의 양을 측정한다. 코르티솔 수준은 쿠싱 증후군 또는 애디슨병을 진단하는데 도움을 주기 위해 측정된다.

8.29 유리 티록신( fT4 )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 유리된 티록신의 양을 측정한다. 이 테스트는 전형적으로 갑상선기능저하증(hypothyroidism) 또는 갑상선기능항진증(hyperthyroidism)을 진단하기 위해 사용된다.

8.30 갑상선 자극 호르몬( TSH )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 갑상선 자극 호르몬의 양을 측정한다. 이 테스트는 전형적으로 갑상선 장애를 검진하고, 진단하고 모니터링하기 위해 사용된다.

8.31 페리틴

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 페리틴을 측정하기 위해 사용된다. 낮은 페리틴 수준은 철 결핍의 지표이다. 상승된 수분은 혈색소증에서와 같이 철의 과부하의 지표이다.

8.32 트로포닌( TnI )

이 테스트는 혈청 또는 혈장에서 트로포닌의 양을 측정한다. 이 테스트는 전형적으로 환자가 심근 손상을 입었는지 여부를 측정하기 위해 가슴 통증을 가진 환자에게서 사용된다.

8.33 용혈 지수

용혈 지수 테스트는 세포 용혈의 정도를 측정한다. 용혈은 생화학 실험실에서 마주치는 가장 흔한 간섭(interference)이다. 테스트는 대개 특정 또는 모든 분석물질의 보고를 위한 시험관에서 용혈 및 샘플 적합성을 탐지하기 위해 및 용혈성 빈혈(haemolytic anaemia)(유전구형적혈구증, 자발적 용혈, RBC 효소 결핍)의 탐지에서 사용된다. 용혈 또는 용혈 지수(혈청 또는 혈장에서 유리 헤모글로빈의 농도)는 현재 모든 일반적인 화학 분석기에 의해 추정된다. 그 후 수치는 어떠한 분석물질이 어느 정도의 용혈 수준이 영향을 미칠 수 있는지 또는 보고되지 않는지를 측정하는데 가이드로서 사용된다.

8.34 황달 지수

황달 지수는 순수한 분광광도법적 방법에 의해 테스트 샘플에서 빌리루빈의 상대적인 수준을 나타내는 수치를 되돌린다. 이는, 특정 분석물질의 보고 및 총 빌리루빈 광도학적 추정법에 의한 간섭이라는 희귀한 경우에서 빌리루빈 결과의 정확성을 이중 확인에 대한 샘플 적합성을 측정하는데에 사용된다. 황달 지수는, 황달 지수가 영향을 받지 않고 그대로 있는 로슈 총 빌리루빈 방법(Roche Total Bilirubin method, 문헌 [Sheppard et al., 2005] 참조)으로 암 파라단백질 간섭(침전 및 가짜 높은 총 빌리루빈)을 탐지하는데 있어서 가치가 있는 것으로 나타났다. 빌리루빈은 문헌 [Dimeski et al., 2008]에서 논의된 바와 같이 높은 농도(예를 들어, ＞200 μM/L)에서 일부 크레아티닌 분석을 간섭할 수 있다.

8.35 지질혈증 지수

지질혈증 지수는 지질혈증에 기인하여 분석법의 가능한 간섭을 예측하기 위해 사용되었다.

9. 진단방법

본 발명은, 대상에서 질병 또는 질환의 존재, 부재 또는 심각성을 진단하는 방법을 제공하고, 여기서 질병 또는 질환의 존재, 부재 또는 심각성은 대상에서 관심의 대상이 되는 분석물질의 존재, 부재 또는 비정상적인 양과 관련된다. 이들 방법은 일반적으로 상기 폭넓게 개시된 방법에 따라 제조된 혈청 샘플을 제공하는 단계; 및 혈청 샘플에서 분석물질의 존재, 부재 또는 비정상적인 양을 탐지함으로써 대상에서 질병 또는 질환의 존재, 부재 또는 심각성을 측정하는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 진단을 얻기 위해 참고 결과에 분석물질 테스트의 결과를 비교하는 단계를 포함한다.

질병 또는 질환은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 상이한 분석물질 테스트에 관련된 상기에 요약된 질병 또는 질환을 포함한, 혈청 샘플을 사용하여 진단될 수 있는 임의의 적합한 질병 또는 질환일 수 있다.

일부 실시양태에서, 방법은 대상에게서 이전에 나타나지 않은 질병 또는 질환의 존재 또는 부재를 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 방법은 대상이 전에 나타냈던 질병 또는 질환의 존재, 부재 또는 심각성을 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 이전에 대상으로부터 수득되는 결과에 대한 참고를 포함할 수 있다. 다르게는, 참고 결과는 표준 분석 참고일 수 있다.

일부 실시양태에서, 방법은 병리학 실험실과 같은 테스트 시설에서 수행된다. 일부 다른 실시양태에서, 방법은 "현장 진단(point-of-care)" 방법이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "현장 진단"은 환자를 돌보는 장소에서 또는 가까이에서 수행된다는 것을 의미한다. 현장 진단 방법은 병원 및 빠른 결과를 수득하는 것일 필요한 기타 환경에서 갈수록 인기를 얻고 있으며, 종종 수송가능하고, 휴대가능하고, 손으로 들 수 있는 기구 및 테스트 키트의 사용을 통해 완수된다.

현장 진단 테스트의 장점은 (예를 들어, 피부 천공에 의해 수득되는 모세 혈관의 혈액 한 방울을 사용하여) 집 또는 수술실에서 분석 결과를 수득할 수 있는 능력, 및 병원, 특히 응급 상황에서 침대 옆에서 빠른 분석 결과를 수득할 수 있는 능력을 포함한다.

시장에서 현재 입수할 수 있는 현장 진단 장치를 위한 장치는 지멘스 DCA 밴티지 분석기(Siemens' DCA Vantage Analyzer)라고 불리는 지멘스에서 시판중인 면역분석 장치, 환자의 HIV 감염 상태뿐만 아니라 그들의 현재 면역 상태를 동시에 측정하는데 사용되는 밀레니엄 바이오테크놀로지 주식회사(Millenium Biotechnology, Inc.)에서 시판중인 레트로(Retro)-STATUS HIV/CD4 350 래피드 테스트, 및 이른 임신 중독증 발병을 탐지하기 위해 사용되는 엘리어 인터내셔널(Alere International)에서 시판중인 트리아지(Triage) PLGF 테스트를 포함한다.

10. 조사 툴( research tool )

본 발명은 또한 본 발명에 따라 제조되는 혈청 샘플을 사용하는 조사 툴의 사용을 고려한다. 이들 방법은 일반적으로 상기 대략 개시한 방법에 따라 제조된 혈청 샘플을 제공하는 단계; 및 이에 한정되는 것은 아니지만 유전체학, 단백질체학, 대사체학, 시스템 생물학, 분자 이미징 또는 분석 연구를 포함하는 조사 툴 연구에서 혈청 샘플을 사용하는 단계를 포함한다.

적합한 조사 툴은 당 분야에서 잘 공지되고, 그 전체 내용이 참조로 인용되는 문헌 [Scaros, O. et al ., 2005]에 개시된 방법을 포함한다. 유전체학은 유전학 및 치료에 반응하는 유전자 발현 패턴 사이의 상관관계를 연구하는 약리유전체학을 포함한다. 단백질체학은 시스템에서 단백질의 풍부함 및 분포의 분석을 허용한다. 대사체학 또는 생화학 프로파일링은 시스템에서 대사물질의 연구이다. 시스템 생물학은 시스템이 자극에 어떻게 반응하는지 잠재적으로 예측할 수 있는 거동 모델을 만드는 기능 단위로서 전체 생물학 시스템에서 본다. 분자 이미징 기법은 특정한 분자 표적의 수준 및 생체 내에서 표적의 기능 상태를 증명하기 위한 능력을 가지고, 진단법에서 사용될 수 있다.

본 발명이 쉽게 이해되고, 실질적인 효과를 부여하기 위하여, 특정한 바람직한 실시양태가 하기 비한정적인 실시예에 의해 지금부터 개시될 것이다.

실시예

실시예 1: 뱀독으로부터 프로트롬빈 활성제의 정제 및 특성분석

실시예 1a: Echis carinatus 독으로부터 에카린 , 카린액타바아제 -1 및 카린 액타바아제-2의 정제 및 특성분석

이 실시예는 Echis carinatus의 독으로부터 에카린으로 불리는 그룹 A 프로트롬빈 활성제, 및 카린액타바아제-1(CA-1) 및 카린액타바아제-2(CA-2)로 불리는 그룹 B 프로트롬빈 활성제의 정제 및 특성분석을 개시한다.

동결건조된 Echis carinatus 독(157 mg; Sigma Chemical Co, 미국; cat no. V8250)은 8 mL의 0.05 M Tris-HCl pH 8.0 버퍼에서 용해되고, 30분 동안 용해되도록 방치된 후, 원심분리되어(1000 g 및 10 분) 불용성 물질이 제거되었다. 부피 7.7 mL의 복원된 정화 용액이 용출를 위해 동일한 Tris-HCl 버퍼를 사용하여 수퍼덱스 200 겔 여과 크로마토그래피 컬럼(cat no 17-1043-02)(2.5 x 95 cm)(GE Healthcare Bio-Sciences, 스웨덴) 상으로 로딩되었다. 컬럼 유속은 20 mL/hr이었고, 4 mL 분획이 수집되었다(15분 분획). 활성 분획은 하기에 더욱 상세하게 개시된 바와 같이 정상 시트레이트 처리된 혈장과 응고 활성에 의해 측정되었다. 프로트롬빈 활성제 활성을 나타내는 모인 분획은 총 28.3 단위의 A₂₈₀로 총 100 mL을 함유하였다. 도 1은 상술한 바와 같이 수퍼덱스 200 컬럼 상에 겔 여과를 사용하여 E. carinatus 독으로부터 에카린, 카린액타바아제-1, 및 카린액타바아제-2의 단리에서 용출 프로파일을 도시한다. 세 개의 프로트롬빈 활성제(에카린, 카린액타바아제-1, 및 카린액타바아제-2)의 모인 분획은 도 1에서 바(bar)로 나타냈다.

이들 모인 분획은 즉시 동일한 pH 8.0의 0.05 M Tris-HCl 버퍼로 미리 평형을 맞춘 블루 세파로즈의 컬럼(2.0 x 12 cm)(Sepharose 6 Fast Flow에 부착된 Cibacron Blue 3G; cat no. 17-0948-01)(GE Healthcare Bio-Sciences, 스웨덴)에 적용되었다. 대략 2 컬럼 부피의 시작 버퍼로 세정한 후, 결합된 물질은 동일한 버퍼 내의 NaCl의 선형 구배로 용출되었다(0-1.0M; 200 mL의 각 비커). 카린액타바아제-1은 미결합 분획에서 회수되었고, 카린액타바아제-2 및 에카린은 각각 0.2 및 0.5 M NaCl에서 용출되었다. 프로트롬빈 활성제 활성은 하기에 더욱 상세하게 개시된 바와 같이 30 mM 칼슘의 존재 및 첨가되는 칼슘의 부재하에서 정상 시트레이트 처리된 혈장 응고 분석에 의해 확인되었다. 특정한 프로트롬빈 활성제 활성을 가진 분획(각 3 mL)은 응고 시간의 개별적인 특정한 응고 활성에 이어 아미콘 교반된 세포 농축기(Amicon stirred cell concentrator) 모델 번호 42에서 YM 10 멤브레인을 사용하여 1 mg/mL로 농축함으로써 모아졌다. 모든 크로마토그래피는 요구되는 유속에서 검정색에서 보라색 챔버 세트, 280 nm의 두 개의 감쇠(attenuation)에서 알텍스(Altex) 듀얼 웨이브 UV 탐지기 세트 및 시간 기반 분획 수집을 사용한 LKB 7000 ULTRORAC 분획 수집기(fraction collector)를 사용하여 길슨(Gilson) 연동 펌프를 사용하여 4℃에서 수행되었다. 도 2는 블루 세파로즈 크로마토그래피의 용출 프로파일을 도시하고, 바(bar)는 카린액타바아제-1, 카린액타바아제-2, 및 에카린의 모인 분획을 나타낸다. 수득된 분획은 4℃에서, 버퍼 중에 -20℃에서, 또는 50% 글리세롤-버퍼 중에 -20℃에서 저장되었다. 프로트롬빈 활성제를 함유하는 이들 분획(제제)이 달리 지시되지 않는 한 모든 후속 실험에서 사용되었다.

프로트롬빈 활성제 활성은 문헌 [Masci et al., 1988]에 개시된 방법에 의해 분석되었다. 필수적으로, 이 분석법은 문헌 [Austen, D. E., et al . 1975]에 개시된 바와 같이 하일랜드-클로텍(Hyland-Clotek) 장치를 사용하여 수행되는 응고 분석을 포함하였다. 정상 지원자로부터 신선하게 모은 시트레이트 처리된 혈장이 각 그룹의 실험에 사용되었다. 제제에 대한 응고 시간 분석이 문헌 [Kini, R. M., 2005]에서 그룹 A 및 그룹 B 프로트롬빈 활성제로 정의된 기준에 근거하여 수행되었다. 분석은 칼슘의 존재(30 mM Ca^{2 +}) 하에서 그룹 B 프로트롬빈 활성제(카린액타바아제-1 및 카린액타바아제-2)를 확인하고, 첨가 칼슘의 부재 하에서 그룹 A 프로트롬빈 활성제(에카린)를 확인하기 위해 수행되었다. 프로트롬빈 활성제에 의해 트롬빈 생성의 형성을 측정하는, 펩타이드 p-니트로아닐라이드 S-2238에 대한 가수분해 활성은, 25℃에서 분광광도계(Hitachi U2800)의 세포 분획에서 10 mM CaC1₂, 및 100 μL의 S-2238(물 중의 3 mM)의 존재 또는 부재시 pH 7.4에서 0.90 mL의 0.02 M Tris-HCl 버퍼의 균형에 의해 측정되었다. 반응은 프로트롬빈(250 nM)으로 25 μL 분취의 프로트롬빈 활성제 제제의 첨가에 의해 시작되었고, p-니트로아닐린의 방출은 405 nm에서 측정되었다. 1 활성 단위는 1분당 1 pmol의 기질의 가수분해와 대등하다. 다른 펩타이드 니트로아닐린을 사용하는 분석법이 100μM의 최종 농도로 동일한 방식으로 수행되었다.

실시예 1b: Pseudonaja textilis 독으로부터 PtPA 및 Oxyuranus scutellatus 독으로부터 OsPA 의 정제 및 특성분석

이 실시예는 Pseudonaja textilis 및 Oxyuranus scutellatus 뱀의 독으로부터 그룹 C 프로트롬빈 활성제의 정제 및 특성분석을 설명한다. 이러한 프로트롬빈 활성제는 각각 PtPA 및 OsPA로 축약된다.

동결건조된 P. textilis 독은 pH 7.4에서 0.05 M Tris-HCl에서 복원된다. 도 3은 pH 7.4에서 0.05 M Tris-HCl 버퍼에서 세파크릴 S-300 컬럼 상에 복원된 P. textilis 독의 용출 프로파일을 제공한다. 'A'는 보이드 부피를 나타내고, 'B'는 이 컬럼 상에서 250 mL이고 250kDa의 대략적인 분자량과 동등한 PtPA에 대한 용출 위치(Ve)를 나타낸다. 'B' 아래, 280nm에서 흡광도(A₂₈₀)는 컬럼에 적용되는 총 A₂₈₀ 단위의 40%를 나타낸다. O. scutellatus 독으로 유사한 겔 여과 실험은 로딩된 총 A₂₈₀의 대략 10%가 250 kDa 피크(프로트롬빈 활성제에 상응함)에서 용출되는 것을 보여주었다.

0.05 M Tris-HCl, pH 7.4 중의 콘 A-세파로즈 4B를 사용한 친화도 크로마토그래피가 미정제 P. textilis 및 O. scutellatus 독으로부터 프로트롬빈 활성제를 정제하기 위해 사용되었다. 용출 버퍼는 0.01% 나트륨 아자이드와 0.2 M 메틸-α-D-만노피라노사이드이었다. PtPA에 대한 콘 A-세파로즈 상의 용출 프로파일은 도 4에 개시된다. 화살표는 용출 버퍼의 적용을 나타내고, "a"는 프로트롬빈 활성제를 제공하기 위해 모인 분획을 나타낸다. 도 5는 pH 8.6에서 네이티브(native) PAGE의 결과를 도시한다. 도 4로부터 피크 "a"는 주요 단백질 밴드 및 레인(lane)당 25 ㎍(A) 및 50 ㎍(B)의 로딩에서 미량의 작은 밴드를 도시하였다. 250 kDa 밴드는 평행 실험에서 겔로부터 절단되었고, PtPA로서 그 존재가 확인하는, 발색 기질 S-2222에 대한 인자 Xa-유사 활성을 가지는 것으로 개시되었다(도 6). 유사한 패턴의 용출이 OsPA에 대해 수득되었다.

PtPA 및 OsPA는 β-머캅토에탄올의 존재("red."로 지시됨) 또는 부재("unred.")하에서 SDS-PAGE에 의해 추가로 특성분석되었다(도 7). 성분 폴리펩타이드 체인을 나타내는 PtPA 및 OsPA에 대해 여러 개의 밴드가 존재한다는 것이 분명하다.

본 방법에 따른 PtPA- 및 OsPA-함유 제제는 달리 지시되는 경우를 제외하고, 모든 후속 실험에서 사용되었다.

실시예 1c: Notechis scutatus 독으로부터 노테카린의 정제 및 특성분석

노테카린이라고 불리는 그룹 D 프로트롬빈 활성제는 그룹 C 프로트롬빈 활성제에 대하여 상기 실시예 1b에서 개시된 것과 유사한 방식으로 세파크릴 S-300 겔 여과 크로마토그래피(5.0 x 9.5 cm)를 사용하여 Notechis scutatus의 독으로부터 정제되었다. 용출 프로파일은 도 8에 도시되고, 여기서 "PA"는 노테카린을 함유하는 분획을 나타낸다.

이 방법에 따라 제조된 노테카린-함유 제제는 달리 지시되는 경우를 제외하고, 모든 후속 실험에서 사용되었다.

실시예 1d: 카린액타바아제 -1, 카린액타바아제 -2, 에카린 , PtPA , OsPA , 및 노테카린의 추가 특성분석

실시예 1a, 1b, 및 1c에서 제조된 프로트롬빈 활성제 제제는 하기와 같이 추가로 특성분석되었다.

pH 8.9에서 프로트롬빈, α-트롬빈 및 프로트롬빈 활성제의 네이티브 PAGE가 수행되었고, 그 결과는 도 9에 도시되고, 여기서 라벨은 다음과 같다: (I) 프로트롬빈; (II) α-트롬빈; (III) 에카린; (IV) 카린액타바아제-1; (V) 카린액타바아제-2; (VI) PtPA; (VII) OsPA; (VIII) 노테카린(각 프로트롬빈 활성제는 20㎍씩 로딩되었다).

프로트롬빈 활성제 제제는 β-머캅토에탄올의 존재(도 10) 및 부재(도 11)하에서 SDS-PAGE에 의해 추가로 특성분석되었다. 각 도에서, 레인은 다음과 같다: (1) 카린액타바아제-1; (2) 카린액타바아제-2; (3) 에카린; (4) PtPA; (5) OsPA; (6) 노테카린; (7) 트롬빈; 및 (M) 분자량 마커. 레인 (4)에서 PtPA-함유 샘플 및 레인 (5)에서 OsPA-함유 샘플은 도 7에 도시된 결과를 위해 사용된 것과 동일하였다.

SDS-PAGE는 각 경우에, 예상된 지역에서 단백질 밴드가 존재한다는 것뿐만 아니라, 제제가 균일하지는 않다는 것을 보여준다. 프로트롬빈 활성제 제제의 단백질 농도는 1 mg/mL 용액이 1의 A₂₈₀를 갖는 관계를 사용하여 계산되었고, 몰 농도는 단백질 농도를 분자량에 대한 문헌 값으로 나누어서 계산되었다. 따라서, 이들 제제를 사용하는 본 명세서에 기재된 후속 실험에서 인용되는 몰 농도는 제제가 균일하지 않기 때문에, 상한 추정치(upper estimate)이다.

실시예 2: 프로트롬빈 활성제에 의해 프로트롬빈의 트롬빈으로의 전환

실시예 2a: 5분 배양 기간

이 실험의 목적은 실온에서 5분 동안 배양 후, 실시예 1에서 제조된 뱀독으로부터 6개의 상이한 프로트롬빈 활성제, 즉 에카린, 카린액타바아제-1, 카린액타바아제-2, PtPA, OsPA, 및 노테카린을 함유하는 제제들로부터 얼마나 많은 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시켰는지 측정하는 것이었다.

실험은 다음과 같이 수행되었다.

20 mM HEPES 버퍼 pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 0.05% 계면활성제 p20이 제조되었다.

0.05 M Tris-HCl pH 7.4 중의 인간 프로트롬빈 용액은 증류수로 1/50으로 정제된 인간 프로트롬빈(17.8 mg/mL; #HCP-0200; HTI, USA)의 저장액을 희석함으로써 제조되어, 72 ㎍/mL 또는 0.99 μM의 튜브 내의 최종 농도를 수득하는 작업 용액 0.36 mg/mL을 제공하였다. 겔 로딩을 위해 0.36 mg/L의 프로트롬빈 용액이 사용되었다.

앞서 개시된 바와 같이 제조된 프로트롬빈 활성제 제제의 저장액은 희석되어 6 nM의 최종 농도를 제공하였다.

저장 α-트롬빈(10 mg/mL, #HCT-0020; HTI, USA)은 0.01% Tween 20을 함유하는 증류수로 희석되어(1/30) 0.33 mg/L의 작업 트롬빈 용액을 제공하였고, 이 용액은 사용되어 SDS-PAGE 겔 상에 로딩되었다.

이어서, 샘플은 표 3에 도시된 부피로 제조되었고, 실온에서 5분 동안 배양되었다.

표 3: 배양을 위한 각 샘플의 부피

샘플	1	2	3	4	5	6	7	8
LHEPES 버퍼( μL)	80	60	60	60	60	60	60	80
프로트롬빈( μL)	20	20	20	20	20	20	20	0
프로트롬빈 활성제	0	50	50	50	50	50	50	0
α-트롬빈( μL)	0	0	0	0	0	0	0	20
총 부피( μL)	100	100	100	100	100	100	100	100

상기 샘플에서 프로트롬빈 활성제는 다음과 같았다: (1) 프로트롬빈 활성제 없음(버퍼 중에 인간 프로트롬빈만 존재); (2) 카린액타바아제-1; (3) 카린액타바아제-2; (4) 에카린; (5) PtPA; (6) OsPA; (7) 노테카린; 및 (8) 매우 정제된 α-트롬빈(프로트롬빈 활성제 없음).

사용된 SDS PAGE 겔은 러닝 버퍼 Tris-Glycine(#BG-143)과 nUView Precast Mini Gels(#NB10-420, 4-20%)이었다. 샘플 버퍼(#BG-145)(NuSEP, 호주)가 수득되었고(즉, 비-환원 샘플 버퍼), 및 5% β-머캅토에탄올(#44143, BDH, 영국)로 샘플 버퍼의 환원 샘플 버퍼가 제조되었다.

5분 배양 후, 각 샘플로부터 40 μL 분취가 동등한 부피의 비-환원 샘플 버퍼 또는 환원 샘플 버퍼로 옮겨졌다. 이어서, 샘플은 가열 블록 내에서 100℃에서 10분 동안 배양되었다. 각 샘플의 25 μL의 분취 및 예비-착색된 분자량 마커(#SM0671 Page Ruler Prestained Protein Ladder, Fermentas, Hanover, MD, USA) 12 μL의 분취를 겔 상에 로딩하였다. 염료 맨 앞부분이 겔의 바닥에 도달할 때까지 겔이 미니-프로테인 II 셀(Mini-Protein II Cell) PAGE 장치(Bio-Rad)를 사용하여 100V에서 작동되었다. 겔은 쿠마시 브릴리언트 블루 G(Commassie Brilliant Blue G)(#B-0770, Sigma)(0.25% w/v Commassie Brilliant Blue G, 45% 메탄올, 10% 아세트산)로 착색되었고, 과량의 착색약은 탈착색제로 제거되었다(45% 메탄올, 45% 물 및 10% 아세트산).

결과는 도 12에 도시되었고, 도 12a는 β-머캅토에탄올(비-환원 샘플 버퍼) 없이 샘플 버퍼를 사용한 SDS-PAGE 겔을 도시하고, 도 12b는 5% β-머캅토에탄올(환원 샘플 버퍼)을 함유하는 샘플 버퍼를 사용한 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 표 3에 사용된 샘플 숫자는 도 12에서 겔에서 레인 번호와 동일하고, "m"은 분자량 마커를 나타낸다.

이 실험은 PtPA 및 OsPA에 의해 5분 내에 프로트롬빈의 트롬빈으로의 완전한 전환을 보여주지만, 이들 조건 하에서 다른 프로트롬빈 활성제 제제에 의해서는 매우 적은 전환만을 보여준다.

실시예 2b: PtPA 에 의한 전환에 대한 시간 코스 및 노테카린에 의한 전환에 대한 시간 코스

PtPA(6 nM)에 의한, 그리고 노테카린(6 nM)에 의한 프로트롬빈(14 μM)의 트롬빈으로의 전환에 대한 시간 코스를 측정하였고, SDS-PAGE 겔 결과는 도 13에 도시되고, 여기서 각 레인은 실시예 2a와 유사한 방법론을 사용하여 하기 표 4에 도시된 바와 같이 배양 시간에 따라 넘버링된다.

표 4: 도 13에 도시된 각 레인에 대한 배양 시간

레인	시간(분)
1	0
2	0.5
3	1
4	2
5	4
6	6
7	8
8	10
9	15
10	20
11	25
12	30
13	45
14	150

이들 결과는 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환함에 있어서 PtPA가 노테카린보다 효율적이지만, 노테카린도 여전히 더 긴 반응 시간 후에 프로트롬빈의 완전한 분할을 달성하였다는 것을 보여준다.

실시예 2c: 실시예 2b 결과로부터 선택된 밴드의 N-말단 서열화

프로트롬빈 상에 PtPA 및 노테카린의 작용(즉, 프로트롬빈의 트롬빈으로의 절단화)에 의해 제조된 실시예 2b에서 SDS-PAGE 결과로부터 선택된 밴드가 용출되었고, 특정한 분자 도메인을 부여하기 위하여 질량분광 분석을 사용하여 N-말단 서열화하였다. 이들 결과는 도 14에 도시된다. SDS-PAGE N-말단 서열화는, α-트롬빈 중쇄에 상응하는 N-말단 서열 IVEGSDA로 주요 밴드에 의해 도시된 바와 같이, PtPA 및 노테카린에 의한 프로트롬빈의 α-트롬빈으로의 전환을 확인하였다.

실시예 2d: 반응속도론적 분석에 의해 발생하는 트롬빈의 추정

이 실험은 반응속도론적 분석을 이용하여, 0.6 nM 농도에서 각 프로트롬빈 활성제, 즉 에카린; 카린액타바아제-1; 카린액타바아제-2; PtPA; OsPA; 및 노테카린에 의해 프로트롬빈으로부터 생성된 트롬빈의 양을 측정하기 위해 설계되었다.

발색 트롬빈 기질 S-2238로부터 생성되는 p-니트로아닐린(pNA)의 흡광도는 상이한 농도의 트롬빈을 함유하는 샘플에 대해, 그리고 하기 목록에 기재된 프로트롬빈 활성제 중의 하나를 함유하는 샘플에 대해 405 nm에서 연속적으로 모니터링되었다.

트롬빈 연구를 위하여, 각 큐벳(cuvette)은 50 μL의 S-2238 기질(134 μM), 상이한 농도에서(0.25-30 nM 범위) 50 μL의 트롬빈 및 900 μL의 HEPES 버퍼를 함유한다. 도 15는 도 16에서 도시된 표준 곡선을 생성하기 위해 사용되는 트롬빈에 의한 S-2238 가수분해를 위한 진행 곡선을 도시한다.

프로트롬빈 활성제의 연구를 위하여, 각 큐벳은 50 μL의 프로트롬빈(247 nM), 10 μL(0.6 nM)의 프로트롬빈 활성제(에카린, 카린액타바아제-1, 카린액타바아제-2, PtPA, OsPA, 또는 노테카린), 100 μL(267 μM)의 S-2238 기질 및 840 μL의 HEPES 버퍼를 함유하였다. 각 프로트롬빈 활성제에 대한 반응 기울기는 155초에서 측정되었고, 155초에서 생성된 트롬빈의 양은 도 17 및 표 5에 도시된 바와 같이 도 16에서 표준 곡선으로부터 판독하였다.

표 5: 155초 동안 0.6 nM의 프로트롬빈 활성제에 의해 생성된 트롬빈의 양

프로트롬빈 활성제(0.6 nM )	도 16의 표준 곡선으로부터 계산된 기울기	155초에서 생성된 트롬 빈의 양( nM )
에카린	0.00085	1.74
카린액타바아제-1	0.00007	0.07
카린액타바아제-2	0.0005	0.99
PtPA	0.0094	20.12
OsPA	0.0077	16.47
노테카린	0.0001	0.13

예측한 바와 같이 모든 프로트롬빈 활성제 제제는 트롬빈을 제조하였으나, 다시 한번, PtPA 및 OsPA가 가장 효과적이었다.

이들 결과는 그룹 C 프로트롬빈 활성제(PtPA 및 OsPA)가 프로트롬빈을 트롬빈으로 가수분해함에 있어서 가장 효과적인 효소이었다는 것을 나타낸다. 이는 S-2238 기질을 가수분해하여 색을 가진 산물인 pNA를 형성할 수 있는 형성된 트롬빈의 양으로써 확인되었다. 다음으로 가장 효과적인 프로트롬빈 활성제는 약 4%의 S-2238를 가수분해하는 것으로 나타난 에카린이었고, 이어서 카린액타바아제-2(2.5%), 다음으로 카린액타바아제-1, 및 마지막으로 노테카린(<1%)이 이 정제 시스템에서 가장 효과적이지 않은 프로트롬빈 활성제이었다. 그룹 D 프로트롬빈 활성제(예를 들어, 노테카린)는, 시스템에서는 부재하지만, 모두가 혈액에서는 존재하는, 인자 Va, 칼슘 및 인지질을 필요로 한다.

실시예 2e: 프로트롬빈 활성제에 의한 트롬빈으로부터 트롬빈 생성의 상대 속도에 대한 반응속도론적 연구

이 실험은 각 프로트롬빈 활성제 제제에 의해 순수한 프로트롬빈으로부터 생성된 트롬빈 형성의 속도를 측정하기 위해 설계되었다.

각 큐벳은 50 μL의 프로트롬빈(247 nM), 10 μL의 상이한 프로트롬빈 활성제, 100 μL(267 μM)의 S-2238 기질 및 840 μL의 HEPES 버퍼를 함유하였다.

각자의 프로트롬빈 활성제를 위한 S-2238 가수분해(트롬빈 활성)를 위한 진행 곡선은 0.006-6 nM 범위에서 3 내지 5개의 상이한 농도에서 측정되었다. 데이터는 DynaFit 4.04.64 엔자임 키네틱 데이터 분석 소프트웨어(Enzyme Kinetic Data Analysis Software(BioKin Ltd, Watertown, MA, USA)(Kuzmic, P., 1996)를 사용하여 분석되었다.

S-2238의 트롬빈 촉매된 가수분해의 곡선 정합 분석이 도 18에 도시된다.

이어서 반응속도론적 파라미터는 다음과 같이 계산되었다:

모델: B → B + pNA + P(S-2238의 트롬빈 가수분해에 대한 모조 1차 속도 상수), 여기서:

B = 트롬빈;

pNA = p-니트로아닐린;

P = 억제 산물; 및

S-2238은 과량이고, 따라서 반응에 포함되지 않는다.

미분 방정식은 다음과 같다:

d[B]/dt = -kb[B] + kb[B];

d[pNA]/dt = +kb[B]; 및

d[P]/dt = +kb[B].

표 6은 트롬빈에 대한 추정된 반응속도론적 파라미터를 나타낸다.

표 6: 트롬빈에 대한 추정된 반응속도론적 파라미터

단위	파라미터	시작	정합	CV %
s-1	kb	61.3(Sonder, et al ., 1986)	66.2	0.4

프로트롬빈 활성제에 대한 속도 상수의 추정:

모델:

A + Z →A + B: ka (프로트롬빈의 활성에 대한 2차 속도 상수);

B →B + pNA + P: kb;

여기서, A는 프로트롬빈 활성제이다.

미분 방정식은 하기와 같다:

d[A]/dt = -ka[A][Z] + ka[A][Z];

d[Z]/dt = -ka[A][Z];

d[B]/dt = +ka[A][Z] - kb[B] + kb[B];

d[pNA]/dt = +kb[B]; 및

d[P]/dt = +kb[B].

PtPA에 대한 반응속도론적 파라미터가 추정되었고 표 7에 도시된다.

표 7: PtPA에 대한 추정된 반응속도론적 파라미터

단위	파라미터	시작	정합	CV %
s-1	kb		66.2
s-1 nM-1	ka	0.001	6.722 e-4	1.8
s-1 M-1	ka		6.72 x 105	1.8

트롬빈 생성의 속도:

= ka(s^-1 M^-1) x 60(s) x 10^-6

= 40.3 μM 트롬빈/분/M 프로트롬빈/M 활성제

= 40.3 nmol 트롬빈/mL/분/μmol 프로트롬빈 /μmol 활성제

도 19는 프로트롬빈과 상이한 PtPA 농도(0.006 - 0.12 nM)의 반응 속도, 이어서 발색 기질 S-2238으로 생성된 트롬빈 및 프로트롬빈의 PtPA 활성화에 대한 최적 정합 곡선을 증명하는, 프로트롬빈의 PtPA 활성화를 그래프로 표시한다. 점선은 실험 결과이고, 실선은 최적 정합으로 계산된 것이다. 이들 실험 및 계산된 진행 곡선은 양호한 일치를 나타낸다.

이어서, OsPA에 대한 반응속도론적 파라미터가 추정되었고, 표 8에 도시된다.

표 8: OsPA에 대한 추정된 반응속도론적 파라미터

단위	파라미터	시작	정합	CV %
s-1	kb		66.2
s-1 nM-1	ka	0.001	7.325 e-4	3.3
s-1 M-1	ka		7.33 x 105	3.3

트롬빈 생성의 속도:

= 44.0 nmol 트롬빈/mL/분/μmol 프로트롬빈/μmol 활성제

도 20은 프로트롬빈과 상이한 OsPA 농도(0.006 - 0.24 nM)의 반응 속도, 이어서 발색 기질 S-2238로 생성된 트롬빈, 및 프로트롬빈의 OsPA 활성화에 대한 최적 정합 곡선을 증명하는, 프로트롬빈의 OsPA 활성화를 그래프로 표시한다. 점선은 실험 결과이고, 실선은 최적 정합으로서 계산된 것이다. 이들 실험 및 계산된 진행 곡선은 양호한 일치를 나타낸다.

이어서, 에카린에 대한 반응속도론적 파라미터가 추정되었고, 표 9에 도시된다.

표 9: 에카린에 대한 추정된 반응속도론적 파라미터

단위	파라미터	시작	정합	CV %
s-1	kb		66.2
s-1 nM-1	ka	0.001	4.607 e-005	1.2
s-1 M-1	ka		4.61 x 104	1.2

트롬빈 생성의 속도:

= 2.76 μM 트롬빈/분/μM 프로트롬빈/μM 활성제

= 2.76 nmol 트롬빈/mL/min/μmol 프로트롬빈/μmol 활성제

도 21은 프로트롬빈과 상이한 에카린 농도(0.24 - 1.2 nM)의 반응 속도, 이어서 발색 기질 S-2238로 생성된 트롬빈, 및 프로트로빈의 에카린 활성화에 대한 최적 정합 곡선을 증명하는, 프로트롬빈의 에카린 활성화를 그래프로 표시한다. 점선은 실험 결과이고, 실선은 최적 정합으로서 계산된 것이다. 이들 실험 및 계산된 진행 곡선은 양호한 일치를 나타낸다.

이어서, 카린액타바아제-1에 대한 반응속도론적 파라미터가 추정되었고, 표 10에 도시된다.

표 10: 카린액타바아제-1에 대한 반응속도론적 파라미터

단위	파라미터	시작	정합	CV %
s-1	kb		66.2
s-1 nM-1	ka	0.001	3.944 e-006	0.3
s-1 M-1	ka		3.94 x 103	0.3

트롬빈 생성의 속도:

= 0.24 μM 트롬빈/분/μM 프로트롬빈/μM 활성제

= 0.24 nmol 트롬빈/mL/분/μmol 프로트롬빈/μmol 활성제

도 22는 프로트롬빈과 상이한 카린액타바아제-1 농도(0.24 - 1.2 nM)의 반응 속도, 이어서 발색 기질 S-2238로 생성된 트롬빈, 및 프로트롬빈의 카린액타바아제-1 활성화에 대한 최적 정합 곡선을 증명하는, 프로트롬빈의 카린액타바아제-1 활성화를 그래프로 표시한다. 점선은 실험 결과이고, 실선은 최적 정합으로서 계산된 것이다. 이들 실험 및 계산된 진행 곡선은 양호한 일치를 나타낸다.

이어서, 카린액타바아제-2에 대한 반응속도론적 파라미터가 추정되었고, 표 11에 도시된다.

표 11: 카린액타바아제-2에 대한 추정된 반응속도론적 파라미터

단위	파라미터	시작	정합	CV %
s-1	kb		66.2
s-1 nM-1	ka	0.001	3.183 e-005	1.8
s-1 M-1	ka		3.18 x 104	1.8

트롬빈 생성의 속도:

= 1.91 μM 트롬빈/분/μM 프로트롬빈/μM 활성제

= 1.91 nmol 트롬빈/mL/분/μmol 프로트롬빈/μmol 활성제

도 23은 프로트롬빈과 상이한 카린액타바아제-2 농도(0.24 - 1.2 nM)의 반응 속도, 이어서 발색 기질 S-2238로 생성된 트롬빈, 및 프로트롬빈의 카린액타바아제-2 활성화에 대한 최적 정합 곡선을 증명하는, 프로트롬빈의 카린액타바아제-2 활성화를 그래프로 표시한다. 점선은 실험 결과이고, 실선은 최적 정합으로서 계산된 것이다. 이들 실험 및 계산된 진행 곡선은 양호한 일치를 나타낸다.

이어서, 노테카린에 대한 반응속도론적 파라미터가 추정되었고, 표 12에 도시된다.

표 12: 노테카린에 대한 추정된 반응속도론적 파라미터

단위	파라미터	시작	정합	CV %
s-1	kb		66.2
s-1 nM-1	ka	0.001	7.139 e-007	0.3
s-1 M-1	ka		7.14 x 102	0.3

트롬빈 생성의 속도:

= 0.043 μM 트롬빈/분/μM 프로트롬빈/μM 활성제;

= 0.043 nmol 트롬빈/mL/분/μmol 프로트롬빈/μmol 활성제.

도 24는 프로트롬빈과 상이한 노테카린 농도(0.24 - 6.0 nM)의 반응 속도, 이어서 발색 기질 S-2238로 생성된 트롬빈, 및 프로트롬빈의 노테카린 활성화에 대한 최적 정합 곡선을 증명하는, 프로트롬빈의 노테카린 활성화를 그래프로 표시한다. 점선은 실험 결과이고, 실선은 최적 정합으로서 계산된 것이다. 이들 실험 및 계산된 진행 곡선은 양호한 일치를 나타낸다.

각 상이한 프로트롬빈 활성제에 대한 추정된 활성화 속도 상수 및 트롬빈 생성 속도의 요약이 표 13에서 제공된다.

표 13: 상이한 프로트롬빈 활성제애 대한 추정된 활성화 속도 상수 및 트롬빈 생성 속도의 요약

프로트롬빈 활성제	활성화 속도 상수 ka(s-1 nM-1)	트롬빈 생성 속도 (nmol 트롬빈/mL/분/μmol 프로트롬빈/μmol 활성제)
PtPA	6.72 x 105	40.3
OsPA	7.33 x 105	44.0
에카린	4.61 x 104	2.76
카린액타바아제-1	3.94 x 103	0.24
카린액타바아제-2	3.18 x 104	1.91
노테카린	7.14 x 102	0.043

상이한 프로트롬빈 활성제 및 트롬빈 기질 S-2238 사이에 어떠한 반응도 일어나지 않았으며, S-2238과 프로트롬빈에 의한 어떠한 반응도 일어나지 않았다. 활성화 속도 데이터 상수는 그룹 C 프로트롬빈 활성제(PtPA 및 OsPA)가 프로트롬빈을 트롬빈으로 가수분해시키는 데에 잇어서 가장 강력하다는 것을 확인하였다. 사실, 이들은 에카린 및 카린액타바아제-2보다 20배 이상 효과적이고, 카린액타바아제-1보다 200배 이상 효과적이고, 노테카린보다 대략 1000배 정도 효과적이었다. 추정된 트롬빈 생성 속도는 효능비를 동등하게 나타내며, 그룹 C 활성제가 가장 많은 양의 트롬빈을 생성할 수 있었고, 이어서 에카린, 카린액타바아제-2, 카린액타바아제-1이었고, 노테카린이 가장 비효과적이었다. 실시예 2d에 나타난 바와 같이, 노테카린은 활성을 위해 보조인자를 필요로 한다.

하기 실시예에서 사용되는 재료 및 방법

하기에 개시되는 실시예에서 지시되는 한, 하기 재료 및 방법이 사용되었다.

(A) 샘플 제조를 위한 용기

혈청 샘플 또는 혈장 샘플의 제조를 위한 전형적인 용기(예를 들어, 튜브)는, (1) 원심분리 동안 혈장 또는 혈청으로부터 세포(및 혈청의 경우 혈전)를 분리하고, 후속 재-혼합이 일어나는 것을 방지하기 위한 겔 배리어; (2) 후속 세포 용혈을 최소화하기 위해 튜브 벽에 세포 및 단백질의 부착을 막기 위해 내벽을 코팅하는 계면활성제; 및 (3) 혈청 샘플의 제조를 위한 응고 과정을 향상시키는 응혈원(procoagulant)(예를 들어, 실리카 입자) 또는 혈장 샘플의 제조를 위한 항응고제(anticoagulant)(예를 들어, 리튬 헤파린, 시트레이트, 또는 EDTA)를 함유한다.

실시예에서, 수많은 시판중인 튜브가 하기에 개시된 바와 같이 혈청 샘플 또는 혈장 샘플을 제조하기 위해 사용되었다.

그레이너 배큐엣 (상표명) 혈장 튜브. 이것은 참조 번호 456083로 그레이너(Greiner)에 의해 제공되는 혈장 분리 튜브이다. 튜브의 내벽은, 항응고제로서 작용하는 분무 건조된 리튬 헤파린(89 IU)으로 코팅된다. 튜브는 또한 튜브의 기저에 분리 겔을 함유한다. 그레이너는 상기 겔이 작용하여 파라미터가 48시간까지 안정하게 유지되도록 허용하여 혈장과 혈액 세포 사이에서 안정한 배리어를 형성한다고 명시한다. 충전 부피는 5.0 mL이다.

벡톤 디킨슨( BD ) 배큐테이너 ( Vacutainer , 상표명) 혈장 튜브( BD PST II ). 이것은 참조 번호 367375로 BD에 의해 제공되는 혈장 분리 튜브이다. 각 튜브는 항응고제로서 77 IU/mL의 리튬 헤파린(0.2 - 1.0 mg)을 함유한다. 튜브는 원심분리 동안 세포와 혈장 사이에 배리어를 형성하는 아크릴성 겔(0.8 - 1.9 g)을 함유한다. BD는 대부분의 분석물질이 25℃에서 24시간 동안 튜브 내에서 안정하기 때문에 피브린 및 측정가능한 백혈구, 적혈구 및 혈전에서 감소에 의해 증명되는 향상된 혈장 순도, 및 향상된 분석물질 안정성을 제공한다고 명시한다. 충전 부피는 4.0 mL이다.

그레이너 배큐엣 (상표명) 혈청 튜브. 이 튜브는 참조 번호 456078로 그레이너에 의해 제공된다. 튜브는 실리카 입자를 응고 활성제로서 함유한다. 충전 부피는 4.0 mL이다. 이 튜브에서 추천된 응고 시간은 30분이다.

벡톤 디킨슨( BD ) 배큐테이너 ( Vacutainer , 상표명) 혈청 튜브( BD SST II ). 이 튜브는 참조 번호 367954로 BD에 의해 제공된다. 이 튜브는 혈청 샘플을 수득하고 분리하기 위해 사용된다. 각 튜브는 응고제로서 0.20 - 2.56 mg의 비정질 (또는 용융) 실리카, 및 또한 원심분리 후 혈전 및 혈청 사이에 배리어를 형성하는 겔(0.90 - 3.50 g)을 함유한다. BD는 이 튜브에 대해 30분의 응고 시간을 추천한다. 충전 부피는 4.0 mL이다.

벡톤 디킨슨( BD ) 배큐테이너 ( Vacutainer , 상표명) 빠른 혈청 튜브( BD RST ). 이 튜브는 참조 번호 368771로 BD에 의해 제공된다. 이 튜브는 트로빈-계 의약 응고제 및 겔을 함유한다. BD는 이런 튜브들이 5분 내(즉, 시판중인 표준 혈청 튜브보다 더 빠른 응고)에 응고된 샘플을 제공할 것이며 "최소 피브린 형성"을 일으킬 것을 주장한다. 충전 부피는 4.0 mL이다.

그레이너 배큐엣 (상표명) 무첨가제 튜브. 이들은 참조 번호 45400으로 그레이너에 의해 제공된 보통 플라스틱 튜브들이며 여기에 특정 농도의 프로트롬빈 활성제가 아래 실시예들에 기술된 대로 첨가되었다.

사르스테트(Sarstedt ) 혈청 튜브. 이 튜브는 카달로그 번호 5092503로 제공되며 옅은 갈색 상부를 구비하고 4.7 mL의 충전 부피를 가진다. 이런 튜브들은 실리카 입자들 및 겔 배리어를 함유한다.

테루모(Terumo ) 플레인 튜브. 이 튜브는 카달로그 번호 VF-076SP로 상표명 VENOSAFE로 제공되며 6.0 mL의 충전 부피를 가진다. 이런 튜브들은 실리카 입자들 및 겔 배리어를 함유한다.

테루모 레드 탑( Red Top ( RT )) 튜브. 이 튜브는 카달로그 번호 VF-108SAS로 상표명 VENOSAFE로 제공되며 8.0 mL의 충전 부피를 가진다. 이런 튜브들은 실리카 입자들 및 겔 배리어로 내부가 코팅된다.

그레이너 배큐엣 (상표명) 시트레이트 튜브. 이 플라스틱 튜브는 3.2% 시트레이트를 함유하며 4.0 mL 충전 부피를 가진다. 이 튜브는 카달로그 번호 454327로 판매된다.

그레이너 배큐엣 (상표명) K2EDTA 튜브. 이 플라스틱 튜브는 8 mM EDTA를 함유하며 4.0 mL 충전 부피를 가진다. 이 튜브는 카달로그 번호 454023으로 판매된다.

(B) 샘플 분석 - 클로텍 분석기( CLOTEK ANALYSER )

클로텍 분석기(Hyland, USA)는 튜브가 장치에 삽입될 때 수직으로 진동하는 자성 볼을 함유하는 샘플 튜브를 사용한다. 자성 강 볼은 튜브가 진동하는 동안 자기장에 의해 위치가 고정된다. 샘플, 버퍼, ±칼슘 및 응혈원이 첨가되고 타이머가 작동된다. 트롬빈은 피브리노겐을 응고가능한 피브린으로 변환되고 탐지가능한 혈전을 형성하는데 필요한 시간이 응고 시간이다. 혈전 형성시에 강 볼은 자기장 현탁액 및 광 통로로부터 제거되어, 광빔이 광전지를 때려 타이머를 정지시킨다(Austen, D. E., et al . 1975 및 Starr, H., et al ., 1980).

(C) 샘플 분석 - 트롬보엘라스토그라프( THROMBOELASTOGRAPHY )

트롬보엘라스토그라프(TEG)는 혈전 형성 및 용해의 속도 및 이의 형성 및 용해 동안 혈전의 탄성 특성들을 측정함으로써 전혈의 응고를 측정한다. 아래 일부 실시예들에서 나타낸 곳에서, TEG 분석을 실행하였다.

TEG 분석은 TEG 분석 소프트웨어 버전 4를 가진 Thrombelastograph^®5000(TEG, Haemoscope Corporation Pty Ltd, Niles, IL, USA)를 사용하여 실행하였다.

TEG 분석을 위해 본 발명에서 사용한 응고 변수들은 다음과 같았다:

R - 반응 시간(초/분): 분석의 시작으로부터 TEG 트레이싱 진폭이 탐지가능한 혈전 형성을 나타내는 2mm에 도달할 때까지의 시간;

α- 각도: 피브린 형성 및 가교의 속도의 크기(즉, 혈전 강화);

MA - 최대 진폭(mm): 혈전의 최대 강도;

TMA - 분석의 시작으로부터 MA에 도달할 때까지의 시간(초/분); 및

K - 시간(초): 혈전 형성의 시작으로부터 곡선이 20mm의 진폭에 도달할 때까지의 시간.

표시된 상기 응고 변수들을 가진 TEG 그래프(혈전 형성 부분)가 도 25에 제공된다. 혈전 용해 변수들이 포함되지 않았기 때문에 응고 변수들만 제공된다.

실시예 3: 독 프로트롬빈 활성제에 의한 혈장 샘플의 응고

실시예 3a: PtPA 대 소 트롬빈에 의한 정상 시트레이트 처리된 혈장의 응고 시간

(실시예 1d에서 개시된 대로 제조된) PtPA 및 소 α-트롬빈(3276 U/mg; Sigma Chemical Co.)에 의한 모인 시트레이트 처리된 혈장(6명 정상 참가자의 혼합된 혈장)의 응고 시간을 칼슘(10 mM)을 첨가하고 첨가하지 않고 이중 샘플들에서 측정하였다.

결과들은 표 14에 나타나며, 값들은 이중 실험들의 평균이다.

표 14: 하이랜드-클로텍 장치에서 측정한 PtPA 및 소 트롬빈에 의한 시트레이트 처리된 혈장의 응고 시간(초).

	응고시간(초)
효소의 농도( nM )	PtPA + 칼슘	PtPA - 칼슘	트롬빈 + 칼슘	트롬빈 - 칼슘
100	4.2	4.7	4.8	7.9
50	4.2	4.8	6.4	17.9
30	4.3	5.0	13.3	27.2
10	4.5	5.4	33.2	57.2
3	5.0	6.2	78.6	>200#
1	6.0	6.6	>200#	>200
0.1	8.7	8.8	>200	>200
0.001(1 pM)	13.5	29.0	>200	>200
0.0001(0.1 pM)	74.1	98.6	>200	>200
0	>200	>200	>200	>200

# 약한 혈전이 관찰됨.

PtPA는 재석회화된 또는 재석회화되지 않은 0.1 pM 정도로 낮은 농도에서 시트레이트 처리된 혈장을 효율적으로 응고하였다. 1 nM의 농도는 약 6초의 응고 시간을 제공하였고, 100 nM에서 얻은 최소 응고 시간 4.2초와 비슷하다.

이런 결과들은 또한 몰을 기초로 소 트롬빈 보다 (재석회화된 또는 재석회화되지 않은) 시트레이트 처리된 혈장의 응고에 약 3x10⁴배 더 효과적이라는 것을 나타낸다. 예를 들어, 10 mM 첨가된 칼슘의 존재하에서, 1 pM PtPA는 30 nM 트롬빈과 동일한 응고 시간을 제공하였고 0.1 pM PtPA는 3 nM 트롬빈과 매우 유사한 응고 시간을 가졌다(표 14의 볼드체 값들).

실시예 3b: 프로트롬빈 활성제에 의한 정상 시트레이트 처리된 혈장의 응고 시간

이 실험은 실시예 3a과 동일한 혈장을 사용하였다.

각각의 클로텍 튜브는 100 μL의 정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장, 100 μL의 Tris 버퍼(150 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4), 50 μL 0.2 M CaCl₂ 또는 식염수, 및 50 μL의 각 응혈원 (프로트롬빈 활성제 제제 또는 트롬빈)을 함유하였다.

(재석회화된 또는 재석회화되지 않은) 정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장에 대한 각 프로트롬빈 활성제 제제 및 트롬빈으로부터의 응고 결과들은 표 15 및 16에 나타난다. 이 표(및 다른 곳)에서, CA-1은 카린액타바아제-1이며 CA-2는 카린액타바아제-2이다.

표 15: 칼슘이 있는 상이한 프로트롬빈 활성제 제제 및 트롬빈에 의한 정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장의 응고 시간.

[ 응혈원 ]( mM )	Ca 2 + 이 있음(초)
	에카린	CA -1	CA -2	PtPA	OsPA	노테카린	트롬빈
100	43.0	108	65.8	3.5	5.7	42.4	4.3
50	56.0	145	85.0	4.6	6.5	52.8	6.7
30	69.0	181	167	4.9	7.9	57.5	10.5
10	105	>300	>300	12.5	12.5	68.5	32.8
3	208	>300	>300	20.1	18.3	99.8	92.3
1	>300	>300	>300	61	30.0	144	>300
0.1	>300	>300	>300	120	108	284	ND
0.01	>300	>300	>300	212	>300	>300	ND
0.001	>300	>300	>300	>300	>300	>300	ND

표 16: 칼슘이 없는 상이한 프로트롬빈 활성제 제제 및 트롬빈에 의한 정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장의 응고 시간.

[ 응혈원 ]( mM )	Ca 2 + 이 없음(초)
	에카린	CA -1	CA -2	PtPA	OsPA	노테카린	트롬빈
100	94.0	>300	216	3.9	7.3	51.7	5.6
50	129	>300	>300	5.0	8.2	67.6	9.2
30	167	>300	>300	6.1	8.9	76.7	14.6
10	>300	>300	>300	9.0	14.0	115	43.6
3	>300	>300	>300	15.5	21.5	250	145
1	>300	>300	>300	24.6	34.5	>300	>300
0.1	>300	>300	>300	93.0	152	>300	ND
0.01	>300	>300	>300	>300	>300	>300	ND
0.001	>300	>300	>300	>300	>300	>300	ND

결과는 첨가된 칼슘의 존재하에서 모든 프로트롬빈 활성제(그룹 A-D를 나타냄)는 정상 시트레이트 처리된 혈장을 효율적으로 응고하였다는 것을 나타낸다.

시트레이트 처리된 혈장은 완전히 칼슘을 고갈시키지 않는다. 정상 시트레이트 처리된 혈장에서 총 칼슘 농도는 ~1.3 mmol/L이며 이온화된 칼슘 농도는 측정할 수 없다(<0.25 mmol/L). 그러나, 시트레이트는 샘플에 있는 칼슘에 결합하는 칼슘의 킬레이터라서 유리 칼슘은 혈전 형성을 위해 사용되도록 쉽게 이용될 수 없다. 칼슘은 프로트롬비나아제 착물의 일부이며 프로트롬빈의 트롬빈으로의 촉매작용에 중요한 역할을 한다. 또한 시트레이트는 마그네슘 및 아연 이온을 포함하는 다른 금속 이온들과 결합한다. 튜브에 존재하는 시트레이트의 양, 0.109mol/L는 튜브에 있는 모든 금속 이온들을 킬레이트하는데 충분한 양 이상이다.

이런 결과들은 그룹 A 프로트롬빈 활성제, 에카린이 첨가된 칼슘의 존재하에서 혈장을 응고하는데 2배 이상 효과적이었고 따라서 칼슘은 혈전 형성을 촉진하는 에카린의 능력을 현저하게 강화한다는 결론을 나타내었다. 그룹 B 프로트롬빈 활성제, 카린액타바아제-1 및 카린액타바아제-2는 칼슘의 부존재에 의해 강하게 영향을 받아서 ~4배의 활성 감소를 나타내었고, 칼슘이 이런 프로트롬빈 활성제들과 함께 응고 활성을 강화한다는 것을 확인시켰다. 노테카린, 그룹 D 프로트롬빈 활성제의 활성은 첨가된 칼슘의 존재에 의해 자극되었고 칼슘에 대한 요구는 노케카린 농도의 감소에 의해 가장 명백하였고 칼슘의 첨가로 이의 효율이 ~30% 증가하였다.

트롬빈 자체는 첨가된 칼슘의 부존재에 의해 더 적은 정도로 영향을 받았다. 트롬빈 자체는 칼슘을 필요로 하는 프로트롬빈의 혈액응고 연쇄고리(coagulation cascade)에 의해 샘플에 트롬빈 형성을 일으킨다. 따라서 샘플 프로트롬빈으로 형성된 트롬빈의 양은 칼슘의 부존재와 함께 감소하였다.

응혈원들의 칼슘 의존성은 이들의 효능 때문에 이들의 농도가 높을 때 적었다. 결과들은 그룹 C 프로트롬빈 활성제, PtPA 및 OsPA가 첨가된 칼슘의 존재 또는 부존재하에서 정상 "모인" 시트레이트 혈장을 응고하는데 가장 효과적이었다는 것을 나타내었다. 사실, 칼슘의 부존재는 이런 두 응혈원의 응고 능력에 미세한 차이를 나타내었다. 첨가된 칼슘의 존재 및 부존재에 의해 그룹 C 프로트롬빈 활성제는 <5분 후에 응고를 달성하기 위해 ~0.1 nM을 필요하였다.

실시예 3c: PtPA 에 의한 시트레이트 처리된 샘플들 및 피브리노겐의 응고 시간

다음 재석회화된 시트레이트 처리된 혈장 샘플들 및 정제된 피브리노겐의 샘플을 응고하는 PtPA의 능력은 다음 이중 샘플에서 측정하였다:

(i) 시트레이트 처리된 혈장;

(ii) Al(OH)₃에 의해 흡착된 시트레이트 처리된 혈장(Al(OH)₃에 의한 흡착이 프로트롬빈 및 다른 γ-카복시글루타메이트(GLA)-함유 단백질들을 제거한다);

(iii) 장기간의 와파린 치료를 받은 환자들의 시트레이트 처리된 혈장(4.0보다 큰 국제정상화비율(international normalized ratio)(INR)을 가짐);

(iv) Al(OH)₃에 의해 흡착된 장기간의 와파린 치료를 받은 환자들의 시트레이트 처리된 혈장(4.0보다 큰 국제정상화비율(international normalized ratio)(INR)을 가짐);

(v) 유전적으로 결함이 있는 환자들로부터 얻은 시트레이트 처리된 인자 X-결핍 혈장;

(vi) 유전적으로 결함이 있는 환자들로부터 얻은 시트레이트 처리된 인자 V-결핍 혈장; 및

(vii) (소량의 프로트롬빈을 제거하기 위해) Al(OH)₃에 의해 흡착된 정제된 인간 피브리노겐(등장성 식염수 속 2 mg/mL).

(iii) 및 (iv)에 관해, 와파린은 γ-카복실기들을 프로트롬빈의 10N-말단 글루탐산 잔기들 속에 삽입하는 효소인 간 γ-카복실라아제를 억제한다. 따라서 와파린 혈장은 프로트롬빈의 카복실레이트되지 않은 전구체이며, Al(OH)₃에 의한 흡착에 의해 제거되지 않는 데스카복시프로트롬빈을 함유한다.

(v) 및 (vi)에 관해, 인자 Xa 및 인자 Va는 인간 프로트롬비나아제 착물의 필수 구성요소들이다. 인자 X-결핍 및 인자 V-결핍 혈장들은 오르소-다이아그노스틱(USA)에 의해 공급되었다.

결과들은 표 17에 나타난다.

표 17: 시트레이트 처리된 혈장 샘플 (i)-(vi) 및 피브리노겐 샘플 (vii)의 응고 시간.

	샘플에 대한 응고 시간(초±0.5초)
PtPA * ( nM )	(i)	( ii )	( iii )	( iv )	(v)	( vi )	( vii )
54	12.8	> 180	15.6	18.4	16.5	12.8	>180
26	16.4	> 180	18.4	26.8	n.d.	n.d.	n.d.
16	22.5	> 180	24.6	28.6	n.d.	n.d.	n.d.
7.3	34.6	> 180	38.8	42.3	n.d.	n.d.	n.d.
3.8	48.2	> 180	55.0	59.8	n.d.	n.d.	n.d.
0#	10.0	10.6	7.7	8.6	14.6	10.6	5.4

* 이 실험에서, PtPA의 상이한 제제를 사용하였고, 상기 표 14에서 더 낮은 응고 활성의 원인이 되었다.

n.d.는 측정이 결정되지 않았다는 것을 의미한다.

# PtPA가 첨가되지 않은 경우, 0.1 Unit의 소 트롬빈(Parke-Davis, 현재 Pfizer, USA)을 양성 대조군으로서 모든 샘플에 첨가하였다. 트롬빈의 첨가에 의해 관찰된 빠른 응고는 모든 샘플에서 피브리노겐의 존재를 확인시켰다.

표 17의 결과는 다음을 나타낸다:

(1) 프로트롬빈은 Al(OH)₃-흡착된 시트레이트 처리된 혈장(샘플(ii))이 PtPA에 의해 응고되지 않았기 때문에 PtPA에 의한 응고에 필수적이다;

(2) PtPA는 와파린 혈장(샘플 (iii) 및 (iv))을 응고하며 데스카복시프로트롬빈은 PtPA에 의해 α-트롬빈으로 변환될 수 있다는 것을 나타낸다;

(3) 와파린 혈장에서 소량의 정상 프로트롬빈이 Al(OH)₃에 의해 제거될 것이기 때문에, Al(OH)₃에 의해 흡착된 와파린 혈장에 대한 결과는 데스카복시프로트롬빈이 α-트롬빈으로 변환된 것을 확인시킨다;

(4) 인자 Xa는 PtPA에 의한 응고에 필요로 하지 않는다(샘플(v)에 대한 결과);

(5) 인자 Va는 PtPA에 의한 응고에 필요로 하지 않는다(샘플(vi)에 대한 결과); 및

(6) PtPA는 피브리노겐 용액을 응고할 수 없고 따라서 트롬빈 유사 효소로서 기능하지 않는다.

요약하면, 이런 결과들은 PtPA에 의해 유도된 응고는 프로트롬빈 활성화 때문이며; 데스카복시프로트롬빈은 PtPA에 의해 효과적으로 트롬빈으로 변환되며; 인자 Xa 및 Va는 PtPA에 의한 프로트롬빈 활성화에 필요로 하지 않으며; PtPA는 이런 조건들하에서 피브리노겐을 피브린으로 변환하지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 3d: EDTA -처리된 혈장의 응고

생화학적 분석을 위해 얻은 적지만 상당한 비율의 샘플(혈청 또는 리튬 헤파린 혈장 샘플)은 EDTA에 의해 오염된다. 따라서 프로트롬빈 활성제들이 EDTA 혈장 및 EDTA 전혈을 응고하는데 효율적이었는 지를 측정하는 것이 중요하다. 따라서 이 실시예는 아래 실시예 5b로 제공되어, EDTA 혈장 및 EDTA 전혈의 연구들의 비교가 이루어질 수 있다.

실시예 3e: 프로트롬빈 활성제들에 의한 와파린 투여 참여자들의 시트레이트 처리된 혈장의 응고

와파린은 일반적으로 항응고제로 사용되며, 따라서 이 실험의 목적은 와파린 치료가 와파린 투여 환자들의 샘플들을 응고하는 프로트롬빈 활성제들: 에카린; 카린액타바아제-1; 카린액타바아제-2; PtPA; OsPA; 및 노테카린의 능력에 영향을 미치는지를 측정하는 것이었다.

INR(1.1-7.6)을 기초로 (와파린 복용량과 관련된) 다른 응고 시간들을 가진 참가자 혈장 샘플들을 선택하였고 상이한 응혈원들(프로트롬빈 활성제들 및 트롬빈)으로 검사하였다.

클로텍 튜브는 100 μL의 리튬 헤파린 혈장, 100 μL의 Tris 버퍼(150 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4), 50 μL의 0.2 M CaCl₂ 및 501 μL의 각 응혈원을 함유하였다.

결과는 표 18 및 19에 나타난다. 이런 표 및 다른 곳에서 사용된 대로, CA-1은 카린액타바아제-1이며 CA-2는 카린액타바아제-2이다.

표 18: 프로트롬빈 활성제들에 의한, 와파린 투여 환자들의 재석회화된 시트레이트 처리된 혈장에 대한 응고 시간(초).

[ 프로트롬빈 활성제] 30 nM	샘플 INR
	1.1	1.2	1.5	2.0	2.9	6.4	7.6
PtPA	5.0	5.7	6.7	6.1	7.0	9.8	10.5
OsPA	9.0	9.1	12.6	16.8	17.2	17.2	19.3
노테카린	69.4	67.1	68.6	66.6	71.0	91.0	121
에카린	72.2	63.4	63.4	69.4	85.6	114	111
CA-1	231	198	232	229	>300	>300	>300
CA-2	115	103	115	109	149.2	242	240

표 19: PtPA 및 트롬빈에 의한 와파린 투여 환자들의 재석회화된 시트레이트 처리된 혈장에 대한 응고 시간(초).

[ 응혈원 ] 30 nM	샘플 INR
	1.1	1.7	2.3	2.8	5.8	6.4
PtPA	7.4	8.1	8.1	8.3	11.1	13.3
트롬빈	13.4	13.7	14.7	14.0	14.7	16.3

와파린은 정상 인자-X(FX) 및 프로트롬빈의 이들의 전구체들(데스카복시인자-X 및 데스카복시프로트롬빈)로부터의 합성에 감소를 유도한다. 프로트롬빈 및 데스카복시프로트롬빈은 프로트롬빈 활성제들에 의해 표적화된 기질들이다. 프로트롬빈의 감소는 더 적은 트롬빈이 프로트롬빈 활성제들에 의해 생성되었다는 것을 의미하며, 따라서 연장된 응고 시간이 관찰되었다. 트롬빈 자체는 와파린에 의해 억제되지 않았고 따라서 트롬빈에 의한 응고 시간은 이 실험에서 관찰되었던 대로 영향을 받지 않는다. 이 실험의 결과들은 카린액타바아제-1은 INR =2.9을 가진 혈장 샘플들을 응고할 수 없는 유일한 프로트롬빈 활성제이었다는 것을 나타내었다. 결과들은 PtPA 및 OsPA가 와파린을 투여한 환자들의 혈장에 대한 가장 효과적인 응혈원들이었다는 것을 나타내었다.

실시예 3f: 프로트롬빈 활성제들에 의한 FV -결핍 및 FX -결핍 혈장의 응고

시판중인 FV-결핍 혈장(#0008466150) 및 FX-결핍 혈장(#0008466350)(Instrumentation Laboratory, Lexington, MA, USA)을 응고하는 능력에 대해 클로텍 분석기(Hyland USA)를 사용하여 프로트롬빈 활성제 제제들을 검사하였다.

클로텍 튜브는 100 μL의 FV- 또는 FX-결핍 혈장, 100 μL의 Tris 버퍼(150 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4), 50 μL 0.2 M CaCl₂ 및 50 μL의 각 응혈원을 함유하였다. 모든 응혈원들은 30 nM의 농도이었고, 100 nM의 농도의 카린액타바아제-1을 함유하는 샘플들을 검사하였다.

결과들은 표 20에 나타난다.

표 20: 프로트롬빈 활성제 제제 및 트롬빈에 의한 FV- 또는 FX-결핍 혈장의 응고 시간(초)

[ 응혈원 ] 30 nM	응고 시간(초)
	정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장	FV -결핍 혈장	FX -결핍 혈장
에카린	66.8	74.8	77.5
CA -1	184	>300	>300
CA -1(100 nM)	ND	216	218
CA -2	133	159	159
OsPA	13.3	12.7	12.7
PtPA	9.0	7.4	7.6
노테카린	47.5	>300	71.9
트롬빈	13.8	44.6	50.2

"ND"는 이것이 결정되지 않았다는 것을 의미한다.

노테카린은 5분 후에 FV-결핍 혈장을 응고할 수 없었고 또한 이의 응고 효과는 FX의 부존재하에서 감소하였다. 게다가, 그룹 A 및 B 프로트롬빈 활성제들의 응고 활성 또한 FV 또는 FX의 부존재하에서 감소하였다. 그룹 C 프로트롬빈 활성제, PtPA 및 OsPA는 분명하게 혈장을 응고하는데 가장 효과적이었고 혈장으로부터 FV 또는 FX를 필요로 하지 않는다.

트롬빈 응고 시간은 정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장에 대한 응고 시간과 비교하여 FV- 및 FX-결핍 혈장에서 3배 이상 더 길게 현저하게 증가하였다.

실시예 3g: 정상 및 헤파린 처리된 시트레이트 처리된 혈장에서 PtPA 및 OsPA의해 생성된 트롬빈의 양의 추정

이 실험은 상이한 농도를 사용하고 헤파린의 존재하에서 PtPA 및 OsPA에 의해 생성된 트롬빈의 양의 추정값을 제공하기 위해 설계되었다.

건강한 참가자로부터 얻은 정상 시트레이트 처리된 혈장을 여러 튜브(그레이너 시트레이트)에 넣고 즉시 원심분리하여 시트레이트 처리된 혈장을 모았다.

사용된 트롬빈은 트롬빈-JMI, 국소(소) 5000USP(GenTrac Inc, King Pharmacia, Middleton, WI, USA)이었다. USP 유닛들은 IU와 동일하며 1 IU는 9 nM과 동일하다. 사용된 트롬빈 기질은 S-2238이었다(25 mg 원료 용액 MW 626 Da를 15 mL에 용해하고 2.67 mM(#820324 Chromogeinix IL Lexington MA, USA)을 얻었다). 사용된 헤파린은 5000 IU/5 mL(1000 IU/mL), 나트륨 헤파린(화이자, NZ)이었다. 헤파린의 경우, 190.9 IU = 1 mg(Camenzind, et al . 1997); ~12000 Da의 MW이 몰 농도를 계산하기 위해 사용되었다. 사용된 버퍼는 20 mM Hepes 버퍼; 150 mM NaCl; pH 7.4; 0.05% 계면활성제 p20이었다.

혈장 배양을 위해서 튜브들은 0.5 mL 시트레이트 처리된 혈장, 50 μL의 0.5 M CaCl₂, 및 5-40 μL 트롬빈 또는 프로트롬빈 활성제에 더해 860, 4300, 및 8600 nM(2, 10 및 20 IU)의 농도를 제공하는 20 μL의 헤파린 또는 식염수를 함유하였다. 튜브들을 실온에서 5분 동안 배양하였다. 5분 직후, 혈전을 2개의 목면봉을 사용하여 둥글게 만들어, 제거하여 버렸다.

트롬빈 활성 분석을 위해, 각 분광광도계 큐벳은 930 μL의 버퍼, 50 μL의 S-2238 및 혈전이 상기 배양에서 각 튜브로부터 제거된 후 잔존하는 20 μL의 깨끗한 혈청을 함유하였다. 흡광도 변화는 5분 동안 405 nm에서 관찰되었다.

도 26은 상이한 농도의 트롬빈이 첨가된 튜브들에서 잔존하는 트롬빈의 활성들을 나타낸다. 각 곡선의 경우, 275초에서 기울기를 250-300초의 시간 범위를 사용하여 측정하였고, 트롬빈 농도들과 함께 이런 기울기들을 사용하여, 도 26 및 27에 나타낸 대로, 더 높은 트롬빈 농도에 대해 선형 관계를 제공하는 로그 형식의 표준 곡선을 전개하였다.

재석회화된 혈장(응혈원 없음)은 실온에서 응고하는데 ~37분 걸렸다. 모든 트롬빈 함유 샘플은 잠복성 응고(latent clotting)를 나타내었다. 트롬빈의 최저 농도는 잠복성 응고를 나타내는데 가장 느렸다(~3분). 잠복성 응고에 대한 시간은 트롬빈의 농도가 증가함에 따라 감소하였다. 농도 >200 nM 트롬빈을 가진 샘플들은 혈청이 분취됨에 따라 혈전이 제거된 직후 잠복성 응고를 나타내었다. 때때로, 광도계 분석을 위한 튜브로부터 충분한 샘플을 얻는 것을 보증하기 위해 2차 혈전 제거가 필수적이었다.

상이한 농도의 프로트롬빈 활성제 PtPA 및 OsPA는 함유하나 헤파린은 없는 샘플들의 경우, 결과들은 다음과 같았다. 상이한 농도의 PtPA를 함유하는 샘플들에 대한 분광광도계 결과들은 도 28에 나타나며 상이한 농도의 OsPA를 함유하는 샘플들에 대한 결과들은 도 29에 나타난다.

그 후에 PtPA에 의해 생성된 트롬빈 농도들을 5분에 기울기에 대해 그래프로 나타내었고 결과는 도 20에 나타나며 OsPA에 의해 생성된 트롬빈 농도들을 5분에 기울기에 대해 그래프로 나타내었고 결과는 도 31에 나타난다.

혈청에서 활성이 있는 상이한 PtPA 및 OsPA 농도에 의해 생성된 트롬빈의 농도를 추정하였고 표 21에 나타난다.

표 21: 표준 곡선 회귀 방정식으로부터 측정된 PtPA 및 OsPA의 상이한 농도에 의해 생성된 혈청에 존재하는 활성 트롬빈의 추정, 도 27.

[ 프로트롬빈 활성제]( nM )	초당 5분에서 기울기	활성 트롬빈의 추정 농도( nM )
PtPA
1.2	0.00098	574
6.1	0.00171	869
12.3	0.00196	965
OsPA
1.2	0.00094	554
6.1	0.00149	784
12.3	0.00195	961

결과들은 매우 상당한 양의 트롬빈이 1.2 nM PtPA 및 OsPA에 의해서도 생성되었다는 것을 나타내었다. 매우 소량의 PtPA 및 OsPA는 <5분 후에 재석회화된 정상 시트레이트 처리된 혈장을 완전히 응고할 수 있었다. 잠복성 응고는 관찰되지 않았고, 생성된 트롬빈의 양은 피브리노겐에 완전히 촉매작용을 미쳐서 매우 높은 품질의 혈장과 일치할 수 있는 잠복성 응고를 예방하는데 충분하다는 것을 나타낸다.

상이한 농도의 헤파린을 함유하는 샘플들의 경우, 결과들은 다음과 같았다.

먼저, 4300 nM(10 IU) 헤파린의 존재하에서 트롬빈, PtPA 및 OsPA의 작용에 의한 혈장 성분에 잔존하는 트롬빈의 농도를 측정하였고 도 32에 나타난다(S-2238 가수분해에 대한 A₄₀₅의 변화 / y-축 상의 분은 트롬빈 농도에 비례한다). 135 nM 트롬빈은 혈장 샘플을 완전히 응고하는데 실패하였고, 단지 작은 2-3mm "솜털-유사" 혈전이 관찰되었다. 6.1 nM 농도의 두 프로트롬빈 활성제들이 대략 1분 후 4300 nM(10 IU)의 헤파린을 함유하는 샘플을 응고하였고 실온에서 24시간 저장 후에도 잠복성 응고가 관찰되지 않았다.

반응이 상이한 헤파린 농도들과 유사한 성질인지를 조사하였다. 정상 참가자들의 혈장이 불충분했었기 때문에, 정상 모인 시트레이트 처리된 혈장을 응고 연구소, 병리학 퀸스랜드, 프린세스 알렉산드라 병원(Coagulation Laboratory, Pathology Queensland, Princess Alexandra Hospital)으로부터 얻었다. 결과들은 도 33(PtPA) 및 도 34(OsPA)에 나타난다.

혈청에서 활성이 있는 1.5 nM PtPA 및 OsPA 농도에 의해 생성된 트롬빈의 양을 추정하였고 표 22에 나타난다.

표 22: 표준 곡선 회귀방정식으로부터 측정된 1.5 nM의 PtPA 및 OsPA에 의해 생성된 혈청에 존재하는 활성 트롬빈의 추정, 도 27.

[ 프로트롬빈 활성제]( nM )	헤파린 nM( IU )/ mL	초당 5분에서 기울기	활성 트롬빈의 추정 농도( nM )
PtPA
1.5	0	0.0007	443
1.5	860(2)	0.00018	159
1.5	4300(10)	0.00024	197
1.5	8600(20)	0.00024	197
OsPA
1.5	0	0.0006	394
1.5	860(2)	0.0002	172
1.5	4300(10)	0.00022	185
1.5	8600(20)	0.00020	172

860 및 4300 nM(2 및 10 IU) 헤파린을 함유하는 샘플들은 2분 내에 응고되었고 잠복성 응고를 나타내지 않았다. 혈전은 단단하였으나 헤파린을 함유하지 않은 샘플들에서 관찰된 것들처럼 단단하지 않았다. 860 nM(2 IU) 헤파린-함유 샘플은 헤파린을 함유하지 않는 혈장 샘플들의 약 25%인 트롬빈 활성을 제공하였다. 반대로, 8600 nM(20 IU) 헤파린을 함유하는 샘플은 3분 내에 "젤리-유사" 혈전(트롬빈-함유 샘플들에 형성된 혈전들과 더욱 유사)을 만들었고 그런 후에 샘플은 5분 내에 잠복성 응고를 나타내었다. 도 33 및 34에서, 더 높은 헤파린 농도에서 진행 곡선의 모양에 대한 원인은 알려져 있지 않다.

실시예 3h: 정상 모인 시트레이트 처리된 혈장을 사용하는 BD RST 튜브에 의해 생성된 트롬빈의 양의 추정 및 헤파린의 효과

이 실험의 목적은 상이한 부피들의 혈장으로 채워진 BD RST 튜브에서 활성 형태로 생성되어 존재하는 트롬빈의 양의 추정을 제공하는 것이다. 또한 BD RST 튜브들의 응고 능력에 대한 헤파린의 효과를 연구하였다.

정상 모인 시트레이트 처리된 혈장(< 24시간)을 응고 연구소, 병리학 퀸스랜드, 프린세스 알렉산드라 병원으로부터 얻었다.

표준 곡선의 경우, BD RST 튜브들은 1, 2, 3 및 4 mL의 시트레이트 처리된 혈장 및 50 μL의 0.5 M CaCl₂를 함유하였다. 튜브를 8-10회 뒤집어서 혼합하고 5분 동안 배양하였다. 혈전을 2개의 목면봉을 사용하여 둥글게 만들어, 제거하여 버렸다.

분광광도계 큐벳은 930 μL의 버퍼, 50 μL의 S-2238 및 혈전이 상기 각 BD RST 튜브로부터 제거된 후 잔존하는 20 μL의 깨끗한 혈청을 함유하였다. 흡광도 변화는 5분 동안 405 nm에서 관찰되었고 결과는 도 35에 나타난다. 트롬빈 농도는 도 16의 표준 곡선을 사용하여 기울기들로부터 추정하였고 도 35의 기울기에 대해 그래프로 나타내었다. 4개의 샘플의 혈전 제거 혈청에서 최초 BD RST 튜브 트롬빈 농도 및 잔존하는 트롬빈 농도는 다음과 같았다: 135 vs 4.3; 67.5 vs 1.4; 45 vs 0.5; 및 33.8 vs 0.3 nM. 트롬빈은 혈전 피브린에 결합될 것이기 때문에 대부분의 트롬빈은 혈전 제거 동안 제거될 것이다.

실시예 3g에 기술된 순수한 트롬빈을 가진 샘플들과 달리, BD RST 튜브들의 각각에 있는 각 샘플은 1분 내에 응고되었고 잠복성 응고가 관찰되지 않았다. 그러나, 각 샘플의 혈전 강도는 실시예 3g에 기술된 PtPA 또는 OsPA에 의해 관찰된 것들보다 훨씬 더 약했다.

상이한 부피의 시트레이트 처리된 혈장 및 상이한 헤파린 농도를 함유하는 샘플들의 경우, 흡광도 변화는 5분 동안 405 nm에서 관찰되었고, 결과는 도 37에 나타난다. 더 높은 헤파린 농도에서 진행 곡선의 모양에 대한 원인은 알려져 있지 않다.

3개 헤파린 농도 중 하나의 존재하에서 완전한 응고를 일으키는 샘플들이 없었다. 비록 혈전은 헤파린의 부존재하에서 단단한 혈전들과 비교하여 부드럽지만, 가장 강한 혈전은 830 nM(2 IU) 헤파린 및 1 mL의 혈장을 함유하는 샘플들에 의해 관찰되었다. 형성된 가장 약한 혈전들은 4 mL의 혈장으로 채워지고 8600 nM(20 IU) 헤파린을 함유하는 튜브에 있는 것들이었다. 혈전은 "솜사탕"과 유사하였고 샘플의 단지 일부이었다. 헤파린을 함유하는 모든 튜브들은 5분 후에 일부 잠복성 응고를 나타내었다. 4300 및 8600 nM(10 및 20 IU) 헤파린에 의한 실제 곡선 모양은 PtPA 및 OsPA에 의해 관찰된 곡선들과 매우 유사하였다.

상이한 헤파린 농도 및 상이한 트롬빈 농도의 존재하에서 기울기 및 활성 트롬빈의 추정이 표 23에 나타난다.

표 23: 도 36의 표준 곡선으로부터의 회귀 방정식을 사용하여, BD RST 튜브들로부터의 상이한 농도의 헤파린 및 상이한 농도의 트롬빈의 존재하에서 활성 트롬빈의 추정.

[헤파린] ( IU ) [ nM ]	mL 당 [ BD RST 트롬빈 ] mL( nM )	기울기	추정된 [활성 BDRST 트롬빈]( nM )	헤파린의 존재하에서 감소의 비율( 컬럼 2/ 컬럼 4)
2 [830 nM]	135	0.00050	30	4.5
2 [830 nM]	33.8	0.00016	6	5.6
10 [2150 nM]	135	0.00050	30	4.5
10 [2150 nM]	33.8	0.00024	12	3.0
20 [8300 nM]	135	0.00042	25	5.4
20 [8300 nM]	33.8	0.00020	9	3.8

결과들은 동일한 명목 트롬빈 농도들(nominal thrombin concentrations)(컬럼 2)이 상이한 헤파린 농도의 존재하에서 유사한 활성 트롬빈 농도를 생산하였다는 것을 나타내었다. 응고 후 측정된 트롬빈 농도들은 명목 농도보다 수 배 더 낮았다.

실시예 4: 프로트롬빈 활성제들에 의한 건강한 참가자들의 전혈 샘플들의 응고

실시예 4a: 에카린에 의한 응고

이 실험을 위해, Echis carinatus 독으로부터 정제된 에카린을 시그마(카달로그 번호 EO 504-1VL; 배치 번호 128K 1536)로부터 구입하였다. 시트레이트 처리된 혈액(정상 응고 프로파일을 가진 3개 샘플의 풀)을 병리학 퀸스랜드, 프린세스 알렉산드라 병원(퀸스랜드, 호주)로부터 얻었다.

한 병의 에카린(50 units)을 100 μL의 H₂O에서 재구성하여 500 units/mL의 원료 농축액을 얻었다. 원료의 증류수 희석액들(1:100, 즉 5 units/mL; 1:1000, 즉 0.5 units/mL; 1:10000, 즉 0.05 units/mL)을 TEG 분석에서 사용하였다. 각 분석 혼합물은 310 μL 시트레이트 처리된 혈액, 20 μL 0.2 M CaCl₂, 및 10 μL 식염수(대조군) 또는 에카린 희석액으로 이루어졌다. 따라서, 분석 혼합물에서 에카린의 농도 범위는 0 내지 0.15 units/mL이었다. 모든 실험은 이중으로 실시하였다. 결과들은 표 24에 나타난다.

표 24: 에카린에 의한 재석회화된 시트레이트 처리된 혈액 샘플들의 응고에 대한 TEG 결과들

에카린(units / mL )	R(분)	TMA (분)	α( deg )	MA( mm )
대조군	6.95	26.45	52.65	65.60
0.0015	7.3	27.60	59.80	65.65
0.015	4.5	17.90	74.15	67.25
0.15	2.1	15.75	69.25	73.80

재석회화된 시트레이트 처리된 혈액에 에카린을 첨가하면 R-시간 및 TMA 모두에 농도 의존성 감소 및 MA의 적은 증가가 일어났다. 검사된 최고의 농도, 0.15 units/mL에서, 에카린은 R-시간을 6.95분으로부터 2.1분으로 감소시켰고 TMA를 26.45로부터 15.75분으로 감소시켰다. 검사된 에카린의 최저 농도, 0.0015 units/mL는 응고 시간 및 혈전 강도에 대해 현저한 영향을 미치지 못한 반면 0.015 units/mL의 농도의 에카린은 중간의 효과를 가졌다.

이런 결과들은 에카린은 임상 실험에서 분석물 측정을 위해 혈청을 빠르게 생산하는 효과적인 프로트롬빈 활성제일 것을 암시한다.

실시예 4b: 6개 프로트롬빈 활성제에 의한 정상 "모인" 재석회화된 시트레이트 처리된 혈액의 응고

실시예 1에 기술된 대로 제조된 에카린, 카린액타바아제-1, 카린액타바아제-2, PtPA, OsPA, 및 노테카린의 정제 제제들을 사용하였다.

6개 프로트롬빈 활성제, 트롬빈에 의한 그리고 BD RST 튜브들에서 (실시예 4a와 같이) 정상 모인 시트레이트 처리된 혈액의 응고는 실시예 4a에 기술된 대로, TEG에 의해 연구되었다.

결과들은 표 25에 제공된다.

표 25: 상이한 응혈원들에 의한 정상 "모인" 재석회화된 시트레이트 혈액에 대한 TEG 응고 연구.

응혈원( nM )	R(분)	MA(mm )	TMA (분)
에카린
32	1.2	60.5	18.2
9	2.2	61.6	20.1
3.2	3.4	59.0	21.6
0.9	6.5	59.5	29.7
카린액타바아제-1
50	3.3	69.1	21.7
32	4.6	68.5	27.1
9	6.2	63.9	31.4
3.2	7.4	64.9	30.3
카린액타바아제-2
50	1.8	64.9	19.9
32	2.1	68.2	20.0
9	3.3	67.8	19.7
3.2	4.6	68.0	23.6
OsPA
0.9	0.7	63.7	18.4
0.09	2.9	61.8	20.5
0.009	4.2	63.5	22.5
0.0009	6.2	59.3	24.8
PtPA
0.9	1.5	62.4	22.1
0.09	2.6	63.1	23.6
0.009	3.9	63.9	24.8
0.0009	5.8	53.4	28.1
노테카린
3.2	1.2	62.1	20.2
0.9	1.8	63.7	18.3
0.09	3.7	63.2	20.3
0.009	7.3	59.0	26.3
트롬빈
32	2.3	65.2	22.8
9	3.5	64.0	23.8
3.2	5.5	62.4	27.6
BD RST
24	0.8	54.8	24.8
6	1.5	59.3	23.7

이 결과들은 모든 프로트롬빈 활성제가 매우 효과적으로 혈액을 응고하며; 그룹 C 프로트롬빈 활성제(PtPA 및 OsPA)가 정상 "모인" 재석회화된 시트레이트 처리된 전혈을 응고하는데 가장 효과적이었다는 혈장 응고 결론(실시예 3)에 대한 추가 지지를 제공하였다. 예를 들어, 9 pM PtPA 및 OsPA는 MA 결과들에 의해 확인된 대로 약 5분의 R 시간 및 최대 혈전 강도를 얻었다. 다음으로 가장 효과적인 프로트롬빈 활성제는 노테카린, 그룹 D 프로트롬빈 활성제이었고, 0.09 내지 0.009 nM의 최소 농도로 5분의 R 시간 및 최대 혈전 강도를 생산할 수 있었다. 비록 노테카린 자체는 FVa를 함유하지 않으나, 혈장에 존재하는 FV는 노테카린 FXa에 의해 형성된 소량의 트롬빈에 의해 활성 형태로 변환된다. 다음으로 가장 효과적인 프로트롬빈 활성제는 에카린, 그룹 A 프로트롬빈 활성제이었고, 0.9 내지 3.2 nM의 최소 농도로 원하는 R 시간 및 최대 혈전 강도를 생산할 수 있었다. 최저 효과적인 프로트롬빈 활성제는 <5분의 R 시간 및 최대 혈전 강도를 얻기 위해 각각 ≥9 내지 ≥3 nM 농도를 필요로 하는 그룹 B 프로트롬빈 활성제, 카린액타바아제-1 및 카린액타바아제-2이었다. 원하는 R 시간 및 최대 혈전 강도를 얻기 위해 필요한 최소 트롬빈 농도는 ≥3 nM이었다.

실시예 4c: 구입가능한 혈청 튜브 및 PtPA -함유 튜브의 비교

건강한 참가자의 혈액을 인슐린 버터플라이 바늘을 사용하여 다음 튜브 속으로 연속적으로 뽑았다:

(1) 4.0 mL 그레이너 배큐엣(상표명) 무첨가제 튜브;

(3) 그레이너 베큐엣(상표명) 혈청 튜브;

(4) BD 베큐테이너(상표명) 혈청 튜브;

(5) 사르스테트 혈청 튜브;

(6) 테루모 RT 튜브; 및

(7) 테루모 플레인 튜브.

튜브에 필요한 충전 표시까지 새로 수집한 혈액을 채우고 부드럽게 8-10회 뒤집어서 30초 동안 즉시 혼합하였다. 그런 후에 340 μL 샘플을 즉시 분석을 위해 TEG 컵 속에 옮겼다. 이런 방법의 혈액 수집은 시판중인 튜브에서 혼합한 직후 TEG 분석을 위한 혈액 샘플의 빠른 옮김을 가능하게 하여서 TEG 분석에서 항응고제 또는 재석회화를 필요로 하지 않는다. 플레인 튜브(1)로부터의 분취량, 330 μL의 혈액을 TEG 컵에 즉시 옮겼고 10 μL(1.41 ㎍)의 PtPA를 첨가하고(2) 분석을 즉시 시작하였다.

모든 TEG 분석을 이중으로 실시하였다. TEG 변수들(이중 샘플의 평균)은 아래 표 26에 나타난다.

표 26: 상이한 튜브들에서 건강한 참가자의 혈액에 대한 결과

샘플	R(분)	TMA (분)	α( deg )	MA( mm )
(1) 플레인 튜브	14.3	46.5	26.9	49.8
(2) PtPA	0.8	12.2	70.8	54.9
(3) 그레이너	3.0	23.5	71.2	68.2
(4) BD 혈청	4.9	25.3	71.0	68.1
(5) 사르스테트	5.1	23.8	70.8	69.1
(6) 테루모 RT	9.6	22.5	63.2	58.1
(7) 테루모	13.4	31.2	38.2	54.6

표 26의 TEG 변수들은 도 38의 TEG 그래프에 나타나며 트레이스 A는 보통 플라스틱 튜브(1)를 나타내며; 트레이스 B는 PtPA가 첨가된 플레인 튜브(2)를 나타내며; 트레이스 C는 그레이너 혈청 튜브(3)를 나타내며; 트레이스 D는 BD 혈청 튜브(4)를 나타내며; 트레이스 E는 사르스테트 혈청 튜브(5)를 나타내며; 트레이스 F는 테루모 RT 튜브(6)를 나타내며; 트레이스 G는 테루모 혈청 튜브(7)를 나타낸다.

PtPA 튜브(2)에 있는 혈액 샘플은 TEG 컵에서 가장 빠르게 응고되었다(R 시간 = 0.8분). 시판중인 튜브(3)-(7)에 대한 R 시간은 그레이너 튜브(3)의 대한 3.0분으로부터 테루모 튜브(7)에 대한 13.4분으로 변했다. 이런 R 시간들은 플레인 튜브(1)에 대한 14.3분의 R 시간과 비교될 수 있다. 시판중인 튜브들 사이의 R 시간 차이는 상이한 응혈원들 및 첨가제들의 존재 및/또는 이런 튜브들에서 상이한 양의 응혈원들 또는 첨가제들을 나타낸다고 생각된다.

또한 모든 튜브에서 혈전 형성을 눈으로 관찰하였다. 시판중인 튜브들은 30분의 표준 시간 동안 응고되게 하였다. PtPA 표본을 5분 동안 방치하였다. 튜브들을 원심분리기에 넣기 전에 혈전 형성에 대해 눈으로 검사하였다. 모든 튜브들을 20℃에서 10분 동안 3000g로 원심분리하였다. 표본들을 실온, ~21℃에서 6시간까지 저장하였고 잠복성 혈전 형성에 대해 시간 간격으로 검사하였다. PtPA-함유 튜브를 포함하는 모든 튜브들은 단단한 혈전들을 형성하였고, PtPA-함유 튜브는 2분 내에 단단한 부동의 혈전을 형성하였다. 수집 후 6시간까지 튜브들 중 어느 곳에서도 잠복성 응고는 관찰되지 않았다.

이 실시예는 소량의 PtPA의 함유가 검사된 시판중인 튜브들 중 어느 것에서보다 더 빠른 응고를 유도하여, 임상 실험에서 분석물 측정을 위한 더 빠른 턴-어라운드 시간(turn-around time)을 제공하기 위한 혈청의 빠른 생산에 대한 가능성을 증명하였다는 것을 나타낸다.

실시예 4d: PtPA , OsPA , 에카린 , 및 일부 시판중인 튜브들에 의한 정상 시트레이트 처리된 혈액의 응고

이런 실험의 목적은 3개의 프로트롬빈 활성제: PtPA, OsPA, 및 에카린을 3개의 일상적으로 사용된 시판중인 응고 튜브: 그레이너 혈청, BD SST II 및 BD RST와 어떻게 비교할지를 연구하는 것이었다.

건강한 참가자의 혈액을 시트레이트-함유 튜브 속에 수집하였다.

프로트롬빈 활성제들의 경우, 30 μL의 활성제(PtPA 및 OsPA 0.56 nM의 농도; TEG 컵 속 에카린 5.3 nM), 20 μL의 0.2 M CaCl₂ 및 290 μL의 시트레이트 처리된 혈액을 TEG 컵에 첨가하였다.

시판중인 혈청 튜브들의 경우, 1 mL의 증류수를 첨가하고 ~2시간 동안 롤러에서 혼합하여 튜브의 내용물을 용해하였다. BD RST는 135 nM 소 트롬빈(33.8 nM/mL의 혈액)을 함유하는 반면, TEG 컵에서 이 실험에 사용된 농도는 53 nM/mL이었다. 시판중인 혈청 튜브의 경우 45 μL의 용해된 내용물, 20 μL의 0.2 M CaCl₂ 및 275 μL의 시트레이트 처리된 혈액을 TEG 컵에 첨가하였다.

결과들은 표 27에 나타난다.

표 27: 건강한 참가자의 천연 혈액을 가진 PtPA, OsPA, 에카린, 및 일상적으로 사용된 시판중인 혈청 튜브들에 대한 TEG 데이터.

튜브	튜브 카달로그 #	R 시간(분)	MA	TMA
그레이너 배큐엣 혈청	455078	2.8	62.5	20.6
BD SST II	367958	4.3	62.8	23.5
BD RST(18 nM)	368771	0.5	58.8	20.2
PtPA(0.53 nM)		1.4	65.6	19.8
OsPA(0.53 nM)		1.5	64.0	19.7
에카린(5.3 nM)		2.6	64.3	19.3
천연 혈액(플레인 튜브)		6.4	67.6	27.8

결과들은 일상적으로 사용된 시판중인 튜브들은 현저한 혈전 형성이 TEG(R 시간)에 의해 탐지된 시간이 변하며, 시간은 건강한 참가자의 재석회화된 시트레이트 처리된 혈액에 대해 0.5-6.4분 범위인 것을 증명하였다. 이런 튜브들의 제조사들은 혈청 튜브들의 원심분리 전에 30분의 최소 응고 시간을 권장하였다. 결과들은 또한 0.5 M의 PtPA 및 OsPA가 <2분의 R 시간을 제공하며 혈청을 빠르게 생산하는데 사용될 응혈원으로서 평가에 매우 적절하게 만들는 동일한 혈전 강도를 가진다는 것을 증명하였다.

실시예 5: 프로트롬빈 활성제들에 의한 항응고제들을 함유하는 전혈 샘플들의 응고

여러 혈액 샘플을 헤파린, 와파린 및 시트레이트와 같은 항응고제로 처리된 환자들로부터 채취한다. 또한, 일부 혈액 샘플을 EDTA 및 시트레이트와 같은 항응고제들을 함유하는 튜브들 속에 수집하거나 수집 과정 동안 항응고제들로 오염시킨다. 다음 실험들을 실행하여 프로트롬빈 활성제들에 의한 항응고제들을 함유하는 혈액 샘플들의 응고를 연구하였다.

실시예 5a: 건강한 참가자의 시트레이트처리 또는 EDTA 처리된 혈액의 농도 의존성 응고

TEG 분석을 실행하였고 각 TEG 분석 혼합물은 310 μL의 시트레이트처리 또는 EDTA 처리된 혈액, 20 μL의 CaCl₂(0.2 M) 및 10 μL 식염수 또는 농도 범위(원료 용액 - PtPA, 4.8 mg/mL 또는 OsPA, 2.0 mg/mL)의 프로트롬빈 활성제 용액으로 이루어졌다. 결과들은 PtPA에 대해 도 39 및 표 28와 29 또는 OsPA에 대해 표 30과 31에 나타난다.

표 28: PtPA에 의한 정상 시트레이트 처리된 혈액의 응고에 대한 TEG 결과

PtPA(㎍/ mL )	R(분)	TMA (분)	α( deg )	MA( mm )
0	10.9	40.4	23.8	55.2
0.00141	10.3	39.6	26.2	44.0
0.0141	4.6	22.8	54.0	67.2
0.141	3.8	23.5	67.7	67.0
1.41	1.0	21.2	72.4	64.8
14.1	0.3	20.2	74.7	59.7

표 29: PtPA에 의한 재석회화된 EDTA -처리된 혈액의 응고에 대한 TEG 결과

PtPA(㎍/ mL )	R(분)	TMA (분)	α( deg )	MA( mm )
0	9.8	39.2	25.8	54.6
0.00141	9.1	31.5	34.9	60.9
0.0141	6.8	27.0	62.4	64.4
0.141	5.5	25.3	62.0	64.4
1.41	1.3	19.8	72.1	66.3
14.1	0.3	21.2	70.1	60.9

표 30: OsPA에 의한 정상 시트레이트 처리된 혈액의 응고에 대한 TEG 결과

OsPA(㎍/ mL )	R(분)	TMA (분)	α( deg )	MA( mm )
0	9.0	31.3	29.5	55.0
0.000588	9.0	24.0	34.2	49.0
0.00588	5.9	21.3	54.3	62.0
0.0588	2.8	15.3	65.9	54.8
0.588	0.8	17.9	73.6	64.2
5.88	0.3	19.8	72.3	58.2

표 31: OsPA에 의한 재석회화된 EDTA -처리된 혈액의 응고에 대한 TEG 결과

OsPA(㎍/ mL )	R(분)	TMA (분)	α( deg )	MA( mm )
0	13.9	40.8	31.2	50.7
0.000588	16.3	45.4	29.8	53.7
0.00588	9.8	30.0	36.2	62.4
0.0588	3.3	18.3	64.3	70.7
0.588	0.8	17.0	73.1	64.0
5.88	0.3	20.8	77.0	61.1

프로트롬빈 활성제의 첨가 없는 재석회화된 혈액의 R 시간은 대략 10분이었고 1.41 ㎍/mL PtPA의 존재하에서 1분 또는 1.3분으로 감소하였다(표 28 및 29). 응고의 속도는 빨랐고(각도 = 54-72^o)(0.0141 내지 1.41) 60-70 mm의 MA 값을 가진 최대 강도 혈전들을 얻었다. 대략 10분의 프로트롬빈 활성제의 첨가 없는 재석회화된 혈액의 R 시간은 0.59 ㎍/mL OsPA의 존재하에서 0.8분으로 감소하였다(표 30 및 31).

PtPA 또는 OsPA의 첨가에 의해 관찰된 매우 짧은 R-시간 및 큰 α는 트롬빈의 다량의 분출의 생성에 의해 설명될 수 있으며, 하류 반응(피브로노겐의 피브린으로의 변환, 인자 XIII의 활성화, 피브린 모노머들의 가교)은 속도 제한적이며 비교적으로 TMA의 더 작은 개선을 초래한다고 생각된다.

표 28, 29, 30 및 31로부터의 TEG 결과들은 도 39에 나타나며, TEG 그래프 A는 표 28 결과(시트레이트 처리된 혈액 및 PtPA)를 나타내며; TEG 그래프 B는 표 29결과(EDTA 처리된 혈액 및 PtPA)를 나타내며; TEG 그래프 C는 표 30 결과(시트레이트 처리된 혈액 및 OsPA)를 나타내며 TEG 그래프 D는 표 31 결과(EDTA 처리된 혈액 및 OsPA)를 나타낸다.

도 39에서, 각 TEG 그래프에서 A로 표시한 트레이스들은 PtPA에 대해 14.1 ㎍/mL 및 OsPA에 대해 5.88 ㎍/mL를 나타내며; B로 표시한 트레이스들은 PtPA에 대해 1.41 ㎍/mL 및 OsPA에 대해 0.588 ㎍/mL를 나타내며; C로 표시한 트레이스들은 PtPA에 대해 0.141 ㎍/mL 및 OsPA에 대해 0.0588 ㎍/mL를 나타내며; D로 표시한 트레이스들은 PtPA에 대해 0.0141 ㎍/mL 및 OsPA에 대해 0.00588 ㎍/mL를 나타내며; E로 표시한 트레이스들은 PtPA에 대해 0.00141 ㎍/mL 및 OsPA에 대해 0.000588 ㎍/mL를 나타내며; F로 표시한 트레이스들은 PtPA에 대해 0 ㎍/mL 또는 OsPA에 대해 0 ㎍/mL를 나타낸다.

요약하면, PtPA 및 OsPA 모두는 매우 효과적인 농도-의존 방식으로 재석회화된 시트레이트처리 및 EDTA-처리된 혈액을 응고시킨다. 따라서 실제로, EDTA 튜브에 수집된 혈액은 생화학적 및 다른 실험 분석을 위해 PtPA 또는 OsPA를 첨가함으로써 빠르게 응고되어 혈청을 생산할 수 있다.

실시예 5b: 건강한 참가자로부터 얻은 EDTA 혈장 및 혈액의 응고

상기 실시예 3d에서 언급한 대로, 생물학적 분석을 위해 제공받은 작지만 상당한 비율의 샘플들(혈청 또는 리튬 헤파린 혈장 샘플들)은 EDTA에 의해 오염된다. 따라서 프로트롬빈 활성제들이 EDTA 혈장 및 EDTA 전혈을 응고하는데 효과적인지를 측정하는 것이 중요하다. 이 실험의 목적은 이를 측정하는 것이었고, EDTA 혈장과 EDTA 전혈을 비교하는 것이었다.

건강한 환자의 혈액을 충전 표시까지 채워질 때 1.8 mg/mL(6.2 mmol) EDTA를 함유하는 그레이너 EDTA 튜브 속에 수집하였다. 이 농도에서, EDTA는 튜브에 존재하는 모든 금속 이온들(Ca^{2 +}, Mg^{2 +}, Fe^{2 +}, Zn^{2 +}, 및 Cu^{2 +}포함)과 결합할 수 있다. EDTA 혈장을 얻기 위해, 각 샘플의 일부를 표준 프로토콜하에서 원심분리하였다.

클로텍 튜브는 100 μL의 EDTA 혈장, 100 μL의 Tris 버퍼(150 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4), 50 μL의 0.2 M CaCl₂ 또는 Tris 버퍼 및 50 μL의 각 응혈원을 함유하였다.

TEG 컵은 20 μL의 0.2 M CaCl₂ 또는 식염수, 60 μL의 응혈원 및 260 μL의 EDTA 혈액을 함유하였다.

BD RST 실험의 경우 2개 튜브의 내용물을 각각 1 및 4 mL의 증류수에 용해하고, 5분 동안 혼합하고 60 μL의 내용물을 응혈원으로서 TEG 컵에 사용하였다.

혈장 응고 연구의 결과들은 표 32 및 표 33에 나타난다.

표 32: 칼슘이 있는, 상이한 농도의 상이한 응혈원(프로트롬빈 활성제들 및 트롬빈)에 의한 건강한 참가자로부터 얻은 EDTA 혈장에 대한 응고 시간.

[ 응혈원 ]( nM )	Ca 2 + 이 있음(초)
	에카린	CA -1	CA -2	PtPA	OsPA	노테카린	트롬빈
50	68.9	165.4	82.5	6.5	10.0	85.5	12.7
10	127	232	101	13.5	15.8	117	43.0
1	224	>300	151	35.7	42.7	206	>300
0.1	ND	ND	ND	98.6	123	ND	>300

"ND"는 이것이 결정되지 않았다는 것을 의미한다.

표 33: 칼슘이 없는, 상이한 농도의 상이한 응혈원(프로트롬빈 활성제들 및 트롬빈)에 의한 건강한 참가자로부터 얻은 EDTA 혈장에 대한 응고 시간.

[ 응혈원 ]( nM )	Ca 2 + 이 없음(초)
	에카린	CA -1	CA -2	PtPA	OsPA	노테카린	트롬빈
50	>300	>300	>300	31.7	56.4	132	17.9
10	>300			48.7	68.2	242	53.2
1	>300			86.4	107	>300	>300
0.1				190	251		>300

BD RST 혈장 응고 연구의 결과들은 표 34에 나타난다.

표 34: 칼슘이 있고 없는 BD RST 튜브에 대한 응고 시간.

BDRST 튜브( nM )	Ca 2 + 이 있음(초)	Ca 2 + 이 없음(초)
1 mL(23)	12.3	44.9
4 mL(6)	34.3	101

EDTA는 칼슘과 킬레이트화하여 정상 응고 과정이 일어나는 것을 방해하는 금속 킬레이터이다.

이런 결과들은 칼슘-의존성 프로트롬빈 활성제들이 나중 재석회화할 수 있었지만, 칼슘-의존성 프로트롬빈 활성제들인 카린액타바아제-1(CA-1) 및 카린액타바아제-2(CA-2)는 < 5 분의 필수 시간에 50 nM 농도에서도 EDTA 혈장을 응고하지 않는다는 것을 나타낸다. 에카린에 대한 효과는 현저하였다: 재석회화없이 응고 시간은 5분 초과이었다. 과량의 칼슘 첨가는 PtPA 및 OsPA에 의해 응고 시간에 단지 적당한 감소를 일으켰다(예를 들어, 0.1 nM PtPA, 190초 내지 98.6초). 비록 본 발명 기술된 다른 실시예들은 노테카린이 PtPA 및 OsPA보다 응혈원으로서 덜 효과적이라고 주장했지만, 결과들은 칼슘의 부존재하에서 최소로 영향을 받은 것은 프로트롬빈 활성제이었다는 것을 나타내었다. 과량의 칼슘 첨가는 트롬빈에 의한 혈장의 응고에 3배 증가를 일으켰다.

전혈 응고 연구로부터의 결과들은 표 35에 나타난다.

표 35: 칼슘의 존재 및 부존재하에서 EDTA 혈액에 대한 다른 응혈원들의 효과를 나타내는 TEG 결과.

응혈원( nM )	R(분)	MA(mm )	TMA (분)
에카린
53(재석회화됨)	2.5	56.8	22.1
53(재석회화되지 않음)	16.9*	ND	ND
카린액타바아제 - 1
53(재석회화됨)	4.8	57.6	29.5
53(재석회화되지 않음)	16.9*	ND	ND
카린액타바아제 - 2
53(재석회화됨)	2.6	55.7	25.6
53(재석회화되지 않음)	34.8*	ND	ND
OsPA
53(재석회화됨)	1.6	41.5	21.6
53(재석회화되지 않음)	17.7*	ND	ND
PtPA
53(재석회화됨)	0.5	58.2	22.9
53(재석회화되지 않음)	17.8*	ND	ND
1(재석회화됨)	1.6	64.0	22.9
PtPA
690 nM(Run 1)(재석회화되지 않음)	50.1*	ND	ND
690 nM(Run 2)(재석회화되지 않음)	50.3*	ND	ND
노테카린
53(재석회화됨)	1.9	54.2	25.8
53(재석회화되지 않음)	17.2*	ND	ND
트롬빈
53(재석회화됨)	2.6	49.9	31.5
53(재석회화되지 않음)	45.4*	ND	ND
BD RST
23(재석회화됨)	1.6	45.4	24.0
23(재석회화됨)	1.8	57.7	28.3
6(재석회화됨)	30.1*	ND	ND
6(재석회화됨)	32.5*	ND	ND
재석회화된 EDTA 혈액 단독
Run 1	11.2	58.5	40.8
Run 2	10.6	56.7	38.5

^*는 측정이 종료되었다는 것을 의미하고 ND는 이것이 결정되지 않았다는 것을 의미한다.

이 실험은 EDTA 전혈은 응혈원들에게 어려운 도전을 제공한다는 것을 나타내었다. EDTA 혈장과 달리, 응혈원들 중 어떤 것도 재석회화없이 EDTA 혈액을 응고할 수 없었다. 응고는 매우 높은 PtPA농도(690 nM)에 의해서도 성취되지 않았다. 그러나, 모든 응혈원들은 EDTA 혈액이 재석회화될 때 이를 응고할 수 있었다. 빠르고 완전한 응고는 매우 낮은 PtPA 농도(1 nM)에 의해서도 성취될 수 있었다. EDTA는 세포 형태를 보존하기 위한 특별한 항응고제이며 칼슘을 킬레이트화함으로써 EDTA 또한 혈소판 활성화 및 혈소판 엉킴을 방해한다.

30 nM PtPA를 사용하는 두 추가 혈장 응고 실험을 실행하였다. 첫 번째 실험에서, Tris 버퍼 대신에 물을 클로텍 튜브에 첨가하였고 샘플은 여전히 6.4초 후 응고하였다. 두 번째 실험에서, 버퍼를 사용하지 않았고, 단지 200 μL EDTA와 50 μL PtPA를 사용하였고 응고 시간은 5.4초이었다. TGE 연구의 경우, 50 μL Tris 버퍼, 60 μL PtPA, 230 μL EDTA 혈액을 TEG 컵에 첨가하였고 여전히 응고는 관찰되지 않았다. 또한, BD RST 튜브에 EDTA 혈액으로 충전 표시까지 채웠고 60분 후 매우 부분적인 응고를 나타내었다. 이런 실험들로부터 EDTA가 존재할 때마다, 응혈원에 대한 칼슘의 첨가는 응고를 성취하기 위해서 고려돼야 한다는 것이 명백하다.

실시예 5c: 와파린 -처리된 참가자들의 혈액의 응고

두 참가자("W1" 및 "W2")의 혈액 샘플들의 응고에 대한 PtPA 및 OsPA의 효과를 측정하였다.

표준 응고 프로토콜에 의해 측정한 각 참가자의 응고 변수들은 표 36에 나타나며:

aPTT = 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간;

PT = 프로트롬빈 시간;

INR = 국제정상화비율; 및

Fib-D = 프로트롬빈 시간 유도 피브리노겐(prothrombin time derived fibrinogen).

표 36: 항응고제 치료를 받은 참여자들에 대한 응고 변수들

참여자	aPTT( s)	PT( s)	INR	Fib -D(g/L)
W1	30.27	21.3	2.08	1.55
W2	36.15	27.4	2.61	5.20
정상 혈장	30-32	10-11	1.0	2.5-4.0

표 36의 결과들은 참여자 W1 및 W2의 혈액은 예상대로 응고가 방지되었다는 것을 확인시킨다.

그 후에 TEG 분석을 실행하였다. 각 TEG 분석 혼합물은 310 μL의 시트레이트 처리된 혈액, 20 μL의 CaCl₂(0.2 M) 및 10 μL 식염수 또는 0 내지 14.1 ㎍/mL의 프로트롬빈 활성제의 최종 분석 농도들 생성하는 프로트롬빈 활성제(PtPA 또는 OsPA)의 용액으로 이루어졌다.

TEG 결과들은 아래 37, 38 및 39에 나타난다. 값들은 도 40 및 41에 나타낸 대로 TEG 데이터로부터 유도된다.

표 37: OsPA에 의한 W1의 시트레이트 처리된 혈액의 응고에 대한 TEG 결과

OsPA(㎍/ mL )	R(분)	TMA (분)	α( deg )	MA( mm )
0	12.2	35.5	23.6	50.4
0.0588	4.4	22.9	68.1	59.5
0.588	1.6	16.7	73.8	60.8
5.88	0.6	17.8	67.5	53.0

표 38: PtPA에 의한 W1의 시트레이트 처리된 혈액의 응고에 대한 TEG 결과

PtPA(㎍/ mL )	R(분)	TMA (분)	α( deg )	MA( mm )
0	12.2	35.5	23.6	50.4
0.0141	9.4	31.5	48.4	54.3
1.41	0.8	18.8	69.7	59.6
14.1	0.4	20.6	65.1	53.1

표 39: PtPA에 의한 W2의 시트레이트 처리된 혈액의 응고에 대한 TEG 결과

PtPA(㎍/ mL )	R(분)	TMA (분)	α( deg )	MA( mm )
0	12.3	37.6	49.1	60.8
0.0141	7.7	26.1	62.9	66.4
1.41	1.3	17.9	77.7	73.3
14.1	0.4	18.4	79.6	69.4

표 37 및 38의 결과들의 TEG 그래프들은 도 40에 제공되며 TEG 그래프 A는 표 37(OsPA)로부터의 결과들을 나타내며 TEG 그래프 B는 표 38(PtPA)로부터의 결과들을 나타낸다. 도 40에서, A 그래프의 경우 (i)로 표시된 트레이스는 5.88 ㎍/mL OsPA에 대한 결과를 나타내며, (ii)로 표시된 트레이스는 0.588 ㎍/mL OsPA에 대한 결과를 나타내며, (iii)로 표시된 트레이스는 0.0588 ㎍/mL OsPA에 대한 결과를 나타내며, (iv)로 표시된 트레이스는 0 ㎍/mL에 대한 결과를 나타낸다. 도 40에서, B 그래프의 경우 (i)로 표시된 트레이스는 14.1 ㎍/mL PtPA에 대한 결과를 나타내며, (ii)로 표시된 트레이스는 1.41 ㎍/mL PtPA에 대한 결과를 나타내며, (iii)로 표시된 선은 0.0141 ㎍/mL PtPA에 대한 결과를 나타내며, (iv)로 표시된 트레이스는 0 ㎍/mL에 대한 결과를 나타낸다.

도 41에서, (i)로 표시된 트레이스는 14.1 ㎍/mL PtPA에 대한 결과를 나타내며, (ii)로 표시된 트레이스는 1.41 ㎍/mL PtPA에 대한 결과를 나타내며, (iii)로 표시된 트레이스는 0.0141 ㎍/mL PtPA에 대한 결과를 나타내며, (iv)로 표시된 트레이스는 0 ㎍/mL에 대한 결과를 나타낸다.

요약하면, 낮은 농도의 PtPA 및 OsPA는 와파린 치료를 받은 참가자들의 혈액 샘플들을 빠르게 응고하였고, R 시간, α값 및 MA 값은 건강한 참가자의 혈액에 의한 필적하는 실험들의 값들과 유사하다(상기 표 28-31 참조). 이런 결과들은 실시예 3c에서 와파린 혈장에 대한 관찰을 확인시킨다.

실시예 5d: PtPA 및 OsPA 에 의한 높은 복용량 헤파린 처리된 참가자의 혈액의 응고

혈액 샘플을 채취하기 전에 30분 동안 35,000 IU의 헤파린을 투여받은 참가자("H1")로부터 혈액을 채취하였다. 헤파린의 농도는 대략 7 IU/mL의 혈액이 될 것으로 계산하였다. 혈액을 보통 주사기에 수집한 후 그레이터 배규엣(상표명) 시트레이트 튜브에 옮겼다.

참가자의 응고 변수들을 측정하였고 표 40에 나타난다.

표 40: 헤파린 처리된 참가자에 대한 응고 변수들.

참가자	aPTT (s)	PT (s)	INR	TT (s)	PTNH (s)	REPT (s)	Fib -D(g/L)
H1	실패	41.2	3.75	실패	17.75	15.28	2.40

표 40의 모든 응고 변수들은 당업계에 공지되어 있으며, aPTT = 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간; PT = 프로트롬빈 시간; INR = 국제정상화비율; TT = 트롬빈 시간; PTNH = 프로타민 설페이트 시간; REPT = 렙틸라제 시간; 및 Fib-D = 프로트롬빈 시간 유도 피브리노겐.

표 40의 결과들은 강하게 헤파린 처리된 샘플에 대한 예상 결과들의 범위에 있다.

그 후에 TEG 분석을 실행하였다. 각 TEG 분석 혼합물은 310 μL의 시트레이트 처리된 혈액, 20 μL의 CaCl₂(0.2 M) 및 10 μL의 식염수 또는 프로트롬빈 활성제(PA)의 용액으로 이루어졌다.

TEG 결과들은 아래 표 41 및 도 42에 나타난다.

표 41: 매우 높은 복용량의 헤파린을 투여받은 참가자의 혈액의 응고에 대한 TEG 결과

PA	PA 농도 (㎍/ mL )	시트레이트처리
		R(분)	TMA (분)	α( deg )	MA( mm )
	0	n.c.	n.c.	n.c.	n.c.
PtPA	14.1	0.4	20.9	72.6	64.3
OsPA	5.9	1.3	12.8	70.6	61.3

상기 표 41에서, "n.c."는 응고가 없다는 것을 나타낸다.

표 41의 결과들의 TEG 트레이스들이 도 42에 제공되며 A로 표시된 트레이스는 프로트롬빈 활성제가 없는 것에 대한 결과를 나타내며; B로 표시된 트레이스는 14.1 ㎍/mL PtPA에 대한 결과를 나타내며; C로 표시된 트레이스는 5.9 ㎍/mL OsPA에 대한 결과를 나타낸다.

검사된 농도에서 PtPA 및 OsPA는 헤파린 처리된 참가자의 시트레이트 처리된 혈액을 빠르게 응고할 수 있었다. 관찰된 TEG 변수들에 대한 값들(R-시간,TMA, 각도, MA)은 건강한 참가자의 혈액으로부터 얻은 결과들에 필적하였고, 프로트롬빈 활성제들의 활성은 혈액 샘플에 존재하는 헤파린의 농도에 의해 억제되지 않았다는 것을 나타낸다.

실시예 5e: PtPA -함유 튜브 및 BD RST tube 에 의한 완전히 헤파린 처리된 참가자의 혈액의 응고.

10 mL 혈액 샘플을 샘플 수집 30분 전에 38,000 IU의 헤파린을 투여받은 심장 수술을 받고 있는 참가자로부터 수집하였다. 혈액을 보통 주사기로 수집하여 분석을 위해 실험실로 10분 내에 전달하였다.

BD RST 튜브를 충전 마크까지 채웠고 30분 동안 뒤집고/혼합하고 340 μL의 이 혈액을 채널 1에 있는 TEG 컵에 옮겼다.

330 μL의 최초 헤파린 처리된 참가자 혈액 샘플을 채널 2에 있는 TEG 컵에 10 μL의 PtPA(최종 농도 1.41 ㎍/mL)에 첨가하였다.

TEG 분석의 결과들은 표 42 및 도 43에 나타난다.

표 42: BD RST 튜브 및 PtPA를 가진 튜브에 있는 헤파린 처리된 혈액에 대한 TEG 분석 결과

샘플	R(분)	K(분)	각도( deg )	MA(mm )	TMA (분)
PtPA(외부 트레이스)	0.7	1.3	74.4	43.8	9.8
BD RST 튜브(내부 트레이스)	6.2	N/A	7.8	11.5	24.0

BD RST 튜브의 경우, R 시간은 6.2분이었고 11.5mm의 최대 진폭(MA)을 가지며, 단지 부분 응고가 달성되었다는 것을 나타낸다. 이 혈전 강도는 2시간의 분석 동안 추가로 증가하지 않았다.

PtPA를 가진 튜브의 경우, R 시간은 0.7분이었고 최대 진폭(MA)은 43.8mm이었고, 최대 진폭에 대한 시간은 9.8분이었고 강하고 안정한 혈전이 빠르게 형성되었다는 것을 나타낸다.

표 42로부터의 결과들은 TEG 그래프로서 도 43에 나타나며 트레이스 "A"는 채널 2(PtPA)에 있는 TEG 컵의 트레이스이며 트레이스 "B"는 채널 1(BD RST 튜브)에 있는 TEG 컵의 트레이스이다.

보통 주사기에 수집된 혈액 및 BD RST 튜브에 있는 혈액을 응고에 대해 눈으로 관찰하였다. 2일까지 보통 주사기에서 응고가 관찰되지 않았다. BD RST 튜브에 있는 혈액은 30분에 부분 응고를 나타내었고 24시간 내에 완전한 응고를 나타내었다.

요약하면, 강하게 헤파린 처리된 샘플은 PtPA를 함유하는 튜브에서 빠르고 완전하게 응고되나 BD RST 튜브에서는 단지 매우 느리고 불완전하게 응고되었다.

실시예 5f: 프로트롬빈 활성제들에 의한 헤파린 함유 혈액 샘플들의 응고

그레이너 리튬 헤파린 튜브(혈액의 mL 당 18 IU 헤파린)에 수집된 건강한 참가자의 혈액을 응고하는 독 프로트롬빈 활성제들의 능력을 TEG 분석을 사용하여 측정하였고 결과들은 표 43에 나타난다. MA 값들의 비교를 위해 시트레이트 샘플을 수집하였다.

표 43: 건강한 참가자로부터 그레이너 리튬 헤파린 튜브에 수집한 혈액에 대한 TEG 결과.

응혈원( nM )	R(분)	MA(mm )	TMA (분)
에카린
56(검은색)	9.9	18.8	37.8
32(녹색)	13.8	18.6	39.8
카린액타바아제 - 1
100(검은색)	35.6*	ND	ND
50(녹색)	34.8*	ND	ND
카린액타바아제 - 2
56(검은색)	10.4	23.0	37.8
34(녹색)	18.0	18.5	47.5
OsPA(nM )
56(심홍색)	1.9	37.6	24.7
34(분홍색)	2.3	36.5	26.1
9(녹색)	2.9	29.8	25.2
3(검은색)	10.3	6.2	20.0
PtPA
56(심홍색)	2.3	33.5	26.6
34(갈색)	2.3	39.8	27.2
9(녹색)	2.8	31.3	25.7
3(검은색)	6.8	14.7	25.8
노테카린
56(검은색)	2.5	34.1	30.7
32(녹색)	7.9	18.0	28.4
BD RST
25(검은색)	35.6*	ND	ND
6(녹색)	35.8*	ND	ND
재석회화된 시트레이트 혈액
Run 1	6.3	61.2	30.1
Run 2	6.5	61.5	27.1

^*는 측정이 종료되었다는 것을 의미하며 ND는 이것이 결정되지 않았다는 것을 의미한다.

리튬 헤파린 전혈에 의한 이런 실험의 결과들은 응혈원들의 일부가 더 낮은 응혈원 농도에서 헤파린 처리된 혈액을 응고할 수 있는 반면, 다른 응혈원들은 이 실험에서 검사된 최고 농도 범위에서도 혈액을 응고할 수 없었다는 것을 나타내었다. 결과들은 그룹 C 응혈원(PtPA 및 OsPA)이 5분 내에 R 시간을 달성하기 위해 OsPA 및 PtPA에 대해 ≥9 nM를 필요로 하는, 그레이너 리튬 헤파린 튜브에 수집된 혈액을 응고하는데 가장 효과적이었다. 이것은 재석회화된 시트레이트 처리된 혈액에서 달성한 MAs(~61)보다 현저하게 낮았다. 비록 이론에 한정될 것을 원하지 않으나, ATIII-헤파린 착물은 형성된 트롬빈을 억제하며 뒤이어 적절한 또는 더 강한 혈전 형성을 방해한다. 상이한 프로트롬빈 활성제들에 대해 필요한 최소 농도들은 에카린과 카린액타바아제-2에 대해 >56 nM, 카린액타바아제-1에 대해 >100 nM 및 노테카린에 대해 >32 nM이다. BD RST 튜브로부터 6 및 25 nM의 트롬빈 농도는 혈액을 전혀 응고하지 못했다.

다시, 이론에 한정될 것을 원하지 않으나, 트롬빈과 FXa를 억제하여 응고 과정을 억제하는 ATIII-헤파린 착물을 압도하기 위해, 그룹 C 프로트롬빈 활성제들(OsPA 및 PtPA)은 훨씬 더 크고 더 지속적인 분출의 트롬빈을 생산하였다고 생각된다.

실시예 5g: 상이한 농도의 헤파린이 첨가된 정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장의 응고

이 실험은 헤파린 처리된 환자들의 혈장에서 발견될 수 있는 수준을 모방하기 위해 상이한 농도의 헤파린이 첨가된 혈장을 응고하는 상이한 프로트롬빈 활성제들의 필요한 농도를 측정하도록 실행하였다.

정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장은 2.71 mmol/L로 조절된 전체 칼슘을 가지며 그런 후에 헤파린의 분취량이 첨가되어 환자 혈액 샘플들에서 발견할 수 있는 범위인 0.8, 2.0, 10 및 20 IU/mL의 클로텍 튜브에서 최종 헤파린 농도를 얻었다. 또한 시트레이트 처리된 혈장의 1 mL 분취량을 그레이너 리튬 헤파린 튜브들에 분산한 후 15분 동안 롤러에서 혼합하여 90 IU/mL의 리튬 헤파린 농도를 얻었다. 클로텍 튜브는 100 μL의 나트륨 또는 리튬 헤파린 혈장, 100 μL의 Tris 버퍼(150 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) 및 50 μL의 각 응혈원을 함유하였다.

헤파린 첨가 혈장 샘플들에 의한 각 프로트롬빈 활성제에 대한 응고 결과들은 표 44-49에 나타나며 트롬빈에 대한 응고 결과들은 표 50에 나타난다.

표 44: 헤파린이 첨가된 또는 그레이너 리튬 헤파린 튜브들에 분산된 정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장의 PtPA에 의한 응고

헤파린 ( IU / mL )	PtPA ( nM)/응고 시간(초)
	120 nM	60 nM	36 nM	30 nM	20 nM	12 nM
0	3.3	4.3	5.2	5.5	6.4	10.1
0.8	3.5	5.3	7.4	7.6	10.4	14.0
2.0	6.2	9.8	12.7	15.7	16.6	26.5
10	25.3	39.1	46.1	60.2	72.3	142
20	38.0	47.2	68.2	80.6	232	>300
90( 그레이너 Li 헤파린 튜브)	17.4	27.7	53.7	69.5	228	>300

표 45: 헤파린이 첨가된 또는 그레이너 리튬 헤파린 튜브들에 분산된 정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장의 OsPA에 의한 응고

헤파린 ( IU / mL )	OsPA ( nM )//응고 시간(초)
	120 nM	60 nM	36 nM	30 nM	20 nM	12 nM
0	6.9	7.2	8.3	8.6	8.9	9.4
0.8	9.1	10.8	12.9	13.7	16.4	21.7
2.0	13.8	15.2	17.6	19.1	22.6	27.9
10	27.3	35.2	49.2	56.5	86.1	270
20	93.9	120	>300	>300	>300	>300
90( 그레이너 Li 헤파린 튜브)	>300	>300	>300	>300	>300	>300

표 46: 헤파린이 첨가된 또는 그레이너 리튬 헤파린 튜브들에 분산된 정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장의 노테카린에 의한 응고

헤파린 ( IU / mL )	노테카린 ( nM )/응고 시간 (초)
	120 nM	60 nM	36 nM	12 nM
0	44.3	55.1	61.6	87.0
0.8	49.8	65.0	78.3	126
2.0	57.0	92.2	129	262
10	>300	>300	>300	>300
20	>300	>300	>300	>300
90( 그레이너 Li 헤파린 튜브)	>300	>300	>300	>300

표 47: 헤파린이 첨가된 또는 그레이너 리튬 헤파린 튜브들에 분산된 정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장의 에카린에 의한 응고

헤파린 ( IU / mL )	에카린 ( nM )/응고 시간(초)
	120 nM	60 nM	36 nM	12 nM
0	28.5	40.0	49.3	92.3
0.8	30.1	41.3	51.8	109
2.0	33.1	50.9	70.7	156.6
10	75.7	142	269	>300
20	140	>300	>300	>300
90( 그레이너 Li 헤파린 튜브)	>300	>300	>300	>300

표 48: 헤파린이 첨가된 또는 그레이너 리튬 헤파린 튜브들에 분산된 정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장의 카린액타바아제 -1에 의한 응고

헤파린 ( IU / mL )	CA -1( nM )//응고 시간(초)
	120 nM	60 nM	36 nM	12 nM
0	170	258	>300	>300
0.8	215	297	>300	>300
2.0	>300	>300	>300	>300
10	>300	>300	>300	>300
20	>300	>300	>300	>300
90( 그레이너 Li 헤파린 튜브)	>300	>300	>300	>300

표 49: 헤파린이 첨가된 또는 그레이너 리튬 헤파린 튜브들에 분산된 정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장의 카린액타바아제 -2에 의한 응고

헤파린 ( IU / mL )	CA -2( nM )/응고 시간(초)
	120 nM	60 nM	36 nM	12 nM
0	80.6	120	168	267
0.8	87.8	126	181	>300
2.0	130	230	>300	>300
10	>300	>300	>300	>300
20	>300	>300	>300	>300
90( 그레이너 Li 헤파린 튜브)	>300	>300	>300	>300

표 50: 헤파린이 첨가된 또는 그레이너 리튬 헤파린 튜브들에 분산된 정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장의 트롬빈에 의한 응고

헤파린 ( IU / mL )	트롬빈 ( nM )/응고 시간(초)
	100	60	30	10
0	5.1	7.0	13.5	24.7
0.8	23.2	>300	>300	>300
2.0	>300	>300	>300	>300
10	>300	>300	>300	>300
20	>300	>300	>300	>300
90( 그레이너 Li 헤파린 튜브)	>300	>300	>300	>300

이전 실험(실시예 5f)에 나타낸 대로, 헤파린(및 ATIII-헤파린 착물에 의한 트롬빈 억제)의 존재는 혈액의 부분 또는 완전 응고를 방해하는데 응혈원들에 대한 중요한 도전을 제공한다. 이런 실험의 결과들은 헤파린 처리된 혈장의 응고에서 응혈원들의 상대적 효과를 나타내었다.

결과들은 PtPA 및 OsPA가 ATIII-헤파린 착물에 의한 항응고 효과를 극복하는데 가장 효과적인 프로트롬빈 활성제들이었다는 것을 나타낸다. PtPA는 환자 샘플들에서 발견할 수 있는 최고 헤파린 농도를 함유하는 혈장을 응고하기 위해 최저 농도(12-20 nM)를 필요로 하였다. 하나의 흥미로운 발견은 헤파린 농도는 20 IU/mL 헤파린을 함유하는 첨가된 샘플과 비교하여 90 IU/mL이었음에도 불구하고 PtPA가 단지 12 nM의 최저 PtPA 농도에 의해 <5분 후 그레이너 리튬 헤파린 튜브로부터의 헤파린 처리된 혈장을 효과적으로 응고할 수 있는 유일한 프로트롬빈 활성제이었다는 것이다. 단지 PtPA가 그레이너 리튬 헤파린 튜브에 함유된 계면활성제에 의해 도움을 받는 것이 매우 가능하였다. 20 IU의 헤파린을 함유하는 혈장을 응고할 수 있기 위해 OsPA는 >36 nM을 필요로 하고 에카린은 >60 nM를 필요로 하였고 둘 다는 각각 <5분 후에 그레이너 리튬 헤파린 튜브로부터의 헤파린 처리된 혈장을 응고할 수 없었다. 카린액타바아제-2 및 노테카린은 ≥10 IU의 헤파린을 함유하는 혈장을 응고할 수 없었고 카린액타바아제-1은 농도가 120 nM이었을 때에도 <5분의 필요 시간 후 >0.8 IU의 헤파린을 함유하는 혈장을 응고할 수 없었다. 트롬빈 연구는 100 nM의 트롬빈 농도가 단지 최저 헤파린 농도 0.8 IU/mL 첨가된 샘플을 응고할 수 있었다는 것을 나타내었다. 따라서, 135 nM의 트롬빈을 함유하는 BD RST 튜브를 고려할 때 5분의 필요 시간 후 헤파린 >2 IU/mL을 함유하는 샘플들을 응고할 수 없을 같다.

실시예 5h: 건강한 참가자의 리튬 헤파린 혈장의 응고

그레이너 리튬 헤파린 튜브에 수집된 샘플들은 특히 튜브들이 권고 충전 부피까지 채워지지 않을 경우, 실험실이 받게 될 가장 강하게 헤파린 처리된 샘플들일 것이다. 이 실험의 목적은 헤파린 항응고된 환자들로부터 얻을 수 있는 모든 다른 샘플들을 응고하는 응혈원들의 필요 최소 농도에 대한 지표를 제공하고 높은 품질의 혈청을 생산하는 것이었다.

그레이너 리튬 헤파린 튜브들을 권고 충전 표시까지 채워서, 18 IU/mL의 헤파린 농도를 만들었다. 클로텍 튜브들은 100 μL의 리튬 헤파린 혈장, 100 μL의 Tris 버퍼(150 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) 및 50 μL의 각 응혈원을 함유하였다. TEG 컵들은 60 μL 응혈원 및 그레이너 헤파린 튜브에 수집된 260 μL의 참가자 혈액을 함유하였다.

BD RST 튜브의 경우, 두 튜브(BDRST1 - 1 mL; BDRST2 - 4 mL)에 탈이온수를 첨가하고 30분 동안 롤러에서 혼합하여 트롬빈을 용해하고 내용물을 다른 응혈원들과 함께 사용하였다.

리튬 헤파린 혈장에 의한 각 응혈원에 대한 응고 결과들은 표 51에 나타난다.

표 51: 그레이너 리튬 헤파린 튜브에 수집된 리튬 헤파린 혈장에 대한 응고 연구.

[ 프로트롬빈 활성제]( nM )	응고 시간(s)
	에카린	CA-1	CA-2	PtPA	OsPA	노테카린	트롬빈
120	69.0	>300	100.1	7.5	15.6	47.8	>300
60	122.6	>300	180.3	10.7	18.1	62.7	>300
36	175.2		270.6	13.1	21.0	82.4	>300
12	>300		>300	32.7	37.1	269.3
4	>300		>300	78.5	102.1	>300
1	>300		>300	207.8	>300	>300
0.1	>300		>300	>300	>300
0.01	>300		>300	>300	>300

실험 목적은 혈액 수집 튜브들로부터의 헤파린 처리된 혈장을 응고하는데 응혈원들의 효과를 나타내는 것이었다. 에카린 및 카린액타바아제-2의 경우 <5분의 응고를 달성하기 위한 최소 필요 농도 범위는 12 내지 36 nM이었고, 카린액타바아제-1의 경우 >120 nM 및 노테카린의 경우 4 내지 12 nM이었다. 트롬빈의 경우, >120 nM의 농도가 필요하였다. BD RST 튜브를 7.7 및 2.7 nM의 트롬빈으로 검사하였고 두 농도는 응고 시간 >5분을 발생시켰고 이는 BDRST가 높은 복용량의 헤파린을 투여받은 환자들의 샘플들을 응고하는데 효과가 없을 것을 암시하였다. 결과들은 그룹 C 프로트롬빈 활성제들(PtPA 및 OsPA)은 <5분 후 응고를 달성하기 위해 각각 0.1 내지 1 nM의 PtPA 및 1 내지 4 nM의 OsPA를 필요로 하는, 그레이너 리튬 헤파린 튜브에 수집된 건강한 참가자의 혈액으로부터 얻은 리튬 헤파린 혈장을 응고하는데 가장 효과적이었다는 것을 나타낸다.

실시예 5i: "완전히 헤파린 처리된" 심장 수술 참가자로부터 얻은 혈액과 혈장의 응고

심장 수술과 같은 복잡한 외과 수술들에서 헤파린의 최고 농도는 정맥으로 투여된다. 최대 헤파린첨가 기간 동안 샘플들이 생화학을 위해 수집된 경우 결과들은 주로 최단 가능 시간 후에 제공될 필요가 있다. 혈청이 사용된 경우, 이런 혈청 샘플들이 실험실에 도착하는 시간, 즉 <10분 후에 응혈원에 의해 응고가 완결될 것을 필요로 할 것이다.

환자들에게 투여된 헤파린은 나트륨 헤파린이며 혈액 수집 튜브 또는 주사기에서는 리튬 헤파린이다. 이런 환자들에게 주입된 헤파린의 최대량은 ~45000 IU이다. 이런 환자들은 혈액 희석되어(즉, 혈장 부피가 ~4L로 증가됨), 혈장의 mL 당 ~10 IU의 헤파린 농도를 제공한다.

이 실험은 선택된 응혈원 농도들이 "완전히" 헤파린 처리된 심장 수술 환자 혈액을 응고하는지를 측정하고 높은 품질의 혈청을 생산하도록 설계되었다. 참가자는 37000 IU의 헤파린을 투여받았고 샘플을 헤파린 주입 ~30분 후 수집하였고, 혈장의 mL 당 ~9.3 IU의 헤파린과 동일하였다. 혈액 샘플의 일부는 원심분리하여 혈장을 얻었다.

혈장 응고의 경우, 클로텍 튜브는 100 μL의 심장병 참가자 혈장, 100 μL의 Tris 버퍼(150 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) 및 50 μL의 각 응혈원을 함유하였다.

전혈 응고의 경우, TEG 컵은 60 μL의 응혈원 및 260 μL의 참가자 혈액을 함유하였다. 완전히 헤파린 처리된 후에 혈액은 자체로 응고하지 않았다.

BD RST-1 실험의 경우, 두 BDRST 튜브의 내용물을 각각 1 및 4 mL의 증류수로 용해하였고, 60 μL의 용액을 응혈원으로서 TEG 컵에 사용하였다.

BDRST-2 실험의 경우, 튜브들에 각각 1 및 4 mL의 혈액을 채웠고, 튜브들을 10회(~30초) 뒤집고 340 μL의 혈액을 TEG 컵에 옮겼다.

환자의 혈장에 의한 각 응혈원에 대한 응고 결과들은 표 52에 나타나며 전혈 결과들은 표 53에 나타난다.

표 52: 상이한 농도의 상이한 프로트롬빈 활성제, 트롬빈 및 BD RST 튜브 내용물에 의한 "완전히 헤파린 처리된" 심장 수술 참가자의 혈장의 응고 시간(초).

응혈원 농도 ( nM )	PtPA	OsPA	에카린	CA -1	CA -2	노테카린	트롬빈	BDRST
120	10.0	ND	64.8	175	66.5	ND	>300	>300(27 nM)
60	14.8	18.7	89.7	>300	95.1	68.6	>300	>300(6 nM)
36	15.9	27.3	>300	>300	124	84	>300	ND
12	36.3	35.5	>300	>300	>300	163	ND	ND
6	65.9	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND
4	301.6	100	>300	>300	>300	179	ND	ND
3	ND	123	ND	ND	ND	ND	ND	ND
1	ND	>300	ND	ND	ND	>300	ND	ND

ND는 이것이 결정되지 않았다는 것을 의미한다.

이 실험의 결과들은 각 응혈원의 농도들이 <5분의 필요 시간 후 혈장을 응고하는데 필요하는 것을 나타내었다. 약 5분의 응고 시간을 제공하는 최대 활성제 농도는 PtPA 4 nM, OsPA 1-3 nM, 노테카린 3 nM, 카린액타바아제-2 >12 nM, 에카린 >36 nM, 카린액타바아제-1 >60 nM, 및 트롬빈 >120 nM 이었다. 노테카린 효과는 그룹 C 활성제들에 필적하였다는 것은 놀라웠다.

표 53: 상이한 응혈원들에 의한 "완전히 헤파린 처리된" 심장 수술 참가자의 혈액에 대한 TEG 응고 연구의 결과들.

응혈원( nM )	R(분)	MA(mm )	TMA (분)
에카린
56	2.3	47.6	19.4
34	3.7	49.0	25.1
11	16.6	35.2*	53.3*
3	28.8*	ND	ND
카린액타바아제 - 1
112	5.3	36.9	23.7
56	9.8	33.1*	37.7*
카린액타바아제 - 2
56	2.8	38.1	25.8
34	3.3	36.9	24.3
11	8.9	30.7*	38.5*
OsPA(nM )
56	0.2	64.2	18.6
3	2.9	61.4	25.8
2.3	4.2	54.8	28.4
2	11.0	29.4*	37.9*
PtPA
56	0.4	62.9	20.1
6	4.4	60.9	27.9
3	9.7	42.8*	48.6*
2	28.7*	ND	ND
노테카린
56	0.8	51.9	23.3
34	1.1	51.0	19.6
11	2.2	46.6	22.2
3	7.2	39.5	33.6
BD RST - 1
25	18.9*	ND	ND
6	19.3*	ND	ND
BD RST - 2
135(1 mL)	0.4	9.9	13.3
34(4 mL)	0.3	12.7	8.1

^*는 측정이 종료되었다는 것을 의미하며 ND는 이것이 결정되지 않았다는 것을 의미한다.

상이한 프로트롬빈 활성제들에 대한 이런 결과들로부터 <5분의 R 시간 및 최대 혈전 강도를 달성하는데 측정된 농도는 PtPA 6 nM, OsPA 2.3 nM, 노테카린 3-11 nM, 에카린 11-34 nM, 카린액타바아제-2 11-34 nM, 및 카린액타바아제-1 57-112 nM 이었다.

놀랍게도, 노테카린은 그룹 A 및 B 프로트롬빈 활성제들보다 높은 MA를 가진 혈전들을 만들었고 이론에 한정되지 않기를 바라며, 이런 환자들의 혈액 내 첨가제들은 응고 효과를 촉진한 것으로 간주된다.

MA에 의해 나타낸 대로 형성된 가장 강한 혈전들은 PtPA 및 OsPA에 의한 것이었고 가장 약한 혈전들은 카린액타바아제-1 및 카린액타바아제-2 프로트롬빈 활성제에 의한 것이었다.

BD RST 튜브(135 nM의 트롬빈에 의한 BDRST-2 실험)에 있는 트롬빈은 MA에 의해 나타낸 대로 불완전한 응고와 약한 혈전들을 만들었다. 이런 샘플들은 원심분리 후 혈청에 잠복성 응고를 일으킬 가능성이 매우 높다.

실시예 5j: 리바록사반이 첨가된 정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장의 응고

이 실험은 응혈원들의 응고 능력에 대한, 새로운 인자 Xa 억제제 항응고제들의 하나인, 리바록사반의 효과를 검사하도록 설계되었다.

한 리바록사반 테이블(10mg, Mol Wt 435, Xarelto, Bayer Schering Pharm, Germany) 정제를 5 mL 탈이온수에 분쇄하고(2 mg/mL), 30분 동안 혼합한 후 원심분리하여 용해되지 않은 입자들을 제거하였다. 투여된 통상적인 치료 복용량은 하루 1회 10-40 mg이다. 70kg 사람(~3000 mL 혈장)의 경우 총량은 0.14-0.57 mg/kg, 0.0033-0.013 mg/mL의 혈장이다. 제조되어 클로텍 튜브에서 검사된 농도는 0.0033, 0.0083, 0.017, 0.033, 및 0.17 mg/mL이었다.

클로텍 튜브들은 50 μL의 Tris 버퍼(150 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4), 50 μL 0.2 mM CaCl₂, 100 μL 정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장, 50 μL의 Tris 버퍼 또는 상이한 농도의 항응고제 및 50 μL의 프로트롬빈 활성제(30 nM)를 함유하였다.

응고 시간은 표 54에 나타난다.

표 54: 정상 "모인" 시트레이트 처리된 혈장 및 리바록사반에 대한 응고 시간(초).

응혈원(30 nM )	항응고제 농도	리바록사반 농도( mg / mL )
	0	0.003	0.008	0.017	0.033	0.17
PtPA	4.8	5.8	6.2	7.7	8.8	12.0
OsPA	8.6	8.6	8.8	8.8	9.3	16.9
에카린	42.6	50.7	51.6	53.9	58.9	83.9
노테카린	41.7	42.7	44.9	46.2	47.6	67.3
CA -1	128	133	152	176	194	258
CA -2	60.9	61.1	62.8	66.1	70.6	98.0
트롬빈	7.1	7.0	7.3	7.4	8.0	9.8
BDRST 23 nM	5.1	5.3	5.2	5.8	5.7	7.7

결과들은 리바록사반은 환자들에서 발견할 수 있는 치료적 농도 범위 0.0033-0.013 mg/mL의 혈장에서 응혈원들에 대해 최소 효과를 가진다는 것을 나타낸다. 그러나, 더 높은 농도에서, 리바록사반은 응혈원들의 각각의 존재하에서 응고에 현저한 억제 효과를 가졌다. 이런 효과는 응혈원들에 의해 발생된 트롬빈에 의해 혈장에 있는 인간 FX로부터 생산된 인자 Xa의 억제 때문일 것이다.

실시예 5k: 시트레이트 항응고가 진행중인 환자의 혈액의 응고

이전 실험들에서, 프로트롬빈 활성제들은 그레이너 시트레이트 튜브들에 수집된 시트레이트 처리된 혈액을 응고할 수 있다는 것이 나타났다. 이 실험의 목적은 인 비보 시트레이션이 프로트롬빈 활성제들에 대한 응고 문제들을 제공하지 않았는지를 확인하는 것이었다.

이 실시예에서, 환자는 혈류의 리터 당 3.0 mmol의 시트레이트를 투여받았다. 일상적인 병리학 검사를 위해 혈액을 50 mL 보통 주사기(BD Plastipak #300866)에 수집하였고 여기서 <3 mL를 남겨서 PtPA에 대해서만 매우 제한된 연구를 실행하였다.

응고 변수들은 PT 13s(RR 9-13), INR 1.3, APTT 45s(RR 24-39), 피브리노겐(유도) 7.2 g/L(RR 1.7-4.5)이었고, 항응고를 확인하였다.

TEG 컵은 20 μL의 0.2 M CaCl₂ 또는 식염수, 5 μL의 PtPA 및 320 μL의 시트레이트 처리된 혈액을 함유하였다.

결과는 표 55에 나타난다.

표 55: 시트레이트 처리된 항응고된 참가자에 대한 TEG 결과.

시트레이트 처리된 항응고된 참가자	R(분)	MA( mm )	TMA (분)
재석회화된 시트레이트 혈액 단독	4.8	77.1	18.0
재석회화된 2.8 nM PtPA	0.6	74.7	15.8
재석회화되지 않은 2.8 nM PtPA	0.8	76.2	18.9

결과들은 PtPA가 재석회화된 혈액 및 재석회화되지 않은 혈액에서 응혈원으로 사용될 때 환자들의 항응고에 사용된 시트레이트 농도가 응고 문제들을 제공하지 않았다는 것을 나타내었다. 그레이너 시트레이트 튜브들에 수집된 혈액에서 시트레이트 농도는 3.2% 또는 109 mM이었고, 환자가 투여받았던 농도의 약 36배이다. 또한, 시트레이트 처리된 환자들이 이온화된 칼슘에 대해 연속적으로 관찰되고 필요에 따라 이온화된 칼슘이 보충되기 때문에 어떠한 응고 문제들이 있을 것으로 예상되지 않았다. 이 환자에서 4.8분과 비교하여 정상 "모인" 시트레이트 혈액에서 R 시간은 (표 43에 나타낸 대로) 6.4분이었다. 재석회화는 필요량을 초과하여 칼슘을 첨가하며 따라서 이론적으로 이것이 차이에 기여하지 않아야 한다. 차이는 7.2 g/L이었던 피브리노겐을 포함하는 응고 인자들의 더 높은 농도 때문이라고 간주된다.

실시예 6: 연장된 응고 프로파일 또는 낮은 혈소판 수를 가진 참가자들의 전혈 샘플들의 응고

일부 환자들은 약물 치료 또는 유전적 인자(예를 들어, 혈우병)의 결과로 연장된 응고 변수들 및/또는 감소된 혈소판 수를 제공한다. 다음 실험들을 실시하여 PtPA 또는 OsPA가 이런 환자들의 혈액 샘플들을 빠르게 응고할 수 있는지를 측정하였다.

실시예 6a: 연장된 응고 시간을 가진 참가자들

내인성 경로(intrinsic pathway)에 결함을 나타내는 연장된 aPTT를 가진 4명의 참가자("A", "B", "C" 및 "D")의 혈액을 병리학 퀀스랜드, 프린세스 알렉산드라 병원(퀸스랜드, 호주)로부터 얻었다. 각 참가자의 응고 변수들을 측정하였고 표 56에 나타난다.

표 56: 각 참가자의 응고 변수들^*

참가자	aPTT (s)	PT (s)	INR	TT (s)	Fib -D(g/L)	plat (x10 9 /L)
A	48	16	1.6	19	7.1	453
B	44	34	3.0	16	4.1	97
C	>200	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
D	45	16	1.5	15	1.5	96
기준 간격	25-38	8-14	0.9-1.3	10-15	1.5-4.0	140-400

^* aPTT = 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간; PT = 프로트롬빈 시간; INR = 국제정상화비율; TT = 트롬빈 시간; Fib-D = 프로트롬빈 시간 유도 피브리노겐; Plat = 혈소판, n.d. = 측정할 수 없음. 기준 간격은 병리학 퀀스랜드로부터 얻었다.

TEG 분석을 실행하였다. 각 TEG 분석 혼합물은 A-D 참가자 샘플들의 310 μL 시트레이트 처리된 혈액, 20 μL의 CaCl₂(0.2 M) 및 10 μL의 식염수 또는 PtPA(최종 농도1.41 ㎍/mL)으로 이루어졌다. CaCl₂를 시점 0에 첨가하여 응고를 개시하였다.

4개 샘플에 대한 TEG 트레이스들은 도 44에 나타나며 이런 트레이스로부터의 TEG 변수들은 표 57에 나타난다.

표 57: 비정상 응고 변수들을 가진 참가자들의 혈액 샘플들의 응고에 대한 TEG 결과

	R(분)	TMA (분)	α( deg )	MA( mm )
A	>35	n.d.	n.d.	n.d.
A + PtPA	1.3	16.6	70.9	67.4
B	23.0	>39	17.0	n.d.
B + PtPA	0.9	21.3	70.0	59.0
C	>52	n.d.	n.d.	n.d.
C + PtPA	2.1	24.5	67.6	60.4
D	16.1	43.3	26.4	31.7
D + PtPA	1.4	19.2	52.0	40.8

"n.d."는 이것이 결정되지 않았다는 것을 나타낸다.

4개의 샘플에 대한 TEG 그래프는 도 44에 나타나며 TEG 그래프 A는 참가자 A를 나타내며 이 그래프에서 (i)로 표시된 2개의 트레이스는 첨가된 칼슘을 가진 식염수 대조군을 나타내며; (ii)로 표시된 2개의 트레이스는 PtPA를 가진 샘플들이다. TEG 그래프 B는 참가자 B를 나타내며 이 그래프에서 (i)로 표시된 2개의 트레이스는 첨가된 칼슘을 가진 식염수 대조군이며; (ii)로 표시된 2개의 트레이스는 PtPA를 가진 샘플들이다. TEG 그래프 C는 참가자 C를 나타내며 이 그래프에서 (i)로 표시된 트레이스는 식염수 대조군이며; (ii)로 표시된 4개의 트레이스는 첨가된 PtPA를 가진 샘플들이다. TEG 그래프 D는 참가자 D를 나타내며 이 그래프에서 (i)로 표시된 2개의 트레이스는 식염수 대조군이며; (ii)로 표시된 2개의 트레이스는 PtPA를 가진 샘플들이다. 심한 비정상 응고 변수들 때문에 환자 C에 대해 삼중 측정을 실행하였다. 표 57에 있는 데이터는 TEG 데이터로부터의 평균을 나타낸다.

요약하면, 참가자 A-D의 혈액 샘플들은 44 내지 >220초 범위의 aPTT 시간을 나타내며 내인성 응고 경로에 결함을 나타낸다. PtPA 없이 샘플들은 응고하지 않거나 매우 약한 혈전들을 만들었다. 모든 경우에 PtPA(1.41㎍/ml)는 빠른 응고를 일으켰고, 응고 시간을 1-2분으로 감소시켰다. 따라서 PtPA는 이런 응고 경로에 결함을 가진 환자들의 혈액을 빠르게 응고하는데 효과적이다.

실시예 6b: 낮은 혈소판 수를 가진 참가자들

낮은 혈소판 수를 가진 참가자들에서, 응고 시간은 건강한 사람들의 혈액과 비교하여 현저하게 증가한다. 이것은 혈소판들이 프로트롬비나아제 착물의 형성을 위한 인지질 표면을 제공하며 혈액 응고를 가속화하기 때문이다.

낮은 혈소판 수를 가진 4명의 참가자("E", "F", "G" 및 "H")의 혈액 샘플을 병리학 퀸스랜드, 프린세스 알렉산드라 병원(퀸스랜드, 호주)로부터 얻었다. 각 참가자의 응고 변수들을 측정하였고 표 58에 나타나며, 낮은 혈소판 수를 확인시킨다.

표 58: 각 참가자의 응고 변수들

응혈원	aPTT (s)	PT (s)	INR	TT (s)	fib (g/L)	plat (x10 9 /L)
E	31	10	1.1	n.d.	4.5	10
F	29	14	1.4	n.d.	1.2	29
G	34	12	1.2	n.d.	2.7	18
H	54	11	1.2	21	6.4	46
기준 간격	25-38	8-14	0.9-1.3	10-15	1.5-4.0	140-400

n.d.는 이 측정들이 결정되지 않았다는 것을 나타낸다.

TEG 분석을 실행하였다. 각 TEG 분석 혼합물은 E-H 참가자 샘플들의 310 μL 시트레이트 처리된 혈액, 20 μL의 CaCl₂(0.2 M) 및 10 μL의 식염수 또는 프로트롬빈 활성제의 용액(1.41 ㎍/mL 또는 14.1 ㎍/mL의 최종 농도의 PtPA 또는 0.59 ㎍/mL 또는 5.9 ㎍/mL의 최종 농도의 OsPA)으로 이루어졌다.

TEG 트레이스들은 도 45에 나타나며 TEG 변수들은 표 59 및 60에 나타난다.

표 59: PtPA에 의한 낮은 혈소판 수를 가진 참가자들의 혈액 샘플들의 응고에 대한 TEG 결과

응혈원	㎍/ mL	R(분)	TMA (분)	α( deg )	MA( mm )
E	0	10	30.3	42.3	34.6
	1.41	1.5	22.5	61.6	35.3
	14.1	0.4	20.3	73.2	31.1
F	0	9.3	29.8	15.6	28.2
	1.41	1.5	24.2	29.0	31.2
	14.1	0.6	24.3	38.4	28.0
G	0	12.8	32.8	29.5	30.2
	1.41	1.4	23.4	57.1	33.7
	14.1	0.4	25.0	66.9	31.3
H	0	9.1	32.0	39.3	48.2
	1.41	1.7	24.2	66.3	58.8
	14.1	0.3	22.2	73.7	54.7

표 60: OsPA에 의한 낮은 혈소판 수를 가진 참가자들의 혈액 샘플들의 응고에 대한 TEG 결과

응혈원	㎍/ mL	R(분)	TMA (분)	α( deg )	MA( mm )
E	0	10	30.3	42.3	34.6
	10	3.8	23.8	41.0	32.7
	100	0.9	21.8	63.7	32.9
F	0	9.3	29.8	15.6	28.2
	10	3.2	25.3	27.4	28.7
	100	1.6	25.6	27.5	29.3
G	0	12.8	32.8	29.5	30.2
	10	3.3	24.6	38.8	31.7
	100	0.9	24.5	56.5	29.9
H	0	9.1	32.0	39.3	48.2
	10	3.4	24.1	59.8	59.7
	100	0.8	22.6	66.7	54.9

TEG 그래프들은 도 45에 나타나며 그래프 A는 참가자 E에 대한 결과를 나타내며; 그래프 B는 참가자 F에 대한 결과를 나타내며; 그래프 C는 참가자 G에 대한 결과를 나타내며; 그래프 D는 참가자 H에 대한 결과를 나타낸다. 각 그래프에서, (i)로 표시된 트레이스는 PtPA 또는 OsPA가 없다는 것을 나타내며; (ii)로 표시된 트레이스는 14.1 ㎍/mL PtPA를 나타내며; (iii)로 표시된 트레이스는 1.41 ㎍/mL PtPA를 나타내며; (iv)로 표시된 트레이스는 5.88 ㎍/mL OsPA를 나타내며; 청색 트레이스는 0.588 ㎍/mL OsPA를 나타낸다.

요약하면, PtPA 및 OsPA는 낮은 혈소판 수를 가진 참가자들의 혈액을 빠르게 응고하여 강한 강도의 혈전들을 형성한다.

실시예 7: 프로트롬빈 활성제-함유 뱀독의 응고 활성 비교

Pseudonaja textilis(Pt), Oxyuranus scutellatus(Os), Oxyuranus microlepidotus(Om), Notchis scutatus(Ns), 및 Echis carinatus(Ec) 뱀으로부터의 5개의 새로 복원된 뱀독들이 50 mg/mL의 스톡 농도의 증류수에서 복원되었다. 6 mg/mL의 작업 스톡 희석이 새로 제조되었고 재석회회된 시트레이트 처리된 혈장에 대한 이들의 응고 활성이 측정되었다. 뱀독들은 2 mg/mL 내지 500 pg/mL의 분석에서 각 농도의 2통을 연속적으로 희석하였다. 나타난 결과들은 중복 측정들의 평균이다. 분석물은 10 mM 칼슘이 첨가된 100 ㎕의 0.02 M Hepes 버퍼 pH 7.4에 100 ㎕의 시트레이트 처리된 혈장를 더한 것으로 이루어지며, 응고 시간(초)은 뱀독 희석액의 첨가 시간으로부터 측정되었다.

결과는 표 61 및 도 46에 나타나있다.

표 61: 다른 농도들에서 프로트롬빈 활성제를 포함하는 뱀 독의 응고 시간들

	응고 시간(초)
뱀독 ( mg / mL ).	Os	Pt	Om	Ns	Ec
2	59.5	20.6	14.6	27.4	10.3
1	28.4	9.8	9.8	26.5	9.7
0.5	15	5.2	7.8	29.2	10.9
0.25	9.3	5	6.6	36	14.7
0.125	7.6	4.2	6.1	42.7	17.1
0.063	7.4	3.6	6.8	46.4	19.8
0.031	6.5	3.5	6.9	52.00	24.3
0.015	8.2	3.6	8.0	59.9	28.1
0.0075	8.6	3.7	8.6	67.2	33.4
0.0037	9.2	3.8	9.3	75.7	42.1
0.002	10.6	4.0	10.7	78.8	48.6
0.001	11.2	4.2	11.1	86.00	54.6
0.0005	12.4	4.5	12.6	92.5	61.4
0.00025	12.8	6.2	13.0	105.6	72.3
0.00013	14.5	11.2	14.8	132.4	76.4
0.00006	20.4	12.6	21.1	165.5	82.5
0.00003	21.8	14.3	22.4	192.6	91.3
0.00001	24.6	16.5	25.6	209	106.4
0.0000005	30.7	18.6	31.2	235.4	123.2

표 61 및 도 46 모두에서 나타나듯이, 모든 5개의 뱀독 응고되고 재석회화되고 시트레이트 처리된 혈장은 500 pg/mL의 농도로 매우 효율적으로 낮아졌다. 그룹 C 프로트롬빈 활성제-함유 뱀독(Pt, Os 및 Om)은 500 pg/mL의 농도에서 50초 미만의 응고 시간을 달성하여 가장 활성적이었다.

실시예 8: 구입가능한 튜브들을 이용하여 또는 PTPA 를 이용하여 제조된 혈장 및 혈청 샘플에서 침전 및 잠재( latent ) 응고와 트로포닌 I 추정에 대한 효과

본 명세서의 앞 부분들에서 논의된 바대로, 다수의 문제들이 잠재 응고 또는 비 응고(혈청 튜브들), 마이크로혈전 및 피브리노겐 스트링(혈청 또는 혈장 튜브들), 및 단백질의 침전 및 세포 물질(혈청 또는 혈장 튜브들)의 누출과 같은 상업용 혈청 및 혈장 튜브들의 사용과 관련되어 있다. 프로트롬빈 활성제를 포함하는 튜브가 이들 문제들의 일부를 나타내는지 조사하기 위해서, 구입가능한 튜브들에서 혈액 샘플들을 눈으로 보고 조사하고 PtPA-함유 튜브들의 혈액 샘플들과 비교하였다. 결과들은 도 47-49에 나타나있다.

실시예 8a: 침전 및 잠재 응고

도 47은 구입가능한 (리튬 헤파린을 함유한) 그레이너 혈장 튜브에서 수집된 혈액 샘플로부터의 혈장 제제의 결과들을 보여준다. 튜브의 4개의 구획들이 (도면의 상부로부터 하부까지) 표시되었다: 혈장; 젤라틴화된 침전물; 분리 겔; 원심분리에 의해 패킹된 세포. 젤라틴화된 침전물은 피브리노겐 및 다른 혈장 단백질들로 이루어지며 튜브가 2-8℃에서 저장되는 경우 형성된다. 이러한 침전물은 장치 기능 및 분석 물질 측정을 방해할 가능성을 가지고 있다. 이러한 침전물들은 리튬 헤파린 혈장 샘플의 ~5%에서 발생한다.

도 48은 3개의 구입가능한 혈청 튜브들: 왼쪽 튜브(GS)는 그레이너 혈청 튜브; 가운데 튜브(BDS)는 BD 혈청 튜브 및 오른쪽 튜브(BDT)는 BD RST 튜브에서 혈청 제제의 결과들을 나타낸다. 튜브들의 4개의 구획들이 (도면의 상부로부터 하부까지) 표시되어 있다: 패킹된 세포들; 분리 겔; 잠재 응고; 혈청. 후-원심분리(잠재) 응고는 3개의 튜브들 모두의 상청액 또는 혈청 성분에서 두렷하다. 튜브들은 혈전의 존재를 설명하기 위해 뒤집어진다. 이들 잠재 혈전은 계측 및 기능적 분석을 방해할 가능성을 가지고 있다.

도 49는 반씩 나누어져 있다. 왼쪽 절반은 3개의 구입가능한 튜브들(왼쪽부터 오른쪽): 그레이너 배큐엣^TM 혈청 튜브(GS), BD 배큐테이너^TM 혈청 튜브/SST II(BDS) 및 BD RST 튜브(BDT), 및 또한 PtPA가 첨가된 그레이너 배큐엣^TM 무첨가제 튜브에서 동일한 완전히 헤파린화된 환자로부터의 단일 혈액 샘플로부터의 혈청 제제의 결과들을 보여준다. 튜브들의 3개의 구획들이 (도면의 상부로부터 하부까지) 표시되어 있다: 혈청; 분리 겔; 패킹된 세포들. 도 49로부터의 모든 4개의 튜브들은 원심분리된 후 하룻밤 동안 놓아두며, 이후 각 튜브의 혈청을 투명한 유리 튜브로 옮긴 다음 도 49의 오른쪽 절반에 나타난 것과 같이 사진을 찍는다(왼쪽부터 오른쪽으로: GS, BDS, BDT 및 PtPA 튜브들). 3개의 구입가능한 튜브들 모두로부터의 혈청들은 튜브의 면에서 혈전 생성에 의한 응고의 증거 및 피브린 가닥의 관찰을 보여주지만, 다른 샘플들을 이용하여 관찰된 상당히 초과하는 투명성을 갖는 PtPA-함유 튜브에서 제조된 혈청에서 침전의 증거는 없었다.

실시예 8b: 트로포닌 I 수준

증가된 트로포닌 I(심장 사건들의 가장 특이한 마커들 중 하나)을 나타내는 적어도 일부 잘못된 양성 결과들은 혈청 및 혈장 샘플에서의 침전/잠재 응고 때문이라는 것이 관찰되었다.

64명의 참가자들로부터의 혈액 샘플들에서 트로포닌 I 수준은 구입가능한 튜브들 및 PtPA-함유 튜브들에서 제조된 혈청 및 혈장 샘플들을 이용하여 측정되었다.

5개의 구입가능한 튜브들: 그레이너 배큐엣^TM 혈장; BD PST II; 그레이너 배큐엣^TM 혈청; BD SST II; 및 BD RST, 그리고 PtPA(1.2 ㎍/4 mL)를 포함하는 그레이너 배큐엣^TM 무첨가제 튜브들에서 각 참가자들에 대해 혈청 및 혈장 샘플들이 제조되었으며, Beckman Coulter AccuTnI 분석을 이용하여 트로포닌 I(TnI)에 대해 분석되었다.

참가자 18. 20, 38 및 63에 대해 표 62에 표시된 바대로 4개의 모순된 결과들이 얻어졌다. 참가자 18 및 38은 건강하였으며, 참가자 20 및 63은 모두 헤파린을 투여받은 심장 수술을 받고 있는 환자들이었다. 3개의 잘못된 양성 결과들(참가자 18, 20 및 38)이 얻어졌다. 동일한 혈액 샘플로부터의 다른 튜브들로부터의 결과들과 비교할 때, 제 1 튜브로부터의 분취량의 재원심분리에 이은 재분석 결과는 기대했던 대로 음성 결과를 나타내었다. 추가적인 결과는 예외적으로 높았다(참가자 63). 분취량의 재원심분리 및 재분석은 다른 튜브들에 필적할만한 결과를 나타내었다.

샘플의 원심분리가 불일치를 해결한다는 사실은 모순된 결과들이 부정확한 샘플링을 유발하는 잠재 응고/침전물 형성에 기인한다는 것을 강하게 제안한다. PtPA 혈청을 이용한 경우 모순된 결과들이 얻어지지 않았다.

표 62: 불일치를 보여주는 트로포닌 I 분석 결과.

참가자	최초 TnI 결과(반복 TnI 결과) ㎍/L
	PtPA	그레이너 혈장	BD PST II	그레이너 혈청	BD SST II	BD RST
18	0.003	0.000	0.000	0.000	0.053 (0.004)	0.000
20	0.007	0.015	0.093 (0.015)	0.013	0.013	0.004
38	0.009	0.000	0.006	0.006	1.334 (0.002)	0.004
63	0.675 (0.690)	0.665 (0.704)	0.643 (0.665)	0.652 (0.650)	0.542 (0.579)	1.251 (0.734)

요약하면, 구입가능한 튜브들에서 혈장 및 혈청 샘플들의 제조 동안 관찰된 침전 및 잠재 응고는 분석물질 측정에 상당한 문제들을 나타낸다. 혈청 샘플을 제조하기 위해 PtPA를 사용한 경우 마이크로혈전 형성의 침전 또는 증거는 관찰되지 않았다.

실시예 9: 혈장 및 혈청 샘플들에서 피브리노겐, 분해된 피브리노겐 및 피브린 수준

본 명세서의 앞 부분들에서 논의된 바대로, 분석물질 측정을 위해 혈청 및 혈장 샘플들에서 가용성 피브리노겐, 부분적으로 분해된 가용성 피브리노겐(fdp) 및 미중합(unpolymerised) 피브린(FDP)은 바람직하지 않은 성분들이다. 간단히 말하면, 특히 지속적인 질환들에 대한 표준 혈청 제제 질환들 이후 불용성 피브린(마이크로혈전)으로의 추가적인 변환을 막기 위해 고품질 혈청 샘플에서 피브리노겐/fdp/FDP는 최소이어야 한다. 마이크로혈전 또는 피브린 가닥은 계측을 방해할 수 있으며 분석물질 측정에 영향을 미칠 수 있다. 표준 방법들에 의해 제조된 혈청 샘플들의 경우, 샘플에서 피브리노겐/fdp/FDP의 농도는 환자/개인이 항응고된 정도, 환자의 건강 상태(예를 들어, 간질환의 존재), 샘플 수집 용기의 형태, 및 드문 경우 튜브에서 샘플의 불충분한 혼합에 의존하는 것으로 여겨진다. 이 실시예에서, 다른 튜브들을 이용하여 제조된 혈청 및 혈장 샘플에서 피브리노겐/fdp/FDP의 농도가 "고품질" 혈청 샘플의 제제에 대한 수립된 조건들을 돕기 위해 조사되었다.

혈청 및 혈장 피브리노겐/fdp/FDP 농도들이 아래에 기술된 바대로 샌드위치 효소 면역분석(ELISA)에 의해 측정되었다. 이 분석은 가용성 피브리노겐, fdp 및 FDP를 인식하는 피브리노겐에 대한 다중클론성 항혈청을 사용한다.

ELISA 방법은 (정제된 IgG 분획: AHFAS으로) 항-피브리노겐 항혈청 및 항-피브리노겐 항혈청-호스라디쉬 퍼옥시다아제 콘쥬게이트(AHFAS-HRP)를 필요로 한다. 각각의 제제들은 MP 바이오케미컬, USA로부터 구입되었다. 국제 피브리노겐 표준은 NIBSC(London)으로부터 구입하였으며, 50% 글리세롤/식염수에서 1 mg/mL의 작업 스톡 농도로부터 희석되었다.

세정 버퍼는 0.05 M 인산염 버퍼, pH 7.4, 0.5 M NaCl, 0.05 % Tween 20 및 1% BSA로 이루어지는 반면, 사용된 바인딩 버퍼는 0.1 M 중탄산염 버퍼, pH 9.6이었다.

항체들의 작업 희석액은 바인딩 버퍼에서 AHFAS 및 AHFAS-HRP 스톡을 1:500 희석함으로써 제조되었다. HRP 기질 용액은 50 mL 반응 용액에서 20 mM 테트라메틸벤지딘, 0.4 mL의 30% H₂O₂ 및 50μL의 0.05 M 시트르산염 버퍼 pH 4.0으로 이루어진다.

Nunc ELISA IMMUNOSORB 96 웰 플레이트(Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY)를 4℃에서 하룻밤 동안 AHFAS로 플레이트를 배양함으로써 웰 당 100 μL의 AHFAS 작업 희석액으로 코팅하였다. 이후 플레이트를 4℃에서 하룻밤 동안 세정 버퍼에서 100 μL의 2% 소 혈청 알부민(Sigma 화학적, Co)으로 블록한(blocked) 다음 세정 버퍼로 3회 세정하였다.

건강한 지원자들(건강) 및 환자들(심장 및 신장 질환)로부터의 혈액 샘플들을 다음 튜브들에 수집하였다:

그레이너 혈청 튜브들(GS 또는 GRS);

BD 혈청 튜브들(BDS);

BD RST 튜브들(BDT or BD RST);

PtPA 스톡 용액 4.8 mg/mL(PtPA)으로부터의 1.2 ㎍ PtPA가 첨가된 그레이너 무첨가제 튜브들;

OsPA 스톡 용액 2.0 mg/mL(OsPA)으로부터의 0.5 ㎍ OsPA가 첨가된 그레이너 무첨가제 튜브들;

0.6 U 에카린이 첨가된 그레이너 무첨가제 튜브들;

1.2 U 에카린이 첨가된 그레이너 무첨가제 튜브들;

0.63 U/4 mL 에카린이 첨가된 그레이너 무첨가제 튜브들(실시예 9b);

1.25 U/4 mL 에카린이 첨가된 그레이너 무첨가제 튜브들(실시예 9c);

2.5 U/4 mL 에카린이 첨가된 그레이너 무첨가제 튜브들(실시예 9c);

그레이너 배큐엣^TM 혈장 튜브들(GRLH);

BD 배큐테이너^TM 혈장(PST II) 튜브들(BDLH);

혈장(CIT)에 대한 그레이너 배큐엣^TM 시트르산염 튜브(3.2% 시트르산염); 및

혈장(EDTA)에 대한 그레이너 배큐엣^TM K2EDTA 튜브(1.5-2.2 mg/mL의 EDTA).

각 튜브에서 제조된 혈장 및 혈청 샘플들을 혈액이 각 튜브에 수집되고, 튜브를 3,000g에서 원심분리하기 전에 놓아두는 표준 병리학 퀸즈랜드(호주) 분석물질 샘플 제제 절차에 따라 제조하였다. BD RST, PtPA, OsPA 및 에카린-함유 튜브들을 5분간 놓아둔 반면, 표준 혈액의 경우 30분간 항응고된 혈액의 경우 60분간 모든 남은 튜브들을 놓아두었다.

각 튜브로부터, (각각 1/1,000 희석 및 1/10 희석으로 희석된) 혈장 또는 혈청 샘플의 100 ㎕의 분취량을 3중으로 플레이트하였다. 피브리노겐 표준(1,000 ng/mL 내지 10 ng/mL의 농도 범위를 커버하는 11개의 희석액들)의 연속 희석액들을 중복하여 플레이트하였다. 플레이트를 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.

결합되지 않은 성분들을 제거하기 위해 플레이트를 세정 버퍼로 6회 세정하고 웰 당 100 ㎕의 AHFAS-HRP 작업 용액으로 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 웰 당 100 ㎕ HRP 기질 용액을 추가하기 전에 플레이트를 세정 버퍼로 다시 6회 세정하였다.

1 ㎍/mL의 피브리노겐 농도에서 A₄₅₀ nm가 1.0의 흡광도에 다다르기 전까지 어두운 환경에서 파란색의 발달이 탐지되었다. 그런 다음 반응은 웰 당 100㎕의 1.0M 황산 용액을 추가함으로써 정지되었으며, 노란색을 나타내었다. 그런 다음 플레이트는 Ascent 소프트웨어를 이용한 Thermo Scientific Multiskan Ascent 플레이트 리더의 A₄₅₀ nm에서 판독되었다.

실시예 9a: 환자로부터의 그레이너 혈청 튜브들( GS )에서 수집된 48개 혈청 샘플들에서 피브리노겐/ fdp / FDP 수준

임상 질환들에 대한 분석물질 측정이 필요한 48개의 무작위로 선택된 환자들로부터의 그레이너 혈청(GS) 튜브들로부터의 혈청 샘플들에서 피브리노겐/fdp/FDP 농도가 상기 기술된 ELISA 방법을 이용하여 측정되었다.

도 50은 결과들을 나타낸다. 4.4-32 ㎍/mL 범위의 이들 샘플들에서 피브리노겐/fdp/FDP의 농도가 2.0-5.0 mg/mL의 이들 혈장 샘플들의 피브리노겐 농도와 비교되었다. 이들 자료는 표준 구입가능한 혈청 튜브들에서 99% 이상의 피브리노겐이 응고 과정에 의해 제거된다는 것을 보여준다. 이들 자료는 또한 입원 환자의 혈액 샘플로부터의 그레이너 혈청 튜브들의 혈청 제제에서 피브리노겐의 참조 구간 범위를 제공한다.

실시예 9b: 표준 혈청 및 혈장 샘플들에서 피브리노겐/ fdp / FDP 수준

피브리노겐/fdp/FDP 수준에 대한 PtPA 첨가(300 ng/mL 또는 1.2 ㎍/4 mL 튜브)의 효과를 조사하기 위해 (프로트롬빈 시간, aPTT 및 피브리노겐 분석들에 의해 결정된 대로) 36개의 표준 혈청 샘플들이 선택되었다. 각 그레이너 혈청 튜브로부터의 1 mL의 두 개의 동일한 혈청 샘플들을 플레인 플라스틱 튜브들(제 2 튜브들)로 분취하기 전에 표준 병리학 퀸즈랜드 절차 하에서 그레이너 혈청 튜브들(제 1 튜브들)에서 혈청들을 제조하였다. PtPA(300 ng/mL 또는 1.2 ㎍/4 mL 튜브)를 하나의 튜브에 첨가하고 동일한 부피(50 ㎕)의 식염수를 두 번째 튜브에 첨가하여 제 2 튜브들의 대응 짝들(matched pairs)을 제공하였다.

각각의 제 2 튜브에서 피브리노겐/fdp/FDP 농도가 상기 기술된 ELISA 방법을 이용하여 측정되었으며 결과들이 도 51에 나타나있다. 제 2 튜브들 모두에서 잔류 피브리노겐은 혈액에 존재하는 것의 1% 미만으로 감소하였다. 하지만 PtPA의 첨가는 평균 12.8 ㎍/mL에서 11.8 ㎍/mL로 피브리노겐/fdp/FDP 수준을 추가로 감소시켰다. 이러한 감소는 대응된 t-테스트 분석에서 유의성(p < 0.04)이 있었다. 따라서 PtPA는 잔류 피브리노겐/fdp/FDP 수준이 매우 낮은 표준 개인 혈청들에서도 혈청 피브리노겐/fdp/FDP를 추가로 환원시킬 수 있다. 극소량 잔류물(<1.0%)은 항체와 반응하지만 불용성 혈전을 형성하기 위해 중합할 수 없는 분자들일 수 있다.

그 다음 9개의 표준 혈액 샘플들이 4개의 다른 혈청 튜브들에 수집된다: 그레이너 혈청, BD 혈청, BD RST 및 PtPA-함유 그레이너 배큐엣^TM 무첨가제 튜브들. 각각의 제 2 튜브에서 피브리노겐/fdp/FDP 농도가 상기 서술된 ELISA 방법을 이용하여 측정되며 결과들이 도 52에 도시된다. PtPA-함유 그레이너 배큐엣^TM 무첨가제 튜브에서 제조된 혈청들에서 피브리노겐 농도가 현저하게 낮았다.

이후 OsPA 및 에카린을 이용하여 제조된 혈청에서 피브리노겐/fdp/FDP의 농도가 조사되었다. 혈청 샘플들은 OsPA(0.50 ㎍/4 mL 튜브), 에카린(0.63 units/4 mL 튜브) 및 PtPA(1.2 ㎍/4 mL 튜브)을 포함하는 그레이너 혈청 튜브들(GRS) 및 그레이너 무첨가제 튜브들에서 5명의 표준 참가자들의 혈액으로부터 제조되었다. 각 튜브의 혈청들에서 피브리노겐/fdp/FDP 농도가 상기 서술된 ELISA 방법을 이용하여 측정되었다. 결과들은 도 53에 도시된다. 모든 경우에서 잔류 피브리노겐/fdp/FDP 수준은 혈액 또는 혈장에서의 것의 1% 미만이었다.

실시예 9c: 헤파린화된 환자들로부터 제조된 혈청 샘플에서 피브리노겐/fdp/FDP 수준

신장 투석 중인 환자들은 투석 동안 프로트롬빈성 사건들을 피하기 위해서 온화한 수준의 헤파린화(치료 기간 동안 1,000 - 10,000 U의 헤파린)가 필요하다. 5분의 배양 시간에서 투석 환자들로부터의 혈액을 효율적으로 응고시키기 위한 PtPA 튜브들(1.2 ㎍/4 mL 튜브) 및 BD RST 튜브들의 능력을 시험하기 위해 이 카테고리로부터의 3명의 환자들이 선택되었으며, 30분의 응고 시간에서 그레이너 혈청(GRS) 및 BD 혈청(BD SST II) 혈액 수집 튜브들에서 얻어진 혈액의 응고와 비교하였다. 응고의 효율은 상기 서술한 ELISA 방법을 이용한 각각의 혈청들에서 피브리노겐/fdp/FDP 농도를 측정함으로써 결정되었다.

결과들은 도 54에 도시되며 헤파린화된 혈액으로부터의 PtPA-제조된 혈청들에서 피브리노겐/fdp/FDP의 잔류 수준이 표준 혈액으로부터의 PtPA-제조된 혈청들에서의 값들에 필적한다는 것을 밝히고 있다(도 51 및 53). 대조적으로, GRS, BDS 및 BD RST 튜브들에서 제조된 혈청에서 잔류 피브리노겐/fdp/FDP 수준은 훨씬 높았다. 이들 수준에서, 잠재 혈전 형성 및 마이크로혈전은 특히 헤파린의 존재 하에서 확실한 듯하다. GRS, BDS 및 BDRST에 대한 도 54의 값들은 샘플의 단일 희석에 기초한 최소 추정치들이다.

(25,000-41,000 Units의 헤파린으로 처리된) 2명의 심장 수술 환자들로부터의 혈액 샘플들을 다음 튜브들: 그레이너 혈장 튜브들, 그레이너 혈청 튜브들, BD 혈청 튜브들, BD RST 튜브들, PtPA(1.2 ㎍/4 mL 튜브) 첨가된 그레이너 배큐엣^TM 무첨가제 튜브들, OsPA(0.50 ㎍/4 mL 튜브) 첨가된 그레이너 배큐엣^TM 무첨가제 튜브들, 첨가된 4 mL 튜브 당 에카린 1.25 units/L을 갖는 그레이너 배큐엣^TM 무첨가제 튜브들(EC1), 또는 첨가된 4 mL 튜브 당 에카린 2.5 units/L을 갖는 그레이너 배큐엣^TM 무첨가제 튜브들(EC2)에 수집하였다.

각 튜브의 혈청들 및 혈장에서 피브리노겐/fdp/FDP 농도가 상기 서술된 ELISA 방법을 이용하여 측정되었으며 결과들이 도 55에 도시된다. 혈장 및 다른 혈청 튜브들과 비교하여 프로트롬빈 활성제-함유 튜브들을 사용하여 얻어진 혈청에서 피브리노겐/fdp/FDP 농도는 현저하게 감소하였다. 또한 응고에 허용된 시간은 오직 5분이었으며 프로트롬빈 활성제-함유 튜브들은 다른 튜브들에서의 30분 또는 항응고된 혈액을 위한 튜브들에서의 60분과 비교되었다.

요약하면, 프로트롬빈 활성제를 포함하는 튜브들은 구입가능한 혈청 또는 혈장 튜브들을 사용하여 제조된 혈청 샘플에서 보다 잔류 피브리노겐/fdp/FDP의 낮은 농도를 갖는 혈청 샘플을 제공할 수 있었다. 표준 샘플들의 경우, 효과는 상대적으로 적었다. 하지만 헤파린화된 샘플들과 함께, 프로트롬빈 활성제는 상업용 혈청 튜브들에서 제조된 혈청과 비교하여 낮은 잔류 피브리노겐을 갖는 혈청을 제조할 수 있었다. 결과들은 모든 혈청 샘플들에서 잠재 응고 또는 침전을 피하기 위해 잔류 피브리노겐/fdp/FDP의 충분히 낮은 농도가 프로트롬빈 활성제를 이용함으로써 달성될 수 있을 것이라는 것을 제안한다. 높은 항응고제 투여(예를 들어, 심장 보호, 투석)를 받는 환자들로부터 "고품질" 혈청 및 심장 수술을 한 환자들로부터의 "완전하게 헤파린화된" 샘플들을 제공하는 이러한 능력은 유용하다.

실시예 10: 혈장 및 혈청 샘플들에서의 헤모글로빈 농도

용혈 지수는 화학 병리학에서 혈청 및 혈장 샘플들에 존재하는 헤모글로빈 및 따라서 세포 용해의 정도를 측정하기 위해 관례적으로 사용된다. 혈액 수집 및 혈청/혈장 제조 및 놓아둔 동안 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 포함하는 모든 형태들의 혈액 세포들의 용해는 인비보 발생할 수 있다. 인비보 세포 용해는 일반적으로 소형 게이지 바늘 또는 일반적으로 압력을 받는 이동 장치를 이용한 샘플들의 수집 또는 샘플들의 이동 동안 발생한다. 인비보 적혈구 용해만으로 용혈성 빈혈을 발생시킬 수 있다. 인비트로 세포의 용해 동안 세포 함유물들이 혈청 또는 혈장으로 방출되어 일부 분석물질들의 결과를 잘못되게 바꾼다; 용혈이 광범위한 경우 세포 함유물의 방출은 심지어 다른 분석물질들의 희석을 일으킬 수도 있다. 혈장 또는 혈청의 헤모글로빈은 분석 동안 스펙트럼 문제를 유발시킬 수 있으며 다른 세포 분석물질들은 교차 반응할 수 있다. 혈청은 일반적으로 리튬 헤파린 혈장보다 약간 높은 헤모글로빈을 포함하며, 이는 혈전이 확장하고 수축하기 때문에 소수의 세포를 용해하는 응고 과정에 기인한 것으로 생각된다. 따라서 낮은 헤모글로빈 농도는 "고품질" 혈청 샘플을 위한 중요한 기준이다.

다음 실험은 PtPA존재 및 부존재 하에서 및 리튬 헤파린을 이용하여 제조된 혈장에서 제조된 혈청의 헤모글로빈 함량을 비교하기 위해 수행되었다. 혈액 샘플들은 시트르산염 항응고 치료를 받는 2명의 환자 및 9명의 건강한 참가자들로부터 수집되었다. 샘플들은 그레이너 혈장 튜브들, 그레이너 혈청 튜브들, 및 PtPA(1.2 ㎍/4 mL의 혈액)를 포함하는 그레이너 배큐엣^TM 무첨가제 튜브들에 수집되었다. 수집 후 튜브들은 그레이너 혈장 튜브들 및 PtPA를 갖는 그레이너 배큐엣^TM 무첨가제 튜브들에 대해 5분간 그리고 그레이너 배큐엣^TM 무첨가제 튜브들(PtPA 없음)에 대해 30분간 원심분리되었다. 원심분리 후 30분 내에 헤모글로빈에 대해 샘플들을 분석하였다. 결과들은 표 63에 나타나있다.

표 63: 혈장 및 혈청 샘플들에서의 헤모글로빈 농도

샘플	헤모글로빈 농도( mg /L)
	그레이너 혈장	그레이너 혈청	PtPA 를 갖는 그레이너 배큐엣 TM 무첨가제 튜브들
샘플들의 수 (2명의 시트레이트 처리된 참가자 및 9명의 건강한 참가자)	11	11	11
평균	55	67	46
표준 편차	26	28	25

혈장 샘플들에서 평균 헤모글로빈 농도는 55 mg/L이었으며, 문헌들로부터 예상된 그레이너 샘플에서 확인된 67 mg/L보다 다소 낮았다. PtPA 혈청에 대한 평균값은 46 mg/L이었으며, 그레이너 혈청에 대해 확인된 것보다 상당히 낮았으며 심지어 혈장에 대해 확인된 것보다도 낮았다. 사람간에 따른 개인 편차 때문에 평균의 표준 편차들은 매우 크다. 이는 임의의 한 사람에 대한 세 가지 타입의 튜브들 사이에서 유의성의 추정을 제공하지 않는다. 이들 차이들의 유의성을 조사하기 위해 11개의 혈액 샘플들로부터의 자료를 이용하여 쌍 양방 검증 t-테스트(paired two tailed t-tests)를 수행하였다. 결과는 다음과 같다:

그레이너 혈장 v 그레이너 혈청: p = 0.1243

그레이너 혈청 v PtPA를 가진 그레이너 배큐엣^TM 무첨가제 튜브들: p = 0.0188(통계적으로 유의한 P<0.05)

그레이너 혈장 v PtPA를 가진 그레이너 배큐엣^TM 무첨가제 튜브: p = 0.1038

이러한 예로부터 도출될 수 있는 결론은 다음과 같다:

(1) 그레이너 혈장 튜브들에서 제조된 혈장 샘플에서의 헤모글로빈 농도는 문헌으로부터 예상된 대로, 그레이너 혈청 튜브들에서 제조된 혈청에서의 것보다 낮았다;

(2) PtPA를 가진 그레이너 배큐엣^TM 무첨가제 튜브들에서 제조된 혈청들에서의 헤모글로빈 농도는 그레이너 혈청에서의 것보다 현저하게 낮았다. 이들 혈청 샘플들에서 헤모글로빈의 낮은 수준은 훨씬 더 빠른 응고 속도를 반영할 수 있어, 응고 과정 동안 발생하는 세포 용해의 양을 제한한다; 및

(3) PtPA 혈청 샘플에서 평균 헤모글로빈 농도는 혈장 샘플의 것보다 낮았으며 차이는 유의성 경계이었다(p = 0.1038).

따라서, PtPA 튜브의 사용은 상업용 그레이너 혈청 튜브의 사용보다 헤모글로빈 함량 측면에서 고품질의 혈청들을 제공한다.

실시예 11: 혈장 및 혈청 샘플들에서 세포의 존재 및 세포 함량

구입가능한 튜브들에서 제조된 리튬 헤파린 혈장은 현탁액 또는 원심분리 후 혈장과 접촉하는 겔 장벽 상의 버피 코트층에서 잔류 세포를 포함한다. 구입가능한 튜브들에서 건강한 참가자 샘플들로부터 제조된 혈청은 (혈장과 비교하여) 혈청과 접촉하는 적은 세포를 포함한다. 재분석 또는 추가 분석들에 대한 요구들의 경우 2-8℃에서 적어도 7일 동안의 혈장 및 혈청의 보관은 국가 병리학 실험실 검증 자문회(NPACC)에 의해 호주에서 규제 요건이다. 혈청 또는 혈장의 보관 및 분석 동안 세포들의 존재는 두 가지 효과들을 가질 수 있다. 첫째로, 세포들은 용해할 수 있어, 세포 함유물질들(예를 들어, K⁺, 젖산 탈수소효소)을 혈청 또는 혈장으로 방출한다. 이는 원심분리 후 즉시 이루어지는 측정들 및 보관 기간 이후 측정들 사이에서 현저한 차이를 야기할 수 있다. 둘째로 세포는 저장 중에 대사적으로 활성 상태를 지속하며 상당한 양의 영양분들(예를 들어, 글루코오스)을 사용할 수 있으며 대사 산물들(예를 들어, 젖산)을 방출한다. 건강한 참가자들로부터의 샘플들이 일반적으로 추천되는 30분의 응고 시간 동안 저장되는 경우 변화들이 심지어 다수의 튜브들의 혈액 샘플들에서 관찰될 수 있다.

따라서 세포 오염의 정도는 혈청 샘플들에 대해 중요한 품질 기준이며 혈장 대신혈청을 사용하는 것의 중요한 이점이다.

PtPA를 이용하여 제조된 혈청을 그레이너 혈청 튜브들을 이용하여 제조된 혈청 및 그레이너 혈장 튜브들을 이용하여 제조된 리튬 헤파린 혈장과 비교하기 위해 다음 실험들을 수행하였다. 세포 및 세포 함유물질들에 의한 혈청 및 혈장 샘플들의 오염의 정도는 여러 가지 오염의 마커들을 이용하여 측정될 수 있다. 여기에서 사용된 세포 오염의 세 가지 마커들은: 보관 중 젖산 탈수소효소(LD) 활성의 증가; 보관 중 글루코오스 농도의 감소; 및 세포들의 직접 관찰이다.

실시예 11a: 구입가능한 튜브들에서 제조된 건강한 참가자들로부터의 PtPA 혈청과 리튬 헤파린 혈장과의 비교

그레이너 혈장 튜브, 및 PtPA를 포함하는 그레이너 혈청 튜브에서 10명의 건강한 참가자들로부터 혈액이 수집되고 다음과 같이 제조되었다. 튜브들을 무균 탈이온수로 채움으로써 그레이너 혈청 튜브들의 내부를 세정하여 그레이너 응혈원/첨가제를 제거하고, ~20회 뒤집고, 10분간 놓아둔 다음, 겔 장벽에 피해를 주지 않고 튜브의 내부벽 및 내부 일부를 무균 코튼 스왑으로 문질렀다. 내용물을 폐기하고 튜브들을 추가로 채우고/뒤집고/탈이온수로 3회 세정하였다. 세정된 튜브들은 최종적으로 40℃에서 건조 오븐에 위치시켜 PtPA를 분배(1.2 ㎍/4 mL의 혈액)하기 전에 물방울들을 완전히 건조시켰다. 그런 다음 혈액을 튜브들에 수집하였다. 각 참가자들로부터의 두 개의 튜브들(그레이너 혈장 및 PtPA)을 원심분리하고 젖산 탈수소효소(LD) 및 글루코오스(0 시간) 수준에 대해 즉시 분석하였다. 샘플들을 실온(21℃)에서 놓아두고 동일한 분석기 상에서 ~8시간 이후 재분석하였다. 결과들은 표 64 및 65에 나타나있다.

표 64: 0시간 및 21℃에서 보관된 8시간 후 원심분리에서 측정된 10명의 참가자들로부터의 샘플의 LD 활성(U/L)

A	그레이너 혈장				PtPA
	0 hr	8 hr	8-0 hr *	% 8-0 hr *	0 hr	8 hr	8-0 hr *	% 8-0 hr *
평균	177	199	22	+12.5	175	173	1.3	-0.6
SD	14	23	16	9.2	19	16	3.4	2.0

* = 8시간 및 0시간 사이의 차이 및 8시간 및 0시간 사이의 백분율 차이

표 65: 0시간 및 21℃에서 보관된 8시간 후 원심분리에서 측정된 10명의 참가자들로부터의 샘플의 글루코오스 농도(mmol/L)

B	그레이너 혈장				PtPA
	0 hr	8 hr	8-0 hr *	% 8-0 hr *	0 hr	8 hr	8-0 hr *	% 8-0 hr *
평균	5.1	4.7	0.5	-9.1	5.2	5.1	0.08	-1.5
SD	0.8	0.9	0.2	5.1	0.8	0.8	0.04	0.9

* = 8시간 및 0시간 사이의 차이 및 8시간 및 0시간 사이의 백분율 차이

PtPA 튜브들로부터의 혈청 샘플들에서, 그레이너 혈장 튜브 샘플들 각각에 대한 12.5% 및 9.1% 변화와 비교해 LD 및 글루코오스 결과들은 8시간 동안 6% 및 1.5% 변화를 보여준다. 혈장 샘플들에서, 세포들의 존재는 글루코오스 소비 및 용해된 세포들로부터의 유출에 의한 증가된 LD를 유발한다.

결과들은 PtPA를 가진 혈액의 응고는 세포를 효율적으로 제거하며 이는 8시간까지 가장 영향을 받은 분석물질들인 글루코오스 및 LD에서 임의의 현저한 변화를 막는다는 것을 확인한다. 따라서 혈청 튜브에서 PtPA의 포함은 건강한 참가자들의 혈액 샘플들로부터 고품질의 안정한 혈청을 제공하였다.

실시예 11b: 항응고된 환자들로부터 제조된 혈청 및 혈장의 세포 오염

혈액 수집 바로 전(헤파린 주입 후 15분 내)에 총: P1 - 30000, 및 P2 - 35000 units의 헤파린을 투여받은 심장 수술을 받은 두 명의 참가자들(P1 및 P2)로부터 혈액 샘플들이 수집되었다. 샘플들을 ~30 mL 혈액이 채워진 50 mL 플레인 주사기(BD Plastipak REF #300866)에 수집하였다. 수집 15분 내에 주사기를 실험실로 옮겼다. 다음 튜브들을 혈액으로 채웠다: 그레이너 혈장 튜브, 그레이너 혈청 튜브, 및 PtPA(1.2 ㎍/4 mL의 혈액)를 포함하는 그레이너 혈청 튜브(상기 절차에 따라 세정됨). 튜브들을 포함하는 혈장 및 PtPA를 실험실에 도착 즉시 원심분리하였다. 그레이너 혈청 튜브를 원심분리 전 60분간 놓아두었다. 샘플들을 분석한 다음 실온(21℃)에 놓아두고 동일한 분석기에서 24시간 후 재분석하였다. 결과들은 표 66 및 67에 나타나있다.

표 66: 0시간 및 21℃에서 보관된 24시간 후 원심분리에서 측정된 2명의 심장 수술 참가자들로부터의 샘플의 LD 활성(U/L)

A	그레이너 혈장				그레이너 혈청				PtPA 혈청
	0 hr	24 hrs	Dfce(24-0 hrs)	% Dfce(24-0 hrs)	0 hr	24 hrs	Dfce(24-0 hrs)	% Dfce(24-0 hrs)	0 hr	24 hrs	Dfce(24-0 hrs)	% Dfce(24-0 hrs)
평균	87	94	8	+9	87	98	11	+13	84	81	-3	-3
SD	11	1	9	12	8	9	1	1	9	10	1	1

표 67: 0시간 및 21℃에서 보관된 24시간 후 원심분리에서 측정된 2명의 심장 수술 참가자들로부터의 샘플의 글루코오스 농도(mmol/L)

B	그레이너 혈장				그레이너 혈청				PtPA 혈청
	0 hr	24 hrs	Dfce(24-0 hrs)	% Dfce(24-0 hrs)	0 hr	24 hrs	Dfce(24-0 hrs)	% Dfce(24-0 hrs)	0 hr	24 hrs	Dfce(24-0 hrs)	% Dfce(24-0 hrs)
평균	5.4	4.6	-0.8	-14.8	5.4	4.7	-0.8	-13.9	5.3	5.3	-0.1	-0.9
SD	0.1	0.1	0.0	0.4	0.1	0.1	0.1	1.0	0.1	0.1	0.1	1.3

PtPA-제조된 혈청 샘플들에서, LD 및 글루코오스 결과들은 리튬 헤파린 혈장에서의 9%, 및 -14.8% 변화, 및 혈청 샘플 각각에 대한 13% 및 -13.9% 변화와 비교해 24시간에서 -3 및 -0.9%의 변화를 보여준다. 실시예 11a의 건강한 참가자 군과 유사하게 혈장에서의 세포의 존재는 글루코오스 소비를 야기하며 세포 용해와 함께 LD의 활성이 증가된다. 그레이너 혈청 튜브들은 예상한 대로 혈장과 유사한 결과를 보여주며, 이는 샘플들이 절대 응고되지 않기 때문이다.

그레이너 혈청 튜브에서 원심분리 후 24시간 동안 혈액 응고 및 어떠한 눈으로 보이는 또는 분석기에 의해 탐지되는 잠재 응고가 관찰되지 않았다. PtPA-함유 튜브들에서의 샘플들은 3-5분 내에 응고된다. 참가자(P1)의 3개의 튜브들을 사진으로 찍어 겔 장벽의 상부 상의 세포들의 존재를 나타내었다. PtPA 튜브에서, 겔 장벽 상 또는 내부에 매우 적은 세포들이 존재하였으며, 겔 장벽을 통해서 및 겔 장벽 상에서 세포들이 보이는 다른 두 개의 튜브와는 대조적이었다.

3개의 튜브들의 각각으로부터 혈장 또는 혈청 성분의 대부분을 겔 장벽의 상부 상의 층의 손상 없이 부드럽게 제거하여, 튜브에서 혈장 또는 혈청의 약 0.5 mL를 남겼다. 각 튜브에서 잔류 혈장 또는 혈청을 버피 코트와 재혼합하고 슬라이드 원심분리기인 사이토스핀(Shandon-Elliott Cytospin, Shandon-Elliott Instruments Limited)으로 이동시켜 세포를 농축하여 현미경 관찰을 위한 세포의 김사 염색(Giemsa-stained) 슬라이드, 세포 기질(cell stroma) 등을 제조하였다. 슬라이드들(도 56에 도시됨)은 혈장에 풍부한 세포의 존재를 명확하게 나타내었으며, 그레이너 혈청에서는 약간 적었으며 PtPA-제조된 혈청에서 최소 세포들의 존재를 나타내었다.

이들 결과들은 PtPA를 가진 혈액의 응고가 이른바 "완전히 헤파린화된" 참가자들에서도 매우 짧은 시간 내인 <5분에 달성된다는 것을 확인한다. 원심분리 이후 잔류 세포들의 수는 최소이며 LD 활성 또는 글루코오스 농도에 효과를 갖기에는 불충분하다.

실시예 11c: 분석물질들에 대한 한 명의 심장 수술 참가자로부터의 혈청 및 혈장 샘플들의 장기적인 보관에 대한 효과

실온(21℃)에서 24시간 후 심장 수술 참가자(P2)로부터의 3 개의 샘플들을 추가적인 13일 동안(수집 후 총 14일 또는 336시간) 4℃에서 제 1 튜브에 보관한 다음 K⁺, 글루코오스, LD 및 인산염(Pi)에 대해 재분석하였다. 결과들은 표 68에 나타나있다.

표 68: 원심분리 후 0, 24 및 336시간에서 측정된 심장 수술 참가자로부터의 혈청 및 혈장 샘플에서의 분석물질의 농도

분석물질	0 hr	24 hrs	336 hrs	Dfce(24-0)	%Dfce(24-0)	Dfce(336-0)	%Dfce(336-0)
그레이너 혈장
K+(mmol/L)	4.7	4.6	4.9	-01	-2.1	0.2	4.3
글루코오스(mmol/L)	5.5	4.1	3.1	-1.4	-25.5	-2.4	-43.6
LD(U/L)	79	93	208	14	17.7	129	163.0
Pi(mmol/L)	0.59	0.6	0.69	0.01	1.7	0.1	16.9
그레이너 혈청
K+(mmol/L)	4.7	4.7	5.2	0	0	0.5	10.6
글루코오스(mmol/L)	5.5	4.7	3.8	-0.8	-14.5	-1.7	-30.9
LD(U/L)	81	91	180	10	12.3	99	122.2
Pi(mmol/L)	0.58	0.63	0.74	0.05	7.8	0.16	27.6
PtPA 혈청
K+(mmol/L)	4.6	4.6	4.6	0	0	0	0
글루코오스(mmol/L)	5.4	5.3	5.3	0.1	1.9	-0.1	-1.9
LD(U/L)	77	74	64	3	3.9	-13	-20.3
Pi(mmol/L)	0.57	0.58	0.65	-0.01	-1.8	0.08	12.3

리튬 헤파린 혈장 및 그레이너 튜브들로부터의 "혈청"과는 달리, PtPA 혈청 샘플들은 K⁺ 및 글루코오스 결과들에서 미미한 변화를 보여준 반면, LD 및 Pi 결과들은 최소 변화들을 보여주었다.

이러한 극단적인 경우의 시나리오에서, PtPA를 이용하여 제조된 혈청이 이후에 실험실이 추가적인 분석물질 테스팅을 제공하는 것을 허용할 것이며 신뢰를 가지는 가장 안정한 샘플 타입을 쉽게 제공하였으며 결과들이 정확할 것이다. PtPA 샘플에서의 Ld 활성에서의 20% 감소는 아마 보관 중 존재하는 LD의 느린 변성에 기인하였을 것이다.

전체적인 결론

혈청을 제조하는 PtPA는 모든 환자들에서 응고 및/또는 원심분리 과정 동안 겔 장벽 상의 혈장 또는 혈청 성분으로부터의 세포의 불완전 제거에 의해 가장 영향받기 쉬운 분석물질 농도에서 우수한 안정성을 제공한다. 우리의 결과들은 또한 직접 관찰에 의해 건강한 참가자들 또는 헤파린의 높은 투여량을 받는 환자들로부터 제조되는 그레이너 리튬 헤파린 혈장과 비교해 혈청을 제조하는 PtPA로부터의 세포들의 상대적인 부재를 보여준다.

실시예 12: 상업용 튜브들에서 제조된 혈장 및 혈청 샘플들 및 뱀독 프로트 롬빈 활성제들( 에카린 , PtPA , 및 OSPA )을 이용하여 제조된 혈청 샘플들에서 화학적 분석물질들의 측정

본 명세서의 앞 부분들에서 논의된 바와 같이, 현재 구입가능한 혈액 수집 튜브들은 최적의 환자 치료를 위한 생화학 실험실들로부터의 품질 및 턴-어라운드 시간 기대를 만족시키기 위해 시기적절하게 모든 혈액 샘플들로부터 완벽하게 응고된 혈청을 제공할 수 없다. 상기 실시예들에서 결과들은 다양한 환자들/개인들로부터의 혈액에서 프로트롬빈 활성제들이 낮은 수준의 피브리노겐/fdp/FDP를 가지며 세포 오염(혈청을 눈으로 보는 검사, 투명도 및 분석에 의해 측정됨)이 없는 양질의 혈청 샘플을 빠르게 제공하기 위해 사용될 수 있다는 것을 증명한다.

따라서 프로트롬빈 활성제들이 분석 또는 환자들의 임상 관리에 일반적으로 사용되는 분석물질들을 방해하는지 아닌지를 결정하는 것이 중요하다. 프로트롬빈 활성제들은 원칙적으로 분석적인 방법들에 수반되는 혈청 단백질 또는 단백질을 쪼갤 수 있는 단백질 가수 분해 효소들이며, 따라서 분석 결과들에 영향을 미친다. 단백질들은 관심 분석물질로서 또는 관심 분석물질들을 측정하기 위해 사용되는 반응물질들(예를 들어, 효소들, 항체들)로서 분석 방법들에 수반된다.

본 실시예의 목적은 프로트롬빈 활성제들을 이용하여 제조된 혈청이 현재 상업용 방법들을 사용하는 현재 구입가능한 튜브들에서 제조된 혈장 및 혈청과 동일한 분석 결과들을 나타내는지를 조사하는 것이다.

단일 혈청 또는 혈장 튜브로부터 30개 초과의 생화학적 분석물질들이 요청되고 수행되는 것은 드문 일이 아니다. 기술적인 발전에 의해 분석물질들의 범위가 증가하고 분석물질 당 분석 부피들이 감소할수록, 단일 튜브로부터의 분석들의 수는 추가적으로 증가할 것이다. 따라서 튜브 첨가제, 특히 응혈원들이 비활성이며 분석물질들에 대한 임의의 분석적 효과들을 부과하지 않으며, 또한 분석물질들의 가장 정확한 예측을 위한 최상의 품질의 샘플을 제공하는 것이 필수적이다.

표준 분석 테스트 절차들이 아래 열거된 33개의 분석들의 각각에 대한 다음 실험들에서 사용된다:

테스트 1: 나트륨(Na⁺)

테스트 2: 칼륨(K⁺)

테스트 3: 염화물(Cl^-)

테스트 4: 중탄산염(HCO₃ ^-)

테스트 5: 글루코오스(Gluc)

테스트 6: 요소(Urea)

테스트 7: 크레아티닌(Creat)

테스트 8: 요산염(Urate)

테스트 9: 총 단백질(TP 또는 T Prot)

테스트 10: 알부민(Alb)

테스트 11: 총 빌리루빈(T Bili)

테스트 12: 알칼리성 인산가수분해효소(ALP)

테스트 13: 감마-글루타밀 전이효소(GGT)

테스트 14: 알라닌 아미노전이효소(ALT)

테스트 15: 아스파르트산염 아미노전이효소(AST)

테스트 16: 젖산 탈수소효소(LD)

테스트 17: 크레아틴 키나아제(CK)

테스트 18: 총 칼슘(TCa)

테스트 19: 인산염(Pi 또는 Phos)

테스트 20: 마그네슘(Mg^{2 +})

테스트 21: 리파아제(Lipase)

테스트 22: 콜레스테롤(Chol)

테스트 23: 트리글리세라이드*

테스트 24: 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C 또는 HDL)

테스트 25: 철(Fe^{2 +})

테스트 26: 트랜스페린(Trf)

테스트 27: C 반응성 단백질(CRP)

테스트 28: 코르티솔 테스트(코르티솔)

테스트 29: 유리 티록신(FT4)

테스트 30: 갑상선 자극 호르몬(TSH)

테스트 31: 페리틴(ferritin)

테스트 32: 트로포닌(TnI)

테스트 33: 용혈 지수(Haem index)**

테스트 34: 황달(Icteric) 지수*

테스트 35: 지질혈증(Lipemia) 지수*

*PtPA 제제에서의 글리세롤의 존재 때문에 트리글리세라이드는 이들 실험들에서 측정되지 않았다. 황달 및 지질혈증 지수들은 또한 이 연구에서 측정되지 않았다.

** 실시예 10 참조.

테스트 분석

분석이 Beckman DxC800 일반 화학 분석기 및 DxI800 면역분석기(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)에서 수행되었다. 되풀이되는 잠재 응고에 맞닥뜨리는 것을 제외하고는 샘플들이 동일한 시간에 원심분리 후 1-2시간 내에 동일한 장치들 상에 로딩되었다.

테스트된 분석물질들과 반정량적인 용혈 수준들이 결과 표에 나열되었다. Beckman DxC800 분석기 및 DxI800 분석기 상에서 테스트된 35개의 분석물질들에 대한 두 개 및 세 개의 내부 품질 제어 농도들로부터의 검사 간 변동 계수(CVs)의 계수의 부정확성의 상한이 각각 표 69에 도시되어 있다. 우리는 또한 심장 간호 및 투석 참가자들에서 표본 수집 시기에 참가자들의 혈액 샘플들에서 정확한 항응고제 농도를 알아내기 어렵기 때문에 AC^TOPS(Instrumentation Laboratory, Lexington MA, USA)에 대한 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)을 측정하였다. 모든 경우들에서, 결과들은 항응고의 나열된 정도와 일치하였다.

자료 분석

각 테스트의 결과들을 얻은 다음 자료 분석을 다음과 같이 수행하였다. 튜브의 각 타입에 대한 각각의 테스트에 대해 평균 및 표준 편차(SD)를 계산하였다. 다른 튜브들(예를 들어, PtPA 튜브 결과 대 그레이너 혈청 결과 타입) 사이의 각 테스트에 대한 각 결과쌍 사이의 차이(실제 및 %)가 또한 계산되었다. 그런 다음 % 차이는 다른 혈청 튜브들 및 다른 혈청 튜브들 대 혈장 튜브들 사이의 분석적 유의성이 존재하는지를 결정하기 위해 분석기들 상에 얻어진 검사 간 정확도 값들과 비교되었다(표 69). 또한 참가자 자료를 건강한 참가자들 및 항응고된 참가자들로 분리하고 동일한 분석을 수행하였다. (불충분한 표본을 야기하는 되풀이되는 잠재 응고, 수집된 불충분한 표본, 분석기 상에서 요청되지 않은, 또는 불충분한 시약으로 인해) 만약 3개의 튜브들 중 임의에서의 분석물질에 대한 측정이 얻어지지 않는 경우, 결과는 분석 당 분석되는 많은 표본들의 가변성을 설명하는 계산에 포함되지 않는다.

표 69: Beckman DxC800 및 DxI800 분석기(*DxI800) 상의 품질 제어(QC) 부정확성

분석물질	QC 수준 1			QC 수준 2			QC 수준 3
	평균	SD	CV %	평균	SD	CV %	평균	SD	CV %
Na+	132	1.27	1.0	150	1.33	0.9
K+	3.9	0.06	1.4	6.0	0.07	1.2
Cl-	85	1.17	1.4	100	1.19	1.2
HCO3 -	17	0.66	3.8	29	0.85	2.9
Gluc	4.8	0.12	2.6	16.7	0.28	1.8
요소	5.2	0.17	3.3	15.9	0.41	2.6
Creat	68	3.34	4.9	491	8.93	1.8
요산염	0.23	0.001	1.9	0.49	0.01	1.5
T Prot	41	0.73	1.8	67	1.07	1.6
Alb	26	0.37	1.4	40	0.54	1.3
T Bili	21	1.37	6.4	93	1.96	2.1
ALP	106	2.79	2.6	471	7.93	1.7
GGT	38.7	2.03	5.3	155	2.88	1.9
ALT	25	1.52	6.2	94	2.00	2.1
AST	34	1.35	3.9	201	2.39	1.2
LD	149	3.21	2.2	408	5.65	1.4
CK	139	2.53	1.8	459	5.8	1.3
TCa	2.07	0.03	1.6	2.86	0.04	1.3
Phos	1.00	0.02	1.9	2.86	0.04	1.5
Mg2 +	0.84	0.02	2.5	1.63	0.04	2.3
리파아제	29	2.39	8.2	57	4.05	7.1
Chol	3.0	0.05	1.7	6.5	0.15	2.3
Trig	1.0	0.04	3.6	2.0	0.05	2.7
HDL	1.1	0.04	3.5	1.9	0.05	2.6
Fe2 +	10	0.29	2.8	34	1.93	5.7
Trf	1.0	0.04	3.5	2.3	0.08	3.5
CRP	4.6	0.36	7.9	10.0	0.55	5.4
TnI*	0.052	0.01	16.1	0.55	0.04	7.9	10.2	0.69	6.7
코르티솔*	139	8.85	6.4	552	28.48	5.2	906	41.7	4.6
fT4*	7.51	0.62	8.2	23.93	0.94	4.0	50.9	1.92	3.8
TSH*	0.71	0.05	7.1	4.17	0.26	6.3	23.1	1.53	6.6
페리틴*	19	1.68	8.8	159	9.67	6.1	358	22.42	6.3

실시예 12a: PtPA 혈청과 상업용 튜브들에서 제조된 혈청 및 리튬 헤파린 혈장의 비교

총 61명의 참가자들이 모집되었다. 모든 61명의 참가자들은 >18세의 성인이었으며, 남성과 여성의 혼합이었다. 참가자들은 두 개의 그룹: 26명의 건강한 지원자들 및 35명의 항응고된 환자들로 구성되어 있다.

35명의 항응고된 환자들 중 1명이 낮은 와파린 투여 치료를 받는 외래환자이었으며 34명이 입원환자들이었다.

34명의 입원환자들 중 11명이 심장 수술을 받았으며, 8명은 심장 간호 환자들이며, 15명은 투석 중이었다.

심장 수술을 받은 11명의 입원환자들은 헤파린 주입 후 30분 내인 혈액 수집 시기에 총 25,000-41,000 units의 헤파린을 투여받았다. 참가자들이 (심장이 아닌 기계에 의해 혈액이 펌프되는) 우회(bypass)를 받는 동안 표본들을 수집하였다.

8명의 심장 중환자실 참가자들을 표본 수집 전날 밤에 모집하고 시간당 950-1450 units의 헤파린을 IV 주입에 의해 헤파린을 투여하였다. 7명이 표본이 수집되는 시기에 IV 헤파린 주입(혈액 수집은 IV 헤파린 주입이 시작된 후 ≥12 시간이었다)을 지속하였으며, 나머지는 당일 수술로 인해 표본 수집 대략 3시간 전에 주입을 멈추어야 하였다(혈액 수집은 IV 헤파린 주입이 시작된 후 >9 시간 및 IV 헤파린 주입이 멈춘 후 ~3시간이었다). 환자 기록의 정보로부터 주입액(infusate)의 헤파린 농도 및 주입 속도는 참가자들에 대해 IV 헤파린 주입이 시작되고 혈액이 수집되는 사이의 기간 동안 변화가 없었다.

15명의 투석 중인 입원환자들 중 12명이 헤파린 IV 주입을 받았으며, 1명은 와파린/헤파린(~1750-7000 units의 헤파린, 최초 볼루스와 함께 매 시간마다 보충하는 투여) 주입을 받았으며 2명은 크렉산(clexane) 주입을 받았다. 투석이 시작되고 적어도 한 시간 후 이들 환자들로부터의 혈액을 수집하였다.

표준화된 뽑는 방식을 이용하여 혈액을 뽑았다. 건강한 지원자들로부터 정맥 천자(venipuncture)에 의해, 심장 환자들로부터의 우회 포트를 통해, 그리고 투석 환자들로부터의 혈통을 통해 혈액이 뽑아졌다. 다음의 튜브들이 사용되었다:

그레이너 배큐엣^TM 시트르산염 튜브(응고 연구용);

PtPA가 첨가된 그레이너 배큐엣^TM 무첨가제 튜브(1.2 ㎍/4 mL)(PtPA);

그레이너 배큐엣^TM 혈장 튜브(GLH);

BD 배큐테이너^TM 혈장/PST II 튜브(BDLH);

그레이너 배큐엣^TM 혈청 튜브(GRS);

BD 혈청 튜브/SST II(BDS); 및

BD RST 튜브(BD RST).

플레인 주사기에서 PtPA-함유 튜브에 대한 혈액을 수집한 후 세포 용해를 최소화하기 위해 바늘 없이 주사기로부터 PtPA를 포함하는 그레이너 튜브로 이동시켰다.

그레이너 혈청 및 BD SST 튜브들을 건강한 참가자들에 대해 30분의 표준 시간 동안 응고시키고 항응고된 참가자들에 대해서는 60분 동안 응고시켰다. 원심분리기에 로딩하기 전에 혈전 형성에 대해 이들 튜브들을 눈으로 보고 검사하였다.

수집(정맥 절개술 또는 임상 유닛) 시점에 모든 참가자들에 대해 5분에서 혈전 형성에 관해 BD RST 및 PtPA 튜브들을 눈으로 보고 검사하였다. 5분에서 딱딱한 혈전을 형성한 건강한 참가자들 및 항응고된 참가자들에 대한 BD RST 표본들을 실험실로 전달(<20 분)하자마자 원심분리하였다. 응고가 불완전한 경우 표본들은 매 10-15분 마다 응고에 대해 다시 체크되었으며 최대 60분 동안 응고되도록 놓아두었다. 리튬 헤파린 및 PtPA 튜브들을 실험실로 전달 즉시(수집으로부터 <20 분) 원심분리하였다.

스윙 버킷 원심분리기에서 20℃에서 10분간 3000g로 모든 튜브들을 원심분리한 다음 ~21℃에서 보관하였다. 원심분리 직후 및 분석기로 로딩하기 바로 전에 다시 튜브들을 눈으로 검사하고 잠재 응고를 검사하였다. 잠재 응고가 관찰된 경우를 제외하고 이들 튜브(제 1 튜브들)는 분석에 사용되었다. 잠재 응고가 관찰된 튜브들에서, 제 1 튜브들의 혈청은 분취량 튜브로 전달되고, 재 원심분리되어 혈전이 제거되었으며, 깨끗한 혈청은 분석에 사용되는 또 다른 분취량 튜브(제 2 튜브)로 전달되었다. 그레이너 무첨가제 튜브는 혈청 겔 장벽을 포함하지 않으며, 따라서 PtPA 형성된 혈청이 또한 분석을 위해 제 2 튜브로 이동되어 재혼합을 방지하며 세포와의 접촉을 늘린다.

결과

결과들이 표 70에 나타나 있다. 또한, 총 단백질(TP)의 측정에 대한 결과들의 예시가 도 57에 제공된다. 왼쪽 그래프는 각 튜브 타입들에 대한 모든 표준 환자 결과들(n=26)의 표준 편차값을 갖는 평균을 도시한다. 가운데 그래프는 각 튜브 타입들에 대한 모든 표준 환자 결과들(n=61)의 평균값을 도시한다. 오른쪽 그래프는 각 튜브 타입들에 대한 심장 환자들(n=11)에 대한 결과들의 평균값을 도시한다. y-축에 대한 단위는 g/L 단백질이다. 오차 막대(error bars)는 표준 편차이다.

PtPA 혈청들과 건강한 및 항응고된 참가자들로부터의 상업용 튜브 혈청들과의 비교. 분석물질들의 어떤 것과도 현저한 차이는 관찰되지 않았다. 이러한 결론은 표 70 및 상기에 기술된 쌍방식 통계적 분석의 평균 테스트 값들의 비교에 기반한다.

PtPA 혈청들과 건강한 및 항응고된 참가자들로부터의 상업용 튜브 리튬 헤파린 혈장과의 비교. 혈장 및 혈청 사이의 잘 정립된 차이들 때문에 예상한 대로 일부 분석물질들(K⁺, TP, AST 및 Pi)에서 현저한 차이가 관찰되었다. 구입가능한 혈청 튜브들에서 제조된 혈청들은 PtPA 혈청들을 가진 혈장에서 보여진 것과 유사한 분석적 차이들을 보여주었다.

표 70: 혈청 및 혈장 샘플들에 대한 32개의 분석물질들에 대한 분석 자료

			평균±SD
샘플들의 수	분석물질	단위	PtPA	GLH	BDLH	GS	BDS	BD RST
60	Na+	mmol/L	136.9 ± 2.24	137.4 ± 2.44	137.2 ±2.38	137.5 ±2.29	137.5 ±2.34	137.4 ±2.38
61	K+	mmol/L	4.09 ± 0.59	3.91 ± 0.63	3.93 ± 0.65	4.13 ± 0.62	4.15 ± 0.60	4.07 ± 0.60
61	Cl-	mmol/L	104.1 ± 3.8	104.6 ± 4.2	104.8 ±4.1	104.6 ±4.0	104.8 ±3.8	104.7 ±3.9
61	HCO3 -	mmol/L	24.8 ± 2.8	25.8 ± 3.0	25.3 ±2.7	25.7 ±3.1	25.1 ±2.9	25.0 ±3.0
61	Gluc	mmol/L	6.2 ±2.09	6.3 ±2.15	6.3 ±2.11	6.2 ±2.07	6.2 ±2.11	6.3 ±2.08
61	Urea	mmol/L	5.3 ±2.0	5.3 ±2.0	5.4 ±2.0	5.3 ±2.1	5.4 ±2.1	5.3 ±2.1
61	Creat	μmol/L	134.1 ±112.8	135.1 ±115.0	136.3 ±114.7	137.1 ±116.0	136.7 ±116.0	138.1 ±116.6
60	Urate	mmol/L	0.27 ±0.11	0.27 ±0.12	0.27 ±0.12	0.28 ±0.11	0.28 ±0.11	0.27 ±0.12
61	TP	g/L	62.6 ±13.0	65.0 ±13.2	65.5 ±13.3	63.0 ±12.6	63.0 ±12.5	62.8 ±12.6
61	Alb	g/L	36.1 ±8.3	35.9 ±8.1	35.9 ±8.1	36.1 ±8.3	36.1 ±8.3	36.2 ±8.3
58	T Bili	μmol/L	13.5 ±3.8	13.6 ±3.7	13.4 ±3.4	13.3 ±3.6	13.4 ±4.0	13.2 ±3.8
61	ALP	U/L	74.1 ±26.9	68.9 ±26.5	69.4 ±26.6	71.3 ±26.9	71.7 ±27.5	71.4 ±26.9
61	GGT	U/L	27.9 ±17.6	28.3 ±17.0	28.1 ±16.9	27.3 ±17.1	28.1 ±17.1	27.8 ±17.5
61	§ALT	U/L	30.4 ±19.9	29.6 ±18.8	29.6 ±19.1	30.4 ±19.1	29.8 ±19.2	30.7 ±20.1
59	§AST	U/L	34.2 ±37.7	32.5 ±37.5	32.6 ±36.9	32.0 ±34.9	32.6 ±38.7	32.4 ±39.1
58	§LD	U/L	212.9 ±110.0	215.4 ±113.1	215.3 ±110.7	213.8± 106.0	222.8 ±120.0	212.5 ±119.2
59	§CK	U/L	147.1 ±250.3	146.6 ±250.0	145.3 ±242.8	146.0 ±241.3	149.4 ±259.6	147.7 ±253.3
61	TCa	mmol/L	2.19 ±0.26	2.17 ±0.24	2.17 ±0.24	2.20 ±0.26	2.20 ±0.26	2.19 ±0.26
61	Pi	mmol/L	1.07 ±0.28	1.02 ±0.28	1.02 ±0.28	1.08 ±0.30	1.08 ±0.30	1.08 ±0.30
57	Mg2 +	mmol/L	0.94 ±0.19	0.95 ±0.20	0.94 0.19	0.94 ±0.18	0.94 ±0.20	0.93 ±0.20
59	Lipase	U/L	28.2 ±9.0	28.3 ±9.0	28.3 ±8.9	28.2 ±9.0	28.6 ±9.2	28.2 ±9.0
57	Chol	mmol/L	4.2 ±1.6	4.2 ±1.6	4.2 ±1.6	4.3 ±1.6	4.3 ±1.6	4.3 ±1.6
58	HDL-C	mmol/L	1.17 ±0.6	1.25 ±0.58	1.26 ±0.60	1.20 ±0.58	1.21 ±0.58	1.21 ±0.59
59	Fe2 +	μmol/L	14.6 ±6.6	14.5 ±6.5	14.6 ±6.7	14.7 ±6.7	14.9 ±6.7	14.6 ±6.6
59	Trf	g/L	2.17 ±0.74	2.13 ±0.71	2.14 ±0.72	2.17 ±0.73	2.19 ±0.73	2.18 ±0.77
57	CRP	μg/L	14.4 ±49.3	14.5 ±49.5	14.6 ±50.5	14.2 ±46.8	15.0 ±52.3	15.1 ±52.4
59	Cortisol*	nmol/L	356 ±247	354 ±241	356 ±254	356 ±249	352 ±248	358 ±250
60	FT4*	Pmol/L	13.6 ±4.1	12.7 ±3.7	12.7 ±3.6	12.7 ±3.9	12.7 ±3.9	12.8 ±3.7
61	TSH*	μIU/mL	1.81 ±2.12	1.87 ±2.05	1.89 ±2.12	1.83 ±2.10	1.82 ±2.02	1.86 ±2.08
43	Ferritin*	μg/L	204 ±191	199 ±191	202 ±192	208 ±203	207 ±198	204 ±187
60	§TnI*	μg/L	0.873 ±5.33	0.994 ±6.06	0.945 ±5.75	0.782 ±4.77	0.869 ±5.25	0.951 ±5.75
61	Haem Index		0.2 ±0.7	0.2 ±0.7	0.3 ±0.7	0.3 ±0.7	0.2 ±0.7	0.2 ±0.7

* 분석은 DxI800 면역분석 분석기 상에서 수행되었다.

§는 사용된 비-모수(non-parametric) 분포를 나타낸다. p 값은 Wilcoxen Matched-Paris Ranks 테스트에 의해 결정되었다.

실시예 12b: PtPA , OsPA 및 에카린 혈청과 상업용 튜브들에서 제조된 혈청 및 혈장의 비교

4명의 남성 및 1명의 여성으로 혼합된 5명의 건강한 지원자들, 및 심장 수술을 받은 2명의 환자들로 이루어진 7명의 참가자들(모두 >18세의 성인)을 모집하였다. 두 명의 심장 환자들은 헤파린 주입 후 30분 내에 34,000 및 43,000 units의 헤파린을 투여받았다.

표준화된 뽑는 순서를 이용한 정맥 천자에 의해 건강한 참가자들로부터의 혈액을 뽑았다: 그레이너 시트르산염 혈장 튜브; 그레이너 혈청 튜브; 그레이너 혈장 튜브; PtPA, OsPA 또는 에카린 함유 그레이너 무첨가제 튜브들(이들 4 mL 튜브들에서 프로트롬빈 활성제들의 농도는 PtPA 1.2㎍, OsPA 0.5㎍ 및 건강한 참가자들에 대해 에카린 0.625 units 및 심장 수술 참가자들에 대해 1.25 units이었다)의 경우 플레인 주사기(Thermo 10 mL #CE0197). 주사기로부터의 혈액은 세포 용해를 최소화하기 위해 바늘 없이 프로트롬빈 활성제를 함유하는 그레이너 무첨가제 튜브로 전달되었다.

심장 참가자들의 경우 우회 동안 혈액을 플레인 주사기(30 mL)에 수집하였다. 혈액을 15분 내에 실험실로 전달하고, 상기 열거한 다양한 튜브들에 분배하였다.

그레이너 혈청 튜브들을 건강한 참가자들에 대해 30분의 표준 시간 동안 응고시키고 심장 수술을 받은 참가자들에 대해서는 60분 동안 응고시킨 다음 원심분리기에 로딩하기 전에 혈전 형성에 대해 이들 튜브들을 눈으로 보고 검사하였다. 수집 시점(건강한 참가자들에 대해서는 정맥 절개술 및 심장 수술 참가자들에 대해서는 임상 유닛에서)에서 모든 참가자들에 대해 혈전 형성에 관해 3 및 5분 마크에서 PtPA, OsPA 및 에카린 표본들을 눈으로 보고 검사하였다. 리튬 헤파린, 실험실에 전달 즉시(수집으로부터 <30분) PtPA, OsPA 및 에카린 튜브들을 원심분리하였다.

스윙 버킷 원심분리기에서 20℃에서 10분간 3000g로 모든 튜브들을 원심분리한 다음 ~21℃에서 보관하였다. 원심분리 직후 및 분석기로 로딩하기 바로 전에 다시 튜브들을 눈으로 검사하고 잠재 응고를 검사하였다. 그레이너 제 1 튜브들을 분석에 사용하였다. 그레이너 무첨가제 튜브는 혈청 겔 장벽을 포함하지 않으며, 따라서 프로트롬빈 활성제를 사용하여 형성된 혈청이 분취(제 2) 튜브들로 전달되어 재혼합을 방지하며 세포와의 접촉을 늘린다.

결과

결과들은 표 71에 도시되어 있으며 다음 결론들을 뒷받침한다:

1. 프로트롬빈 활성제들 대 그레이너 혈청들에 의해 생성된 혈청들의 비교 - 분석물질들의 어떤 것과도 현저한 차이는 관찰되지 않았다.

2. 프로트롬빈 활성제들 대 그레이너 리튬 헤파린 혈장들에 의해 생성된 혈청들의 비교 - 혈장 및 혈청 사이의 잘 정립된 차이들 때문에 예상한 대로 일부 분석물질들(K⁺, TP, AST 및 Pi)에서 현저한 차이가 관찰되었다. 상업용 혈청 튜브들에서 제조된 혈청들은 프로트롬빈 활성제 혈청들을 가진 혈장에서 보여진 것과 유사한 분석적 차이들을 보여주었다.

표 71: 세 가지의 서로 다른 뱀 응혈원 및 그레이너 튜브로부터의 각 분석물질들에 대한 데이터

샘 플들 의 수	분석물질	평균± SD
		단위	GLH	GS	PtPA	OsPA	에카린
7	Na+	mmol/L	138.1±1.22	138.1±1.46	137.3±1.25	136.7±2.36	137.1±1.57
7	K+	mmol/L	4.40±0.82	4.61±0.71	4.53±00.77	4.50±0.76	4.49±0.79
7	Cl-	mmol/L	104.0±2.8	104.0±2.6	103.0±2.6	102.9±2.34	103.4±2.4
7	HCO3 -	mmol/L	25.1±3.2	25.3±3.5	23.9±2.4	24.1±2.7	23.3±2.2
7	Gluc	mmol/L	5.76±0.88	5.69±0.94	5.63±0.0.81	5.60±0.80	5.64±0.0.90
7	Urea	mmol/L	4.63±0.82	4.66±0.80	4.64±0.85	4.54±0.83	4.54±0.88
7	Creat	μmol/L	75.1±10.9	76.7±12.35	75.9±12.10	76.29±12.54	75.0±12.7
7	Urate	mmol/L	0.33±0.08	0.33±0.08	0.33±0.08	0.32±0.07	0.32±0.08
7	TP	g/L	68.5±11.0	62.7±11.6	63.9±11.8	62.4±14.1	63.4±13.4
7	Alb	g/L	38.3±5.5	38.3±5.5	38.6±5.8	38.4±6.0	38.6±5.8
7	T Bili	μmol/L	15.6±4.6	16.6±4.7	16.4±4.5	16.1±4.6	15.7±5.2
7	ALP	U/L	65.7±18.6	66.0±18.4	66.1±20.7	69.3±16.7	67.9±18.7
7	GGT	U/L	27.4±15.2	25.1±15.0	25.4±14.7	25.7±15.8	24.9±15.8
7	§ALT	U/L	30.4±11.4	31.0±11.8	32.0±11.4	31.7±12.2	32.1±11.8
7	§AST1	U/L	22.6±7.8	25.0±8.3	24.1±7.2	24.9±6.5	24.9±6.7
7	§LD	U/L	194.4±23.1	193.6±41.6	195.6±22.4	189.0±18.9	192.7±21.2
7	§CK	U/L	98.9±34.9	97.9±37.5	98.6±36.8	97.1±34.0	98.0±36.1
7	TCa	mmol/L	2.20±0.236	2.23±0.245	2.22±0.255	2.20±0260	2.21±0.25
7	Pi	mmol/L	1.13±0.13	1.18±0.14	1.19±0.13	1.16±0.14	1.17±0.13
7	Mg2 +	mmol/L	1.04±0.23	1.06±0.22	1.03±0.20	1.03±0.19	1.04±0.21
7	Chol	mmol/L	4.3±1.7	4.3±1.7	4.3±1.7	4.3±1.7	4.3±1.7
7	HDL-C	mmol/L	1.07±0.27	1.04±0.23	1.01±0.27	1.03±0.28	1.01±0.06
7	Fe2 +	μmol/L	16.1±5.8	16.3±5.9	16.4±5.8	16.4±5.7	16.1±5.8
7	Trf	g/L	2.18±0.51	2.18±0.51	2.21±0.54	2.20±0.53	2.21±0.55
7	CRP	μg/L	1.7±1.5	1.9±1.6	1.7±1.5	1.9±1.6	1.7±1.5
7	Cortisol*	nmol/L	382.1±251.4	379.7±247.2	373.6±256.9	366.3±241.2	359.3±237.7
7	FT4*	Pmol/L	13.53±2.63	13.56±3.26	13.46±1.2.3	13.76±3.17	14.23±3.13
7	FT3*	Pmol/L	4.83±0.35	4.66±0.43	4.91±0.51	4.74±0.35	4.97±0.48
7	TSH*	μIU/mL	1.86±0.48	1.88±0.56	1.72±0.30	1.75±0.30	1.73±0.32
7	Ferritin*	μg/L	236.6±297.2	234.9±304.8	226.4±280.8	207.3±236.5	225.3±280.1
7	§TnI*	μg/L	0.079±0.136	0.071±0.137	0.091±0.165	0.092±0.170	0.093±0.174
7	Haem Index		0.4±0.5	0.6±0.8	0.6±0.5	0.4±0.5	0.4±0.5

§는 사용된 비-모수(non-parametric) 분포를 나타낸다. p 값은 Wilcoxen Matched-Paris Ranks 테스트에 의해 결정되었다.

* 분석은 DxI800 면역분석 분석기 상에서 수행되었다.

실시예 12의 요약

PtPA, OsPA 및 에카린-함유 튜브들에서 가장 낮은 투여량에서부터 가장 높은 "완전하게" 헤파린화된 참가자들에 걸친 모든 건강한 참가자들 및 항응고된 참가자들의 혈액은 5분 내에 응고되어 딱딱하고 움직이지 않는 혈전이 되었다. 프로트롬빈 활성제들에 의해 제조된 혈청들의 어느 것에서도 어떠한 잠재 응고도 눈으로 관찰되거나 분석기에 의해 탐지되지 않았다. 단백질 가수 분해 효소들인 프로트롬빈 활성제들에도 불구하고 이들은 분석물질들이 단백질인지 또는 분석적 방법들에서 단백질들이 반응 화합물로 사용되는지에 관계없이 측정된 분석물질들의 어느 것에 대해서도 어떠한 분석적인 또는 임상적인 현저한 효과를 제공하지 않았다. 상업용 튜브에서 제조된 혈청들 및 프로트롬빈 활성제를 사용하여 제조된 혈청들 사이의 분석물질들의 어느 것에서도 현저한 차이는 없었다. 상업용 튜브에서 제조된 리튬 헤파린 혈장들 및 프로트롬빈 활성제를 사용하여 제조된 혈청들 사이의 분석물질들에서 관찰된 분석적 및 임상적 차이들은 발행된 자료들과 비슷하였다.

실시예 13: 상업용 튜브들에서 제조된 혈장 및 혈청 샘플들 및 뱀독 프로트롬빈 활성제들( 노테카린 및 카린액타바아제 -2)을 이용하여 제조된 혈청 샘플들에서 생화학적 분석물질들의 추가 측정

본 실시예는 실시예 12에 따르며 실시예 12에 기재된 것과 동일한 방법을 사용한다.

실시예 13a: 분석물질 측정

5명의 건강한 참가자들로부터의 혈액을 25 ㎍의 노테카린 또는 카린액타바아제-2가 첨가된 그레이너 무첨가제 튜브들(Cat No 454001)에 수집하여 12 nmol/mL 및 45 nmol/mL의 농도를 각각 나타내었다. 그레이너 배큐엣 혈청 튜브들(Cat No 456078; GS)을 대조군으로 사용하였다. 원심분리 전 제조사의 추천대로 GS 튜브들을 30분 동안 응고시켰다. 혈액의 첨가 후 즉시 응고에 관해 프로트롬빈 활성제들을 포함하는 튜브들을 관찰하였다.

2분 이내에 응고된 노테카린 및 카린액타바아제-2 튜브들을 수집 7 내지 15분 내에 실험실로 가져와 원심분리하였다. 활성제를 포함하는 튜브들에 형성된 혈전은 고체였으며, 잠재 혈전 형성은 관찰되거나 탐지되지 않았다.

그 다음 31개의 분석물질들에 대해 샘플들을 분석하였으며, 결과들이 표 72에 나타나있다. 27개의 분석물질들의 경우, 얻어진 값들은 실험적 오차 내에서 동일하였으며, 결과 쌍들 사이의 차이들은 최소유의변화값(the least significant change)(LSC%) 보다 적었다. 차이들이 기술된 LSC 보다 큰 결과들(강조됨)은 다음과 같이 설명될 수 있다:

(1) LD의 경우, 두 개의 프로트롬빈 활성제 샘플들에서의 약간 낮은 활성들은 그레이너 혈청들과 비교해 이들의 감소된 세포 오염을 반영할 수 있다;

(2) 노테카린 샘플에서 높은 트리글리세라이드(Trig) 수준은 노테카린이 저장되는 글리세롤에 의한 간섭에 기인한다;

(3) 노테카린 혈청은 높은 AST 수준을 생성하였지만 차이들은 임상적으로 현저하지 않다;

(4) 5명의 환자들에 대한 트로포닌 결과들은 정확한 구별을 위해서는 너무 낮았다.

표 72: 노테카린 및 카린액타바아제-2에 의해 생성된 혈청 샘플들에 대한 분석 결과들.

샘플들의 수	분석물질		평균 ± SD			N otec -GS	CA2-GS	LSC (%)	CAL (%)
		단위	GS	노테카린	CA -2	쌍들 간의 평균 차이(%)	쌍들 간의 평균 차이 (%)
5	Na+	mmol/L	138.6±1.5	138±1.6	138±1.5	-0.4	-0.4	2.8	3
5	K+	mmol/L	3.94±0.17	3.94±0.18	3.83±0.18	0	-2.9	3.3	5
5	Cl-	mmol/L	104.2±2.4	104.2±2.7	106.5±2.6	0	2.2	3.3	5
5	HCO3 -	mmol/L	26.8±2.6	25.6±2.5	25.6±2.2	-4.5	-4.5	4.8	10
5	Gluc	mmol/L	4.86±0.86	4.76±0.82	4.74±0.65	-2.1	-2.4	4.4	10
5	Urea	mmol/L	5.58±2.49	5.56±2.44	5.55±2.42	-0.4	-0.5	5.0	10
5	Creat	μmol/L	69.2±25.0	69.2±22.9	67.2±22.9	-2.9	-2.9	5.5	10
5	Urate	mmol/L	0.242±0.026	0.240±0.026	0.240±0.023	-0.8	-1.2	3.8	10
5	TP	g/L	66.0±2.0	65.0±2.2	63.6±2.4	-1.5	-3.3	3.5	5
5	Alb	g/L	40.8±1.9	40.2±1.9	39.5±1.4	-1.5	-3.1	3.2	5
5	T Bili	μmol/L	11.4±8.8	11.6±9.0	10.6±6.9	1.8	-7.0	7.0	10
5	ALP	U/L	60.0±4.1	60.4±4.2	58.4±4.3	0.7	-2.6	4.8	10
5	GGT	U/L	14.6±4.9	14.4±6.5	14.8±5.0	-1.4	1.2	7.3	10
5	ALT	U/L	22.6±8.0	23.2±7.6	23.9±7.6	2.7	5.8	6.8	10
5	AST	U/L	17.2±3.8	19.8±4.4	17.3±3.5	15.1 §	0.4	6.2	10
5	LD	U/L	192.2±17.0	184.8±18.3	179.9±17.6	-3.9 §	-6.3 §	3.7	15
5	CK	U/L	81.4±15.9	81.0±15.4	78.8±14.1	-0.5	-3.2	3.7	15
5	TCa	mmol/L	2.330±0.07	2.290±0.07	2.267±0.07	-1.7	-2.7	3.5	5
5	Pi	mmol/L	1.314±0.118	1.282±0.117	1.271±0.099	-2.4	-3.3	3.8	10
5	Mg2 +	mmol/L	0.804±0.046	0.802±0.051	0.792±0.054	-0.3	-1.4	4.4	10
5	Chol	mmol/L	4.84±0.35	4.78±0.39	4.70±0.34	-1.2	-2.9	3.6	10
5	Trig	mmol/L	1.52±0.55	5.61±0.96	1.56±0.65	269# §	2.6	5.3	10
5	HDL-C	mmol/L	1.420±0.399	1.424±0.293	1.388±0.277	0.3	-2.6	5.2	10
5	Fe2 +	μmol/L	17.2±3.8	16.8±4.1	16.6±3.6	-2.3	-3.3	3.7	10
5	Trf	g/L	2.596±0.187	2.566±0.188	2.508±0.188	-1.16	-3.4	4.8	10
5	Cortisol*	nmol/L	236.0±27.2	244.4±21.5	231.9±297.7	3.6	-1.7	6.4	15
5	FT4*	Pmol/L	10.54±1.45	11.38±2.05	11.08±1.05	-2.7	5.1	6.5	30
5	TSH*	μIU/mL	1.142±0.783	1.142±0.783	1.080±0.783	1.1	-4.5	7.3	15
5	Ferritin*	μg/L	43.6±20	43.6±17.5	14.2±17.7	0.0	1.4	7.2	15
5	TnI*	μg/L	0.009±0.003	0.010±0.005	0.011±0.002	11.6	25.6	14	30
5	Haem Index		0±0	0±0	0±0	0	0

분석은 Beckman DxC800 및 *DxI800 면역분석 분석기 상에서 수행되었다.

§= LSC 및/또는 CAL을 초과하는 차이의 결과들

실시예 13b: 분석물질 안정성

계면활성제 및 응혈원은 제거하지만 겔 장벽은 남겨두도록 그레이너 혈청 튜브들을 세정(증류수로 x5)한 다음 오븐 건조하였다. 노테카린 및 카린액타바아제-2(25μL 분취량들)를 튜브들에 첨가하여 각각 12 nmol/mL 및 45 nmol/mL의 농도를 만들었다. 노테카린을 포함하는 하나의 튜브 및 카린액타바아제-2를 포함하는 하나의 튜브에 건강한 지원자로부터의 혈액(5 mL)을 수집하였다. 5분 후 튜브들을 원심분리하였다. 혈청 제조 후 3시간 간격으로 K⁺, 글루코오스, LD 및 인산염 수준을 측정하였다. 그 다음 샘플들을 5시간 동안 23 ℃에서 보관한 후 4℃에서 5 내지 26.5 시간 동안 보관하였다. 또한 헤모글로빈의 수준을 측정하였다.

결과들은 표 73에 나타나있다.

표 73: 노테카린 및 카린액타바아제-2에 의해 제조된 혈청 샘플들에서 분석물질들의 안정성

분석물질	0 시간	5 시간	26.5 시간	혈청 Hb mg /L
노테카린				32
K+	4.0	4.1	4.0
글루코오스	5.4	5.3	5.1
LD	176	175	173
인산염	1.05	1.13	1.05
카린액타바아제 2				46
K+	3.9	3.9	3.9
글루코오스	5.3	5.0	4.9
LD	176	177	170
인산염	1.03	1.04	1.06

<50 mg/L의 헤모글로빈 수준은 임상적으로 미미한 것으로 여겨진다. 따라서 이들 결과들은 프로트롬빈 활성제들에 의해 제조된 혈청 샘플들이 효과적으로 헤모글로빈을 포함하지 않으며(따라서 응고 과정 동안 용혈이 거의 없다), 세포 오염이 없는 것을 나타낸다. 만약 세포 또는 세포 잔해들이 존재했었다면, 보관 중에 K⁺, LD 및 인산염의 농도는 증가하였을 것이며 글루코오스의 농도는 감소하였을 것이다. 혈청들의 샘플들을 취하여 사이토스핀 방법을 이용해 세포에 대해 분석하였다. 매우 적은 수의 세포들이 탐지되었다.

요약하면, 응고의 환전성, 분석 결과들 및 세포 오염의 부존재에 기초하여 그룹 B 프로트롬빈 활성제(카린액타바아제-2) 및 그룹 D 프로트롬빈 활성제(노테카린)를 이용하여 제조된 혈청 샘플들이 고품질이었다.

실시예 14: 상업용 튜브들에서 제조된 혈장 및 혈청 샘플 및 프로트롬빈 활성제-함유 뱀독들을 이용해 제조된 혈청 샘플들에서 생화학적 분석물질들의 측정

본 실시예는 실시예 12 및 13에 기술된 것과 동일한 분석물질 분석 방법을 이용한다.

선행 실시예들에서 나타난 발견들은 뱀 독 프로트롬빈 활성제들이 임상 환경에서 응혈원으로의 사용에 적절할 것이라는 것을 놀랍게 증명한다. 그런 다음 이는 이들 프로트롬빈 활성제들을 포함하는 미정제 독들이 프로트롬빈 활성제들의 선 정제 없이 혈액 응고 장치들에서 사용될 수 있을지에 대한 문제를 제기하였다.

따라서 인간 혈액 샘플들로부터 고품질 혈청을 빠르게 제공하기 위해 뱀독들이 사용될 수 있는지를 보이기 위해 다음 실험들이 설계되고 수행되었다. 사용된 뱀독의 양은 선행 실험들에서 사용된 정제된 프로트롬빈 활성제들의 대략 4배이었으며, 뱀독들이 프로트롬빈 활성제들 이외에 다른 단백질을 포함한다는 사실을 반영하였다.

실시예 14a: 응고 튜브들에서 응혈원으로서 미정제 P. textilis 및 O. scutellatus 뱀독들의 사용

P. textilis 또는 O. scutellatus 독 2 및 4 ㎍(4 ㎍ O. scutellatus 뱀독에 대해서는 이중으로)을 포함하는 10개의 그레이너 무첨가제 튜브들(#454001, Griener Bio-One, Kremsmuster, Austraia)(4 mL 용량)에 2명의 건강한 지원자들로부터의 혈액을 수집하였다. 또한 비교를 위해 그레이너 표준 혈청 튜브들(#456071, Greiner Bio-One, Kremsmuster, Austraia) 혈액 샘플들을 수집하였다.

2분 안에 육안 관찰에 의해 뱀독 함유 튜브들에서의 응고가 완전하게 나타났다. 뱀독 함유 튜브들의 샘플들은 15분 후, 그레이너 튜브들의 샘플들은 30분 후에 원심분리되었다. 3000g, 10분 및 20℃에서 샘플들을 원심분리하였다(Hereaus 1 S-R centrifuge, Germany). 관찰 및 분석을 위해 Beckman 플레인 플라스틱 튜브들(#448778, Beckman coulter, Brea, CA, USA)로 그레이너 무첨가제 튜브들로부터의 혈청들을 즉시 옮겼다. 뱀독 함유 튜브들의 약 절반(10개 중 6개)에서 잠재 응고가 관찰되었으나 그레이너 혈청 튜브들의 어느 것에서도 잠재 응고가 관찰되지 않았다. 이는 일부 튜브들에서, 사용된 뱀독의 농도에서 응고가 불완전하다는 것을 알려준다. 31개의 분석물질들에 대해 세포, 세포 기질 및 잠재 혈전을 제거하기 위해 플레인 플라스틱 튜브들의 샘플들은 재원심분리하였으며 얻어진 깨끗한 혈청들을 2시간 내에 분석하였다. Beckman DxC800 일반 화학 분석기 및 DxI800 면역분석기(Beckman Coulter, Brea, CA, USA) 상에서 31개의 분석물질들에 대하여 원심분리 후 2시간 내에 샘플 분석을 수행하였다. 12개(4개의 P. textilis 혈청들 및 6개의 O. scutellatus 혈청들 및 2개의 그레이너 혈청들)의 혈청들에 대해 얻어진 결과들 사이의 테스트된 농도 수준들에서 임상적으로 현저한 차이가 없었다.

결과들은 표 74에 나타나있다.

표 74: P. textilis 혈청 및 O. scutellatus 뱀독에 의해 생성된 혈청 샘플들에 대한 분석 결과들

샘플들의 수	분석물질		평균 ± SD						쌍들 간의 평균 차이 (%)					LSC (%)	CAL (%)
		단위	GS	Brown 2.0 ㎍	Brown 4.0 ㎍	Taipan 2.0 ㎍	Taipan 4.0 ㎍	Taipan 4.0 ㎍	Br2 - GS	BR4-GS	T2 - GS	T4 - GS	T4R - GS
2	Na+	mmol/L	136.5±0.71	137.0±1.41	136.5±0.71	137.0±1.41	136±0.00	136.0±0.00	-0.4	0.0	0.4	-0.4	-0.4	2.8	3
2	K+	mmol/L	4.05±0.21	4.05±0.07	4.00±0.00	4.20±0.28	4.00±0.00	4.25±0.35	0.0	-1.2	3.7	-1.2	4.9	3.3	5
2	Cl-	mmol/L	103.5±0.71	103.5±0.71	103.5±0.71	103.5±0.71	104.0±0.00	103.5±0.71	0.0	0.0	0.0	0.5	0.0	3.3	5
2	HCO3 -	mmol/L	26.0±0.0	24.5±0.7	24.0±0.0	24.5±0.7	23.5±0.7	24.0±0.0	-5.8	-7.7	-5.8	-9.6	-7.7	4.8	10
2	Gluc	mmol/L	5.45±0.35	5.20±0.42	5.30±0.14	5.35±0.50	5.2±0.28	5.4±0.42	-4.6	-2.8	-1.8	-4.6	-0.9	4.4	10
2	Urea	mmol/L	7.45±2.76	7.30±2.83	7.25±2.90	7.30±2.97	7.3±2.97	7.35±2.90	-2.0	-2.7	-2.0	-1.3	-2.0	5.0	10
2	Creat	μmol/L	106.0±2.8	101.5±12.0	104.0±7.1	103.5±6.4	107.0±0.00	105.0±8.5	-4.2	-1.9	-2.4	0.9	-0.9	5.5	10
2	Urate	mmol/L	0.31±0.13	0.30±0.14	0.30±0.14	0.30±0.14	0.30±0.14	0.30±0.14	-3.2	-3.2	-3.2	-3.2	-3.2	3.8	10
2	TP	g/L	65.0±0.0	64.5±0.71	65.5±0.71	66.0±0.0	63.5±0.71	65.5±0.71	-0.8	0.8	1.5	-2.3	0.8	3.5	5
2	Alb	g/L	39.5±0.7	40.5±0.7	40.5±0.7	40.5±0.71	40.0±0.0	40.0±0.0	2.5	2.5	2.5	1.3	1.3	3.2	5
2	T Bili	μmol/L	13.5±5.0	11.5±5.0	11.0±4.2	11.0±5.7	12.5±5.0	12.5±5.0	-14.8	-18.5	-18.5	-7.4	-7.4	7.0	20
2	ALP	U/L	66.5±17.7	65.5±20.5	69.0±21.2	67.5±21.9	66.0±21.2	68.0±19.8	-1.5	3.8	1.5	-0.8	2.3	4.8	10
2	GGT	U/L	14.5±6.4	15.0±2.8	15.0±7.1	16.5±5.0	15.5±9.2	14.0±7.1	3.4	3.4	13.8 §	6.9	-3.4	7.3	10
2	ALT	U/L	32.0±2.8	30.5±6.4	30.5±5.0	31.5±3.5	31.5±5.0	30.5±2.1	-4.7	-4.7	-1.6	-1.6	-4.7	6.8	10
2	AST	U/L	23.5±0.7	26.5±0.7	30.0±0.0	29.5±2.1	29.5±2.1	29.0±0.0	12.8	27.7 §	25.5 §	25.5 §	23.4 §	6.2	15
2	LD	U/L	189.5±10.6	189.5±20.5	193.5±6.4	197.5±20.5	201.5±14.8	201.5±13.4	0.0	2.1	4.2	6.3	6.3	3.7	15
2	CK	U/L	152.0±83.4	154.5±84.0	145.5±90.0	145.5±89.8	147.5±92.6	145.5±94.0	1.6	-4.3	-4.3	-3.0	-4.3	3.7	15
2	TCa	mmol/L	2.17±0.06	2.18±0.09	2.17±0.09	2.18±0.06	2.15±0.08	2.17±0.09	0.5	0.0	0.2	-1.2	-0.2	3.5	5
2	Pi	mmol/L	1.22±0.04	1.22±0.04	1.21±0.07	1.21±0.06	1.21±0.04	1.20±0.04	0.0	-0.8	-1.2	-1.2	-2.0	3.8	10
2	Mg2 +	mmol/L	0.915±0.049	0.935±0.05	0.935±0.049	0.930±0.057	0.950±0.057	0.945±0.049	2.2	2.2	1.6	3.8	3.3	4.4	10
2	Chol	mmol/L	4.60±0.00	4.70±0.00	4.70±0.14	4.70±0.00	4.65±0.07	4.70±0.00	2.2	2.9	2.2	1.1	2.2	3.6	10
2	Trig	mmol/L	2.40±0.28	2.50±0.57	2.55±0.50	2.50±0.57	2.50±0.42	2.50±0.42	4.2	6.2	4.2	4.2	4.2	5.3	10
2	HDL-C	mmol/L	1.50±0.42	1.35±0.07	1.50±0.14	1.45±0.07	1.50±0.28	1.50±0.14	-10.0	0.0	-3.3	0.0	0.0	5.2	10
2	Fe2 +	μmol/L	13.0±5.7	13.0±5.7	13.5±5.0	13.0±5.7	13.0±5.7	13.5±5.0	0.0	3.8	0.0	0.0	3.8	3.7	10
2	Trf	g/L	2.59±0.46	2.61±0.44	2.58±0.35	2.62±0.43	2.56±0.44	2.55±0.36	1.0	-0.2	1.2	-1.0	-1.5	4.8	10
2	Cortisol*	nmol/L	236.0±27.2	±	±	±	±	±	3.6	-1.7				6.4	15
2	FT4*	Pmol/L	11.55±1.34	12.80±0.28	12.90±2.55	12.70±2.12	13.25±4.03	12.75±1.34	10.8	11.7	10.0	14.7	10.4	6.5	30
2	TSH*	μIU/mL	2.185±1.011	2.135±0.841	2.430±1.202	2.160±0.834	2.070±0.891	2.085±0.884	-2.3	11.2	-1.1	-5.3	-4.6	7.3	15
2	Ferritin*	μg/L	50.0±0.0	56.0±0.0	56.5±2.1	51.5±9.2	55±9.9	51.0±7.1	12.0	13.0	3.0	10.0	2.0	7.2	15
2	TnI*	μg/L	0.010±0.005	0.012±0.008	0.010±0.002	0.012±0.007	0.010±0.003	0.007±0.002	26.3	0.0	26.3	5.3	-31.6	14	30
2	Haem Index		0±0	0±0	0±0	0±0	0.5±0.7	0.5±0.7

§= CAL을 초과하여 차이 나는 결과들

분석은 Beckman DxC800 및 *DxI800 면역분석 분석기 상에서 수행되었다 Br2 - 갈색(Brown) 뱀 독 2.0㎍; Br4 - 갈색 뱀 독 4.0㎍; T2 - 타이판(Taipan) 뱀 독 2.0㎍; T4 및 T4R - 타이판 뱀 독 4.0㎍.

요약하면, 혈액 응고 튜브들에서 혈청을 제공하기 위해 미정제 P. textilis 및 O. scutellatus 뱀독들이 잠재적인 응혈원인 것을 보여주었다. 잠재 응고를 피하고 분석적 완전성을 유지하기 위해 필요한 최적 농도들의 결정이 필요하다.

실시예 14b: 응고 튜브들에서 응혈원으로서 미정제 E. carinatus 독의 사용

인간 혈액 샘플들로부터 고품질 혈청을 빠르게 생성하기 위해 E. carinatus 독이 사용될 수 있는지를 보이기 위하여 다음 실험들을 수행하였다.

4 ㎍의 E. carinatus 독을 포함하는 10개의 그레이너 무첨가제 튜브들(#454001, Griener Bio-One, Kremsmuster, Austraia)(4 mL 용량)에 2명의 건강한 지원자들로부터의 혈액을 수집하였다. 비교를 위해 동시에 그레이너 표준 혈청 튜브들(#456071, Greiner Bio-One, Kremsmuster, Austraia)에 혈액을 수집하였다.

3분 안에 육안 관찰에 의해 뱀독 함유 튜브들에서의 응고가 완전하게 나타났다. 뱀독 함유 튜브들의 샘플들은 10분 후, 그레이너 튜브들의 샘플들은 30분 후에 원심분리되었다. 3000g, 10분 및 20℃에서 샘플들을 원심분리하였다(Hereaus 1 S-R centrifuge, Germany). 관찰 및 분석을 위해 Beckman 플레인 플라스틱 튜브들(#448778, Beckman coulter, Brea, CA, USA)로 그레이너 무첨가제 튜브들로부터의 혈청들을 즉시 옮겼다. 뱀독 함유 튜브들 또는 그레이너 혈청 튜브들에서 잠재 응고가 관찰되지 않았다. 31개의 분석물질들에 대해 임의의 혈청의 이동 동안 세포를 제거하기 위해 플레인 플라스틱 튜브들의 샘플들은 재원심분리하였으며 얻어진 깨끗한 혈청들을 2시간 내에 분석하였다. Beckman DxC800 일반 화학 분석기 및 DxI800 면역분석기(Beckman Coulter, Brea, CA, USA) 상에서 31개의 분석물질들에 대하여 원심분리 후 2시간 내에 샘플 분석을 수행하였다. 결과들이 표 75에 나타나있다. E. carinatus 및 그레이너 혈청들에 대해 얻어진 결과들 사이에서 테스트된 농도 수준에서 AST 및 HDL에서 임상적으로 현저한 차이가 있었으며 다른 분석물질들에서는 없었다.

표 75: Echis carinatus 뱀독에 의해 생성된 혈청 샘플들에 대한 분석 결과

샘 플들 의 수	분석물질	평균 ± SD			쌍들 간의 평균 차이(%)	LSC (%)	CAL (%)
		단위	GS	E. carinatus 4.0 ㎍	EC4 - GS
2	Na+	mmol/L	138.5±0.71	137.5±0.71	-0.7	2.8	3
2	K+	mmol/L	4.0±0.14	4.0±0.14	0.0	3.3	5
2	Cl-	mmol/L	103±0.0	103.5±0.7	-0.5	3.3	5
2	HCO3 -	mmol/L	27.4±0.92	26.1±0.14	-4.6	4.8	10
2	Gluc	mmol/L	5.45±0.07	5.35±0.07	-1.8	4.4	10
2	Urea	mmol/L	7.25±0.64	7.30±0.71	0.7	5.0	10
2	Creat	μmol/L	88.5±12.1	86.0±17.0	-2.8	5.5	10
2	Urate	mmol/L	0.28±0.09	0.28±0.09	0	3.8	10
2	TP	g/L	63.5±0.7	63.5±0.7	0	3.5	5
2	Alb	g/L	39.5±0.7	40.5±0.7	2.5	3.2	5
2	T Bili	μmol/L	13.5±6.4	12.0±5.7	-11.1	7.0	20
2	ALP	U/L	71.5±23.3	70.0±19.8	-2.1	4.8	10
2	GGT	U/L	14.0±4.2	14.5±7.8	3.6	7.3	10
2	ALT	U/L	34.0±0.0	35.5±2.1	4.4	6.8	10
2	AST	U/L	20.5±2.1	27.0±00	31.7 §	6.2	15
2	LD	U/L	185±5.7	193±11.3	4.3	3.7	15
2	CK	U/L	135±50.9	133.5±48.8	-1.1	3.7	15
2	TCa	mmol/L	2.20±0.014	2.17±0.021	-1.6	3.5	5
2	Pi	mmol/L	1.215±0.247	1.17±0.226	-3.7	3.8	10
2	Mg2 +	mmol/L	0.91±0.0	0.93±0.04	1.6	4.4	10
2	Chol	mmol/L	4.75±0.64	4.75±0.64	0.0	3.6	10
2	Trig	mmol/L	1.45±0.50	1.50±0.14	3.4	5.3	10
2	HDL-C	mmol/L	1.25±0.21	1.80±0.57	44.0 §	5.2	10
2	Fe2 +	μmol/L	13.5±5.0	13.5±5.0	0	3.7	10
2	Trf	g/L	2.62±0.49	2.60±0.44	1.3	4.8	10
2	Cortisol*	nmol/L	232±10.6	238±7.8	2.6	6.4	15
2	FT4*	Pmol/L	12.2±0.6	12.6±0.7	3.7	6.5	30
2	TSH*	μIU/mL	2.16±0.76	2.10±0.67	-3.0	7.3	15
2	Ferritin*	μg/L	50±2.8	47±2.8	-6.0	7.2	15
2	TnI*	μg/L	0.024±0.000	0.020±0.006	-18.8	14	30
2	Haem Index		0±0	0±0

§= 결과들은 CAL을 초과하여 차이가 났다.

분석은 Beckman DxC800 및 *DxI800 면역분석 분석기 상에서 수행되었다 EC4 - Echis carinatus 독 4.0㎍.

이들은 예비 결과들이기 때문에 AST 및 HDL 결과들에 대한 임상적인 현저한 차이가 왜 존재하는지에 대한 이유를 확립하기 위해서는 추가적인 조사가 필요하다.

요약하면, 우리는 혈액 응고 튜브들에서 응혈원으로서 미정제 E. carinatus 독의 사용이 실현 가능한 것을 보여주었다. 잠재 응고를 피하고 분석적 완전성을 유지하기 위해 분석물질 방해에 대한 최적 농도 및 추가적인 연구가 정확하게 결정되는 것이 필요하다.

실시예 15: 안정성 연구

혈액 수집 장치의 성분으로서 뱀독 프로트롬빈 활성제가 유용하기 위해서는 3가지 타입의 안정성 요구조건을 만족하여야만 한다:

(1) 대량 보관 동안의 안정성: 튜브들의 제조에서 정제 이후 사용 전의 기간 동안 안정할 것이 필요하다. 공급의 확실성을 위해, 이 보관 기간은 수 개월 동안일 수 있다. 보관은 농축된 수용액 또는 동결건조된 고체로 할 수 있다. 필요한 경우 보관은 냉장고에서 할 수 있다.

(2) 생산 동안의 안정성: 혈액 수집 장치의 생산 동안에 안정할 것이 필요하다. 이 과정은 분리겔, 계면활성제 및 가능한 미립자 응혈원과 같은 다른 성분들을 이미 포함하는 튜브들로의 프로트롬빈 활성제의 스톡 용액의 분취량의 첨가를 수반할 수 있다. 이후 건조하여 프로트롬빈 활성제의 표면층을 생성하여, 방사선에 의한 진공 및 무균 하에서 튜브들을 밀봉할 수 있다.

(3) 사용 전 장치의 보관 동안의 안정성: 실온, 예를 들어, 23℃에서 적어도 12개월의 기간 동안, 바람직하게는 고온에서 오랜 기간 동안 활성제를 최대 활성에 가깝게 유지하는 것이 필요할 것이다.

지금까지 수행된 실험들은 뱀독 프로트롬빈 활성제들의 적어도 일부에 대해 조건들이 이들 요구조건들을 만족하는 것으로 확인된 것을 시사한다.

실시예 15a: 대량 보관 동안의 안정성

플레인 플라스틱 에펜도프 튜브에서 pH 7에서 인산염 완충된 식염수에서 희석 용액으로 온도들의 범위에서 유지되는 경우 PtPA의 안정성이 측정되었다. 혈장 응고 분석들의 결과들은 도 58에 도시되었다. 결과들은 4 또는 25℃에서 2 주(336 시간) 이후 응고 활성의 현저한 손실이 없음을 나타낸다. Factor Xa 발색 기질 S-2222에 대한 PtPA의 활성이 측정될 때 유사한 결과들이 얻어졌다. 37℃에서 PtPA는 168시간 이후 PtPA 활성의 현저한 양이 손실되었다.

관련된 실험들에서, pH 7.4가 보관을 위한 최적의 온도이며 보관 버퍼로의 칼슘 이온들의 첨가는 혈액 응고 활성을 안정화시킨다는 것이 증명되었다.

이들 실험들은 PtPA 및 밀접하게 관련된 OsPA의 대량 보관을 위한 조건들을 찾는 것이 가능하다는 것을 알려주었으며 이들은 오랜 기간의 보관 동안 이들 활성의 전부 또는 대부분을 유지할 수 있다.

실시예 15b: 생산 동안의 안정성

희석 용액으로 혈액 수집 튜브들에 첨가된 OsPA에 대한 감마 방사선의 효과를 측정하기 위해 실험이 수행되었다.

pH 7.4의 0.02 M Hepes 버퍼로 스톡 OsPA(1.089 mg/mL; 4.36 mM)을 25분의 1로 희석하였다. 50 ㎍을 감마 조사된(irradiated)(16 megaBeq) 5개의 플레인 혈액 수집 튜브들 및 조사되지 않은 5개의 유사한 튜브들의 각각에 다른 첨가제 없이 첨가하였다. 유사하게 50 ㎍의 희석된 OsPA를 10개의 그레이너 실리카-함유 혈액 수집 튜브들(그레이너 혈청 튜브들) 각각에 첨가하고 이들 튜브들 중 5개에 조사하였다. 감마 조사 후, 모든 튜브들을 pH 7.4의 0.02 M Hepes 버퍼로 2.0 mL으로 만들었다. 그런 다음 분취량들을 취하여 S-2765에 대한 가수분해 활성 및 10 mM 칼슘이 첨가된 표준 시트레이트 처리된 혈장을 이용한 응고 활성을 테스트하였다.

결과들이 도 59 및 60에 도시되어 있으며, 조사가 재석회화된 시트레이트 처리된 혈장에 대한 응고 활성 또는 발색 기질 S-2765에 대한 가수분해 활성에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.

플레인 혈액 수집 튜브로의 OsPA(1.5 nM)의 첨가는 새롭게 희석된 OsPA와 비교하여 활성의 현저한 손실을 보여준다. 이는 OsPA의 플레인 플라스틱 튜브로의 소수성 결합에 의해 설명될 수 있다. 실리카-함유 혈액 수집 튜브들에 OsPA를 첨가하는 것은 95% 초과의 가수분해 및 응고 활성의 복구을 나타내었다. 또한, 감마 조사 치료를 이용한 활성 손실은 관찰되지 않았다.

결론적으로, 혈액 수집 튜브에서 OsPA의 감마 조사는 가수분해 또는 응고 활성에 영향을 끼치지 않았다. 실리카, 겔 장벽, 및 계면활성제를 포함하는 응고 튜브로의 OsPA 첨가는 1분 내에 표준 혈액을 응고시키기 위해 지금까지 밝혀진 가장 효과적인 조합이다.

실시예 15c: 장치의 보관 동안의 안정성

0.02 M Hepes 버퍼, pH 7.4(1.5 nM)에서 OsPA의 희석 용액의 분취량들(50 ㎍)을 그레이너 표준 혈청 튜브들에 위치시켰다. OsPA로 표면을 코팅하기 위해 각 튜브를 회전시키고 튜브들을 진공 건조기에 위치시킨 후 건조를 위해 23℃에서 3일 동안 저 진공을 적용하기 전 건조 질소의 증기로 정화하였다. 건조기를 열고, 질소로 세정하고 튜브들을 다시 밀봉하였다. 그런 다음 튜브들을 실온(23 ℃)에서 유지하였다. 특정 시간 후, 3개의 튜브들을 열고, 내용물들을 2 mL 물에 재용해하고 Factor Xa 특정 기질 S-2222에 대해 분석하였다. 결과들이 도 61에 도시되어 있으며, 14일 동안 그레이너 혈청 튜브들에서의 건조 표면층으로서 23℃에서 보관함으로써 S-2222에 대한 OsPA의 활성이 사실상 변하지 않음을 보여준다. 모든 분석들이 3중으로 수행되었다. 도 61에서 오른편 막대는 OsPA 스톡 용액(4.05 uM)의 새로 희석된 샘플의 활성이며 이의 활성은 튜브들에서 확인된 것과 동일하여, 튜브들을 제조하기 위해 사용된 과정이 OsPA 활성의 어떠한 현저한 손실을 유발하지 않음을 나타내었다.

실시예 16: 혈액 수집 튜브의 준비

모든 상업용 혈청 및 혈장 튜브들은 현재 플라스틱이며 이들에서 제조된 샘플의 품질을 증가시키기 위해 공급자들에 의해 개발된 다수의 성분들을 포함한다. 상기에서 논의된 바대로, 혈청 샘플 또는 혈장 샘플의 준비를 위한 일부 용기(예를 들어, 튜브)는 다음을 포함한다:

(1) 원심분리 후 상청액(혈청 또는 혈장)으로부터 세포(및 혈청의 경우 혈전)를 분리하고 재혼합을 제한하는 것을 목적으로 하는 겔 장벽. 겔은 실온으로 식히면 굳어지는 따뜻한 액체로 첨가된다;

(2) 세포, 잔해 및 혈전 물질의 부착 및 세포 용해를 감소시키기 위해 겔 장벽 위의 플라스틱 튜브의 내부 표면상에 분사되는 계면활성제; 및

(3) 일반적으로 미립자이며 계면활성제의 상부 위에 튜브의 내부 표면상에 현탁액으로 분사되는 응혈원/항응고제,

본 발명은 상기 기술된 성분 (1), (2) 및 (3)을 포함하는 혈청 튜브(예를 들어, 플라스틱 튜브)를 고찰하며, 튜브는 성분 (1) 및 (2)를 먼저 튜브에 첨가하고 다음으로 성분 (3)을 튜브에 첨가함으로써 제조된다. 성분 (3)은 본 발명에서 정의된 프로트롬빈 활성제를 포함하는, 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성된, 또는 프로트롬빈 활성제로 구성된 응고 조성물을 포함하는 응혈원을 포함하며, 예를 들어, 성분 (3)은 일부 상업용 혈청 튜브들에서 사용되는 존재하는 미립자 응혈원을 포함할 수 있다. 각 튜브 내의 프로트롬빈 활성제의 양은 상기에 구체적으로 기술된 실험 결과들을 사용하여 측정될 수 있으며, 일반적인 기술들이 당업계에 알려져 있다. 그런 다음 튜브들은 소개되며(evacuated) 무균 마개로 덮인다(capped). 그런 다음 튜브들은 실온에서 보관된다.

또한 성분 (3)을 포함하며 선택적으로 성분 (1) 및/또는 (2)를 포함하는 혈청 튜브(예를 들어, 플라스틱 튜브)가 고찰된다. 각 튜브 내의 프로트롬빈 활성제의 양은 상기에 구체적으로 기술된 실험 결과들을 사용하여 측정될 수 있으며, 일반적인 기술들이 당업계에 알려져 있다. 튜브들은 소개되며(evacuated) 무균 마개로 덮이고(capped) 실온에서 보관될 수 있다.

실시예 17: 현장 진단( point of care ) 실시태양

상기에서 논의된 바대로, "현장 진단" 테스트는 환자 치료의 장소 또는 근처에서 테스트가 수행되는 것을 의미한다. 현장 진단 테스트는 병원 및 빠른 결과에 대한 요구가 존재하는 다른 환경에서 점점 대중적이 되고 있다. 이는 일부는 상대적으로 저렴하고, 작으며, 휴대 가능한 다양한 장치들을 이용하여 성취된다.

현재 실무에서, 많은 현장 진단 장치들이 다음과 같이 작동한다: 혈액 방울이 혈액 세포는 보유하나 혈장은 막을 통해 다수의 분석들이 수행되는 다수의 채널들을 갖는 미세 유체 장치로 분산되는 막 상에 위치한다. 다른 곳에서 논의된 바대로, 생화학적 또는 다른 병리학적 분석들을 위한 샘플로서 혈장보다 혈청이 선호된다. 이 실시태양에서, 본 발명은 현장 진단 테스트를 위해 설계된 장치들에서 혈청을 제조하기 위해 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 프로트롬빈 활성제로 구성된 응고 조성물의 사용을 고려한다.

하나의 이러한 장치에서, 병원 및 의사들의 수술 용도에 적합하게, 정맥천자에 의해 얻어진 혈액 샘플이 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 프로트롬빈 활성제로 구성된 응고 조성물을 포함하는 주사기(또는 유사한 것)에 수집되며, 조성물은 ~30초 안에 얻어진다. 장치는 혈전으로부터 혈청을 빠르게 분리하기 위해 여과 또는 원심분리하도록 설계된다.

이렇게 얻어진 혈청은 생화학적 또는 다른 병리학적 분석을 위해 기존 미세 유체 장치들에서 사용되며, 분석되는 샘플이 혈장보다는 기존 현장 진단 장치들에서 사용되는 혈청이기 때문에 분석의 범위들은 증가한다. 또한 혈청의 샘플은 병리학 실험실에서 추가적인 분석이 가능하도록 보유될 수 있다.

분석을 위해 상기에 기술된 주사기에서 여과 장치는 혈청이 5분 후 통과될 수 있도록 해주는 여과 메커니즘을 포함할 수 있다. 적절하게는 도 62에 도시된 바대로 주사기는 구획들로 나누어질 수 있으며, 주사기는 다음과 같이 표시할 수 있다:

A - 돌출되는 부분을 최소화하기 위하여 열리는 혈액 수집 바늘 어댑터를 가질 입구 포트;

B - 혈청 분배하기 위한 포트 또는 현장 진단 샘플 바늘들을 위한 입구;

C - 혈액의 한 방향 출입을 허용하고 혈액이 혈청 구획으로 밀리는 것을 막기 위한 밸브;

D - 혈청이 혈청 구획들(주사기의 앞 부분) 내로 밀려지도록 해주는 플런저 필터(plunger filter);

E - 혈액이 혈액 구획으로 들어가도록 하기 위한 개구부;

F - 응고가 일어나는 구획 이온(ion).

도 62에서, 응고 과정이 제자리에서 일어나도록 내부 상에서 G는 응고 조성물로 코팅된다. 그런 다음 혈청이 필터(D)를 지나가도록 밀어진다.

또 다른 이러한 장치에서, 현장 진단 장치는 모세관 시스템을 수반하며, 분석을 위해 장치의 일부가 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 프로트롬빈 활성제로 구성된 응고 조성물 및 혈청을 반응 챔버 내로 당길 수 있는 흡수제로 코팅된다.

또 다른 이러한 장치에서, 막에 위치한 혈액 방울의 빠른 응고를 달성하기 위해 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 프로트롬빈 활성제로 구성된 응고 조성물이 미세 유체 흐름 장치의 막과 결합될 수 있다. 이렇게 형성된 혈청은 장치 내로 분산되며 이러한 장치들에서 현재 분석되는 혈장 위치에서 분석된다.

실시예들의 요약

임상 화학 서비스 제공에서 적시에 분석을 위한 적절한 샘플을 얻는 것은 매우 중요하다. 항응고 치료에서 혈청은 보다 깨끗한 샘플로 인식되지만 응고의 완료를 위해 요구되는 시간(현재 구입가능한 대부분의 튜브들에서 완전한 응고를 보증하기 위한 30 분 및 표준 프로토콜에서의 분석 시간) 및 계속 증가하는 환자들의 수 때문에, 특히 병원 환경에서는, 혈장이 일반적으로 사용된다. 하지만, 분석적 오류 및 중요한 결과들의 전달에서의 지연을 유발하는 혈장 샘플에서의 잠재 응고(원심분리 후 응고)가 일어날 수 있다. 이들 문제들의 일부는 상기 실시예들에서 설명되어 있다.

또한 상기 실시예들에서의 결과들은 프로트롬빈 활성제들의 사용이 항응고제로 치료를 받은 환자들을 포함하는 다양한 환자들로부터의 혈액 샘플들로부터 고품질 혈청을 매우 빠르게 제조할 수 있다는 것을 보여준다. 이들은 리튬 헤파린 혈장 및 종래 혈청 튜브들에 대한 적절한 대안들을:

- 혈액 샘플 수집 후 빠른 분석을 가능하게 하는 ~< 5분(샘플들을 실험실로 전달하는데 걸리는 시간)에 완료되는 응고 과정 및 따라서 혈장 튜브들에 대한 시간에 필적하며 대부분의 현재 혈청 튜브들에 대한 것들보다 더 나은 빠른 턴어라운드 시간을 가짐으로써;

- 임상 환경에서 접할 수 있는 건강한 개인 및 전부 항응고된 개인들 모두로부터 혈액을 위한 고품질 혈청 샘플들을 동시에 제공하며 세포 잔해 및/또는 잠재 미세응고로부터 최소 분석물질 방해를 가짐으로써; 및

- 임상 환경에서 일반적으로 사용되는 매우 넓은 범위의 분석에 대한 적절한 단일 혈청 샘플을 제공하며, 분석물질의 분석을 위해 혈청 샘플은 혈장보다 뛰어나며, 단일 샘플은 부족한 자원(더 적은 혈액 튜브들을 수집하기 위해 심각하게 아픈 환자들의 혈액, 스태프 시간 및 필요로 하는 소모품들)에 대한 부담을 줄여줌으로써 제공한다.

명세서 전체를 통해서 임의의 일 실시태양 또는 특징들의 특정 집합에 본 발명을 제한함이 없이 본 발명의 바람직한 실시태양들을 기술하였다. 따라서 당업자는 본 개시의 측면에서 예시된 특정 실시태양들에서 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형 및 변화들이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 모든 변형들 및 변화들은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

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tgctgcagaa 1080 gaaatcacct gggattatgc tccagaaatt cctagcagtg ttgacagaag atacaaagct 1140 cagtatctgg atttttcaaa ttttattggc aagaaataca aaaaggcagt tttcaggcaa 1200 tatgaagaca gcaatttcac taaaccgacc tatgccattt ggcccaaaga acgtggaatt 1260 ctgggccccg ttatcaaagc taaagtcaga gacacagtaa caattgtatt caaaaatctg 1320 gccagtcgac cttacagcat ttatgtgcat ggagtttccg tttcaaaaga tgcagaagga 1380 gctgtttatc cttcagatcc caaagagaat ataactcatg gcaaagcagt tgaaccagga 1440 caggtctaca catataaatg gactgtgctg gatacagatg aacctacagt aaaggattct 1500 gagtgcatta ctaaattata tcatagtgct gtggacatga caagagatat tgcttcagga 1560 cttattgggc cacttctggt ttgtaaacgc aaggcactca gcatcagggg ggtacagaat 1620 aaagctgatg tggaacagca tgcagtcttc gcagtgtttg atgaaaacaa gagctggtac 1680 ttggaagaca atatcaagaa atactgcagc aatccttcca gtgttaagaa agatgaccct 1740 aaattttaca agtccaatgt tatgtacaca ctcaatggct atgcatcaga tagaacagag 1800 gtttgggggt ttcatcagtc tgaagttgtt gaatggcacc tcaccagcgt aggtacagtg 1860 gatgagattg ttccagtaca tctttctggt cacaccttct tatccaaggg aaaacatcaa 1920 gatattttaa atctttttcc catgagtggt gaatccgcta ctgtaacaat ggacaatcta 1980 ggaacctggc ttctgtcatc atggggctcc tgtgagatga gcaatggcat gagattgaga 2040 tttttggatg ccaattatga tgatgaagat gagggaaatg aagaagagga agaagatgat 2100 ggtgatattt ttgccgacat tttcaatcct ccagaagtag taataaagaa agaagaggtt 2160 cccgtaaatt ttgtaccaga cccagaatcg gatgcgctag caaaagaatt aggattattt 2220 gatgacgagg ataatccaaa acagtcacgc agtgaacaga cagaggatga tgaagaacag 2280 ctaatgatag cttcaatgct tgggcttcga tcatttaagg ggtcagttgc tgaagaagaa 2340 ttgaaacaca cagctctagc tttagaagaa gatgcccatg cttctgatcc tcgaattgac 2400 agtaatagtg cacataattc tgacgacata gctggacgct acctgcgtac tatctaccgc 2460 agaaataaaa ggaggtacta cattgcagca gaagaagttt tgtgggacta ctcaccgatc 2520 ggaaaaagtc aagtgagaag tctcccagcc aagaccacat tcaaaaaagc tattttccga 2580 agttatcttg atgatacttt ccagacacct agcactggag gagaatatga aaagcatctt 2640 ggtatactgg gtcctatcat tagggctgag gtggatgatg taatcgaagt tcagttcaga 2700 aatttggcct ctagaccata ctcacttcat gctcatggcc ttctctatga gaaatcttct 2760 gaaggcagaa gctatgacga caactctcct gaattgttca aaaaggatga tgctatcatg 2820 ccaaacggca catacacata tgtctggcaa gtccctccac ggtcaggacc aacagacaat 2880 acagaaaaat gtaaatcatg ggcctattac tctggtgtaa atccggaaaa agatattcac 2940 tctgggctta ttggacctat tttgatctgc cagaaaggca tgattgacaa gtacaacagg 3000 acaatagaca taagggaatt tgtcttgttt tttatggtct ttgatgagga gaaaagctgg 3060 tactttccaa aatctgacaa aagcacttgt gaagagaaac ttataggagt ccaatctcgc 3120 cacacatttc ctgcaattaa tgggatccct tatcagctgc aaggcttgat gatgtacaaa 3180 gatgagaatg tccactggca tttgctgaac atgggtgggc ccaaagatgt ccatgttgtt 3240 aattttcatg gtcagacatt cactgaagag ggaagggaag ataatcaact tggagtcctt 3300 cctcttcttc ctggtacatt cgcctccatc aaaatgaaac catccaaaat tggcacatgg 3360 cttttagaaa cagaagttgg tgaaaatcag gaaagaggaa tgcaggctct ctttactgtc 3420 attgacaaag attgtaaatt accaatggga ctggcaagtg ggataataca agactcacag 3480 atcagtgctt caggtcatgt tggatattgg gagcctaagc tagcaagact gaataatact 3540 ggaatgttta atgcttggag catcataaag aaggaacatg aacatccgtg 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attactaact 4440 ctgcttttta aaaggaaaca aaaacaaaag cataataaaa ctgtcttagc ataaaaaaaa 4500 ctatccttct caattttcag ccatagcttt caaatagctt tgaaaatatc aatcaaaata 4560 tcataactga agtgacgttt acaatgatta attcgtagtg ccacgtttaa tcatgaatgt 4620 aatcctaata caataaaatc gttattgttt ttgccccaaa aaaaaaaaaa aaaaa 4675 <210> 11 <211> 1458 <212> PRT <213> Oxyuranus scutellatus scutellatus <400> 11 Met Gly Arg Tyr Ser Val Ser Pro Val Pro Lys Cys Leu Leu Leu Met 1 5 10 15 Phe Leu Gly Trp Ser Gly Leu Lys Tyr Tyr Gln Val Asn Ala Ala Gln 20 25 30 Leu Arg Glu Tyr Arg Ile Ala Ala Gln Leu Glu Asp Trp Asp Tyr Asn 35 40 45 Pro Gln Pro Glu Glu Leu Ser Arg Leu Ser Glu Ser Asp Leu Thr Phe 50 55 60 Lys Lys Ile Val Tyr Arg Glu Tyr Glu Leu Asp Phe Lys Gln Glu Lys 65 70 75 80 Pro Arg Asp Glu Leu Ser Gly Leu Leu Gly Pro Thr Leu Arg Gly Glu 85 90 95 Val Gly Asp Ser Leu Ile Ile Tyr Phe Lys Asn Phe Ala Thr Gln Pro 100 105 110 Val Ser Ile His Pro Gln Ser Ala Val Tyr Asn Lys Trp Ser Glu Gly 115 120 125 Ser Ser Tyr Ser Asp Gly Thr Ser 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taccacatat aagaaagtag tttttcgaaa gtacctcgac agcactttta ccaaacgtga 5040 tcctcgaggg gagtatgaag agcatctcgg aattcttggt cctattatca gagctgaagt 5100 ggatgatgtt atccaagttc gttttaaaaa tttagcatcc agaccgtatt ctctacatgc 5160 ccatggactt tcctatgaaa aatcatcaga gggaaagact tatgaagatg actctcctga 5220 atggtttaag gaagataatg ctgttcagcc aaatagcagt tatacctacg tatggcatgc 5280 cactgagcga tcagggccag aaagtcctgg ctctgcctgt cgggcttggg cctactactc 5340 agctgtgaac ccagaaaaag atattcactc aggcttgata ggtcccctcc taatctgcca 5400 aaaaggaata ctacataagg acagcaacat gcctatggac atgagagaat ttgtcttact 5460 atttatgacc tttgatgaaa agaagagctg gtactatgaa aagaagtccc gaagttcttg 5520 gagactcaca tcctcagaaa tgaaaaaatc ccatgagttt cacgccatta atgggatgat 5580 ctacagcttg cctggcctga aaatgtatga gcaagagtgg gtgaggttac acctgctgaa 5640 cataggcggc tcccaagaca ttcacgtggt tcactttcac ggccagacct tgctggaaaa 5700 tggcaataaa cagcaccagt taggggtctg gccccttctg cctggttcat ttaaaactct 5760 tgaaatgaag gcatcaaaac ctggctggtg gctcctaaac acagaggttg gagaaaacca 5820 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catggtggac aagatttttg aaggaaatac taataccaaa ggacatgtga agaacttttt 6720 caacccccca atcatttcca ggtttatccg tgtcattcct aaaacatgga atcaaagtat 6780 tgcacttcgc ctggaactct ttggctgtga tatttactag aattgaacat tcaaaaaccc 6840 ctggaagaga ctctttaaga cctcaaacca tttagaatgg gcaatgtatt ttacgctgtg 6900 ttaaatgtta acagttttcc actatttctc tttcttttct attagtgaat aaaattttat 6960 acaagaagct tttataatgt aactccttgc taccagtaag taagataatg gctattactt 7020 ctgcattaat ttgaatacag gtaggaaaat atcaagaacc aacaagaaaa gggcttatct 7080 ttcttaatga ttgaaaatgc tatgaagtaa tatttatgta gttaaaatgc ttcattataa 7140 ctcttttaaa tcctttacac actagtaaaa cagatattac tttaaataat aattgataga 7200 cctggataac tttcacaaac acatgatttt ttaatggttt ttcttgagtg aagagaaaaa 7260 caatattatc aaatgaaata agtacttaaa atatcctgtc tttcccatat aacaatgatt 7320 tttctgactt tccatgagta aaaaaacagc caagcatctt tccagtagcc ccattgaaat 7380 tgtgaatccg tcctggtctc cctaaggact gcacacattg atattcaagg ttggtggtca 7440 ttagatatgg aacagaactg aaataaccat ggtagaactg aatgtgtaat gttggcttta 7500 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agcccctgca gctggttccc ccctggaaca cgctggctta gataagaact cagctctcaa 2580 ccctcccatg gcagagcatt ccagccctta ttctgaagac cctagagaag atcatccact 2640 ctcagatgtc acaggggtaa gcctacttcc atttggcaca ggattcaaaa atcgaaaacc 2700 tgccaaacat caaagattcc aggtaggaag aggccaagca gcaaagcata agttctccca 2760 gacgcgattc ccagcacata aaaccaggac acgtttaagc caagacaact cttcttcttc 2820 cagaatgggg ccctgggagg acattcccag tgatctgtta ctcttacaac aaaaggatcc 2880 atataagatt ctgaatggag aatggcattt ggtttctgag aaaggcagtt atgaaataat 2940 ccaagatgct aatgaaaaca agactgttaa taagttgcca aacagccccc agaatgactc 3000 aaggacttgg ggagaaaaca tccctttcaa aaacagtcat ggaaagcaga gtggccaccc 3060 aacatttttg gtaactagac gtaaacctct acaagacaga caggatagaa gaaatagtag 3120 attgaaggaa ggccttccgt taattaggac acgaagaaag aaaaaggaag agaagcctgc 3180 ataccatgtt cctctatctc caaggagttt tcatcctctg agaggagagg tcaatgcctc 3240 attttcagac agaagacata atcattcatt gttactccat gcgtccaatg aaacatctct 3300 ttccatagac ctcaatcaga cattcccctc tatgaatctt agccttgcag cctcacttcc 3360 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textilis textilis <400> 23 acgcggggga agttactgac agttaataaa gagctgaatt aactccggtc tcgagtctgc 60 tttgttctgg cgatagaaca agaacaagaa ctgaaagaga acaaactgtt cttttccatc 120 gataggcacc atggctcctc aactactcct ctgtctgatc ctcacttttc tgtggagtct 180 cccagaggct gaaagtaatg tattcttaaa aagcaaagtg gcaaatagat ttttgcaaag 240 aacagaacga gctaattcac tggttgagga atttaaatct ggaaacattg aaagggaatg 300 cattgaggag agatgttcaa aagaagaagc cagggaggta tttgaagatg acgagaaaac 360 tgagaccttc tggaatgttt atgtagatgg ggatcagtgt tcatcaaacc cctgtcatta 420 tcgcgggata tgcaaagatg gcattggtag ctatacctgt acctgcttgt ctggctatga 480 agggaaaaac tgtgaacgtg tcttatataa gtcctgcaga gtggacaatg gtaactgttg 540 gcacttctgc aaacatgttc aaaatgatat tcagtgttca tgtgctgaag gttacctttt 600 gggagaggat gggcactctt gtgttgctgg aggtaacttt tcatgtggta gaaatatcaa 660 aacaaggaac aagagggaag caaatctgcc tgactttgtg cagtcccaga atgcaacttt 720 gctgaaaaaa tctgataatc caagccctga tatcagaatt gttaatggaa tggattgcaa 780 actgggtgaa tgtccgtggc aggcagctct ggtagatgaa aaggaaggtg 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gtgttgctgg aggtgacttt tcatgtggta gaaatataaa aacaaggaac 540 aagcgggaag caaatctgcc tgactttcaa acagattttt ctgatgacta cgatgagatt 600 gatgaaaata attttgttga aactcctaca aatttctctg gcttagttct cactgtgcag 660 tcccagaatg caactttgct gaaaaaatct gataatccaa gccctgatat cagagttgtt 720 aatggaacag actgcaaact aggtgaatgt ccatggcagg cacttctgct aaatgatgaa 780 ggagatgggt tttgtggagg aacaattttg agtcccatct atgtgcttac tgcagcccac 840 tgcattaacc agaccaagta cattacagtt gttgtagggg aaatagacat atcaagcaaa 900 aaaaccggac gtcttcattc tgtggataaa atatatgtgc atcaaaaatt tgttcctgcc 960 acgtatgact atgacatagc catcatccaa ctgaagaccc ctatccagtt ctctgaaaat 1020 gtggttcctg cctgccttcc cactgctgat tttgccaacc aagtcctcat gaaacaaaat 1080 tttggcatcg ttagtggatt tgggcgtact cgagaaagag gaaagacctc taacacactt 1140 aaagttgtta cgcttcctta tgtggacagg cacacctgca tgctttccag caattttcca 1200 attactcaaa atatgttctg tgctggctat gatactctgc ctcaagatgc atgccaggga 1260 gacagcggag ggccccacat cactgcatac agagataccc actttattac tgggattgtc 1320 agctgggggg aaggatgtgc 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atcaaggaac 540 aagagggaag caagtctgcc tgactttcat ttttctgatg actatgatgc gattgatgaa 600 aataatttgg ttgaaactgt gcagtcccag agtgcaactt tgctgaaaaa atctgataat 660 ccaagccctg atatcagaat tgttagtgga ttggactgca aactgggtga atgtccatgg 720 caggcagttc tgatagatga acatggaaaa gcgtttggtg gaggaacaat tttgagtccc 780 tactttgtgc ttactgcagc ccactgcctt aaccagacca aaagcattgc agttgttgta 840 gggcaagtag acatatcaag aaaagaaacc agacatcttc tccatgtgga taaagcatat 900 atgcattcaa aatatgttcg tgccacctat gaccatgata tagccatcct cagactgagg 960 acccctatcc agttctctga aaatgtggtt cctgcctgcc ttcccactgc tgattttgcc 1020 gacgaagtcc tcatgaaaca agattttggc atcgttagtg gatttgggcg tttgcatgaa 1080 agaggatcga cctctgacat acttaaagtc attagggttc cttatgtgga caggtacacc 1140 tgcatgcttt ccagcaacta tcgaattact ccaagtatgt tctgtgctgg ctatggtaat 1200 cagcctcaag atgcatgcca gggagacagt ggggggcccc acatcactgc atacggagat 1260 acccacttta ttactgggat tatcagctgg ggggaaggtt gtggaaggaa aggcaaatat 1320 ggtatttaca caaaagtgtc caatttcatc ccttggataa aaacaataat gcgtcgaaat 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cagaaggaga ctgcagcccc tgcagaccta gaaatggcca 540 cagcccatcc ccatgcacca gggggtgagg tggcaggtgg tggaaagggc ctgagggggg 600 cttcttcctt ccaggcgagc acgacctcag cgagcacgac ggggatgagc agagccggcg 660 ggtggcgcag gtcatcatcc ccagcacgta cgtcccgggc accaccaacc acgacatcgc 720 gctgctccgc ctgcaccagc ccgtggtcct cactgaccat gtggtgcccc tctgcctgcc 780 cgaacggacg ttctctgaga ggacgctggc cttcgtgcgc ttctcattgg tcagcggctg 840 gggccagctg ctggaccgtg gcgccacggc cctggagctc atggtcctca acgtgccccg 900 gctgatgacc caggactgcc tgcagcagtc acggaaggtg ggagactccc caaatatcac 960 ggagtacatg ttctgtgccg gctactcgga tggcagcaag gactcctgca agggggacag 1020 tggaggccca catgccaccc actaccgggg cacgtggtac ctgacgggca tcgtcagctg 1080 gggccagggc tgcgcaaccg tgggccactt tggggtgtac accagggtct cccagtacat 1140 cgagtggctg caaaagctca tgcgctcaga gccacgccca ggagtcctcc tgcgagcccc 1200 atttccctag cccagcagcc ctggcctgtg gagagaaagc caaggctgcg tcgaactgtc 1260 ctggcaccaa atcccatata ttcttctgca gttaatgggg tagaggaggg catgggaggg 1320 agggagaggt ggggagggag acagagacag 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gccaccagga aggcccttct cagaggacca 3900 ggctgtgcgt ggtgcccgcc gtgggaggcc agcctggcgt tggcatccag catcatcagt 3960 ttgtgcagtc gggtggggct cagtgagtgc ctcctgtgtg ccaggcacaa tgacgcacaa 4020 tgtgtgcaca ccaggctcat gtgcaggtgg ctgcgagaca gggcgaccca tcaaggcaga 4080 tgcaccatga ggcagtggcc agtgctgtgg gtgttagggg cattgctccc cggccactac 4140 ggcatagcag gcagtgatcg ccacactggc caagctttag accatttatt ccagagaccc 4200 cagaggcaaa aagcccggct gcacctccca gtgactccca cagccattga gcagagacac 4260 tcaggacctt gtgatgggag gtttctgcac tggagaacga gcccagaagc cctctcagcc 4320 tcggaacagt gtggccagtg gtgggcaggt caggaggggc ttcagacaca gcctgtccct 4380 ccagatggtc acgggaaggt cactccccac agaagtacgt tttggggcca tgcgggcaca 4440 gaaggtttgg gggtgggtgg ggcaggtgcc agcctggcct gtgggaggcc atggtgcaga 4500 tgccaagccc cccccgtgac atgagaccac ctgataccac ccagagagtg gctgtgagcg 4560 gaagggcccg cccagaaaca agcagggcct tggggcagaa gtcctgggct cagatcccac 4620 gctcactgcc agcggcctcg gctcaggctt ctgcgctctc taaacttagt tttctcttct 4680 ggaaaaatga tggggaaaat gatatttgta 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210 215 220 Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu 225 230 235 240 Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala 245 250 255 Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Glu Gly Asp Arg Asn Thr 260 265 270 Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile 275 280 285 Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val 290 295 300 Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala 305 310 315 320 Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys 325 330 335 Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln 340 345 350 Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser 355 360 365 Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala 370 375 380 Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly 385 390 395 400 Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val 405 410 415 Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr 420 425 430 Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg 435 440 445 Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser 450 455 460 Pro Leu Lys 465 <210> 49 <211> 1529 <212> DNA <213> Bos Taurus <400> 49 ctcagcaccg ccctgggcgg cctcctgcgg ccggcgggga gcgtgttcct gccccgggac 60 caggcccacc gtgtcctgca gagagcccgc agggccaact cattcttgga ggaggtgaag 120 cagggaaacc tggagcgaga gtgcctggag gaggcctgct cactagagga ggcccgcgag 180 gtcttcgagg acgcagagca gacggatgaa ttctggagta aatacaaaga tggagaccag 240 tgtgaaggcc acccgtgcct gaatcagggc cactgtaaag acggcatcgg agactacacc 300 tgcacctgtg cggaagggtt tgaaggcaaa aactgcgagt tctccacgcg tgagatctgc 360 agcctggaca atgggggctg cgaccagttc tgcagggagg agcgcagcga ggtgcggtgc 420 tcctgcgcgc acggctacgt gctgggcgac gacagcaagt cctgcgtgtc cacagagcgc 480 ttcccctgtg ggaagttcac gcagggacgc agccggcggt gggccatcca caccagcgag 540 gacgcgcttg acgccagcga gctggagcac tacgaccctg cagacctgag ccccacagag 600 agctccttgg acctgctggg cctcaacagg accgagccca gcgccgggga ggacggcagc 660 caggtggtcc ggatagtggg cggcagggac tgcgcggagg gcgagtgccc atggcaggct 720 ctgctggtca acgaagagaa cgagggattc tgcgggggca ccatcctgaa cgagttctac 780 gtcctcacgg ctgcccactg cctgcaccag gccaagaggt tcacggtgag ggtcggcgac 840 cggaacacag agcaggagga gggcaacgag atggcacacg aggtggagat gactgtgaag 900 cacagccgct ttgtcaagga gacctacgac ttcgacatcg cggtgctgag gctcaagacg 960 cccatccggt tccgccggaa cgtggcgccc gcctgcctgc ccgagaagga ctgggcggag 1020 gccacgctga tgacccagaa gacgggcatc gtcagcggct tcgggcgcac gcacgagaag 1080 ggccgcctgt cgtccacgct caagatgctg gaggtgccct acgtggaccg cagcacctgt 1140 aagctgtcca gcagcttcac catcacgccc aacatgttct gcgccggcta cgacacccag 1200 cccgaggacg cctgccaggg cgacagtggc ggcccccacg tcacccgctt caaggacacc 1260 tacttcgtca caggcatcgt cagctgggga gaagggtgcg cgcgcaaggg caagttcggc 1320 gtctacacca aggtctccaa cttcctcaag tggatcgaca agatcatgaa ggccagggca 1380 ggggccgcgg gcagccgcgg ccacagtgaa gcccctgcca cctggacggt cccgcccccc 1440 cttccgctct gagcgggctc cctccctgcc tgattagagc tgtgtcctct ccttaaaaaa 1500 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1529 <210> 50 <211> 492 <212> PRT <213> Bos Taurus <400> 50 Met Ala Gly Leu Leu His Leu Val Leu Leu Ser Thr Ala Leu Gly Gly 1 5 10 15 Leu Leu Arg Pro Ala Gly Ser Val Phe Leu Pro Arg Asp Gln Ala His 20 25 30 Arg Val Leu Gln Arg Ala Arg Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Val 35 40 45 Lys Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Leu Glu Glu Ala Cys Ser Leu 50 55 60 Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ala Glu Gln Thr Asp Glu Phe 65 70 75 80 Trp Ser Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Gly His Pro Cys Leu 85 90 95 Asn Gln Gly His Cys Lys Asp Gly Ile Gly Asp Tyr Thr Cys Thr Cys 100 105 110 Ala Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Phe Ser Thr Arg Glu Ile 115 120 125 Cys Ser Leu Asp Asn Gly Gly Cys Asp Gln Phe Cys Arg Glu Glu Arg 130 135 140 Ser Glu Val Arg Cys Ser Cys Ala His Gly Tyr Val Leu Gly Asp Asp 145 150 155 160 Ser Lys Ser Cys Val Ser Thr Glu Arg Phe Pro Cys Gly Lys Phe Thr 165 170 175 Gln Gly Arg Ser Arg Arg Trp Ala Ile His Thr Ser Glu Asp Ala Leu 180 185 190 Asp Ala Ser Glu Leu Glu His Tyr Asp Pro Ala Asp Leu Ser Pro Thr 195 200 205 Glu Ser Ser Leu Asp Leu Leu Gly Leu Asn Arg Thr Glu Pro Ser Ala 210 215 220 Gly Glu Asp Gly Ser Gln Val Val Arg Ile Val Gly Gly Arg Asp Cys 225 230 235 240 Ala Glu Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Val Asn Glu Glu Asn 245 250 255 Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Asn Glu Phe Tyr Val Leu Thr 260 265 270 Ala Ala His Cys Leu His Gln Ala Lys Arg Phe Thr Val Arg Val Gly 275 280 285 Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Asn Glu Met Ala His Glu Val 290 295 300 Glu Met Thr Val Lys His Ser Arg Phe Val Lys Glu Thr Tyr Asp Phe 305 310 315 320 Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Arg Phe Arg Arg Asn 325 330 335 Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Lys Asp Trp Ala Glu Ala Thr Leu 340 345 350 Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His Glu 355 360 365 Lys Gly Arg Leu Ser Ser Thr Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr Val 370 375 380 Asp Arg Ser Thr Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Thr Ile Thr Pro Asn 385 390 395 400 Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Gln Pro Glu Asp Ala Cys Gln Gly 405 410 415 Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val 420 425 430 Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys Phe 435 440 445 Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Asn Phe Leu Lys Trp Ile Asp Lys Ile 450 455 460 Met Lys Ala Arg Ala Gly Ala Ala Gly Ser Arg Gly His Ser Glu Ala 465 470 475 480 Pro Ala Thr Trp Thr Val Pro Pro Pro Leu Pro Leu 485 490 <210> 51 <211> 30 <212> PRT <213> Echis carinatus <400> 51 Asp Cys Leu Pro Gly Trp Ser Ser His Glu Gly His Cys Tyr Lys Val 1 5 10 15 Phe Asn Gln Glu Met Tyr Trp Ala Asp Ala Glu Lys Phe Cys 20 25 30 <210> 52 <211> 30 <212> PRT <213> Echis carinatus <400> 52 Asp Cys Leu Pro Asp Trp Phe His Tyr Glu Gly His Cys Tyr Arg Val 1 5 10 15 Phe Asp Glu Pro Lys Lys Trp Ala Asp Ala Glu Lys Phe Cys 20 25 30

Claims (9)

1. 분석물질을 탐지하기에 적합한 혈청 샘플의 제조에서 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 또는 프로트롬빈 활성제로 구성되는 응고 조성물의 용도.
2. 혈청 샘플에 존재하는 관심 분석물질을 탐지하기에 적합한 혈청 샘플을 제조하기 위한 용기로서, 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 또는 프로트롬빈 활성제로 구성되는 응고 조성물을 포함하는 것인 용기.
3. 혈청 샘플에 존재하는 관심 분석물질을 탐지하기에 적합한 혈청 샘플을 제조하기 위한 용기로서, 혈액 샘플 및 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 혈액 샘플 및 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 또는 혈액 샘플 및 프로트롬빈 활성제로 구성되는 응고 조성물을 포함하는 것인 용기.
4. 분석물질을 탐지하기에 적합한 혈청 샘플을 제조하기 위한 용기의 제조 또는 생산에서 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 또는 프로트롬빈 활성제로 구성되는 응고 조성물의 용도.
5. 관심 분석물질을 탐지하기 위한 혈청 샘플의 제조 방법으로, 혈청 샘플을 제조하기에 충분한 시간 및 조건 하에서 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 또는 프로트롬빈 활성제로 구성되는 응고 조성물과 혈액 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는 혈청 샘플의 제조 방법.
6. 제 5 항의 방법에 따라 제조된 혈청 샘플을 제공하는 단계 및 관심 분석물질의 존재 또는 양에 대해 혈청 샘플을 분석하는 단계를 포함하는 관심 분석물질을 탐지하는 방법.
7. 대상에서 질병 또는 질환의 존재, 부존재 또는 심각성을 진단하는 방법으로, 질병 또는 질환의 존재, 부존재 또는 심각성은 대상에서 분석물질의 존재, 부존재 또는 비정상적인 양과 연관되며, 제 5 항의 방법에 따라 제조된 혈청 샘플을 제공하는 단계 및 혈청 샘플에서 분석물질의 존재, 부존재 또는 비정상적인 양을 탐지함으로써 대상에서 질병 또는 질환의 존재, 부존재 또는 심각성을 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
8. 제 5 항의 방법에 의해 제조된 혈청 샘플.
9. 혈청 샘플을 제조하기에 충분한 시간 및 조건 하에서 프로트롬빈 활성제를 포함하거나, 프로트롬빈 활성제로 필수적으로 구성되거나, 또는 프로트롬빈 활성제로 구성되는 응고 조성물과 혈액 샘플을 접촉시킴으로써 제조하는 혈청 샘플.

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