KR20210136038A

KR20210136038A - 피에조형 기계 감응 이온 채널 성분 1(piezo1) 변이체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210136038A
Application number: KR1020217030162A
Authority: KR
Inventors: 조슈아 배크맨; 아리스 바라스
Original assignee: 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date: 2019-02-18
Filing date: 2020-02-07
Publication date: 2021-11-16
Also published as: EP3927844B1; EP4317456A2; DK3927844T3; WO2020171982A1; US20200263252A1; FI3927844T3; ES2981593T3; SG11202108922WA; AU2020225197A8; IL285644A; CN113661252A; MX2021009983A; JP2022520659A; EP4317456A3; US11584966B2; CA3130320A1; US20230287502A1; AU2020225197A1; EP3927844A1

Abstract

환자 또는 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 피에조 유형 자기력민감성 이온채널 성분 1(PIEZO1) 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자 및 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 하지정맥류를 갖는 환자를 치료하는 방법, 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된 대상체를 확인하는 방법 및 인간 대상체에서 하지정맥류를 진단하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

피에조형 기계 감응 이온 채널 성분 1(PIEZO1) 변이체 및 이의 용도

서열 목록의 참조

본 출원은 132 킬로바이트의 크기로 2020년 2월 5일에 작성된 18923802502SEQ 명칭의 텍스트 파일로서 전자 제출된 서열 목록을 포함한다. 서열 목록은 본원에 참고로 포함된다.

기술분야

본 개시내용은 환자 또는 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자 및 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 하지정맥류를 갖는 환자를 치료하는 방법, 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된 대상체를 확인하는 방법 및 인간 대상체에서 하지정맥류를 진단하는 방법을 제공한다.

하지정맥류는, 함께 만성 정맥성 질환으로 분류되는, 만성 정맥 부전을 갖는 환자에서 대개 보이는 대부분 알려지지 않은 유전적 유발자를 갖는 흔한 다인성 질환이다. 정맥판의 기능이상은 하지정맥류, 정맥성 고혈압 및 혈전증과 연관된다. 혈류역학적 힘의 변화, 내피 활성화, 염증, 저산소증 및 기질 금속단백분해효소 및 이의 조직 억제제의 이상조절과 같은 몇몇 과정은 하지정맥류 발생과 연관된다. 하지정맥류 위험 인자는 연령 증가, 여성 성별, 임신수, 비만, 심부 정맥 혈전증의 병력 및 서있는 직업을 포함한다. 하지정맥류는 또한 불충분한 림프 순환 및 만성 정맥 부전과 관련되었다. 게다가, 몇몇 전장 게놈 연관 연구(GWAS: genome-wide association study)는 약 18.5%의 하지정맥류 유전성을 나타냈다.

PIEZO1은 16q24.3에 위치한 70 kb의 유전자에 의해 암호화되고, 5개의 가능한 동형단백질에 존재한다. PIEZO1 단백질은 2,521개의 아미노산 길이이고, 38개의 막관통 도메인을 함유하고 동종-사합체로서 작용하는 286 kDa의 막관통 단백질이다. PIEZO1은 진화적으로 보존된 내피 기계 감응 양이온 채널을 암호화하고, 이 채널은 루테늄 레드 및 가돌리늄에 감응하는 직선의 전류-전압 관계식을 특징으로 하는 전류를 생성한다. PIEZO1은 편재하여 발현되고, 가장 가능하게는 이의 활성화된 상태에서 소포체로의 R-Ras 동원을 통한 인테그린 활성화, 및 후속하는 칼파인 신호전달의 자극을 유지시켜 내피 세포 부착에서 역할을 한다. PIEZO1은 맥관구조에서 내피 세포 이동 및 발아하는 혈관신생에 관여된다. 구체적으로는, PIEZO1은 혈류 연관된 전단 응력에 대한 센서로서 작용하고, 내피 세포 체계화 및 혈류 방향의 정렬을 촉진하여서 적절한 혈관 형성, 개형 및 성숙을 보장한다. PIEZO1은 또한 림프 판막 형성에 필요한 것으로 보인다. 다른 보고된 기능은 혈압 조절, 소변 삼투압, 적혈구 통합성, 압력 감지 및 집합관 삼투조절을 포함한다.

요약

본 개시내용은 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된 인간 대상체를 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 피에조형 기계 감응 이온 채널 성분 1(PIEZO1: Piezo Type Mechanosensitive Ion Channel Component 1) 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자; PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 mRNA 분자; mRNA 분자로부터 생산된 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 cDNA 분자; 또는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 폴리펩타이드의 존재 또는 부재를 결정하거나 결정을 해 오고 있는 단계를 포함하고; PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자, mRNA 분자, cDNA 분자 또는 폴리펩타이드의 부재는 그 대상체가 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가되지 않는다는 것을 나타내고; PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자, mRNA 분자, cDNA 분자 또는 폴리펩타이드의 존재는 그 대상체가 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된다는 것을 나타낸다.

본 개시내용은 또한 인간 대상체에서 하지정맥류를 진단하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 샘플에서 피에조형 기계 감응 이온 채널 성분 1(PIEZO1) 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자; PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 mRNA 분자; mRNA 분자로부터 생산된 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 cDNA 분자; 또는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 폴리펩타이드의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고; 대상체가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자, mRNA 분자, cDNA 분자 또는 폴리펩타이드를 갖고, 하지정맥류의 하나 이상의 증상을 가질 때, 그 대상체는 하지정맥류를 갖는 것으로 진단된다.

본 개시내용은 또한 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제에 의해 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 환자는 하지정맥류를 겪거나 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가되고, 상기 방법은 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하거나 수득을 해 오고 있는 것; 및 환자가 피에조형 기계 감응 이온 채널 성분 1(PIEZO1) 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자를 포함하는 유전자형을 갖는지를 결정하도록 생물학적 샘플에서 유전자형분석 검정을 수행하거나 수행을 해 오고 있는 것에 의해 환자가 인간 PIEZO1 폴리펩타이드를 암호화하는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자를 갖는지를 결정하는 단계; 및 환자가 PIEZO1 기준일 때, 표준 투여량으로 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제를 그 환자에게 투여하거나 계속해서 투여하는 단계; 및 환자가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 이형접합성 또는 동형접합성일 때, 표준 투여량과 동일하거나 이보다 많은 양으로 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제를 그 환자에게 투여하거나 계속해서 투여하는 단계를 포함하고; 인간 PIEZO1 폴리펩타이드를 암호화하는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자를 갖는 유전자형의 존재는 그 환자가 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된다는 것을 나타낸다.

본 명세서에 포함되고 이의 일부를 구성하는 첨부 도면은 몇몇 양태를 예시하고, 설명과 함께 본 개시내용의 원칙을 설명하도록 작용한다.
도 1은 UKB 50k WES에서 개체의 쌍에 대한 IBD 공유의 대표적인 분포; UKB 50k 엑솜 참가자의 모든 쌍들 중에서 0의 대립유전자 혈통 동일성(IBD: identical by descent) 대 1개의 대립유전자 IBD에 의한 WES 유전자형의 추정된 비율을 보여준다.
도 2는 기능적 예측에 의해 모든 상염색체 변이체에 대해 관찰된 부위 빈도 스펙트럼(SFS: site frequency spectrum)을 보여주는데; UKB 50k 엑솜은 수평축에 기재된 개체 수에 대해 랜덤으로 다운샘플링되었고; 범례에서처럼 적어도 1% 미만의 LOF AAF의 표시된 수를 함유하는 유전자 수는 수직축에 작도되고; 상염색체 유전자의 최대 수는 18,272개이다.
도 3은 UK Biobank 500k 및 50k에서 유럽대륙 혈통; UK Biobank Data Showcase로부터 이용 가능한 n = 488,377명의 개체에 대해 주성분 1 및 주성분 2; 대표 아프리카인(청색) 혈통, 동아시아인(녹색) 혈통 및 유럽인(적색) 혈통의 도표의 3개의 미리한정된 영역을 보여준다.
도 4는 PIEZO1에서 65개의 pLOF 변이체에 대한 단일점 결과 및 합산 결과를 보여준다.
도 5는 PIEZO1에 대한 LD 평가를 보여준다.

본 개시내용의 양태와 관련된 다양한 용어가 본 명세서 및 청구항에 걸쳐 사용된다. 이러한 용어는 달리 표시되지 않는 한 당해 분야에서의 이의 보통의 의미가 주어질 것이다. 다른 구체적으로 정의된 용어는 본원에 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석되어야 한다.

달리 명확히 기술되지 않는 한, 본원에 기재된 임의의 방법 또는 양태의 단계가 특정한 순서로 실행되는 것을 그 방법 또는 양태가 요구하는 것으로 해석된다는 것이 어떤 방식이든 의도되지 않는다. 따라서, 방법 청구항이 특정한 순서로 단계가 제한되는 것으로 청구항 또는 설명에서 구체적으로 기술하지 않는 경우, 순서가 추론된다는 것이 어떤 면에서도 어떤 방식이든 의도되지 않는다. 이는 단계의 배열 또는 조작 흐름에 관련한 논리학의 문제, 문법상 구성 또는 구두법으로부터 도출된 명백한 의미, 또는 본 명세서에 기재된 양태의 수 또는 유형을 포함하여 해석에 대한 임의의 가능한 표현되지 않은 기준을 보유한다.

본원에 사용된 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥이 명확히 달리 기술하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환 가능하게 사용된다. 대상체는 포유동물을 포함하는 임의의 동물을 포함할 수 있다. 포유동물은 가축(예를 들어, 말, 소, 돼지 등), 반려 동물(예를 들어, 개, 고양이 등), 실험실 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼) 및 비인간 영장류를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.

본원에 사용된 "핵산", "핵산 분자", "핵산 서열", "폴리뉴클레오타이드" 또는 "올리고뉴클레오타이드"는 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 포함할 수 있고, DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있고, 단일-가닥, 이중-가닥 또는 다중 가닥일 수 있다. 하나의 핵산 가닥은 또한 이의 보체를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "포함하는"은 원하는 대로 특정 실시형태로 "이루어지는" 또는 "본질적으로 이루어지는"으로 대체될 수 있다.

본원에 사용된 어구 "상응하는" 또는 이의 문법 변형어는 특정 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 또는 위치의 넘버링의 맥락에서 사용될 때 특정 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열을 기준 서열과 비교할 때 규정된 기준 서열의 넘버링을 지칭한다(예를 들어, 본원에서 기준 서열은 (야생형) PIEZO1의 핵산 분자 또는 폴리펩타이드임). 바꾸어 말하면, 특정 중합체의 잔기(예를 들어, 아미노산 또는 뉴클레오타이드) 수 또는 잔기(예를 들어, 아미노산 또는 뉴클레오타이드) 위치는 특정 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 내의 잔기의 실제 숫자 위치에 의해 지정되기보다는 기준 서열과 관련하여 지정된다. 예를 들어, 2개의 서열 사이의 잔기 일치를 최적화하도록 갭을 도입하여 특정 아미노산 서열을 기준 서열에 정렬할 수 있다. 이 경우에, 갭이 존재하지만, 특정 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열에서의 잔기의 넘버링은 이것이 정렬되는 기준 서열과 관련하여 이루어진다.

본 개시내용에 따르면, PIEZO1에서의 소정의 변이가 하지정맥류를 발생시킬 위험과 연관된다는 것이 관찰되었다. PIEZO1 유전자 또는 단백질의 변이체가 인간에서 하지정맥류와 어떠한 알려진 연관성을 갖지 않는다고 여겨진다. 따라서, 하지정맥류가 억제되고/되거나, 이의 증상이 감소되고/되거나, 증상의 발생이 억제되도록 하지정맥류와 연관된 PIEZO1 변경을 갖는 인간 대상체를 치료할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 활동 질환의 위험에 있거나 이를 갖는 대상체를 치료할 수 있도록 이러한 대상체에서의 하지정맥류를 발생시킬 위험을 확인하거나 계층화하기 위해, 또는 하지정맥류를 갖는 것으로 대상체를 진단하기 위해 대상체에서의 이러한 변이체의 확인을 활용(leveraging)하는 방법을 제공한다.

본 개시내용의 목적을 위해, 임의의 특정 인간을 i) PIEZO1 기준; ii) PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체에 대한 이형접합성 및 iii) PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체에 대한 동형접합성의 3가지의 PIEZO1 유전자형 중 1가지를 갖는 것으로 분류할 수 있다. 인간이 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자의 카피를 갖지 않을 때, 인간은 PIEZO1 기준이다. 인간이 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자의 단일 카피를 가질 때, 인간은 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체에 대해 이형접합성이다. PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자는 부분 기능 상실, 완전 기능 상실, 예측된 부분 기능 상실 또는 예측된 완전 기능 상실을 갖는 PIEZO1 폴리펩타이드를 암호화하는 임의의 PIEZO1 핵산 분자(예컨대, 게놈 핵산 분자, mRNA 분자 또는 cDNA 분자)이다. 부분 기능 상실(또는 예측된 부분 기능 상실)을 갖는 PIEZO1 폴리펩타이드를 갖는 환자는 PIEZO1에 대해 정상하위이다. PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자는 본원에 기재된 임의의 변이체 핵산 분자일 수 있다. 인간이 임의의 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자의 2개의 카피를 가질 때, 인간은 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체에 대해 동형접합성이다.

PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 것으로 유전자형분석되거나 결정된 인간 대상체 또는 환자의 경우, 이러한 인간 대상체 또는 환자는 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된다. PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 것으로 유전자형분석되거나 결정된 인간 대상체 또는 환자의 경우, 이러한 인간 대상체 또는 환자는 하지정맥류를 치료하기에 효과적인 작용제의 의해 치료될 수 있다.

본 개시내용은 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된 인간 대상체를 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자(예컨대, 게놈 핵산 분자, mRNA 분자 및/또는 cDNA 분자) 또는 폴리펩타이드의 존재 또는 부재를 결정하거나 결정을 해 오고 있는 단계를 포함하고; PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자 또는 폴리펩타이드의 부재는 그 대상체가 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가되지 않는다는 것을 나타내고; PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자, mRNA 분자, cDNA 분자 또는 폴리펩타이드의 존재는 그 대상체가 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된다는 것을 나타낸다.

본 개시내용은 또한 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된 인간 대상체를 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 i) PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자; ii) PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 mRNA 분자; iii) mRNA 분자로부터 생산된 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 cDNA 분자; 또는 iv) PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 폴리펩타이드의 존재 또는 부재를 결정하거나 결정을 해 오고 있는 단계를 포함하고; PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자, mRNA 분자, cDNA 분자 또는 폴리펩타이드의 부재는 그 대상체가 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가되지 않는다는 것을 나타내고; PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자, mRNA 분자, cDNA 분자 또는 폴리펩타이드의 존재는 그 대상체가 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된다는 것을 나타낸다.

본 개시내용은 또한 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된 인간 대상체를 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 인간 PIEZO1 폴리펩타이드를 암호화하는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자(예컨대, 게놈 핵산 분자, mRNA 분자, 및/또는 cDNA 분자)의 존재 또는 부재를 결정하거나 결정을 해 오고 있는 단계를 포함하고; i) 인간 대상체가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자가 결여될 때(즉, 인간 대상체는 PIEZO1 기준으로 유전자형분석에 의해 분류됨), 인간 대상체는 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가되지 않고; ii) 인간 대상체가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자를 가질 때(즉, 인간 대상체는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체에 대해 이형접합성으로 분류되거나 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체에 대해 동형접합성으로 분류됨), 인간 대상체는 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된다.

본원에 기재된 임의의 실시형태에서, PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자는 부분 기능 상실, 완전 기능 상실, 예측된 부분 기능 상실 또는 예측된 완전 기능 상실을 갖는 PIEZO1 폴리펩타이드를 암호화하는 임의의 PIEZO1 핵산 분자(예를 들어, 게놈 핵산 분자, mRNA 분자 또는 cDNA 분자 등)일 수 있다. 예를 들어, PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자는 본원에 기재된 임의의 PIEZO1 변이체 핵산 분자일 수 있다.

본원에 기재된 임의의 방법에 의해 인간 대상체가 생물학적 샘플에서 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자를 갖는지를 결정하는 것을 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시험관내에서 이 방법을 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원위치에서 이 방법을 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생체내에서 이 방법을 수행할 수 있다. 임의의 이들 실시형태에서, 핵산 분자는 인간 대상체로부터 얻은 세포 내에 존재할 수 있다.

본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 하지정맥류는 초기 병기 하지정맥류(예를 들어, CEAP(임상학적, 병리학적, 해부학적, 병리생리학적) 분류에 따라 C0)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 하지정맥류는 후기 병기 하지정맥류(예를 들어, CEAP 분류에 따라 C6)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 하지정맥류는 임의의 질환 병기(예를 들어, CEAP 분류에 따라 C0 내지 C6)에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 인간 대상체는 여성이다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체가 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된 것으로 확인될 때, 인간 대상체는 본원에 기재된 것과 같이 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제에 의해 추가로 치료된다. 예를 들어, 인간 대상체가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 이형접합성 또는 동형접합성이고, 따라서 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가될 때, 인간 대상체는 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제가 투여된다. 일부 실시형태에서, 환자가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 동형접합성일 때, 그 환자는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 이형접합성인 환자에게 투여되는 표준 투여량과 동일하거나 이보다 많은 투여량으로 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제가 투여된다. 일부 실시형태에서, 환자는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 이형접합성이다. 일부 실시형태에서, 환자는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 동형접합성이다.

본 개시내용은 인간 대상체에서 하지정맥류를 진단하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 샘플에서 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자(예컨대, 게놈 핵산 분자, mRNA 분자, 및/또는 cDNA 분자) 또는 폴리펩타이드의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고; 대상체가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자, mRNA 분자, cDNA 분자 또는 폴리펩타이드를 갖고, 하지정맥류의 하나 이상의 증상을 가질 때, 그 대상체는 하지정맥류를 갖는 것으로 진단된다.

본 개시내용은 또한 인간 대상체에서 하지정맥류를 진단하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 샘플에서 i) PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자; ii) PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 mRNA 분자; iii) mRNA 분자로부터 생산된 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 cDNA 분자; 또는 iv) PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 폴리펩타이드의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고; 대상체가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자, mRNA 분자, cDNA 분자 또는 폴리펩타이드를 갖고, 하지정맥류의 하나 이상의 증상을 가질 때, 그 대상체는 하지정맥류를 갖는 것으로 진단된다.

본 개시내용은 또한 인간 대상체에서 하지정맥류를 진단하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 샘플에서 인간 PIEZO1 폴리펩타이드를 암호화하는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자(예컨대, 게놈 핵산 분자, mRNA 분자, 및/또는 cDNA 분자)의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고; 대상체가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자, mRNA 분자, cDNA 분자 또는 폴리펩타이드(즉, 인간 대상체는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 이형접합성 또는 동형접합성으로 분류됨)를 갖고, 하지정맥류의 하나 이상의 증상을 가질 때, 그 대상체는 하지정맥류를 갖는 것으로 진단된다.

본원에 기재된 임의의 방법에 의해 대상체로부터 얻은 샘플에서 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시험관내에서 이 방법을 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원위치에서 이 방법을 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생체내에서 이 방법을 수행할 수 있다. 임의의 이들 실시형태에서, 핵산 분자는 인간 대상체로부터 얻은 세포 내에 존재할 수 있다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체가 하지정맥류를 갖는 것으로 진단될 때, 인간 대상체는 본원에 기재된 것과 같이 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제에 의해 추가로 치료된다. 예를 들어, 인간 대상체가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 것으로 결정되고, 하지정맥류의 하나 이상의 증상을 가질 때, 그 인간 대상체는 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제가 투여된다. 일부 실시형태에서, 환자가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 동형접합성일 때, 그 환자는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 이형접합성인 환자에게 투여되는 표준 투여량과 동일하거나 이보다 많은 투여량으로 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제가 투여된다. 일부 실시형태에서, 환자는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 이형접합성이다. 일부 실시형태에서, 환자는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 동형접합성이다.

본 개시내용은 또한 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제에 의해 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 환자는 하지정맥류를 겪거나 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가되고, 상기 방법은 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하거나 수득을 해 오고 있는 것; 및 환자가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자를 포함하는 유전자형을 갖는지를 결정하도록 생물학적 샘플에서 유전자형분석 검정을 수행하거나 수행을 해 오고 있는 것에 의해 환자가 인간 PIEZO1 폴리펩타이드를 암호화하는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자를 갖는지를 결정하는 단계; 및 환자가 PIEZO1 기준일 때, 표준 투여량으로 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제를 그 환자에게 투여하거나 계속해서 투여하는 단계; 및 환자가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 이형접합성 또는 동형접합성일 때, 표준 투여량과 동일하거나 이보다 많은 양으로 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제를 그 환자에게 투여하거나 계속해서 투여하는 단계를 포함하고; 인간 PIEZO1 폴리펩타이드를 암호화하는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자를 갖는 유전자형의 존재는 그 환자가 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된다는 것을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 환자는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 이형접합성이다. 일부 실시형태에서, 환자는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 동형접합성이다.

본원에 기재된 임의의 방법에 의해 환자가 인간 PIEZO1 폴리펩타이드를 암호화하는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자를 갖는지를 결정하기 위한 유전자형분석 검정을 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시험관내에서 이 방법을 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원위치에서 이 방법을 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생체내에서 이 방법을 수행할 수 있다. 임의의 이들 실시형태에서, 핵산 분자는 인간 대상체로부터 얻은 세포 내에 존재할 수 있다.

일부 실시형태에서, 환자가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 동형접합성일 때, 그 환자는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 이형접합성인 환자에게 투여되는 표준 투여량과 동일하거나 이보다 많은 투여량으로 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제가 투여된다.

본 개시내용은 또한 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제에 의해 환자를 치료하는 방법을 제공하고, 환자는 하지정맥류를 겪거나 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가되고, 상기 방법은 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하거나 수득을 해 오고 있는 것; 및 환자가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 폴리펩타이드를 갖는지를 결정하도록 생물학적 샘플에서 검정을 수행하거나 수행을 해 오고 있는 것에 의해 환자가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 폴리펩타이드를 갖는지를 결정하는 단계; 및 환자가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 폴리펩타이드를 갖지 않을 때, 표준 투여량으로 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제를 그 환자에게 투여하거나 계속해서 투여하는 단계; 및 환자가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 폴리펩타이드를 가질 때, 표준 투여량과 동일하거나 이보다 많은 양으로 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제를 그 환자에게 투여하거나 계속해서 투여하는 단계를 포함하고; PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 폴리펩타이드의 존재는 환자가 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된다는 것을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 환자는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 폴리펩타이드를 갖는다. 일부 실시형태에서, 환자는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 폴리펩타이드를 갖지 않는다.

본원에 기재된 임의의 방법에 의해 환자가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 폴리펩타이드를 갖는지를 결정하기 위한 검정을 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시험관내에서 이 방법을 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 원위치에서 이 방법을 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생체내에서 이 방법을 수행할 수 있다. 임의의 이들 실시형태에서, 폴리펩타이드는 인간 대상체로부터 얻은 세포 내에 존재할 수 있다.

본원에 기재된 임의의 실시형태에서, PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 폴리펩타이드는 부분 기능 상실, 완전 기능 상실, 예측된 부분 기능 상실 또는 예측된 완전 기능 상실을 갖는 임의의 PIEZO1 폴리펩타이드일 수 있다. 예를 들어, PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 폴리펩타이드는 본원에 기재된 임의의 PIEZO1 변이체 폴리펩타이드일 수 있다.

하지정맥류의 증상은 무거운 다리, 이환된 다리에서의 거미양 정맥류(모세혈관확장증)의 출현, 특히 밤에 발목 종창, 이환된 정맥 근처의 갈색 내지 황색의 번들거리는 피부 변색, 피부 부위의 발적, 건조 및 가려움(정체 피부염 또는 정맥성 습진이라 칭함), 특히 기립과 같이 갑작스럽게 움직일 때 생기는 경련, 이환된 부위에 경미한 부상, 정상보다 출혈이 많거나 치유에 오랜 시간이 걸림, 발목 위의 피부의 오그라짐(지방피부경화증), 하지 불안 증후군, 발목에서 보이는 희고 불규칙한 흉터 같은 반점(백색 위축), 또는 임의의 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제의 예는 플라보노이드, 예컨대 디오스민 또는 헤스페리딘, 및 소염제, 예컨대 이부프로펜 및 아스피린을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

일부 실시형태에서, 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제의 용량은 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 동형접합성인 환자 또는 인간 대상체(표준 투여량을 받을 수 있음)와 비교하여 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 이형접합성인 환자 또는 인간 대상체에 대해 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 약 90% 감소할 수 있다(즉, 표준 투여량보다 낮음). 일부 실시형태에서, 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제의 용량은 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40% 또는 약 50%만큼 감소할 수 있다. 게다가, PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 이형접합성인 환자 또는 인간 대상체에서 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제의 용량은 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 동형접합성인 환자 또는 인간 대상체와 비교하여 덜 빈번하게 투여될 수 있다.

예를 들어, 1일, 2일, 3일, 5일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 5주, 6주, 7주, 8주, 2개월 또는 3개월 후 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제의 투여를 반복할 수 있다. 반복 투여는 동일한 용량 또는 상이한 용량에 있을 수 있다. 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 이것 초과로 투여를 반복할 수 있다. 예를 들어, 소정의 투약 섭생에 따르면, 예를 들어 6개월, 1년 또는 이것 초과와 같은 연장된 기간 동안 환자는 치료를 받을 수 있다.

비제한적인 예로서 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 척추강내, 복강내, 국소, 비강내 또는 근육내를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제의 투여가 발생할 수 있다. 투여를 위한 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균이고 실질적으로 등장성이며, GMP 조건 하에 제조된다. 단위 투여 형태(즉, 단일 투여를 위한 투여량)로 약제학적 조성물을 제공할 수 있다. 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능하고 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 약제학적 조성물을 제형화할 수 있다. 그 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라진다. 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제가 그 제형의 다른 성분과 상용성이고 이의 수혜자에게 실질적으로 해롭지 않다는 것을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "치료한다", "치료하는" 및 "치료" 및 "예방한다", "예방하는" 및 "예방"은 각각 치료 효과 및 예방 효과와 같은 원하는 생물학적 반응을 유발하는 것을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 치료 효과는 작용제 또는 작용제를 포함하는 조성물의 투여 후 하지정맥류의 축소/감소, 하지정맥류의 중증도의 축소/감소(예를 들어, 하지정맥류의 발생의 감소 또는 억제 등), 증상 및 하지정맥류 관련된 영향의 축소/감소, 증상 및 하지정맥류 관련된 영향의 발생의 지연, 하지정맥류 관련된 영향의 증상의 중증도의 감소, 급성 삽화의 중증도의 감소, 증상 및 하지정맥류 관련된 영향의 수의 감소, 증상 및 하지정맥류 관련된 영향의 잠복기의 감소, 증상 및 하지정맥류 관련된 영향의 경감, 속발성 증상의 감소, 속발성 감염의 감소, 하지정맥류의 재발의 예방, 재발 삽화의 수 또는 빈도의 감소, 증상성 삽화 사이의 잠복기의 증가, 계속되는 진행에 걸리는 시간의 증가, 회복의 가속화, 및/또는 대안적인 치료법의 효능의 증가 또는 이에 대한 내성의 감소 중 하나 이상을 포함한다. 예방 효과는 치료학적 프로토콜의 투여 후 하지정맥류 발생/진행의 완전 또는 부분 회피/억제 또는 지연(예를 들어, 완전 또는 부분 회피/억제 또는 지연 등)을 포함할 수 있다. 하지정맥류의 치료는 임의의 임상 병기 또는 증상에 있는 하지정맥류의 임의의 형태를 갖는 것으로 이미 진단된 환자의 치료, 하지정맥류의 발병 또는 전개 또는 이의 증상 또는 징후의 중증화 또는 악화의 지연, 및/또는 하지정맥류의 중증도의 예방 및/또는 감소를 포함한다.

본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 임의의 방법에서, 대상체 인간으로부터의 생물학적 샘플에서 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자, PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 mRNA 분자, 및/또는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 cDNA 분자의 존재의 검출 또는 결정을 제공한다. 집단 내의 유전자 서열 및 이러한 유전자에 의해 암호화된 mRNA 분자가 단일-뉴클레오타이드 다형성과 같은 다형성으로 인해 변할 수 있다고 이해된다. 본원에 개시된 PIEZO1 변이체 핵산 분자에 대해 본원에 제공된 서열은 오직 예시적인 서열이다. PIEZO1 변이체 핵산 분자에 대한 다른 서열이 또한 가능하다.

대상체로부터의 임의의 세포, 조직 또는 체액으로부터 생물학적 샘플이 유래될 수 있다. 샘플은 임의의 임상적으로 관련된 조직, 예컨대 골수 샘플, 종양 생검, 세침 흡인액, 또는 혈액, 치은열구액, 혈장, 혈청, 림프, 복수, 낭종액 또는 뇨와 같은 체액의 샘플을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 샘플은 구강 면봉을 포함한다. 본원에 개시된 방법에 사용된 샘플은 검정 형식, 검출 방법의 성질 및 샘플로서 사용되는 조직, 세포 또는 추출물에 기초하여 변할 것이다. 사용되는 검정에 따라 생물학적 샘플을 다르게 가공할 수 있다. 예를 들어, 임의의 PIEZO1 변이체 핵산 분자를 검출할 때, 게놈 DNA에 대한 샘플을 단리하거나 농후화하도록 설계된 예비 가공을 사용할 수 있다. 이 목적을 위해 다양한 공지된 기법을 사용할 수 있다. 임의의 PIEZO1 변이체 mRNA의 수준을 검출할 때, 생물학적 샘플을 mRNA로 농후화하도록 상이한 기법을 사용할 수 있다. mRNA의 존재 또는 수준 또는 특정 변이체 게놈 DNA 유전좌위의 존재를 검출하기 위한 다양한 방법을 사용할 수 있다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체에서 인간 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자를 검출하는 것은 생물학적 샘플에서 PIEZO1 게놈 핵산 분자, PIEZO1 mRNA 분자 또는 mRNA 분자로부터 생산된 PIEZO1 cDNA 분자가 기능 상실(부분 또는 부분)을 야기하거나 기능 상실(부분 또는 완전)을 야기하는 것으로 예측된 하나 이상의 변이를 포함하는지를 결정하도록 인간 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플을 분석하거나 유전자형분석하는 것을 포함한다.

일부 실시형태에서, 인간 대상체에서 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자(예를 들어, 게놈 핵산 분자, mRNA 분자 및/또는 cDNA 분자 등)의 존재 또는 부재를 검출하는 방법은 인간 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 검정을 수행하는 단계를 포함하고, 검정은 생물학적 샘플에서의 핵산 분자가 특정 뉴클레오타이드 서열을 포함하는지를 결정한다.

일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 세포 용해물을 포함한다. 이러한 방법은, 예를 들어, PIEZO1 게놈 핵산 분자 또는 mRNA 분자를 포함하는 대상체로부터의 생물학적 샘플을 수득하는 단계 및 mRNA의 경우에는 선택적으로 mRNA를 cDNA로 역전사시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어, 특정 PIEZO1 핵산 분자의 이들 위치의 동일성을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 시험관내 방법이다.

일부 실시형태에서, 결정하는 단계, 검출하는 단계 또는 유전자형분석 검정은 생물학적 샘플에서 PIEZO1 게놈 핵산 분자, PIEZO1 mRNA 분자 또는 mRNA 분자로부터 생산된 PIEZO1 cDNA 분자의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 일부를 시퀀싱하는 단계를 포함하고, 시퀀싱된 부분은 기능 상실(부분 또는 완전)을 야기하거나 기능 상실(부분 또는 완전)을 야기하는 것으로 예측된 하나 이상의 변이를 포함한다.

본원에 기재된 임의의 방법에서, 결정하는 단계, 검출하는 단계 또는 유전자형분석 검정은 생물학적 샘플에서 PIEZO1 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 일부를 시퀀싱하는 단계를 포함하고, 시퀀싱된 부분은 예측된 기능 상실 변이체 부분에 상응하는 위치를 포함하고, 예측된 기능 상실 변이체 위치에서의 변이체 뉴클레오타이드가 검출될 때, 생물학적 샘플에서의 PIEZO1 핵산 분자는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자이다.

일부 실시형태에서, 결정하는 단계, 검출하는 단계 또는 유전자형분석 검정은 a) 생물학적 샘플을 예측된 기능 상실 변이체 위치에 가장 근접한 PIEZO1 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열의 일부에 혼성화하는 프라이머와 접촉시키는 단계; b) 적어도 예측된 기능 상실 변이체 위치를 통해 프라이머를 연장시키는 단계; 및 c) 프라이머의 연장 상물이 예측된 기능 상실 변이체 위치에서의 변이체 뉴클레오타이드를 포함하는지를 결정하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 검정은 전체 핵산 분자를 시퀀싱하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, PIEZO1 게놈 핵산 분자만을 분석한다. 일부 실시형태에서, PIEZO1 mRNA만을 분석한다. 일부 실시형태에서, PIEZO1 mRNA로부터 얻은 PIEZO1 cDNA만을 분석한다.

일부 실시형태에서, 결정하는 단계, 검출하는 단계 또는 유전자형분석 검정은 a) 인간 PIEZO1 폴리펩타이드를 암호화하는 PIEZO1 핵산 분자의 적어도 일부를 증폭시키는 단계이되, 그 일부는 예측된 기능 상실 변이체 위치를 포함하는 증폭시키는 단계; b) 증폭된 핵산 분자를 검출 가능한 라벨에 의해 표지하는 단계; c) 표지된 핵산 분자를 변경-특이적 프로브를 포함하는 지지체와 접촉시키는 단계이되, 변경-특이적 프로브는 엄격한 조건 하에 예측된 기능 상실 변이체 위치에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 접촉시키는 단계; 및 d) 검출 가능한 라벨을 검출하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 핵산 분자는 mRNA이고, 결정하는 단계는 증폭시키는 단계 전에 mRNA를 cDNA로 역전사시키는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 결정하는 단계, 검출하는 단계 또는 유전자형분석 검정은 생물학적 샘플에서의 핵산 분자를 검출 가능한 라벨을 포함하는 변경-특이적 프로브와 접촉시키는 단계이되, 변경-특이적 프로브는 엄격한 조건 하에 예측된 기능 상실 변이체 위치에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 접촉시키는 단계; 및 검출 가능한 라벨을 검출하는 단계를 포함한다.

본원에 기재된 변경-특이적 프로브 또는 변경-특이적 프라이머는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자, 또는 이의 보체에 상보성이고/이거나 혼성화하거나 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변경-특이적 프로브 또는 변경-특이적 프라이머는 적어도 약 5개, 적어도 약 8개, 적어도 약 10개, 적어도 약 11개, 적어도 약 12개, 적어도 약 13개, 적어도 약 14개, 적어도 약 15개, 적어도 약 16개, 적어도 약 17개, 적어도 약 18개, 적어도 약 19개, 적어도 약 20개, 적어도 약 21개, 적어도 약 22개, 적어도 약 23개, 적어도 약 24개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 35개, 적어도 약 40개, 적어도 약 45개 또는 적어도 약 50개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 변경-특이적 프로브 또는 변경-특이적 프라이머는 적어도 15개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 변경-특이적 프로브 또는 변경-특이적 프라이머는 적어도 15개의 뉴클레오타이드 내지 적어도 약 35개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 변경-특이적 프로브 또는 변경-특이적 프라이머는 엄격한 조건 하에 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자, PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 mRNA 분자, 및/또는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 cDNA 분자에 혼성화한다.

핵산 서열에서의 SNP와 같은 돌연변이를 검출하기 위해 변경-특이적 중합효소 연쇄 반응 기법을 사용할 수 있다. DNA 중합효소는 주형과의 불일치가 존재할 때 연장하지 않을 것이므로, 변경-특이적 프라이머를 사용할 수 있다.

일부 실시형태에서, 샘플에서의 핵산 분자는 mRNA이고, mRNA는 증폭시키는 단계 전에 cDNA로 역전사된다. 일부 실시형태에서, 핵산 분자는 인간 대상체로부터 얻은 세포 내에 존재한다.

일부 실시형태에서, 검정은 생물학적 샘플을 엄격한 조건 하에 PIEZO1 변이체 게놈 서열, 변이체 mRNA 서열 또는 변이체 cDNA 서열에 특이적으로 혼성화하고 상응하는 PIEZO1 기준 서열에 혼성화하지 않는 변경-특이적 프라이머 또는 변경-특이적 프로브와 같은 프라이머 또는 프로브와 접촉시키는 단계 및 혼성화가 발생하는지를 결정하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 검정은 RNA 시퀀싱(RNA-Seq)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 검정은 예컨대 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 mRNA를 cDNA로 역전사시키는 단계를 또한 포함한다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 표적 뉴클레오타이드 서열에 결합하고 PIEZO1 변이체 게놈 핵산 분자, 변이체 mRNA 분자 또는 변이체 cDNA 분자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 특이적으로 검출하고/하거나 확인하기 위해 충분한 뉴클레오타이드 길이의 프로브 및 프라이머를 사용한다. 이 결과를 달성하기 위해 조작자가 혼성화 조건 또는 반응 조건을 결정할 수 있다. 뉴클레오타이드 길이는 본원에 기재되거나 예시된 임의의 검정을 포함하여 선택된 검출 방법에 사용하기에 충분한 임의의 길이일 수 있다. 이러한 프로브 및 프라이머는 높은 엄격성 혼성화 조건 하에 표적 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 종래의 방법에 의해 표적 뉴클레오타이드 서열과 다르고 표적 뉴클레오타이드 서열을 특이적으로 검출하고/하거나 확인하는 능력을 보유하는 프로브를 설계할 수 있지만, 프로브 및 프라이머는 표적 뉴클레오타이드 서열 내에 인접한 뉴클레오타이드의 완전한 뉴클레오타이드 서열 동일성을 가질 수 있다. 프로브 및 프라이머는 표적 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열과 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 100%의 서열 동일성 또는 상보성을 가질 수 있다.

핵산 시퀀싱 기법의 예시적인 예는 사슬 종결자(Sanger) 시퀀싱 및 염료 종결자 시퀀싱을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 방법은 정제된 DNA, 증폭된 DNA 및 고정된 세포 제제를 향한 표지된 프라이머 또는 프로브의 사용을 포함하는 시퀀싱 이외의 핵산 혼성화 방법(형광 동소 혼성화(FISH: fluorescence in situ hybridization))을 수반한다. 일부 방법에서, 검출 전에 또는 검출과 동시에 표적 핵산 분자를 증폭시킬 수 있다. 핵산 증폭 기법의 예시적인 예는 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction), 분해효소 연쇄 반응(LCR: ligase chain reaction), 가닥 변위 증폭(SDA: strand displacement amplification) 및 핵산 서열 기반 증폭(NASBA: nucleic acid sequence based amplification)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 방법은 분해효소 연쇄 반응, 가닥 변위 증폭 및 고온성 SDA(tSDA: thermophilic SDA)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

혼성화 기법에서, 프로브 또는 프라이머가 이의 표적에 특이적으로 혼성화하도록 엄격한 조건을 이용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 엄격한 조건 하의 폴리뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브는 배경에 비해 10배 초과를 포함하여 배경에 비해 예컨대 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 또는 이것 초과로 다른 비표적 서열보다 검출 가능하게 더 높은 정도로 이의 표적 서열에 혼성화할 것이다. 엄격한 조건은 서열-특이적이고, 상이한 상황에서 상이할 것이다.

예를 들어, 약 45℃에서의 6X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)의 DNA 혼성화, 이어서 50℃에서의 2X SSC의 세척을 촉진하는 적절한 엄격성 조건은 공지되어 있거나 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6에서 발견될 수 있다. 통상적으로, 혼성화 및 검출에 대한 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.5 M 미만의 Na⁺ 이온, 통상적으로 약 0.01 내지 1.0 M의 Na⁺ 이온 농도(또는 다른 염)이고, 온도가 짧은 프로브(예를 들어, 10개 내지 50개의 뉴클레오타이드 등)의 경우에는 적어도 약 30℃이고 긴 프로브(예를 들어, 50개 초과의 뉴클레오타이드 등)의 경우에는 적어도 약 60℃인 것일 것이다. 엄격한 조건은 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가에 의해 또한 달성될 수 있다. 선택적으로, 세척 완충액은 약 0.1% 내지 약 1%의 SDS를 포함할 수 있다. 혼성화의 기간은 일반적으로 약 24시간 미만, 보통 약 4시간 내지 약 12시간이다. 세척 시간의 지속기간은 적어도 평형에 도달하기에 충분한 시간일 것이다.

본 개시내용은 또한 본원에 기재된 임의의 PIEZO1 핵산 분자(게놈 핵산 분자, mRNA 분자 또는 cDNA 분자), 또는 이의 보체, 및 본원에 기재된 임의의 변경-특이적 프라이머 또는 변경-특이적 프로브를 포함하는 분자 복합체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 분자 복합체에서의 PIEZO1 핵산 분자(게놈 핵산 분자, mRNA 분자 또는 cDNA 분자), 또는 이의 보체는 단일-가닥이다. 일부 실시형태에서, PIEZO1 핵산 분자는 본원에 기재된 임의의 게놈 핵산 분자이다. 일부 실시형태에서, PIEZO1 핵산 분자는 본원에 기재된 임의의 mRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, PIEZO1 핵산 분자는 본원에 기재된 임의의 cDNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 분자 복합체는 본원에 기재된 임의의 PIEZO1 핵산 분자(게놈 핵산 분자, mRNA 분자 또는 cDNA 분자), 또는 이의 보체, 및 본원에 기재된 임의의 변경-특이적 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분자 복합체는 본원에 기재된 임의의 PIEZO1 핵산 분자(게놈 핵산 분자, mRNA 분자 또는 cDNA 분자), 또는 이의 보체, 및 본원에 기재된 임의의 변경-특이적 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 분자 복합체는 비인간 중합효소를 포함한다.

일부 실시형태에서, 인간 PIEZO1 예측된 기능 상실 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 것은 대상체에서의 PIEZO1 폴리펩타이드가 기능 상실(부분 또는 부분) 또는 예측된 기능 상실(부분 또는 완전)을 갖게 하는 하나 이상의 변이를 그 폴리펩타이드가 함유하는지를 결정하도록 인간 대상체로부터 얻은 샘플에서 검정을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 검정은 변이체 위치를 포함하는 PIEZO1 폴리펩타이드의 적어도 일부를 시퀀싱하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출하는 단계는 전체 폴리펩타이드를 시퀀싱하는 것을 포함한다. PIEZO1 폴리펩타이드의 변이체 위치에서의 변이체 아미노산의 확인은 PIEZO1 폴리펩타이드가 PIEZO1 예측된 기능 상실 폴리펩타이드라는 것을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 검정은 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 존재를 검출하기 위한 면역검정을 포함한다. PIEZO1 폴리펩타이드의 변이체 위치에서의 변이체 아미노산의 검출은 PIEZO1 폴리펩타이드가 PIEZO1 예측된 기능 상실 폴리펩타이드라는 것을 나타낸다.

본원에 기재된 프로브 및/또는 프라이머(변경-특이적 프로브 및 변경-특이적 프라이머를 포함)는 약 15개 내지 약 100개, 약 15개 내지 약 35개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 변경-특이적 프로브 및 변경-특이적 프라이머는 DNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변경-특이적 프로브 및 변경-특이적 프라이머는 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 프로브 및 프라이머(변경-특이적 프로브 및 변경-특이적 프라이머를 포함)는 본원에 개시된 임의의 핵산 분자 또는 이의 보체에 특이적으로 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 프로브 및 프라이머(변경-특이적 프로브 및 변경-특이적 프라이머를 포함)는 엄격한 조건 하에 본원에 개시된 임의의 핵산 분자에 특이적으로 혼성화한다. 본 개시내용의 맥락에서 "특이적으로 혼성화한다"는 프로브 또는 프라이머(변경-특이적 프로브 및 변경-특이적 프라이머를 포함)가 PIEZO1 기준 게놈 핵산 분자, PIEZO1 기준 mRNA 분자, 및/또는 PIEZO1 기준 cDNA 분자를 암호화하는 핵산 서열에 혼성화하지 않는다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 프로브(예를 들어, 변경-특이적 프로브 등)은 라벨을 포함한다. 일부 실시형태에서, 라벨은 형광 라벨, 방사선라벨 또는 비오틴이다.

PIEZO1 기준 게놈 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열은 69,883개의 뉴클레오타이드 길이인 서열 번호 1에 기재되어 있다. 서열 번호 1에 기재된 제1 뉴클레오타이드는 16번 염색체의 88,715,338번 위치에서의 뉴클레오타이드에 상응한다( hg38_knownGene_ENST00000301015.14 참조).

비제한적인 예로서 (인간 게놈 기준 빌드 GRch38을 사용하여) 16:88715629:G:A, 16:88715728:G:T, 16:88715767:G:A, 16:88715802:C:A, 16:88715822:D:4, 16:88715987:I:1, 16:88716359:A:G, 16:88716570:C:T, 16:88716874:G:A, 16:88717213:T:A, 16:88719588:G:A, 16:88719722:C:G, 16:88719870:G:T, 16:88720068:D:2, 16:88720229:C:A, 16:88720248:D:4, 16:88720394:C:T, 16:88720644:D:1, 16:88720698:D:1, 16:88720698:I:1, 16:88721165:C:A, 16:88721268:D:1, 16:88721307:G:A, 16:88721586:G:C, 16:88721652:G:C, 16:88722217:C:T, 16:88722605:I:1, 16:88723005:I:7, 16:88723253:G:A, 16:88723311:C:T, 16:88725081:C:A, 16:88726282:G:A, 16:88726546:C:T, 16:88726619:G:A, 16:88726924:G:A, 16:88727038:C:T, 16:88727072:D:1, 16:88727163:G:A, 16:88731768:D:1, 16:88732334:C:G, 16:88732411:D:1, 16:88732720:D:1, 16:88733326:G:C, 16:88733337:D:4, 16:88733587:C:A, 16:88733965:D:1, 16:88734017:C:A, 16:88734042:I:1, 16:88734679:C:T, 16:88734909:I:1, 16:88736167:D:2, 16:88736324:G:A, 16:88736391:G:T, 16:88736409:C:T, 16:88736671:G:A, 16:88737557:A:C, 16:88737727:C:G, 16:88737815:C:T, 16:88738283:G:C, 16:88738637:G:A, 16:88738735:D:1, 16:88741477:C:T, 16:88742306:D:1, 16:88749399:G:A 및 16:88784929:C:T을 포함하는 PIEZO1의 많은 변이체 게놈 핵산 분자가 존재한다. 이와 같이, 예를 들어, 염기로서 서열 번호 1 기준 게놈 뉴클레오타이드 서열을 사용하여(이것 내에 기재된 제1 뉴클레오타이드는 88,715,338번 위치로서 지정됨), 처음에 기재된 변이체(16:88715629:G:A)는 88715629번 위치("변이체 위치"로 지정됨)에서 구아닌이 아데닌("변이체 뉴클레오타이드"로 지정됨)으로 대체될 것이다. "D"에 이어서 숫자로 지정된 이 변이체는 기재된 숫자의 뉴클레오타이드의 결실을 갖는다. "I"에 이어서 숫자로 지정된 이 변이체는 기재된 숫자의 뉴클레오타이드(임의의 뉴클레오타이드)의 삽입을 갖는다. 본원에 기재된 임의의 방법에서 임의의 이들 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자를 검출할 수 있다.

PIEZO1 기준 mRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열은 8,089개의 뉴클레오타이드 길이인 서열 번호 2(NCBI 참조 서열: NM 001142864.4)에 기재되어 있다. 본원에 기재된 변이체 게놈 핵산 분자에 대한 각각의 변이체 위치에서의 변이체 뉴클레오타이드는 또한 서열 번호 2에 따른 PIEZO1 기준 mRNA 서열에 기초하여 변이체 mRNA 분자에 대한 각각의 변이체 위치에서의 상응하는 변이체 뉴클레오타이드를 갖는다. 본원에 기재된 임의의 방법에서 임의의 이들 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 mRNA 분자를 검출할 수 있다.

PIEZO1 기준 cDNA 분자의 뉴클레오타이드 서열은 8,089개의 뉴클레오타이드 길이인 서열 번호 3(NCBI 기준 서열: NM_001142864.4에 기반함)에 기재되어 있다. 본원에 기재된 변이체 게놈 핵산 분자에 대한 각각의 변이체 위치에서의 변이체 뉴클레오타이드는 또한 서열 번호 3에 따른 PIEZO1 기준 cDNA 서열에 기초하여 변이체 cDNA 분자에 대한 각각의 변이체 위치에서의 상응하는 변이체 뉴클레오타이드를 갖는다. 본원에 기재된 임의의 방법에서 임의의 이들 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 cDNA 분자를 검출할 수 있다.

PIEZO1 기준 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 2,521개의 아미노산 길이인 서열 번호 4(UniProt 수탁 번호 Q92508.4 및 NCBI RefSeq 수탁 NM_001142864.4)에 기재되어 있다. PIEZO1 mRNA 분자 또는 cDNA 분자 중 어느 하나의 번역된 뉴클레오타이드 서열을 사용하여, PIEZO1 변이체 폴리펩타이드는 변이체 위치(코돈)에서 상응하는 번역된 변이체 아미노산을 갖는다. 본원에 기재된 임의의 방법에서 임의의 이들 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 폴리펩타이드를 검출할 수 있다.

뉴클레오타이드 염기에 대한 표준 문자 약어 및 아미노산에 대한 3문자 코드를 사용하여 동반된 서열 목록에 기재된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이 기재되어 있다. 뉴클레오타이드 서열은 서열의 5' 말단에서 시작하고 3' 말단으로 정방향으로(즉, 각 선에서 왼쪽에서 오른쪽으로) 진행하는 표준 관례를 따른다. 각각의 뉴클레오타이드 서열의 오직 하나의 가닥이 기재되어 있지만, 표시된 가닥에 임의의 참조로 상보성 가닥이 포함되는 것으로 이해된다. 아미노산 서열은 서열의 아미노 말단에서 시작하고 카복시 말단으로 정방향으로(즉, 각 선에서 왼쪽에서 오른쪽으로) 진행하는 표준 관례를 따른다.

본원에 사용된 어구 "상응하는" 또는 이의 문법 변형어는 특정 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 서열 또는 위치의 넘버링의 맥락에서 사용될 때 특정 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 서열을 기준 서열과 비교할 때 규정된 기준 서열의 넘버링을 지칭한다. 바꾸어 말하면, 특정 중합체의 잔기(예를 들어, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 등) 수 또는 잔기(예를 들어, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 등) 위치는 특정 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 서열 내의 잔기의 실제 숫자 위치에 의해 지정되기보다는 기준 서열과 관련하여 지정된다. 예를 들어, 2개의 서열 사이의 잔기 일치를 최적화하도록 갭을 도입하여 특정 뉴클레오타이드 서열을 기준 서열에 정렬할 수 있다. 이 경우에, 갭이 존재하지만, 특정 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 서열에서의 잔기의 넘버링은 이것이 정렬되는 기준 서열과 관련하여 이루어진다. 하나의 중합체 분자에서의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치에 상응하는 다른 중합체 분자에서의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치를 확인하기 위한 서열 정렬을 수행하기 위해 사용될 수 있는 다양한 컴퓨터 알고리즘이 존재한다. 예를 들어, NCBI BLAST 알고리즘(Altschul 등, Nucleic Acids Res., 1997, 25, 3389-3402) 또는 CLUSTALW 소프트웨어(Sievers and Higgins, Methods Mol. Biol., 2014, 1079, 105-116)를 사용하여, 서열 정렬을 수행할 수 있다. 그러나, 서열을 또한 수동으로 정렬할 수 있다.

상기 또는 하기에 인용된 모든 특허 문헌, 웹사이트, 다른 공보, 수탁 번호 등은 모든 목적을 위해 각각의 개별 항목이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 포함된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 그 전체가 참고로 포함된다. 상이한 서열 버전이 상이한 시점에서의 수탁 번호와 연관되면, 본 출원의 유효 출원일에서의 수탁 번호와 연관된 버전이 의도된다. 유효 출원일은 실제 출원일 또는 적용 가능한 경우 수탁 번호에 조회되는 우선권 출원의 출원일 중 빠른 것을 의미한다. 마찬가지로, 상이한 시점에 공보, 웹사이트 등의 상이한 버전이 공개되면, 달리 표시되지 않는 한 본 출원의 유효 출원일에서의 가장 최근에 공개된 버전이 의도된다. 본 개시내용의 임의의 특징, 단계, 요소, 실시형태 또는 양태는, 구체적으로 달리 표시되지 않는 한, 임의의 다른 특징, 단계, 요소, 실시형태 또는 양태와 조합되어 사용될 수 있다. 본 개시내용이 명확성 및 이해의 목적을 위해 예시 및 실시예의 방식으로 약간 자세히 기재되어 있지만, 첨부된 청구항의 범위 내에 소정의 변화 및 변형이 실행될 수 있는 것으로 이해될 것이다.

하기 실시예는 실시형태를 더 자세히 기재하도록 제공된다. 이들은 청구된 실시형태를 제한하지 않고 예시하는 것으로 의도된다. 하기 실시예는 본원에 기재된 화합물, 조성물, 물품, 장치 및/또는 방법이 어떻게 제조되고 평가되는지의 개시내용 및 설명을 당업자에게 제공하고, 순수히 예시적인 것으로 의도되고 어떠한 청구항의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 수치(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하도록 노력이 이루어지지만, 약간의 오차 및 편차를 처리할 수 있다. 달리 표시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 온도는 ℃ 또는 주위 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.

실시예

실시예 1: 재료 및 방법

WES 샘플 준비 및 시퀀싱

대략 16 ng/μl로 정규화된 게놈 DNA 샘플을 UK Biobank로부터 인하우스로 0.5 ml의 2D 매트릭스 관(Thermo Fisher Scientific)에서 옮기고, 샘플 준비 전에 -80℃에서 자동화 샘플 바이오뱅크(LiCONiC Instruments)에서 저장하였다. 1개의 샘플은 시퀀싱에 불충분한 DNA를 가졌다. 인하우스로 개발된 고속 완전-자동화 접근법을 이용하여 엑솜 포획을 완료하였다. 간단하게, 커스텀 NEBNext Ultra II FS DNA 라이브러리 프렙 키트(New England Biolabs)를 사용하여 200개의 염기쌍의 평균 단편 크기로 100 ng의 게놈 DNA를 효소적으로 전단하여 DNA 라이브러리를 생성하고, 모든 DNA 라이브러리에 공통 Y형 어댑터(Integrated DNA Technologies)를 결찰하였다. 다중화된 엑솜 포획 및 시퀀싱이 용이하게 하도록 KAPA HiFi 중합효소(KAPA Biosystems)에 의한 라이브러리 증폭 동안 DNA 단편에 고유한 비대칭적인 10개의 염기쌍 바코드를 첨가하였다. 밤샘 엑솜 포획 전에 동일한 양의 샘플을 풀링하고, 대략 16시간에, IDT의 xGen 프로브 라이브러리의 약간 변형된 버전으로; 이전의 포획 시약(NimbleGen VCRome)에 의해서는 잘 다뤄지지만 표준 xGen 프로브에 의해서는 불량하게 다뤄지는 게놈의 영역을 포획하도록 보충적 프로브를 첨가하였다. 전체로서, 표적화된 영역에 n = 38,997,831개의 염기가 포함되었다. 포획된 단편은 스트렙타비딘-커플링된 DYNABEADS^®(Thermo Fisher Scientific)에 결합하였고, 제조사의 추천된 프로토콜(Integrated DNA Technologies)에 따라 xGen Hybridization and Wash 키트를 사용하여 일련의 엄격한 세척을 통해 비특이적 DNA 단편을 제거하였다. KAPA HiFi에 의해 포획된 DNA를 PCR 증폭하고, qPCR에 의해 KAPA Library Quantification Kit(KAPA Biosystems)로 정량화하였다. 다중화된 샘플을 풀링하고, 이후 S2 유세포를 사용하여 Illumina NOVASEQ^® 6000 플랫폼에서 2개의 10개 염기쌍 인덱스 리드(read)에 의해 75개 염기쌍 양끝단 리드를 사용하여 시퀀싱하였다.

서열 정렬, 변이체 확인 및 유전자형 배정

각각의 Illumina NOVASEQ^® 실행으로부터의 원시 데이터를 시퀀싱의 완료 시 국소 완충액 저장에 수집하고, 자동화 분석을 위해 DNAnexus 플랫폼에 업로딩하였다. 업로딩을 완료한 후, CBCL 파일을 FASTQ-포맷팅된 리드로 변환시켜 분석이 시작하였고, bcl2fastq 변환 소프트웨어(Illumina Inc., 캘리포니아주 샌 디에고)를 사용하여 특정 바코드를 통해 샘플에 배정하였다. 이후, 그 샘플에 대해 생성된 리드를 모두 나타내는 샘플-특이적 FASTQ 파일을 BWA-mem에 의해 GRCh38 게놈 기준에 정렬하였다. 각각의 샘플에 대한 생성된 이진 정렬 파일(BAM: binary alignment file)은 맵핑된 리드의 게놈 좌표, 품질 정보 및 특정 리드가 이의 맵핑된 위치에서의 기준과 다른 정도를 함유하였다. 이후, Picard MarkDuplicates 도구("picard.sourceforge.net"에서의 월드 와이드 웹)에 의해 중복 리드를 확인하고 플래깅하도록 BAM 파일에서 정렬된 리드를 평가하여서, 다운스트림 분석에서 배타에 대해 모든 가능한 중복 리드가 마킹된 정렬 파일(duplicatesMarked.BAM)을 생성하였다.

이후, 각각의 개별 샘플에서 Genomics PLC로부터의 WeCall 변이체 검출기(caller)("github.com/Genomicsplc/wecall"에서의 월드 와이드 웹)를 사용하여 변이체 콜을 포함하는 GVCF 파일을 작성하여서, 기준과 비교하여 SNV 및 삽입-결실 둘 다를 확인한다. 추가로, 각각의 GVCF 파일은 각각의 변이체의 접합상태, 기준 대립유전자 및 교대 대립유전자 둘 다의 리드수, 유전자형 콜의 신뢰도를 나타내는 유전자형 품질 및 그 위치에서의 변이체 콜의 전체 품질을 운반하였다.

개별 샘플 BAM 파일을 변이체 호출의 완료 시 동일한 도구를 사용하여 완전 무손실 CRAM 파일로 변환하였다. Picard("picard.sourceforge.net"에서의 월드 와이드 웹), bcftools("samtools.github.io/bcftools"에서의 월드 와이드 웹) 및 FastQC("bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc"에서의 월드 와이드 웹)를 사용하여 포착, 정렬, 인서트 크기 및 변이체 호출 품질을 평가하기 위해 각각의 샘플에 대해 미터법 통계를 포집하였다.

샘플 시퀀싱의 완료 후, 유전적으로 결정된 성별과 보고된 성별 사이의 불일치(n = 15), 높은 비율의 이형접합성/오염(0.4 초과의 D-stat)(n = 7), 낮은 서열 적용범위(20X 적용범위를 달성하는 표적화된 염기의 85% 미만)(n = 1), 또는 유전적으로 확인된 샘플 반복실험(n = 14), 및 유전자형분석 칩과 불일치하는 WES 변이체(n = 9)를 나타내는 샘플을 배제하였다. 6개의 샘플은 다수의 카테고리에서 품질 관리에 불합격하여서 38명의 개체가 배제되었다. 이후, 다운스트림 분석을 위해 프로젝트-레벨 VCF(PVCF: project-level VCF)를 작성하도록 남은 49,960개의 샘플을 사용하였다. GLnexus 합동 유전자형분석 도구를 사용하여 PVCF를 생성하였다. 프로젝트-레벨 VCF로 모든 동형접합성 기준, 이형접합성, 동형접합성 교대 및 무호출 유전자형을 보유하도록 주의를 기울였다. '골디락스(Goldilocks)'인 추가의 필터링된 PVCF를 또한 생성하였다. 필터링된 골디락스 PVCF에서, 7 미만의 DP 또는 단일 샘플 파이프라인에서의 SNP 변이체 콜을 보유하는 샘플을 '무호출'로 변환하였다. DP 필터의 적용 후 모든 남은 샘플이 이형접합성으로 호출되고 모든 샘플이 85% ref/15% alt 미만의 AB를 갖는 부위를 배제하였다. 10 미만의 DP를 갖는 단일 샘플 파이프라인에서의 삽입-결실 변이체 콜을 보유하는 샘플을 '무호출'로 변환하였다. DP 필터의 적용 후 모든 남은 샘플이 이형접합성으로 호출되고 모든 샘플이 80% ref/20% alt 미만의 AB를 갖는 부위를 배제하였다. 우측 정렬에 의해 PVCF 파일에서의 다중-대립유전자 변이체 부위가 정규화되고, 이중대립유전자로서 표현되었다.

표현형 정의

ICD10-기반 증례는 내원환자 건강 에피소드 통계(HES: Health Episode Statistics) 기록에서 1차 진단 또는 2차 진단 중 하나 이상을 요구하였다. ICD10-기반 배타는 코드 범위에서 1 이상의 1차 진단 또는 2차 진단을 가졌다. ICD10-기반 제어는 증례 또는 배제가 아닌 개체로서 정의되었다. 커스텀 표현형 정의는 ICD-10 진단, 구두 인터뷰로부터의 자가 보고 질병 및 온라인 추적조사로부터의 의사 진단 질병, 터치스크린 정보 중 하나 이상을 포함하였다. UK Biobank(UKB) 저장소로부터 정량적 특질(예컨대, 신체 측정치, 혈구 계수, 인지 기능 시험 및 영상화 유래 표현형)을 다운로드하였고, 1회 이상의 방문에 걸쳐 이어졌다. 전체로서, WES 연관 분석에서 50건 이상의 증례수를 갖는 1,073개의 이진 특질 및 669개의 수의 정량적 특질을 시험하였다.

예측된 기능 상실(LOF) 변이체의 주석

snpEff 및 Ensembl Release 85로부터의 유전자 모델을 사용하여 변이체에 주석을 달았다. Ensembl 유전자 모델로부터 주석이 달린 시작 코돈 및 중지 코돈을 갖는 모든 단백질 암호화 전사체를 포함하는 단백질 암호화 영역에 대해 포괄적이고 고품질인 전사체 세트를 얻었다. 획득 중단(stop_gained), 소실 시작(start_lost), 스플라이스 공여자(splice_donor), 스플라이스 수여자(splice_acceptor), 소실 중단(stop_lost) 및 프레임쉬프트(frameshift)로서 주석이 달린 변이체는 LOF 변이체인 것으로 여겨진다.

141,456명의 개체에서의 유전 변이의 최근의 대규모 연구는 LOF 변이체의 카탈로그를 제공한다. 엑솜 시퀀싱 캡쳐 플랫폼, 변이체 호출 알고리즘 및 주석의 차이와 같은 많은 인자로 인해 이 데이터와 직접 비교하는 것은 어렵다. 추가로, 이 보고서에서 gnomAD의 NFE 하위집단에서의 개체 수 및 지리학적 유전확인 분포(및 이에 따른 유전적 다양성)는 WES에 의한 UK Biobank의 것보다 클 수 있다. 그럼에도 불구하고, 주석 파이프라인을 사용하여 gnomAD r2.1로부터 "통과(PASS)"로 표지된 gnomAD 엑솜 부위에 주석을 달았다. Picard LiftoverVcf를 사용하여 gnomAD로부터의 데이터를 HG38로 리프팅하였다. 1% 미만의 MAF_NFE를 갖는 변이체로 제한되고, 17,951개의 유전자에서의 임의의 전사체에서 261,309개의 LOF를 얻은 비핀란드 유럽인(NFE)(n = 56,885개의 샘플, 개체)으로 데이터를 하위설정하였다. 모든 전사체에 존재하는 것에만 LOF를 제한하여서, 16,462개의 유전자에서 175,162개의 LOF가 관찰되었다. 유럽인 혈통의 WES에 의한 UKB 참가자에서 유전자의 모든 전사체에서 134,745개의 LOF가 관찰되었다.

LOF 부담 연관 분석을 위한 방법

유럽인 혈통의 49,960명의 개체 내에 희귀 LOF에 대해 부담 연관 시험을 수행하였다. Ensembl에 의해 정의된 것과 같은 각각의 유전자 영역에 대해. 0.01 이하의 MAF를 갖는 LOF는 실패하여서 그 유전자 영역에서의 적어도 하나의 LOF에 대해 이형접합성인 임의의 개체가 이형접합성으로 여겨지고, 동일한 LOF의 2개의 카피를 보유하는 개체만이 동형접합성으로 여겨진다. 희귀 변이체를 페이징하지 않고, 그래서 이 분석에 화합물 이형접합체가 고려되지 않는다.

각각의 유전자 영역에 대해, BOLT-LMM v2에서 실행된 가법 혼합 모델을 사용하여 비누락 표현형 정보를 갖는 5명 이상의 개체에 의한 668개의 순위-기반 역정규 변환된(RINT: rank-based inverse normal transformed) 정량적 측정치(모든 대상체 및 성별-계층화된 모델을 포함)를 평가하였다. 정규화 전에, 처음에 특질을 적합하게 변환하고(log10, 정사각형), 연령, 성별, 연구 장소, 혈통의 처음 4개 주성분 및 일부 경우에는 BMI 및/또는 흡연 상태를 포함하는 표준 공변량 세트에 대해 조정하였다. 정규화 전에 이상점으로서 중앙치로부터 5 중앙치 절대 편차보다 큰 데이터점을 배제하였다. SAIGE에서 실행된 일반화 혼합 모델을 사용하여 연령, 성별 및 혈통의 처음 4개 주성분에 대한 공변량 조정에 의해 50개 이상의 증례를 갖는 1,073개의 별개의 결과(모든 대상체 및 성별-계층화된 모델을 포함)를 평가하였다. 분석에 포함된 각각의 정량적 특질 및 별개의 특질에 대해 비누락 표현형 및 공변량 정보를 갖는 3 초과의 LOF 보균자인 유전자 영역만을 평가하였다.

2단계 접근법을 이용하여 양성 대조군을 조직적으로 정의하였다. 처음에, OMIM, NCBI MedGen 및 NHGRI-EBI GWAS 카탈로그를 포함하는 공공으로 입수 가능한 자원을 이용하여 관련 질환, 특질, 생물학적 또는 기능적 증거를 위한 각각의 유전자에 주석을 달았다. 이후, 관심 유전자에서 특질과 LOF 변이체 사이의 관계를 검증하기 위해 NCBI PubMed를 사용하여 적어도 하나의 소스로부터의 입증 증거를 갖는 유전자를 수동으로 큐레이팅하였다. 본원에서 GWAS 카탈로그에서 관심 특질 또는 관련 표현형(들)에 대한 유전좌위-수준 입증을 갖지만 LOF 연관에 대한 명확한 입증 증거가 부족한 유전자는 신규의 LOF 연관으로 보고된다.

단일 변이체 LOF 연관 분석을 위한 방법

부담 연관 분석에 대한 방법 부문에 기재된 것과 동일한 방법을 사용하여 단일 변이체 연관 분석을 수행하였다. p < 10^-7에 의한 유전자-특질 연관에 대해, 단일 변이체 연관 통계가 계산되었고, 모든 LOF에 대한 관심 표현형은 WES에 의해 49,960명의 유럽인 혈통 개체에서 5 이상의 소수 대립유전자수로 관찰된 부담 시험에 포함되었다. 이들 변이체에 대한 연관 통계가 Extended Data(ExtData_SingleVariantLOFs_V1.xlsx)에서 보고된다.

P-VAL 단일 잔류(LOO) 부담은 시험되는 변이체를 제외하고 존재/부재 시험의 p-값이다. 델타 P-Val 부담은 모든 65개의 변이체를 사용한 부담 시험과 비교하여 중간-탈락 분석에서의 p-값의 비율이다. 비관련된 개체에서 모든 65개의 변이체를 사용한 부담 요약 통계: B = 1.44, SE = 0.26, p-값 = 3.12E-08, cMAF = 0.00174, cMAC = 152, cMAF_cases = 0.0066, cMAC_cases = 17, cMAF_controls = 0.0016, cMAC_cases = 135. 단계별 논리 회귀는 65개 중 11개의 변이체를 선택하였다(AIC 11451). 11개의 변이체를 사용한 부담 요약 통계: B = 3.71, SE = 0.437, p-값 < 2e-16, cMAF = 0.0003, cMAC = 22, cMAF_cases = 0.005, cMAC_cases = 12, cMAF_controls = 0.0001, cMAC_controls = 10. 1 초과의 MAC를 갖는 변이체로 분석이 제한될 때, 단계별 논리 회귀는 13개 중 5개의 변이체를 선택하였다(AIC 11484). 5개의 변이체를 사용한 부담 요약 통계: B = 3.02, SE = 0.53, p-값 = 8.92e-09.

PIEZO1 및 양성 대조군(16:88835545_G_A; 녹색으로 강조됨)에 대한 단계별 회귀에 의해 선택된 11개의 pLOF 변이체에 걸친 LD(r2)는 PIEZO1에 대해 문헌에 보고되어 있다. 이들 12개의 변이체 중 어느 것도 LD, R2>0.01에 있지 않다. 이전에 보고된 변이체 rs2911463(16:88835545_G_A)에 부담 시험을 조정할 때, 부담 시험 p-값은 2E-16 미만에 있고(AIC 11,444), 이는 그 부담이 보고된 변이체를 태그화하지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 2: 시퀀싱된 참가자의 인구통계 및 임상 특징

총 50,000명의 참가자를 선택하였고, 더 완전한 표현형 데이터에 의해 개체를 우선순위 매긴다: UK Biobank Imaging Study로부터 전신 MRI 영상화 데이터, 향상된 기준선 측정, 병원 에피소드 통계(HES), 및/또는 연결된 일차 관리 기록(인정된 조사자에게 곧 이용 가능할 것임)을 갖는 개체. 불합격된 품질 관리 측정치 또는 참가자 중단으로 인해 데이터 생성 동안 40명의 참가자로부터의 샘플이 배제되었고, 그 결과 최종 세트는 49,960명의 개체였다. 전체적으로, 시퀀싱된 샘플은 500,000개의 UKB 참가자를 나타낸다(표 1). 시퀀싱된 샘플과 전체 연구 집단 사이에 연령, 성별 또는 혈통의 현저한 차이가 없었다. 시퀀싱된 참가자는 HES 진단 코드를 가질 가능성이 더 크고(77.3% 전체에 대한 시퀀싱된 것 중에 84.2%), 향상된 측정치를 가질 가질 가능성이 더 컸다(표 1).

적어도 하나의 HES 진단 코드를 갖는 WES에 의한 참가자는 시퀀싱된 샘플에서 가장 많은 것으로서 천식(ICD10 J45) 및 천식 지속상태(ICD10 J46), 및 가장 적은 것으로서 노인성 백내장(ICD10 H25) 및 미상 및 상세불명의 병인(ICD10 R69)에 대한 코드 이외에도 1차 및 2차 ICD10 코드 또는 넓은 표현형 분포의 중앙치 숫자에서 비시퀀싱된 참가자와 다르지 않았다. 시퀀싱된 하위집단은 194개의 부모-자식 쌍, 613개의 완전-형제 쌍, 1개의 일란성 쌍둥이 쌍 및 195개의 2촌 친족을 포함하였다. UKB WES에서의 개체의 쌍들 사이에 관련성의 분포가 도 1에 포함된다.

실시예 3: WES로부터의 암호화 변이의 요약 및 규명

19,467개의 유전자의 단백질 암호화 영역 및 엑손-인트론 스플라이스 부위를 표적화하였다. 모두 및 1% 미만 빈도의 MAF에 대해 유형/기능적 종류에 의해 모든 개체에 걸쳐 상염색체 변이체의 수를 관찰하였다. 모든 변이체는 QC 기준, 10% 미만의 개체 및 변이체 누락 및 10^-15 초과의 Hardy Weinberg p-값을 통과하였다. 모든 변이체 및 1% 미만의 MAF에 대한 변이체 중앙치 수 및 사분범위(IQR). 각각의 샘플에서 적어도 20x 적용범위를 달성하는 표적화된 염기(n = 38,997,831)의 평균 비율은 94.6%(표준 편차 2.1%)였다. 품질 관리 후 10,028,025개의 단일 뉴클레오타이드 및 삽입-결실 변이체가 관찰되었고, 98.5%는 1% 미만의 소수 대립유전자 빈도(MAF: minor allele frequency)를 갖는다(표 2). 전체 변이체 중에서 표적화된 영역 내에 3,995,785개가 있다. 이들 변이체는 2,431,680개의 비동의 변이체(98.9%가 1% 미만의 MAF를 가짐), 1,200,882개의 동의 변이체(97.8%가 1% 미만의 MAF를 가짐) 및 적어도 하나의 암호화 전사체에 영향을 미치는 205,867개의 예측된 기능 상실(pLOF) 변이체(개시 코돈 손실, 조기 중단 코돈, 스플라이싱 및 프레임쉬프팅 삽입-결실 변이체; 99.7%가 1% 미만의 MAF를 가짐)를 포함하였다(도 2). 개체마다 9,403개의 동의 변이체(IQR 125), 8,369개의 비동의 변이체(IQR 132) 및 161개의 pLOF 변이체(IQR 14)의 총계(중앙치 값)는 이전의 엑솜 시퀀싱 연구와 필적하다. 유전자에 대한 모든 전사체에 영향을 미치는 pLOF 변이체로 분석이 제한되면, pLOF 변이체의 수는 전체에서 140,850개로 떨어지고 개체마다 96개로 떨어졌는데(각각 약 31.6% 및 약 40.4%의 감소), 이는 이전의 연구와 일치하였다.

실시예 4: LOF 변이와의 표현형 연관

WES와 풍부한 건강 정보의 조합은 인간 유전 변이의 표현형 결과의 광범위한 조사를 허용한다. LOF 변이는 유전자 기능에 대한 대단한 통찰을 생성할 수 있지만, 입력된 데이터세트는 이러한 변이의 대부분을 누락한다. WES는 LOF 변이체를 확인하고 이의 표현형 연관을 평가하기에 매우 적합하다. 주로 유럽인 혈통의 n = 46,979명의 개체에서 1,741개의 특질(병원 에피소드 통계 및 자가-보고 데이터에 의해 한정된 적어도 50건의 증례수를 갖는 1,073개의 별개의 특질, 668개의 정량적, 인체계측학적 및 혈액 특질)에 의해 희귀(1% 미만의 AAF) pLOF 변이체(3 초과의 pLOF 변이체 보균자에 의해 모든 유전자에 걸쳐 WES에서 확인된 pLOF 변이체)에 대한 연관의 유전자 부담 시험을 수행하였다. 각각의 유전자-특질 연관에 대해, pLOF 유전자 부담 시험에 대한 연관의 강도를 부담 시험에 포함된 각각의 SNV에 대한 연관 결과와 또한 비교하였다.

실시예 5: LOF 연관 및 신규의 유전자 발견

pLOF 유전자 부담 연관 분석에서, PIEZO1 LOF(누적 대립유전자 빈도 = 0.2%)와 크게 증가된 하지정맥류 위험 사이의 신규의 연관이 확인되었다. UKB 50k 엑솜 및 UKB 150k 엑솜 내에 하지의 비증상성 하지정맥류의 이진 표현형에 대한 PIEZO1에 대한 결과가 표 3에 기재되어 있다.

이 발견은 희귀 LOF 변이체의 부담에 의해 유발되고, UKB 50k 엑솜에서 가장 유의미한 PIEZO1 단일 변이체 LOF 연관은 2.29 x 10^-3의 p-값을 달성한다. UKB 50k 엑솜의 단일 잔류 분석은 단일 변이체가 전체 신호를 처리하지 않는다는 것을 나타내고, 단계별 회귀 분석은 11개의 별개의 변이체(이들 중 5개는 MAC가 1 초과임)가 전체 부담 신호에 기여한다는 것을 나타냈다(도 4).

2,953건의 하지정맥류 증례 및 이전에 엑솜 시퀀싱된 75,694명의 대조군에서 이 발견이 반복되었다(OR = 2.7, p = 1.86 x 10^-9). 이 영역은 질환 위험에 대한 적은 효과로 공통의 비암호화 변이체에 의해 이전에 연루되고, 여기서 rs2911463 및 16번 염색체에서 다른 근처의 공통 변이체는 하지정맥류와 최근에 연관되었다(408,455명의 유전자형분석된 U.K. Biobank 참가자의 GWAS에서 빈도 = 0.69, OR = 0.996, p-값 = 1.0 x 10^-27). rs2911463 변이체는 LD에 있지 않고, 임의의 핵심 변이체가 확인되었고(도 5), 부담 시험은 rs2911463에 대해 조정할 때 중요하게 있다.

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> Piezo Type Mechanosensitive Ion Channel Component 1 (PIEZO1) Variants And Uses Thereof <130> 189238.02502 (3172) <150> 62/862,847 <151> 2019-06-18 <150> 62/806,932 <151> 2019-02-18 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 69883 <212> DNA <213> homo sapien <400> 1 gggagccgcc gtccggccca gctcggcccc agtgagccga gcgctgcgct ccgccgaggg 60 gcagggcggt cgcctgagcg agcgcgggcc cgggacgtcg gcaccggcgg ggcggccgaa 120 ggagaaggag gaagaggaga aggcggcgcg cgggtccccg cgggtcagcc atggcgcgcc 180 ggccccgggg cccccgcacc gccccatagc gccgcggcgt ccgctcggtc tgggccgggc 240 cctgggccct ccagccatgg agccgcacgt gctcggcgcg gtcctgtact ggctgctgct 300 gccctgcgcg ctgctggctg gtgagtgggg ggcgggcgcc tgggggcgac gggagggggc 360 tgcgtctcgg ctccccacgg cctggacacc ggacgacgcc ggccggggcg agggctgcgg 420 gcgagcgggc gcggaaattc ccagggacgc gcgacccggg cgcccgcatt cctgaagcat 480 gagcgcgcca ggcggcggcg gggctcctgt cccagggccg ggctggaagg gcggcggcgg 540 ctgggggaga cggcaccgcg tgcccacggg ggcggtcgag cgagcgccgg 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Ser Leu Val Leu Pro Val 1700 1705 1710 Leu Val Phe Leu Trp Ala Met Leu Ser Ile Pro Arg Pro Ser Lys Arg 1715 1720 1725 Phe Trp Met Thr Ala Ile Val Phe Thr Glu Ile Ala Val Val Val Lys 1730 1735 1740 Tyr Leu Phe Gln Phe Gly Phe Phe Pro Trp Asn Ser His Val Val Leu 1745 1750 1755 1760 Arg Arg Tyr Glu Asn Lys Pro Tyr Phe Pro Pro Arg Ile Leu Gly Leu 1765 1770 1775 Glu Lys Thr Asp Gly Tyr Ile Lys Tyr Asp Leu Val Gln Leu Met Ala 1780 1785 1790 Leu Phe Phe His Arg Ser Gln Leu Leu Cys Tyr Gly Leu Trp Asp His 1795 1800 1805 Glu Glu Asp Ser Pro Ser Lys Glu His Asp Lys Ser Gly Glu Glu Glu 1810 1815 1820 Gln Gly Ala Glu Glu Gly Pro Gly Val Pro Ala Ala Thr Thr Glu Asp 1825 1830 1835 1840 His Ile Gln Val Glu Ala Arg Val Gly Pro Thr Asp Gly Thr Pro Glu 1845 1850 1855 Pro Gln Val Glu Leu Arg Pro Arg Asp Thr Arg Arg Ile Ser Leu Arg 1860 1865 1870 Phe Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Pro Ala Arg Lys Gly Ala Ala Ala 1875 1880 1885 Ile Glu Ala Glu Asp Arg Glu Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Lys Glu 1890 1895 1900 Ala Pro Thr Gly Arg Glu Lys Arg Pro Ser Arg Ser Gly Gly Arg Val 1905 1910 1915 1920 Arg Ala Ala Gly Arg Arg Leu Gln Gly Phe Cys Leu Ser Leu Ala Gln 1925 1930 1935 Gly Thr Tyr Arg Pro Leu Arg Arg Phe Phe His Asp Ile Leu His Thr 1940 1945 1950 Lys Tyr Arg Ala Ala Thr Asp Val Tyr Ala Leu Met Phe Leu Ala Asp 1955 1960 1965 Val Val Asp Phe Ile Ile Ile Ile Phe Gly Phe Trp Ala Phe Gly Lys 1970 1975 1980 His Ser Ala Ala Thr Asp Ile Thr Ser Ser Leu Ser Asp Asp Gln Val 1985 1990 1995 2000 Pro Glu Ala Phe Leu Val Met Leu Leu Ile Gln Phe Ser Thr Met Val 2005 2010 2015 Val Asp Arg Ala Leu Tyr Leu Arg Lys Thr Val Leu Gly Lys Leu Ala 2020 2025 2030 Phe Gln Val Ala Leu Val Leu Ala Ile His Leu Trp Met Phe Phe Ile 2035 2040 2045 Leu Pro Ala Val Thr Glu Arg Met Phe Asn Gln Asn Val Val Ala Gln 2050 2055 2060 Leu Trp Tyr Phe Val Lys Cys Ile Tyr Phe Ala Leu Ser Ala Tyr Gln 2065 2070 2075 2080 Ile Arg Cys Gly Tyr Pro Thr Arg Ile Leu Gly Asn Phe Leu Thr Lys 2085 2090 2095 Lys Tyr Asn His Leu Asn Leu Phe Leu Phe Gln Gly Phe Arg Leu Val 2100 2105 2110 Pro Phe Leu Val Glu Leu Arg Ala Val Met Asp Trp Val Trp Thr Asp 2115 2120 2125 Thr Thr Leu Ser Leu Ser Ser Trp Met Cys Val Glu Asp Ile Tyr Ala 2130 2135 2140 Asn Ile Phe Ile Ile Lys Cys Ser Arg Glu Thr Glu Lys Lys Tyr Pro 2145 2150 2155 2160 Gln Pro Lys Gly Gln Lys Lys Lys Lys Ile Val Lys Tyr Gly Met Gly 2165 2170 2175 Gly Leu Ile Ile Leu Phe Leu Ile Ala Ile Ile Trp Phe Pro Leu Leu 2180 2185 2190 Phe Met Ser Leu Val Arg Ser Val Val Gly Val Val Asn Gln Pro Ile 2195 2200 2205 Asp Val Thr Val Thr Leu Lys Leu Gly Gly Tyr Glu Pro Leu Phe Thr 2210 2215 2220 Met Ser Ala Gln Gln Pro Ser Ile Ile Pro Phe Thr Ala Gln Ala Tyr 2225 2230 2235 2240 Glu Glu Leu Ser Arg Gln Phe Asp Pro Gln Pro Leu Ala Met Gln Phe 2245 2250 2255 Ile Ser Gln Tyr Ser Pro Glu Asp Ile Val Thr Ala Gln Ile Glu Gly 2260 2265 2270 Ser Ser Gly Ala Leu Trp Arg Ile Ser Pro Pro Ser Arg Ala Gln Met 2275 2280 2285 Lys Arg Glu Leu Tyr Asn Gly Thr Ala Asp Ile Thr Leu Arg Phe Thr 2290 2295 2300 Trp Asn Phe Gln Arg Asp Leu Ala Lys Gly Gly Thr Val Glu Tyr Ala 2305 2310 2315 2320 Asn Glu Lys His Met Leu Ala Leu Ala Pro Asn Ser Thr Ala Arg Arg 2325 2330 2335 Gln Leu Ala Ser Leu Leu Glu Gly Thr Ser Asp Gln Ser Val Val Ile 2340 2345 2350 Pro Asn Leu Phe Pro Lys Tyr Ile Arg Ala Pro Asn Gly Pro Glu Ala 2355 2360 2365 Asn Pro Val Lys Gln Leu Gln Pro Asn Glu Glu Ala Asp Tyr Leu Gly 2370 2375 2380 Val Arg Ile Gln Leu Arg Arg Glu Gln Gly Ala Gly Ala Thr Gly Phe 2385 2390 2395 2400 Leu Glu Trp Trp Val Ile Glu Leu Gln Glu Cys Arg Thr Asp Cys Asn 2405 2410 2415 Leu Leu Pro Met Val Ile Phe Ser Asp Lys Val Ser Pro Pro Ser Leu 2420 2425 2430 Gly Phe Leu Ala Gly Tyr Gly Ile Met Gly Leu Tyr Val Ser Ile Val 2435 2440 2445 Leu Val Ile Gly Lys Phe Val Arg Gly Phe Phe Ser Glu Ile Ser His 2450 2455 2460 Ser Ile Met Phe Glu Glu Leu Pro Cys Val Asp Arg Ile Leu Lys Leu 2465 2470 2475 2480 Cys Gln Asp Ile Phe Leu Val Arg Glu Thr Arg Glu Leu Glu Leu Glu 2485 2490 2495 Glu Glu Leu Tyr Ala Lys Leu Ile Phe Leu Tyr Arg Ser Pro Glu Thr 2500 2505 2510 Met Ile Lys Trp Thr Arg Glu Lys Glu 2515 2520

Claims

하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된 인간 대상체를 확인하는 방법으로서,
대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서
피에조형 기계 감응 이온 채널 성분 1(PIEZO1: Piezo Type Mechanosensitive Ion Channel Component 1) 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자;
PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 mRNA 분자;
mRNA 분자로부터 생산된 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 cDNA 분자; 또는
PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 폴리펩타이드의 존재 또는 부재를 결정하거나 결정을 해 오고 있는 단계를 포함하고;
PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자, mRNA 분자, cDNA 분자 또는 폴리펩타이드의 부재는 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가되지 않는다는 것을 나타내고;
PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자, mRNA 분자, cDNA 분자 또는 폴리펩타이드의 존재는 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된다는 것을 나타내는, 방법.
인간 대상체에서 하지정맥류를 진단하는 방법으로서,
대상체로부터 얻은 샘플에서
피에조형 기계 감응 이온 채널 성분 1(PIEZO1) 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자;
PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 mRNA 분자;
mRNA 분자로부터 생산된 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 cDNA 분자; 또는
PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 폴리펩타이드의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고;
대상체가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 게놈 핵산 분자, mRNA 분자, cDNA 분자 또는 폴리펩타이드를 갖고, 하지정맥류의 하나 이상의 증상을 가질 때, 그 대상체는 하지정맥류를 갖는 것으로 진단되는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 하지정맥류를 치료하기에 효과적인 작용제에 의해 하지정맥류를 갖거나 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된 대상체를 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제에 의해 환자를 치료하는 방법으로서,
환자는 하지정맥류를 겪거나 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가되고, 상기 방법은
환자가 인간 PIEZO1 폴리펩타이드를 암호화하는 피에조형 기계 감응 이온 채널 성분 1(PIEZO1) 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자를 갖는지를 결정하는 단계이되,
환자로부터 생물학적 샘플을 수득하거나 수득을 해 오고 있는 것; 및
환자가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자를 포함하는 유전자형을 갖는지를 결정하도록 생물학적 샘플에서 유전자형분석 검정을 수행하거나 수행을 해 오고 있는 것에 의해 결정하는 단계; 및
환자가 PIEZO1 기준일 때, 표준 투여량으로 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제를 그 환자에게 투여하거나 계속해서 투여하는 단계; 및
환자가 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자에 대해 이형접합성 또는 동형접합성일 때, 표준 투여량과 동일하거나 이보다 많은 양으로 하지정맥류를 치료하거나 억제하는 치료제를 그 환자에게 투여하거나 계속해서 투여하는 단계를 포함하고;
인간 PIEZO1 폴리펩타이드를 암호화하는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자를 갖는 유전자형의 존재는 그 환자가 하지정맥류를 발생시킬 위험이 증가된다는 것을 나타내는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 결정하는 단계, 검출하는 단계 또는 유전자형분석 검정은 시험관내 수행되는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 결정하는 단계, 검출하는 단계 또는 유전자형분석 검정은 생물학적 샘플에서 PIEZO1 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 일부를 시퀀싱하는 것을 포함하고, 시퀀싱된 부분은 예측된 기능 상실 변이체 부분에 상응하는 위치를 포함하고, 예측된 기능 상실 변이체 위치에서의 변이체 뉴클레오타이드가 검출될 때, 생물학적 샘플에서의 PIEZO1 핵산 분자는 PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자인, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 결정하는 단계, 검출하는 단계 또는 유전자형분석 검정은
a) 생물학적 샘플을 예측된 기능 상실 변이체 위치에 가장 근접한 PIEZO1 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열의 일부에 혼성화하는 프라이머와 접촉시키는 단계;
b) 적어도 예측된 기능 상실 변이체 위치를 통해 프라이머를 연장시키는 단계; 및
c) 프라이머의 연장 산물이 예측된 기능 상실 변이체 위치에서 변이체 뉴클레오타이드를 포함하는지를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 결정하는 단계, 검출하는 단계 또는 유전자형분석 검정은 전체 핵산 분자를 시퀀싱하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 결정하는 단계, 검출하는 단계 또는 유전자형분석 검정은
a) 인간 PIEZO1 폴리펩타이드를 암호화하는 PIEZO1 핵산 분자의 적어도 일부를 증폭시키는 단계이되, 그 일부는 예측된 기능 상실 변이체 위치를 포함하는 증폭시키는 단계;
b) 증폭된 핵산 분자를 검출 가능한 라벨로 표지하는 단계;
c) 표지된 핵산 분자를 변경-특이적 프로브를 포함하는 지지체와 접촉시키는 단계이되, 변경-특이적 프로브는 엄격한 조건 하에 예측된 기능 상실 변이체 위치에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 접촉시키는 단계; 및
d) 검출 가능한 라벨을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
제9항에 있어서, 샘플에서의 핵산 분자는 mRNA이고, mRNA는 증폭 단계 전에 cDNA로 역전사되는, 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서, 결정하는 단계, 검출하는 단계 또는 유전자형분석 검정은
생물학적 샘플에서의 핵산 분자를 검출 가능한 라벨을 포함하는 변경-특이적 프로브와 접촉시키는 단계이되, 변경-특이적 프로브는 엄격한 조건 하에 예측된 기능 상실 변이체 위치에 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 접촉시키는 단계; 및
검출 가능한 라벨을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, PIEZO1 예측된 기능 상실 변이체 핵산 분자는 16:88715629:G:A, 16:88715728:G:T, 16:88715767:G:A, 16:88715802:C:A, 16:88715822:D:4, 16:88715987:I:1, 16:88716359:A:G, 16:88716570:C:T, 16:88716874:G:A, 16:88717213:T:A, 16:88719588:G:A, 16:88719722:C:G, 16:88719870:G:T, 16:88720068:D:2, 16:88720229:C:A, 16:88720248:D:4, 16:88720394:C:T, 16:88720644:D:1, 16:88720698:D:1, 16:88720698:I:1, 16:88721165:C:A, 16:88721268:D:1, 16:88721307:G:A, 16:88721586:G:C, 16:88721652:G:C, 16:88722217:C:T, 16:88722605:I:1, 16:88723005:I:7, 16:88723253:G:A, 16:88723311:C:T, 16:88725081:C:A, 16:88726282:G:A, 16:88726546:C:T, 16:88726619:G:A, 16:88726924:G:A, 16:88727038:C:T, 16:88727072:D:1, 16:88727163:G:A, 16:88731768:D:1, 16:88732334:C:G, 16:88732411:D:1, 16:88732720:D:1, 16:88733326:G:C, 16:88733337:D:4, 16:88733587:C:A, 16:88733965:D:1, 16:88734017:C:A, 16:88734042:I:1, 16:88734679:C:T, 16:88734909:I:1, 16:88736167:D:2, 16:88736324:G:A, 16:88736391:G:T, 16:88736409:C:T, 16:88736671:G:A, 16:88737557:A:C, 16:88737727:C:G, 16:88737815:C:T, 16:88738283:G:C, 16:88738637:G:A, 16:88738735:D:1, 16:88741477:C:T, 16:88742306:D:1, 16:88749399:G:A, or 16:88784929:C:T, 또는 이들로부터 생산된 mRNA 분자, 또는 mRNA 분자로부터 생산된 cDNA 분자인, 방법.