DE68916385T2

DE68916385T2 - Stabilisierte Formulierungen mit hydrohoben Proteinen.

Info

Publication number: DE68916385T2
Application number: DE68916385T
Authority: DE
Inventors: Thomas C Boone; William C Kenney
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1988-12-16
Filing date: 1989-12-18
Publication date: 1994-10-13
Anticipated expiration: 2009-12-19
Also published as: JP2888969B2; CA2005143A1; AU621695B2; EP0373679B1; ES2055001T3; JPH03502808A; EP0373679A3; AU4668989A; WO1990006762A1; US5104651A; EP0373679A2; DE68916385D1; ATE107513T1; CA2005143C; HK1006812A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Formulierungen, die ein Protein enthalten, und Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Formulierungen. Genauer gesagt betrifft diese Erfindung solche pharmazeutischen Formulierungen mit erhöhter Stabilität. Die Formulierungen sind auch sehr stabil während der Verarbeitung. Formulierungen werden bereitgestellt für sofortige, sichere, wirksame therapeutische Verabreichung an Menschen.

Hintergrund der Erfindung

Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor

Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor (G-CSF) umfaßt in seiner natürlichen Form zwei Formen: ein Protein mit 174 Aminosäuren und eine Form mit drei zusätzlichen Aminosäuren. Beide Formen haben fünf Cystein-Reste; vier, die die zwei Disulfidbindungen bilden, und einen freien. In seiner natürlichen Form ist G-CSF ein Glykoprotein. G-CSF unterstützt das Wachstum von überwiegend neutrophilen Kolonien in einem Koloniebildungs(CFU-GM)-Test und unterstützt in der Gegenwart akzessorischer Zellen das Wachstum von frühen Erythroiden (BFU-E) und pluripotenten Progenitoren (CFU-GEMM) (Granulozyten, Erythrozyten, Monozyten und Makrophagen). G-CSF ist auch in der Lage, die Differenzierung einiger myeloischer Leukämiezellinien (z.B. HL-60, WEHI-3B-D&spplus;), frischer myeloischer Leukämiezellen zu fördern, und es ist berichtet worden, daß er die chemotaktische Peptidbindung auf peripheren Blut-Neutrophilen erhöht. Zusätzlich kann G-CSF die Fähigkeit von Neutrophilen signifikant erhöhen, Tumorzielzellen in vitro durch Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxitität (ADCC) abzutöten. In-vivo-Experimente mit rekombinantem menschlichen G-CSF in Hamstern zeigen eine spezifische Wirkung auf der Neutrophilen-Familie mit Anstiegen um das drei- bis sechsfache in peripheren Blut-Neutrophilen.
Wegen seiner hydrophoben Eigenschaften ist G-CSF schwierig zu formulieren. Beispiele für Versuche, G-CSF zu formulieren, sind in der UK-Patentanmeldung GB 21 93 631 dargestellt. Detergenzien, wie etwa Tween -80, sind verwendet worden, um G-CSF in einer monomeren Form zu halten und Teilchenbildung zu minimieren. G-CSF enthält fünf Cysteinyl-Reste, von denen vier in Innerketten-Disulfidbindungen einbezogen sind. Der freie Cysteinyl-Rest ist im allgemeinen aufgrund der Faltung des Moleküls einer Modifikation unzugänglich. Bei erhöhten Temperaturen "atmet" das Molekül schneller und gelegentlich treten die Cysteinyl-Reste miteinander in Wechselwirkung, was zu Dimer- und Multimerbildung führt. Dieses Phänomen wird verstärkt durch die Gegenwart eines nicht-ionischen Tensids, z.B. Tween -80 (Polyoxyethylensorbitmonooleat).
Damit G-CSF im Gesundheitsbereich Tätigen und Patienten zur Verfügung gestellt werden kann, muß es als eine pharmazeutische Zusammensetzung zubereitet werden. Solche Zusammensetzungen müssen Aktivität über geeignete Zeiträume halten, müssen aus sich selbst heraus für leichte und schnelle Verabreichung an Menschen annehmbar sein und müssen leicht herstellbar sein. In vielen Fällen werden pharmazeutische Formulierungen in eingefrorener oder in lyophilisierter Form bereitgestellt. In diesen Fällen müssen die Zusammensetzungen vor Gebrauch aufgetaut oder rekonstituiert werden. Die eingefrorenen oder lyophilisierten Formen werden oft verwendet, um die biochemische Integrität und die Bioaktivität des in den Zusammensetzungen enthaltenen medizinischen Wirkstoffes unter einer breiten Vielfalt von Lagerbedingungen zu erhalten. Solche lyophilisierten Zubereitungen werden vor Gebrauch durch die Zugabe geeigneter pharmazeutisch annehmbarer Verdünnungsmittel rekonstituiert, wie etwa sterilem Wasser für Injektion oder steriler physiologischer Kochsalzlösung.
Alternativ kann die Zusammensetzung in zum sofortigen Gebrauch geeigneter flüssigen Form bereitgestellt werden. Wünschenswert ist eine flüssige Formulierung, die ihre Aktivität bei Langzeitlagerung beibehält.
Frühere Formulierungen bestimmter hydrophober Proteine verlieren Aktivität aufgrund der Bildung von Dimern und Aggregaten höherer Ordnung (Makrobereich) während der Langzeitlagerung. Andere chemische Veränderungen, wie etwa Desamidierung und Oxidation, können auch bei Lagerung auftreten.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, stabile, aggregatfreie Formulierungen herzustellen, die G-CSF enthalten.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, hydrophobe Proteinformulierungen mit höheren G-CSF-Konzentrationen bereitzustellen.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Formulierungen bereitzustellen, die G-CSF enthalten, wobei keine Komponente aus Tieren gewonnen ist, z.B. natürliches Albumin, wodurch mögliche Kontamination der Formulierung mit Verunreinigungen vermieden wird.
Andere Aufgaben, Merkmale und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden bei Betrachtung der folgenden Beschreibung und der beigefügten Ansprüche deutlich werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Aufgaben dieser Erfindung werden gelöst durch eine pharmazeutisch annehmbare Formulierung, die eine pharmazeutisch wirksame Menge eines G-CSF und Säure umfaßt, wobei besagte Formulierung einen pH von 2,75 bis 4,0 und vorteilhafterweise eine niedrige Leitfähigkeit, d.h. weniger als etwa 1000 umhos/cm, besitzt. Der pH der Formulierung beträgt 2,75-4,0 und in einer bevorzugten Ausführungsform ist kein Puffer vorhanden. Die Formulierung hat ein Reinheitsniveau, das pharmazeutisch annehmbar ist. Die Formulierung kann Verarbeitung und Lagerung mit im wesentlichen keinerlei Bildung von Dimern oder Aggregaten höherer Ordnung durchlaufen, Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zum Stabilisieren einer Formulierung, welches den Schritt des Kombinierens des G-CSF mit Säure umfaßt, vorteilhafterweise ohne die Zugabe von irgendeinem Salz, um eine pharmazeutisch annehmbare Formulierung mit einem sauren pH und vorteilhafterweise einer Ionenstärke von weniger als 1000 umhos/cm herzustellen. Fakultativ wird ein Tonizitätsmodifikator zugegeben.

Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt G-CSF, hergestellt bei verschiedenen pH-Werten und laufen gelassen auf einem 15%igen Gel nach Reduktion von Thiolgruppen.
Figur 2 zeigt G-CSF, hergestellt bei verschiedenen pH-Werten und laufen gelassen auf einem 15%igen nicht-reduzierenden Gel.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß bei sauren pH-Werten eine spezifische pharmazeutisch annehmbare Formulierung von G-CSF die Aktivität des Proteins erhält und unerwünschte Reaktionen hemmt, die das Protein während der Verarbeitung, Rekonstitution und Lagerung durchläuft. Wie hierin verwendet, schließt der Begriff "Verarbeitung" Filtration und Abfüllung in Ampullen ein. Die Erfindung betrifft somit solche Formulierungen und alle damit verbundenen Formulierungen und Verfahren zur wirksamen Stabilisierung solcher Proteine.
Es ist beabsichtigt, daß der Begriff G-CSF, wie in dieser Anmeldung verwendet, Substitution, Deletion und Insertion von Aminosäurevarianten oder post-translationale Modifikationen abdeckt. Verschiedene Formen von G-CSF und Herstellungsverfahren sind in WO 8701132 offenbart.
Die Formulierung einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt:
a) eine pharmazeutisch annehmbare Menge eines G-CSF, das bei saurem pH stabil ist, und
b) Säure,
wobei besagte Formulierung einen pH von 2,75 bis 4,0, vorteilhafterweise keinen Puffer und vorteilhafterweise eine Leitfähigkeit von weniger als 1000 umhos/cm aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umf aßt die G-CSF- Formulierung der vorliegenden Erfindung:
a) G-CSF in bis zu 2 mg/ml; und
b) Salzsäure; und
c) Mannit als einem Tonizitätsmodifikator,
wobei der pH 3,2-3,3 beträgt und die Leitfähigkeit der Formulierung niedriger ist als 500 umhos/cm.
In der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung sind hohe Konzentrationen von G-CSF (z.B. 1-5 mg/ml) erreichbar. Die vorliegende Formulierung beseitigt die Notwendigkeit von Tween -80. Eine niedrige Leitfähigkeit ist sehr vorteilhaft bei der vorliegenden Erfindung. Der pH der vorliegenden Erfindung ist vorteilhafterweise niedrig.
Im allgemeinen können die Formulierungen der vorliegenden Erfindung andere Komponenten in Mengen enthalten, die vorteilhafterweise die Herstellung stabiler Formen nicht beeinträchtigen, und in Mengen, die geeignet sind zur wirksamen, sicheren pharmazeutischen Verabreichung.
pH-Bereiche für die Herstellung der Formulierungen hiervon liegen von 2,75 bis 4,0, vorteilhafterweise 3,0 bis 3,7, am vorteilhaftesten 3,2 bis 3,3. Der Formulierungs-pH sollte niedriger als 4 sein, um Aggregatbildung zu verringern. pH- Werte liegen über 2,75, da Werte unter 2,75 zu beträchtlicher Peptidbindungsspaltung führen. Falls erforderlich, wird der pH mit Säure, wie etwa verdünnten Salz-, Salpeter-, Phosphor-, oder Schwefelsäurelösungen, eingestellt. In einer Ausführungsform ist der Gesamtsäuregehalt niedrig, d.h. niedriger als etwa 5 mM, um die Leitfähigkeit der Formulierung niedrig zu halten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist kein anderes Salz (aus einer Säure durch Ersatz von Wasserstoff durch ein Metall gewonnene Verbindung) in der Formulierung vorhanden als dasjenige, das ein in Spurenrückständen vorliegendes Nebenprodukt des Reinigungsverfahrens ist (die Ausführungsform wird hierin als kein Salz aufweisend bezeichnet).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist kein anderer Puffer vorhanden als das interessierende Protein selbst und In Spurenrückständen vorliegendes Nebenprodukt des Reinigungsverfahrens (diese Ausführungsform wird hierin als keinen Puffer aufweisend bezeichnet). Der bevorzugte Puffer, wenn ein Puffer verwendet wird, ist ein Carbonsäurepuffer. Alternativ wird Zitronen-, Milch- oder Weinsäurepuffer bei etwa 1 mM verwendet. Eine Pufferkonzentration, die höher als oder gleich 0 und niedriger als 2 mM ist, ist bevorzugt, am vorteilhaftesten 1 mM. Die Puf ferkonzentration wird niedrig gehalten, um die Leitfähigkeit der Formulierung niedrig zu halten. In diesem Pufferkonzentrationsbereich tritt minimale Aggregation auf.
Die Leitfähigkeit der Formulierungen der vorliegenden Erfindung sollte niedriger sein als 1000 umhos/cm, obgleich bei pH-Werten zwischen etwa 2,75 und 3 die Formulierungsleitfähigkeit fakultativ höher ist. Vorteilhafterweise ist die Leitfähigkeit niedriger als 700 umhos/cm und am vorteilhaftesten niedriger als 500 umhos/cm. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Leitfähigkeit niedriger als 200 umhos/cm. Die Leitfähigkeit wird mit Verfahren, wie etwa Diafiltration, eingestellt.
Vorteilhafterweise sind Formulierungen der vorliegenden Erfindung isotonisch mit dem Blut des Empfängers. Eine Formulierung, die etwa 4-6% (w/v), vorteilhafterweise 5% (w/v) Mannit als einen nicht-ionischen Tonizitätsmodifikator enthält, führt zu einer für intravenöse Injektion geeigneten isotonischen Lösung. Der Tonizitätsmodifikator wirkt auch so, daß er die Formulierung stabilisiert. Als eine Alternative zu Nannit werden andere Zucker oder Zuckeralkohole verwendet, wie etwa Saccharose, Maltose, Fructose, Lactose und dergleichen.
Die Formulierung der vorliegenden Erfindung kann fakultativ einen von mehreren Typen von nicht-ionischen Tensiden einschließen, wie etwa Tween -80. In einer bevorzugten Ausführungsform ist kein Tensid in der Formulierung vorhanden.
Ebenfalls umfaßt durch die Erfindung sind Formulierungen, die pharmazeutisch wirksame Mengen von G-CSF zusammen mit geeigneten Verdünnungsmitteln, Adjuvantien und/oder Trägermitteln umfassen. Andere pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe, die den Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt sind, können ebenfalls einen Teil der vorliegenden Zusammensetzungen bilden. Diese schließen z.B. verschiedene Füllstoffe, zusätzliche Pufferungssubstanzen, Chelatbildner, Antioxidationsmittel, Konservierungsstoffe, Hilfslösungsmittel und dergleichen ein; spezifische Beispiele für diese könnten Trimethylaminsalze ("Tris-Puffer") und EDTA einschließen. In einer Ausführungsform sind mehr als ein Protein-Typ in der Formulierung eingeschlossen, z.B. IL-3 und G-CSF. In einer anderen Ausführungsform sind keine anderen Proteine als der G-CSF Teil der Formulierung.
Eine "pharmazeutisch wirksame Menge" bezeichnet diejenige Menge, die therapeutische Wirkung in verschiedenen Applikationsregimes bereitstellt. Solche Mengen werden von den Fachleuten auf diesem Gebiet ohne weiteres bestimmt. Die Menge an aktivem Inhaltsstoff wird von der Schwere des zu behandelnden Zustandes, dem Applikationsweg, etc. abhängen. Die Zusammensetzungen hiervon können so hergestellt werden, daß sie Mengen von G-CSF von wenigstens etwa 0,1 mg/ml, nach oben bis etwa 5 mg/ml, vorzugsweise von etwa 0,5 mg/ml bis etwa 2 mg/ml enthalten. Zur Verwendung dieser Zusammensetzungen bei der Verabreichung an Menschen, die an z.B. chronischer Neutropenie leiden, können diese Zusammensetzungen von etwa 0, 5 mg/ml bis etwa 4 mg/ml enthalten, entsprechend der gegenwärtig beabsichtigten Dosierungsrate für eine solche Behandlung.
Die Formulierungen werden im allgemeinen durch Kombinieren der Bestandteile unter Verwendung allgemein zugänglicher pharmazeutischer Kombinationstechniken, die per se bekannt sind, hergestellt. Ein besonderes Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung hiervon umfaßt die Verwendung von G-CSF, das nach irgendeinem standardmäßigen Proteinreinigungsschema gereinigt worden ist.

EXPERIMENTELLER TEIL

A. Formulierungsherstellung

Der pH der G-CSF-Lösung bei etwa 5 mg/ml wird mit 0,5 N Salzsäure auf 3, 25 ± 0,1 eingestellt und diese Lösung wird gegen Wasser für Injektion diafiltriert, das mit Salzsäure (etwa 0,56 mM HCl) auf pH 3,25 eingestellt worden ist. Diafiltration wird fortgesetzt, bis die Leitfähigkeit des Permeats niedriger ist als 760 umhos/cm. Diese Lösung wird mit 20% Mannit und Wasser für Injektion kombiniert, um eine Endkonzentration von 1 mg G-CSF/ml und 5% (w/v) Mannit zu erhalten. Falls erforderlich, wird der pH mit Salzsäure- oder Natriumhydroxidlösungen auf 3,25 eingestellt. Die Lösung wird dann durch einen 0,2 um-Filter hindurchgegeben.

B. Analytische Verfahren

Die verwendeten analytischen Verfahren sind in den folgenden Artikeln beschrieben:
SDS-Page: Lammli, U.K. Nature 227, 680-685(1970)
HP-SEC: Watson, E. & Kennedy, W. J. Chromatog. 436, 289-298 (1988)

Ergebnisse

Figur 1 zeigt ein 15%iges SDS-Polyacrylamidgel nach Reduktion von Protein-Thiolgruppen. Die Formulierungen der Proben A-H wurden 2 Wochen lang bei 52ºC gelagert. Das G-CSF wurde bei 1 mg/ml mit 5% (w/v) Mannit formuliert.
Proben pH
A pH 4,2
B pH 3,5
C pH 3,23
D pH 3,0
E pH 2,75
F pH 2, 5
G pH 2,0
H pH 3,0 + 10mM NaCl
I pH 3,23, gelagert bei 4ºC
Figur 2 zeigt ein 15%iges nicht-reduzierendes SDS- Polyacrylamidgel. Proben wurden hergestellt, wie im Fall des reduzierenden Gels (d.h. 2 Wochen bei 52ºC).
Bemerkung: (1) die Menge an Agregat nimmt mit abnehmendem pH ab:
A pH 4,2
B = pH 3,5
C = pH 3,23;
(2) die zunehmenden Banden mit niedrigerem Molekulargewicht aufgrund der Hydrolyse in E, F, G:
E = pH 2,75
F = pH 2, 5
G = pH 2,0;
(3) die höhere Ionenstärke liefert mehr Aggregat:
D = 0 NaCl, pH 3,0
H = 10 mM NaCl, pH 3,0. Tabelle 1 Prozent G-CSF, das als Monomer nach Inkubation für 2 Wochen bei 42ºC oder 52ºC übrig bleibt % Monomer¹ Probe ¹Ausgangsprobe > 99% Monomer, wenn gelagert bei 4ºC.
Die Ergebnisse in Tabelle 1, wie bestimmt mit HP-SEC (Watson, Kenny J. Chromatog. 436, 289-298 (1988)) zeigen, daß die geringste Menge an Aggregatbildung in den Proben C, D, E & F vorliegt, was einem pH-Bereich von 3,2-2,50 entspricht. Außerdem erhöht das Vorhandensein von Salz die Menge an Aggregat (vergleiche D mit H). Mit Ausnahme von A und G trat geringe Veränderung bei Inkubation bei 42ºC auf.
Bei Bewertung der Ergebnisse der Figuren 1 und 2 und Tabelle 1 zusammengenommen waren die vorteilhaftesten Formulierungs-pH- Werte diejenigen der Proben C, D und E, d.h. etwa pH 2,75- 3,23.

Claims

1. Eine stabilisierte pharmazeutisch annehmbare Formulierung, umfassend:

eine pharmazeutisch annehmbare Menge eines G-CSF, das bei saurern pH stabil ist; und

Säure

wobei besagte Formulierung einen pH von 2,75 bis 4,0 besitzt.

2. Eine Formulierung nach Anspruch 1, wobei besagte Formulierung einen pH von 3,0-3,7 und eine Leitfähigkeit von weniger als 1.000 umhos/cm besitzt.

3. Eine Formulierung nach Anspruch 2 mit einem pH von 3,2- 3,3.

4. Eine Formulierung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Säure Salzsäure ist,

5. Eine Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die außerdem einen pharmazeutisch annehmbaren Tonizitätsmodifikator umfaßt.

6. Eine Formulierung nach Anspruch 5, wobei der Tonizitätsmodifikator Mannit ist.

7. Eine Formulierung nach Anspruch 6, wobei das Mannit etwa 5% (w/v) der Formulierung ausmacht.

8. Eine Formulierung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die zusätzlich ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel, Adjuvans oder Trägermittel umfaßt.

9. Eine Formulierung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die zusätzlich ein nicht-ionisches Tensid umfaßt.

10. Eine Formulierung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die außerdem einen Puffer umfaßt.

11. Eine Formulierung nach Anspruch 1, wobei besagtes G-CSF in einer Konzentration von 0,5-2 mg/ml vorliegt und wobei besagte Formulierung einen pH von 3,2-3,3 und eine Leitfähigkeit von weniger als 200 umhos/cm besitzt.

12. Ein Verfahren zur Stabilisierung einer G-CSF-Formulierung, die bei saurem pH stabil ist, welches den Schritt des Kombinierens einer pharmazeutisch annehmbaren Menge von besagtem G-CSF mit Säure umfaßt; wobei besagte Formulierung einen pH von 3,0-3,7 besitzt eine Leitfähigkeit von weniger als 1.000 umhos/cm und pharmazeutisch annehmbar ist.

13. Ein Verfahren nach Anspruch 12, wobei besagter Kombinationsschritt auch die Zugabe eines pharmazeutisch annehmbaren Tonizitätsmodifikators einschließt.

14. Ein Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei besagter Kombinationsschritt die Zugabe von Salzsäure einschließt.

15. Ein Verfahren nach Anspruch 12, 13 oder 14, wobei besagte Formulierung einen pH von 3,2-3,3 besitzt.

16. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei besagter Kombinationsschritt nicht die Zugabe von Salz einschließt.

17. Ein Verfahren nach Anspruch 13, wobei besagter Toniziätsmodifikator Mannit ist.

18 Ein Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Mannit etwa 5% (w/v) der Formulierung ausmacht.

19. Eine Formulierung nach Anspruch 1, wobei besagte Eormulierung keinen Puffer besitzt.

20. Eine Formulierung nach Anspruch 19, die außerdem einen pharmazeutisch annehmbaren Tonizitätsmodifikator umfaßt.

21. Eine Formulierung nach Anspruch 19 oder 20, die kein Tensid besitzt.

22. Eine Formulierung nach den Ansprüchen 19, 20 oder 21 mit einer Leitfähigkeit von weniger als 1.000 umhos/cm.