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Die Erfindung betrifft ein selbsttragendes,
flächiges
Material aus vernetztem Fibrin und Verfahren zu dessen Herstellung.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des Materials und
von Fibrin-Klebern („fibrin
glues/sealants")
zur Behandlung innerer, traumatischer Läsionen (Verletzungen), insbesondere
zur Vorbeugung der Bildung postoperativer Adhäsionen (pathologischen Verwachsungen/Verklebungen).
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Eines der Hauptprobleme bei operativen
Eingriffen in der Bauchhöhle
ist die Vermeidung postoperativer Adhäsionen. Es ist wohlbekannt,
dass Adhäsionen
zu Schmerzen, Unbeweglichkeit, verzögerter Wundheilung und insbesondere
zu Darmverschluss, der sogar lebensbedrohlich sein kann, beitragen.
Auf dem Gebiet der gynäkologischen
Chirurgie können
postoperative Adhäsionen,
wenn weibliche Fortpflanzungsorgane betroffen sind, zu Unfruchtbarkeit
führen.
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Jeder chirurgischer Eingriff führt notwendigerweise
zu einer Wunde, z. B. bei einer Laparoskopie, bei der die Bauchdecke
für eine
Inspektion der Bauchhöhle
eröffnet
wird. Physiologisch gesehen beginnt der Prozess des Wundverschlusses,
sobald das Bluten nach der Bildung eines hämostatischen Blutpfropfes/Blutgerinnsels
an Stellen, an denen Blutgefäße verletzt
sind, aufhört.
Der Blutpfropf, der zunächst
hauptsächlich Thrombozyten
umfasst, wird durch ein Netzwerk aus Fibrin verfestigt, das aus
der Aktivierung einer Enzymkaskade, an der Thrombin, Faktor XIII
und Calcium beteiligt sind, resultiert. Weitere Schritte auf dem
Weg zum Verschluss der Wunde sind das Zusammenziehen des hämostatischen
Blutpfropfes, das Eindringen verschiedener Zelltypen, einschließlich Fibroblasten,
in das Wundgebiet und schließlich
die Lyse des Fibrinnetzwerks. Man nimmt an, dass Adhäsionen sich
bilden, wenn das Fibringerinnsel, das eine Verletzung bedeckt, in
Kontakt mit einer benachbarten Oberfläche kommt, und das neue, durch
die Fibroblasten gebildete Bindegewebe die beiden Oberflächen „zusammenklebt".
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Die Probleme, die mit Adhäsionen verbunden
sind, verlangen oftmals einen weiteren operativen Eingriff zum Entfernen/Lysieren
der Adhäsionen,
genannt Adhäsiolyse,
der wie die erste Operation grundsätzlich das Risiko birgt, dass
Adhäsionen
verursacht werden. Demzufolge ist die Vorbeugung der Bildung von
Adhäsionen
obligatorisch. Unter den verschiedenen Ansätzen zur Vorbeugung der Bildung
von Adhäsion,
umfasst einer die Verwendung von Materialien als physikalische oder
biomechanische Barriere zur Trennung oder Isolierung traumatisierter
Gewebe während
des Heilungsprozesses. Sowohl synthetische als auch natürliche Materialien
sind als Barriere gegen die Bildung von Adhäsionen verwendet worden. Dauerhafte,
inerte Implantate, wie chirurgische Membranen aus Gore-Tex, die
aus gedehntem Polytetrafluoroethylen (PTFE) bestehen, erfordern
im Allgemeinen einen zweiten operativen Eingriff zu ihrer Entfernung,
während
andere, wie chirurgische Membranen aus oxidierter regenerierter
Cellulose, bioabbaubar sind, aber vermutlich eine Entzündungsreaktion
hervorrufen, die schließlich
zur Bildung von Adhäsionen
führt (Harvey
AF and Doty E, Fertility and Sterility 60, 550–558, 1993). Andere Barriere-Materialien,
die zur Vorbeugung von Adhäsionen
vorgeschlagen wurden, schließen
bioelastische Matrizen, die von Elastin abgeleitet sind (Urry DW
et al., Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 292, 1993), und Mucopolysaccharidfilme
(Matsuda T et al., ASAIO Journal 38, M 154–157, 1992) ein. Eine vollständige Vorbeugung
der Bildung von Adhäsionen
unter Verwendung dieser beiden letztgenannten Materialien ist bisher
jedoch nicht berichtet worden.
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Andererseits sind (flüssige) Fibrin-Kleber
(„sealants/glues") zur Verwendung
in Hämostase,
Gewebsverschluss und Wundheilung im Stand der Technik wohlbekannt
und seit mehr als einem Jahrzehnt kommerziell erhältlich.
Fibrin-Kleber imitieren den letzten Schritt der Koagulationskaskade
und werden gewöhnlich
als Kits aus zwei Hauptkomponenten vertrieben. Die erste Komponente
ist eine Lösung,
die Fibrinogen und Faktor XIII umfasst, während die zweite Komponente
eine Thrombin-Calcium-Lösung
ist. Nach Vermischen der Komponenten wird das Fibrinogen durch Thrombin
proteolytisch gespalten und so zu Fibrinmonomeren umgesetzt. In
Gegenwart von Calcium wird Faktor XIII ebenfalls durch Thrombin
in seine aktive Form gespalten (FXIIIa). FXIIIa vernetzt die Fibrinmonomere
zu einem dreidimensionalen Netzwerk, das gemeinhin „Fibrin-Gel" genannt wird. Um
zu vermeiden, dass eine vorzeitige Koagulation das Aufbringen des
Fibrin-Klebers verhindert/beeinträchtigt,
werden die beiden Komponenten mittels spezieller Vorrichtungen entweder
unmittelbar vor dem Aufbringen auf die Empfängeroberfläche oder direkt in situ gemischt.
Demzufolge wird der Polymerisations-/Gelierungsschritt ausschließlich in
situ durchgeführt.
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Da das „Fibrin-Gel", das aus dem Aufbringen
des Fibrin-Klebers resultiert, ein optimales Substrat für das Einwandern
von Fibroblasten und deren anschließendes Bilden von Bindegewebssubstanzen
ist, wird allgemein angenommen, dass Fibrin-Kleber eher adhäsionsfördernde Eigenschaften als adhäsionshemmende Eigenschaften
besitzen.
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Es ist nun überraschenderweise gefunden
worden, dass ein selbsttragendes, flächiges Material aus vernetztem
Fibrin als biomechanische Barriere in der Behandlung von inneren,
traumatischen Läsionen,
insbesondere zur Vorbeugung der Bildung von Adhäsionen als postoperative Komplikation,
verwendet werden kann. Diesbezüglich
wird ein Durchschnittsfachmann erkennen, dass diese biomechanische
Barriere im Allgemeinen in allen Gebieten der Chirurgie von Nutzen
ist. Beispiele, die nicht als Beschränkungen gedacht sind, schließen Geburtshilfe
und Gynäkologie,
Abdominalchirurgie, orthopädische
Chirurgie, Augenchirurgie und Herz-Kreislauf-Chirurgie ein. Normalerweise
besitzt die Barriere die Form eines Films, der nach externer Herstellung
während
des chirurgischen Eingriffs über
eine oder zwischen zwei chirurgisch traumatisierte Oberflächen gelegt
wird, um diese zu isolieren bzw. die beiden Oberflächen von
einander zu trennen und eine unabhängige Heilung zu ermöglichen,
ohne dass es zur Bildung von Adhäsionen
kommt.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung
wird ein selbsttragendes, flächiges
Material aus vernetztem Fibrin, wie es in den Patentansprüchen definiert
ist, bereitgestellt. Weiterhin werden Verfahren zur Herstellung
des Materials, die in den Patentansprüchen definiert sind, bereitgestellt.
Des Weiteren wird die Verwendung des Materials zur Herstellung eines
Medikaments zur Behandlung innerer traumatischer Läsionen bereitgestellt und
in den Patentansprüchen
definiert. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird
eine kombinierte Verwendung eines ersten Fibrin-Klebers, der als
ein hämostatisches
Agens wirkt, und eines zweiten Fibrin-Klebers, der als eine biomechanische
Barriere wirkt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung innerer
traumatischer Läsionen
bereitgestellt und in den Patentansprüchen definiert. Weitere Ausführungsformen
der Erfindung werden ebenfalls durch die Patentansprüche definiert.
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Der Einfachheit halber wird im Folgenden
der Ausdruck „Fibrin-Film" zur Bezeichnung
eines selbsttragenden, flächigen
Materials aus vernetztem Fibrin verwendet. Für die Zwecke der Erfindung
ist der Fibrin-Film aus den gleichen Bestandteilen zusammengesetzt
wie die üblichen
kommerziell erhältlichen
Fibrin-Kleber, d. h.
hauptsächlich
Fibrinogen, Thrombin, Faktor XIII und Calcium.
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Besonders vorteilhaft ist, dass der
Fibrin-Film nach seiner Platzierung nicht nennenswert rutscht oder sich
verschiebt, so dass keine Befestigung, wie Nähte, im Verlauf der Operation
erforderlich ist. Infolge seiner inhärenten mechanischen Eigenschaften
ermöglicht
der Fibrin-Film einen festsitzenden, dichten Schutz des traumatisierten
Gewebes. Darüber
hinaus ähnelt
der Fibrin-Film bezüglich
seiner Zusammensetzung und seiner allgemeinen Struktur den natürlichen
Produkten, die nach Verletzung im menschlichen oder tierischen Körper gebildet
werden, und erfüllt
demzufolge Haupterfordernisse einer idealen chirurgischen Membran,
wie überlegene
Bioverträglichkeit,
Bioabbaubarkeit und Bioresorbierbarkeit. Folglich, und im deutlichen
Gegensatz zu Barrieren aus inerten Materialien, wie gedehntem PTFE,
verschwindet eine biomechanische Barriere aus Fibrin „von selbst", nachdem sie ihre
Funktion ausgeübt
hat, so dass kein zweiter chirurgischer Eingriff zur Entfernung
erforderlich ist. In dem im Folgenden beschriebenen Tiermodell (Ratte)
geschieht dies gewöhnlich
innerhalb von 10 Tagen nach der Anwendung des Fibrin-Films. Darüber hinaus
wird man zu schätzen
wissen, dass der Fibrin-Film keine signifikanten Nebenwirkungen
im Körper
hervorruft.
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In Übereinstimmung mit bevorzugten
Ausführungsformen
der Erfindung wird ein selbsttragendes, flächiges Material aus vernetztem
Fibrin bereitgestellt, wobei das Material eine regelmäßige Porengröße besitzt. Wie
durch Rasterelektronenmikroskopie (REM) (Scanning Electron Microscopy,
SEM) gezeigt wurde, hat der Fibrin-Film der Erfindung innerhalb
seines gesamten Volumens eine dichte, regelmäßige und homogene Struktur.
Die Porengröße des Fibrin-Films
ist „regelmäßig" in dem Sinne, dass
sie nur um einen Bereich von wenigen Mikrometern variiert. Es ist
gefunden worden, dass ein solcher Fibrin-Film besonders wirksam
bei der Vorbeugung der Bildung von Adhäsionen ist.
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Andererseits haben Experimente der
Erfinder ergeben, dass Fibrin-Filme mit einer mehr offenen oder sogar
unregelmäßigen oder
nicht-homogenen Struktur, die sogar größere Löcher einschließt, in dieser
Hinsicht nicht wirksam sind. Ohne an eine Theorie gebunden sein,
könnte
dies wie folgt erklärt
werden. Derartige Schaum-, Schwamm- oder Vlies-artigen Strukturen
können
das Blut, das während
des chirurgischen Eingriffs freigesetzt wird, zurückhalten,
und können
weiterhin das Einwandern von Fibroblasten erlauben und so die endogene
Fibrinbildung fördern,
die von der Bildung von Adhäsionen
begleitet ist. Demgemäß können derartige Fibrin-Filme,
insbesondere in ihrem trockenen Zustand, nützlich bei der Hämostase
sein, um das Exsudat einer Verletzung aufzusaugen. Für die Anti-Adhäsions-Therapie
sind im Allgemeinen jedoch nicht-hämostatische Fibrin-Filme mit nicht-adhäsiven Eigenschaften
gewünscht.
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Der Fibrin-Film gemäß der Erfindung
ist unlöslich
in Wasser und kann in seiner feuchten Form bis zu 92 Gew.-% an Wasser
enthalten. Unabhängig
davon, ob er sich in hydrierter (feuchter) oder rehydrierter Form befindet
(z. B. nach einem vorherigen Trocknungsschritt zur Lagerung), besitzt
dieser Fibrin-Film eine hohe mechanische Festigkeit, ist von sich
heraus selbsttragend und trotzdem weich. Somit ist der Fibrin-Film
der Erfindung einfach zu handhaben und ermöglicht Schneiden, Rollen und,
sofern erforderlich, auch Nähen.
Die selbsttragende Eigenschaft des Fibrin-Films wird durch Trocknen
verstärkt.
Die trockene Form des Fibrin-Films kann als Teil eines Kits vertrieben
werden und ist dann vor Verwendung in der Chirurgie mit geeigneten
Lösungen
von z. B. Wasser, Calciumchlorid, aber auch gepufferten Lösungen,
die Arzneimittel enthalten, zu rehydrieren.
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Für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist in bestimmten Ausführungsformen
die Porengröße des Barrierematerials
vorzugsweise kleiner als 5 μm
und besonders bevorzugt kleiner als 1 μm, um Fibroblasten am Ein- oder
Durchdringen zu hindern. Wie oben angemerkt, wandern im Rahmen des
normalen Wundverschlusses Fibroblasten in das Netzwerk des Fibringerinnsels
und in das entstehende Granulationsgewebe, wo sie u. a. Collagen
bilden und auf diese Weise zu der letztendlichen Bildung eines Narbengewebes
beitragen. Um zu vermeiden, dass die Substanzen, die von den Fibroblasten
gebildet werden, dazu beitragen, eine verletzte Oberfläche und
eine benachbarte Oberfläche
zu verkleben oder zwei verletzte Oberflächen miteinander verkleben,
schlagen die Erfinder vor, die verletzte(n) Oberfläche(n) zu
isolieren oder voneinander zu trennen, indem ein Barrierematerial
aus Fibrin verwendet wird, das eine Porengröße unter 5 μm, vorzugsweise unter 4 μm, vorzugsweise
unter 3 μm,
vorzugsweise unter 2 μm, und
besonders bevorzugt unter 1 μm
besitzt, wobei die Porengröße vorzugsweise „regelmäßig" im Sinne der vorliegenden
Erfindung ist. Die im Folgenden beschriebenen Experimente der Erfinder
zeigen in der Tat, dass durch Verwendung solcher Barrieren die Bildung von
Adhäsionen
vollständig
verhindert werden kann.
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Gewöhnlich besteht der Fibrin-Film
gemäß der Erfindung
aus einer einzelnen Schicht, die zum Zwecke der Vorbeugung der Bildung
von Adhäsionen
eine geschlossene Struktur besitzt, aber für andere Anwendungen auch eine
offene Struktur besitzen kann. Zusätzlich schlagen die Erfinder
einen Fibrin-Film vor, der zwei oder mehr Schichten aufweist. Zumindest
eine Schicht, entweder als eine äußere Schicht
oder eine Zwischenschicht, sollte eine geschlossene Struktur haben,
die eine Steifigkeit/dynamische Elastizität und/oder eine Barrierefunktion
des mehrschichtigen Fibrin-Films sicherstellt, während andere Schichten mit
einer offenen Struktur z. B. als Zufuhrsystem für Arzneimittel dienen.
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In bevorzugten Ausführungsformen
beträgt
die Dicke des Fibrin-Barrierematerials mindestens 20 μm, wenn sich
die Barriere im feuchten Zustand befindet. Vorzugsweise ist die
Dicke etwa 20–2000 μm, und besonders
bevorzugt auch bis zu 5000 μm,
obwohl davon ausgegangen wird, dass sogar Material mit einer Dicke von
weniger als 20 μm
für die
Zwecke der Erfindung geeignet sein kann.
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In noch weiteren Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung umfasst der Fibrin-Film weiterhin unter
5 Gew.-% Fibrinogen, vorzugsweise unter 4 Gew.-% Fibrinogen, vorzugsweise
unter 3 Gew.-% Fibrinogen, vorzugsweise unter 2 Gew.-% Fibrinogen
und besonders bevorzugt unter 1 Gew.-% Fibrinogen, jeweils bezogen
auf das gesamte Trockengewicht an Fibrinogen plus Fibrin. Der Fibrin-Film der Erfindung
wird üblicherweise
durch katalytische Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin hergestellt.
Allgemein gesprochen sind die nicht-adhäsiven Eigenschaften des Fibrin-Films
umso besser, je geringer die Menge an verbliebe nen Fibrinogen ist,
da Fibrinogen in vivo die Fibrinbildung fördern kann und auf diese Weise
auch die Adhäsionsbildung. Idealerweise
sollte die Umsetzung von Fibrinogen zu Fibrin vollständig sein,
d. h. der Fibrin-Film sollte kein verbliebenes Fibrinogen enthalten.
Zum Zweck der Bestimmung des Fibrin- und des Fibrinogengehalts des
Fibrin-Films können
z. B. Verfahren der SDS-Page (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)
verwendet werden.
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In bestimmten Ausführungsformen
ist es bevorzugt, dass der Fibrin-Film weiterhin ein oder mehrere Desinfektionsmittel,
vorzugsweise Methylen-Blau, und/oder ein oder mehrere Arzneimittel,
ausgewählt
aus Antibiotika, fibrinolytischen Agenzien und Biologische-Reaktion-Modifikatoren,
insbesondere Cytokinen und Wundreparaturpromotoren, umfasst, wobei
eine Menge bis zu 1 Gew.-%, bezogen auf das gesamte Trockengewicht
an Fibrin plus Fibrinogen, bevorzugt ist. Beispiele fibrinolytischer
Agenzien schließen
t-Pa, μ-Pa, Streptokinase,
Staphylokinase, Plasminogen und dergleichen ein. Diese Verbindungen
fördern
die Fibrinolyse und können
somit verwendet werden, um die Rate des Abbaus des Fibrin-Films
in vivo zu kontrollieren. Der Begriff „Biologische-Reaktion-Modifikatoren" („biological
response modifiers")
soll sich auf Substanzen beziehen, die an der Modifizierung einer
biologischen Reaktion, z. B. der Wundreparatur, in einer Weise beteiligt sind,
die zu einer Verstärkung
des gewünschten
therapeutischen Effekts führt.
Beispiele schließen
Cytokine, Wachstumsfaktoren und dergleichen ein. Infolge seiner
intrinsischen mechanischen Eigenschaften benötigt der Fibrin-Film der Erfindung
nicht irgendein zusätzliches
Vernetzungsmittel, das irgendwelche toxischen Wirkungen auf den
menschlichen oder tierischen Körper
ausüben
könnte.
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Die vorliegende Verbindung betrifft
weiterhin Verfahren zur Herstellung eines selbsttragenden, flächigen Materials
aus vernetztem Fibrin, die durch die Ansprüche bestimmt werden.
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Somit wird in bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines selbsttragenden,
flächigen
Materials aus vernetztem Fibrin bereitgestellt, wobei das Verfahren
die folgenden Schritte umfasst:
- (a) gleichzeitiges
Vermischen eines Stroms einer ersten, Fibrinogen-haltigen Lösung mit einem Strom einer zweiten,
Thrombin-haltigen Lösung;
- (b) Aufbringen des erhaltenen Gemisches auf einen festen Träger; und
- (c) Inkubieren des Gemisches unter Bildung des gewünschten
Materials.
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Um eine möglichst homogene Mischung in
Schritt (a) (und somit ein homogenes Endprodukt) zu erhalten, wird
ein Strom einer ersten, Fibrinogen-haltigen Lösung, gleichzeitig mit einem
Strom einer zweiten, Thrombin-haltigen Lösung vermischt. Die erste und/oder
die zweite Lösung
können
weiterhin Desinfektionsmittel und/oder Arzneimittel, ausgewählt aus
Antibiotika, fibrinolytischen Agenzien und Biologische-Reaktion-Modifikatoren,
insbesondere Cytokinen und Wundreparaturpromotoren, umfassen. Vorzugsweise
werden gleiche Volumina einer ersten und einer zweiten Lösung miteinander
vermischt. Im Falle, dass verschiedene Volumina einer ersten und
einer zweiten Lösung
gleichzeitig vermischt werden sollen, wird es im Stand der Technik
bekannt sein, welche Maßnahmen
ergriffen werden müssen,
um ein homogenes Gemisch sicherzustellen.
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Der Durchschnittsfachmann wird leicht
erkennen, dass das Vermischen in Schritt (a) mittels kommerziell
erhältlicher
Zwei-Spritzen-Vorrichtungen durchgeführt werden kann. Ein geeignetes
Handelsprodukt ist z. B. Duploject® der Firma Immuno GmbH in Heidelberg,
Deutschland. So werden die zwei Lösungen separat in die beiden
Spritzen gefüllt,
die von einem Y-Stück
zusammengehalten werden. Die Lösungen
werden an dem Ende des Y-Stücks
vermischt, wenn die Inhalte der Spritzen herausgedrückt werden.
Als Alternative können auch
geeignete Sprühvorrichtungen
aus dem Stand der Technik verwendet werden. Das entstehende Gemisch wird über die
Oberfläche
eines festen Trägers,
zum Beispiel einer Petri-Schale und dergleichen, gespritzt, der dann
geneigt wird, um die gesamte Oberfläche so schnell wie möglich zu
bedecken, bevor die Bildung des dreidimensionalen Fibrinnetzwerkes
beginnt. Unter Verwendung dieser Herstellungsart können Fibrin-Filme
mit einer geringen Menge an Thrombin leicht erhalten werden. Bei
höheren
Konzentrationen von Thrombin ist eine schnellere Gerinnungszeit
und somit eine rasch sich erhöhende
Viskosität
als Hauptbeschränkung
des oben beschriebenen Mischverfahrens zu beobachten. Somit muss
bei höheren
Thrombinkonzentrationen darauf geachtet werden, dass das Gemisch,
das gemäß Schritt
(a) gebildet wird, von Beginn an gleichmäßig über die Oberfläche des
festen Trägers
verteilt wird, um so ein homogenes Endprodukt in Schritt (c) zu
erhalten.
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Vorzugsweise erfordert Schritt (c),
dass das auf den festen Träger
aufgebrachte Gemisch vollständig gerinnen
kann, d. h. eine möglichst
vollständige
Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin erhalten wird. Vorzugsweise
wird der Abschluss der Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin durch
Inkubation des festen Trägers
bei der physiologischen Temperatur, d. h. 37°C, für 1 bis 200 Minuten erreicht.
Es versteht sich, dass die Inkubation auch auf bis zu 24 Stunden
und mehr ausgedehnt werden kann. In dieser Hinsicht wird festgestellt,
dass die Erfindung auch solche Produkte umfassen soll, bei denen
die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin nicht zum Abschluss gekommen
ist.
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Die Komponenten der ersten und der
zweiten Lösung
können
aus Plasma durch konventionelle Präzipitation und Reinigungsschritte
hergestellt werden. Ist der zu behandelnde Patient ein Mensch, so
wird humanes Plasma bevorzugt. Die Quelle des Plasmas kann entweder
Sammelspenderblut („pooled
donor blood") oder
Einzelspenderblut („single
donor blood") sein,
das von Blutzentren zu erhalten ist. Es sollte darauf geachtet werden,
dass im Stand der Technik übliche
und bekannte Kontrollen zur Ermittlung viraler Kontamination durchgeführt werden.
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Während
des Herstellungsprozesses können
die Produkte auch mit Standardtechniken sterilisiert werden. Um
jedes Risiko der Kontamination zu vermeiden, könnten die Komponenten aus präoperativen
Eigenblutspenden hergestellt werden. Es liegt auf der Hand, dass
die Komponenten der ersten oder der zweiten Lösung oder deren funktionelle
Analoge auch mittels der Methoden der Molekulargenetik hergestellt
werden können.
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Praktischerweise können angesichts
der vorliegenden Offenbarung kommerziell erhältliche Kits von Zwei-Komponenten-Fibrin-Klebern
zur Herstellung des erfindungsgemäßen Fibrin-Films verwendet
werden. Die benötigten
Bestandteile sind üblicherweise
in den Kits als Trockenkonzentrate enthalten und sind gemäß den technischen
Daten der jeweiligen Kits zu rekonstituieren. Die gewünschte Thrombinkonzentration
wird durch Verdünnen
eines Aliquots der rekonstituierten Thrombinlösung mit steriler Calciumchloridlösung, vorzugsweise
20 mM Calciumchlorid, hergestellt.
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Die Erfinder schlagen vor, den Fibrin-Film
der Erfindung auch unter Verwendung einer einzigen Ampulle, die
alle benötigten
Komponenten enthält,
herzustellen, wobei die katalytischen Agenzien für die Umwandlung von Fibrinogen
zu Fibrin bzw. die Quervernetzung des löslichen Fibrins inaktiviert
sind und die Polymerisation erst durch Induktion mittels einer Veränderung
des pHs, der Ionenstärke,
des Lichts oder dergleichen gestartet wird, nachdem der Inhalt der
Ampulle auf den festen Träger
aufgebracht worden ist. Für
diesen Zweck könnten
beispielsweise photosensitive Inhibitoren von Thrombin und Thrombin-artigen
Molekülen
verwendet werden. Der Fibrin-Film der Erfindung kann ebenfalls hergestellt
werden gemäß Copley
und Luchini (Life Sciences 3, 1293–1305, 1964) und Sasaki et
al. (Science 152, 1069–1071,
1966}, indem man von löslichen
Fibrinogen-Fibrin-Monomerkomplexen
ausgeht, die in der Kälte
präzipitiert
wurden, bei hoher Temperatur wieder gelöst und dann mit FXIII und Calcium
vernetzt werden.
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Gemäß der Erfindung enthält die erste
Lösung
vorzugsweise Fibrinogen und Faktor XIII (10–40 IU/ml). Die Konzentration
an Fibrinogen wird durch die Gesamtproteinkonzentration (etwa 90–140 g/l)
und den Prozentsatz des davon umfassten gerinnbaren Proteins ausgedrückt. Die
Erfinder bevorzugen einen Prozentsatz an gerinnbarem Protein von
mindestens 80% und vorzugsweise von größer oder gleich 90%. Der Durchschnittsfachmann
wird natürlich
erkennen, dass eine Vielzahl anderer Bestandteile ebenfalls in der
ersten Lösung
enthalten sein kann, beispielsweise Albumin, Plasminogen und Tenside.
Die zweite Lösung
umfasst vorzugsweise 1–300
IU/ml Thrombin oder mehr als 300 IU/ml Thrombin (abhängig von
den gewünschten
biophysikalischen Parametern des zu erhaltenden Materials) und Calcium
in einer Konzentration bis zu 45 mM. Zur Vereinfachung wird die
Thrombinkonzentration, die normalerweise in IU/ml angegeben wird,
im Folgenden vielfach, insbesondere in den Tabellen, mit IU angegeben.
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Als Alternative, insbesondere zum
Zweck der Herstellung eines Fibrin-Films mit einer höheren Konzentration
an Thrombin, schlagen die Erfinder ein Verfahren vor, das die folgenden
Schritte umfasst:
- (a) Aufbringen einer ersten,
wässrigen,
Fibrinogen-haltigen Lösung
auf einen festen Träger;
- (b) Entfernen des Wassers bis zur Trockenheit unter Bildung
eines flächigen
Fibrinogen-Materials;
- (c) Aufbringen einer zweiten, Thrombin-haltigen Lösung auf
das flächige
Fibrinogen-Material; und
- (d) Inkubieren unter Bildung des gewünschten Materials.
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Während
die spezifischen Schritte dieses Verfahrens sich von denen des zuvor
beschriebenen Verfahrens zur Herstellung eines Fibrin-Films unterscheiden,
können
die gleiche erste und zweite Lösung
verwendet werden. In einer bevorzug ten Ausführungsform dieses Prozesses
werden gleiche Volumina einer ersten und einer zweiten Lösung in
den Schritten (a) und (c) verwendet.
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Um ein Endprodukt mit einer regelmäßigen Dicke
und einer homogenen Struktur zu erhalten, sollte die erste, wässrige,
Fibrinogen-haltige Lösung
gleichmäßig über den
gesamten festen Träger
verteilt werden. Schritt (b) erfordert, dass das Lösungsmittel
der ersten Lösung,
d. h. Wasser, entfernt wird bis zur Trockenheit, um ein flächiges Fibrinogen-Material
zu erhalten. Vorzugsweise wird das Entfernen von Wasser durch Lufttrocknung,
Gefriertrocknung oder Trocknung unter erhöhter Temperatur und/oder reduziertem
Druck durchgeführt.
Wie die REM zeigt, besitzt das erhaltene flächige Fibrinogen-Material Mikrohohlräume und
somit ein hohes Absorptionsvermögen
für Flüssigkeiten.
Nach einer Rehydratisierung mittels Zugabe einer zweiten, Thrombin-haltigen
Lösung,
die wahlweise Desinfektionsmittel und/oder Arzneimittel wie Antibiotika
oder fibrinolytische Agenzien, Biologische-Reaktion-Modifikatoren
und dergleichen enthält,
wird dieses Material zu einem selbsttragenden, flächigen Material
aus Fibrin umgesetzt.
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Gemäß Schritt (d) wird der feste
Träger
und folglich das Zwischenprodukt aus Schritt (c) inkubiert, um ein
selbsttragendes, flächiges
Material aus vernetztem Fibrin, d. h. das Endprodukt, zu bilden.
Vorzugsweise umfasst Schritt (d) das Inkubieren des festen Trägers bei
37°C für etwa 20
min. (bei Material von geringer Dicke) bis zu etwa 200 min. (bei
Material von hoher Dicke), um die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin
zum Abschluss zu bringen. Es versteht sich, dass die Inkubation
zum Bilden des Endproduktes auch auf 24 Stunden und mehr ausgedehnt
werden kann.
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Es wurde gefunden, dass mit diesem
Verfahren die Dicke des Fibrin-Films unabhängig von der Konzentration
der verwendeten Thrombinlösung
ist. Der erhaltene Fibrin-Film hat eine hohe mechanische Festigkeit,
kann geschnitten, gebogen, gerollt und genäht werden und besitzt eine
regelmäßige Oberfläche.
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Bezüglich des Verfahrens besteht
ein besonderer Vorteil darin, dass er nicht von der Gerinnungszeit abhängig ist.
Das heißt,
es kann kein vorzeitiges Gerinnen stattfinden, da die erste und
die zweite Lösung
getrennt auf den festen Träger
aufgebracht werden.
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Es ist natürlich erkannt worden, dass
die vorläufigen
Verfahrensschritte der beiden oben beschriebenen Verfahren bevorzugte
Laborarbeitsweisen sind, die leicht durch andere Arbeitsweisen mit
gleicher Wirkung ersetzt werden können.
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Allgemein gesprochen schließen die
Hauptfaktoren, die die Struktur des Fibrinnetzwerks und seine biologischen
und biophysikalischen Charakteristiken beeinflussen, die Konzentration
von Thrombin, Fibrinogen und Faktor XIII sowie natürlich die
Temperatur, bei der die Polymerisation durchgeführt wird, ein. Die Fibrinogenkonzentration
und in einem großen
Maß die
Konzentration an gerinnbarem Protein ist proportional zu der Zerreißfestigkeit,
während
die Konzentration an Faktor XIIIa, der die Fibrinmonomere kovalent
quervernetzt, die Elastizität
des Fibrinnetzwerks beeinflusst.
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Die Thrombinkonzentration besitzt
jedoch eine Schlüsselfunktion
beim Kontrollieren der Bildung des Fibrinnetzwerks. Das heißt, die
Biopolymerstruktur ist umgekehrt proportional zu der Thrombinkonzentration, während die
gleiche regelmäßige und
einheitliche Struktur bei jeder Konzentration an Thrombin erhalten
bleibt. Bei geringen Thrombinkonzentrationen gibt es eine langsame
Fibrinogenumwandlung, die mit einem langsamen Faserwachstum einhergeht,
was zu der Bildung einer Fibrinstruktur mit dicken Fasern und großen Poren (>1 μm) führt. Mit anderen Worten, eine
geringe Thrombinkonzentration führt
zu einer langen Gerinnungszeit und größeren Poren. Andererseits resultieren
hohe Konzentrationen an Thrombin in kürzeren Gerinnungszeiten und
produzieren so ein festes Material mit dünnen Fibrinfasern und kleiner
Porengröße (<1 μm). Diese
Wirkung kann durch Verwendung der Rasterelektronenmikroskopie (REM) gezeigt
werden. Während 1 das Netzwerk eines Fibrin-Films
zeigt, der mit einer geringen Thrombinkonzentration (3 IU) entwickelt
wurde und eine Porengröße von mehr
als 1 μm
besitzt (etwa 3–4 μm), zeigt 2 einen Fibrin-Film mit
einer hohen Thrombinkonzentration (300 IU), der eine Porengröße besitzt
die kleiner als 1 μm
ist (etwa 0,2 μm).
Zum Vergleich zeigt 3 eine
typische Struktur eines humanen Fibringerinnsels. In dem humanen
hämostatischen Gerinnsel öffnet die
Gegenwart von Zellen drastisch die dreidimensionale Struktur des
Netzwerks. Eine derartige offene und unregelmäßige Struktur ist für die Wanderung
von Fibroblasten in das Netzwerk des Fibringerinnsels während des
normalen Wundheilungsprozesses physiologisch günstig. Aus diesen Figuren ist
es offensichtlich, dass durch Variieren der Thrombinkonzentration
Fibrinnetzwerke mit geringer oder hoher Porengröße erhalten werden können. Zur
Verwendung des Fibrinmaterials als biomechanische Barriere gemäß der vorliegenden
Erfindung wird die Thrombinkonzentration vorzugsweise eingestellt,
um eine Fibrinnetzwerkstruktur mit einer Porengröße zu erhalten, die das Eindringen
von Fibroblasten ausschließt.
Das Fibrinmaterial, das gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt wurde, kann durch Standard-REM untersucht
und weiterhin in dem Tiermodell getestet werden, das hierein beschrieben
wird.
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Angesichts dieser Ergebnisse schlagen
die Erfinder vor, dass ein Fibrin-Film mit hoch geordneter Struktur,
der eine „geringe
Porengröße" besitzt, als biomechanische
Barriere nützlich
ist, um Kontakte zwischen benachbarten verletzten Oberflächen zu
verhindern. Außerdem
wird vorgeschlagen, einen Fibrin-Film mit hoch geordneter Struktur,
der „relative
große
Poren" besitzt,
als Matrix für
Zellen und Moleküle
zum Erreichen von Hämostase
und Wundreparatur zu verwenden.
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Dies ist umso wichtiger, da die Erfinder
unter Verwendung des unten beschriebenen Tiermodells gefunden haben,
dass für
die Entwicklung von Adhäsionen
Blut, ein Peritonealtrauma und eine Annäherung/Kontakt der verletzten
Oberflächen
notwendig sind.
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Unter Berücksichtigung dieser drei Faktoren
wird in bestimmten Ausführungsformen
die Hämostase und
die Wundreparatur angegangen, indem man eine einzige Schicht eines
Fibrin-Klebers auf die Stelle(n) der Verletzung aufbringt, während die
Trennung/Isolierung der verletzten Oberfläche(n) erzielt wird, indem
eine biomechanische Fibrinbarriere entweder als eine zweite Schicht,
die über
die erste Schicht des Fibrin-Klebers aufgebracht wird, oder einfach
als eine selbsttragende Platte („sheet"), die zwischen die benachbarten Verletzungsstellen
oder zwischen die Verletzungsstelle und die benachbarten nicht verletzten
Gewebe gelegt wird, verwendet wird. Die Erfinder haben entdeckt,
dass die für
die vollständige
Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin erforderliche Zeit bei der Verwendung
einer solchen Kombination eines hämostatischen Agens/Wundreparaturpromotors
(Beschleunigers) und einer biomechanischen Barriere ein wichtiger
zu berücksichtigender Parameter
ist. Insbesondere ist gefunden worden, dass die Schicht des Fibrin-Klebers
bzw. die letzte Schicht, wenn mehr als eine Schicht auf eine verletzte
Oberfläche
aufgebracht wird, sich verfestigen bzw. gerinnen sollte, bis die
Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin zum Abschluss gekommen ist.
Wenn beispielsweise der Fibrin-Kleber gleichzeitig auf zwei verletzte
Oberflächen
wie Zökum
(Caecum/Blinddarm) und Peritoneum (Bauchfell) aufgebracht wird,
um jeweils eine einzelne Schicht zu bilden, und die Oberflächen miteinander
in Kontakt kommen, bevor die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin
abgeschlossen ist, kann es zu einem Zusammenkleben der Oberflächen kommen,
d. h. Adhäsionen
werden gebildet.
-
Dies bedeutet, dass der Oberflächenzustand
der verschiedenen Grenzflächen
und ihre Beziehung bei der Vorbeugung der Bildung von Adhäsionen sehr
wichtig sind. Als allgemeinen Hinweis schlagen die Erfinder vor,
ein ungestörtes
Gerinnen/Verfestigen („setting") zu gestatten, nachdem
die jeweilige letzte äußere Schicht des
Fibrin-Klebers aufgetragen wurde, bis die Umwandlung von Fibrinogen
zu Fibrin vollständig
ist. Dies gilt nicht für
den Fibrin-Film der Erfindung, da dieser vor seiner Anwendung in
vitro gerinnen bzw. sich verfestigen darf. Obwohl natürlich detaillierte
experimentelle Protokolle im Folgenden beschrieben werden, ist dem
Durchschnittsfachmann bewusst, dass die spezifischen Zeiterfordernisse
in Abhängigkeit
von dem jeweiligen Patienten, der Art der Verletzung und der Handhabung
variieren können,
und somit offensichtlich auch eine Frage der klinischen Erfahrung
sind. Es sind jedoch in vitro-Verfahren zum Verfolgen der Umwandlung
von Fibrinogen zu Fibrin im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise
kann die Trübung überwacht
werden, die ein Maß für die sich
entwickelnde optische Dichte von Fibrinnetzwerken in einer Küvette von
1 cm Weglänge
bei 800 nm ist (vgl.: Shah GA et al., Thrombosis Research 40, 181–188, 1985).
Gemäß diesem
Verfahren ist es möglich,
in vitro die erforderliche Zeit für die vollständige Fibrinbildung
bei einer gegebenen Thrombinkonzentration zu bestimmen. Dies gibt
eine Schätzung
der erforderlichen Mindestzeit für
die vollständige
Gerinnung nach Aufbringen der letzten äußeren Schicht(en). Es wird
davon ausgegangen, dass ein Durchschnittsfachmann auf Grundlage
der vorliegenden Offenbarung ein Protokoll für die Verwendung eines bestimmten
Fibrin-Klebers und
die Art und Weise seiner Anwendung bestimmen kann, so dass die Erfordernisse
von Chirurgen bezüglich der
Zeitbemessung („timing") und der technischen
Vorrichtungen erfüllt
werden.
-
Gemäß den oben beschriebenen allgemeinen
Richtlinien umfasst eine bevorzugte Ausführungsform, genannt „double
coating" (Doppelbeschichtung),
das Aufbringen eines ersten Fibrin-Klebers mit einer niedrigen Thrombinkonzentration,
der als hämostatisches
Agens und/oder Gewebereparaturpromotor dienen soll, und eines zweiten
Fibrin-Klebers mit einer hohen Thrombinkonzentration, der die Rolle
einer biomechanischen Barriere spielen soll, die die Verletzung
und die erste Beschichtung, die sich nach Aufbringen des ersten
Fibrin-Klebers gebildet hat, gänzlich
bedeckt. Vorzugsweise ist der erste Fibrin-Kleber durch Vermischen
einer oben beschriebenen Fibrinogen-haltigen Lösung mit einem gleichen Volumen
einer Thrombin-haltigen Lösung,
die weniger als 1000 IU Thrombin, vorzugsweise weniger als 150 IU,
enthält,
hergestellt worden. Der zweite Fibrin-Kleber ist vorzugsweise hergestellt
worden durch Vermischen einer solchen Fibrinogen-haltigen Lösung mit
einem gleichen Volumen einer Thrombin-haltigen Lösung, die mindestens 50 IU
Thrombin, vorzugsweise mindestens 150 IU Thrombin, und besonders
bevorzugt mindestens 300 IU enthält.
Es ist natürlich auch
möglich,
mehr als zwei Schichten aufzubringen, solange die letzte Schicht
die Rolle einer biomechanischen Barriere spielt, die eine Fibroblastenproliferation
zwischen der bedeckten Läsion
und den benachbarten Oberflächen
verhindert.
-
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung, die „Sandwich-Verfahren" genannt wird, wird
eine die verletzte(n) Oberfläche(n)
(„injured
surface(s)") bedeckende
Schicht eines Fibrin-Klebers als hämostatisches Agens und Wundreparaturpromotor
verwendet, während
ein Fibrin-Film, d. h. ein selbsttragendes, flächiges Material aus vernetztem
Fibrin, das zwischen die verletzte Oberfläche und eine benachbarte unverletzte
Oberfläche
oder zwischen zwei verletzte Oberflächen gelegt wird, als eine
biomechanische Barriere dient. Der Fibrin-Kleber wird vorzugsweise
durch Vermischen einer ersten, Fibrinogen-haltigen Lösung mit einem gleichen Volumen
einer Thrombin-haltigen Lösung,
die 1–300
IU/ml Thrombin, vorzugsweise mindestens 20 IU/ml und besonders bevorzugt
mindestens 100 IU/ml enthält,
hergestellt. Der Fibrin-Film wird aus mindestens etwa 4 IU/ml Thrombin,
vorzugsweise mindestens 20 IU/ml Thrombin und besonders bevorzugt
mindestens 300 IU/ml Thrombin, hergestellt. Es versteht sich natürlich, dass
der Fibrin-Film auch in Kombination mit einer Doppelbeschichtung,
wie sie oben beschrieben ist, verwendet werden kann.
-
Die oben beschriebenen Ausführungsformen
können
entweder allein oder in Kombination mit anderen Ausführungsformen
verwendet werden.
-
Diese und andere Einzelheiten sowie
weitere besondere Ausführungsformen
und Vorzüge
der Erfindung werden aus den folgenden Beispielen, den Patentansprüchen und
den Zeichnungen offensichtlich werden.
-
Figuren
-
1 Rasterelektronenmikroskopie
(REM) eines Fibrin-Films, der mit 3 IU Thrombin hergestellt wurde (Vergrößerung 1,5
K und 5,0 K). Die Porengröße beträgt etwa
3–4 μm.
-
2 REM
eines Fibrin-Films, der mit 300 IU Thrombin hergestellt wurde (× 1,5 K, × 5,0 K).
Die Porengröße beträgt etwa
0,2 μm.
-
Die Fibrin-Filme mit 3 IU und 300
IU wurden unter Verwendung der Komponenten eines Standard-Fibrin-Kleberkits
hergestellt, wobei die beiden verschiedenen Thrombinkonzentrationen
von 3 IU/ml und 300 IU/ml durch Verdünnen der rekonstituierten Thrombinlösung mit
20 mM CaCl2 eingestellt wurden. Die Proben wurden
gemäß dem in
Beispiel 1 beschriebenen Verfahren in Petri-Schalen gegossen und
für 1 Stunde
bei 37°C
inkubiert.
-
3 REM-Beobachtung
eines Blutgerinnsels, das durch Mischen von 100 μl Eigenblut mit 100 μl 2O mM CaCl2 erhalten wurde (× 1,5 K, × 5,0 K).
-
Die in den 1–3 gezeigten Proben wurden
gemäß Standardprotokollen
für die
REM weiter verarbeitet.
-
Die Länge der gestrichelten Linie
in der Textzeile von 1–3 entspricht 20 μm (× 1,5 K)
bzw. 6,0 μm (× 5.0 K),
-
4 Fibrin-Filme,
die gemäß Beispiel
1 und 2 unter Verwendung von 300 IU Thrombin hergestellt wurden.
-
4A Fibrin-Film
gemäß Beispiel
1, der Methylen-Blau als Desinfektionsmittel enthält.
-
4B Fibrin-Film
gemäß Beispiel
2.
-
5 Schema,
das die verschiedenen Arten der Beschichtung und Beschichtungsweisen
unter Verwendung von Fibrin-Klebern zeigt.
-
6 Schema,
in dem die verschiedenen Ausführungsformen
der Erfindung gemäß den verschiedenen
experimentellen Ansätzen
zusammengefasst sind.
-
7 Technische
Zeichnung, die verschiedene Ansichten der Klemme zeigt, die im Rahmen
des Tiermodells verwendet wurde.
-
1. MATERIAL
UND METHODEN
-
1.1 Versuchstiere
-
Für
diese Studien wurden weibliche Wistar-Ratten, die jeweils 180–200 g wogen,
verwendet. Die Tiere wurden vor der Operation in Gruppen und nach
der Operation bis zur Obduktion einzeln in Käfigen gehalten. Die Bezeichnung
des Stammes ist ICO.WI/(IOPS, CPB). Die Experimente wurden entsprechend
den Richtlinien der „Législation
et réglementation
relative à l'expérimentation
animale" durchgeführt.
-
1.2 Material
-
Für
diese Experimente wurden Fibrin-Kleber-Kits der Firma Baxter, lot
#26302001AA, verwendet. Während
diese Kits noch nicht auf dem Markt sind, können angesichts der vorliegenden
Offenbarung beliebige Standardkits, die Zwei-Komponenten-Fibrin-Kleber
enthalten, für
die Zwecke der Erfindung verwendet werden.
Calciumchlorid 20
mM von Nycomed lot #931343
Petri-Schalen (9 cm Durchmesser)
von Nunc (Zellkulturqualität)
-
1.3 Ausrüstung für Chirurgie
und Anästhesie
-
Die chirurgische Ausrüstung schloss
ein: PVC-Platte (Chirurgietisch) 30 × 30 cm; Nadelhalter, CRILE-WOOD,
14 cm; Zangen, Wangesteen, 15 cm; anatomische Standard-Zangen, 13
cm; Sezierscheren, Metzenbaum, 14 cm; selbstgemachte Klemme (zum
Fixieren einer Gewebefläche
von 2 cm2); Lampe, Well-Lynch; Einwegskalpelle,
SWANN-MORTON, #24; nicht-resorbierbarer chirurgischer Faden, USP
Dermalon; Dermalon-Nadel 2.0 CE-4, Dermalon-Nadel 4.0 CE-6; Gaze-Tupfer:
Schicht 12, 10 × 10
cm, Mölnlycke.
Diethylether wurde als Betäubungsmittel
verwendet.
-
Die in 7 dargestellte,
selbst hergestellte Klemme dient als Werkzeug, um die Verletzungen,
die der Oberfläche
der Peritonealwand zugefügt
werden, bezüglich
ihrer Position, Fläche
und Tiefe zu standardisieren. Sie besteht aus zwei beweglichen Teilen.
Der „männliche" Teil besitzt abgerundete
Kanten und umfasst eine Fläche
von 2 cm2, die der Oberfläche des
kleinsten Zökums,
das in einer Ratte gefunden wurde, entspricht. Wenn die Klemme geschlossen
ist, besteht zwischen dem männlichen
und dem weiblichen Teil eine Lücke
von 2 mm, die ausreichend ist, um das entsprechende Gewebe (Muskelschichten,
Haut) unbeweglich zu halten, ohne dass es zu einem Scheren oder
zum Einschneiden („shearing
or cutting") kommt.
Die mechanische Spannung, die durch die Klemme induziert wird, ist
notwendig, um eine leichte Trennung der ersten Muskelschicht von
der zweiten zu erlauben, wenn die festgeklemmte Oberfläche mit
einem Skalpell eingeschnitten wird. Die Spannung erlaubt eine bessere
Kontrolle der Einschnitttiefe.
-
1.4 Desinfektion und biologischer
Abfall
-
Die chirurgische Ausrüstung wurde
desinfiziert und mit 15–20
g/l Mucocit-R (Merz) gemäß den beiliegenden
technischen Informationen gewaschen. Für alle Materialien sowie die
Tierkadaver wurden die üblichen Entsorgungsmaßnahmen
ergriffen.
-
1.5 Tierchirurgie
-
Das nachfolgend beschriebene chirurgische
Verfahren unter Verwendung der oben beschriebenen Klemme erlaubt
es, in Kontrollversuchen Adhäsionen
vom gleichen Typ mit einer Häufigkeit
von 100% zu erzeugen.
-
- – Die
Haut wurde entlang einer 4-cm-Linie, die das Xyphoid und den Harnausgang
verbindet, für
eine Ratte, die 180–200
g wiegt, mit einer Metzenbaum-Schere
geschnitten.
- – Die
Hautränder
wurden angehoben und vorsichtig von der Muskelwand auf jeder Seite
der Linea alba präpariert.
- – Der
Bauchmuskel wurde entlang der Linea alba über die 4-cm-Linie eingeschnitten,
wie oben beschrieben.
- – Das
Zökum wurde
sanft entnommen und auf einen Gaze-Tupfer gelegt, wobei zu jeder
Zeit der Kontakt mit den Latex-Handschuhen und eine Verletzung durch
Instrumente vermieden wurden.
-
Das Zökum wurde auf seiner oberen
Seite mit Gaze nur aufgeschürft,
bis punktuelles Bluten auftrat,
-
Das Zökum wurde wieder in die Bauchhöhle zurückgeführt, wenn
keine Behandlung durchgeführt
werden sollte. Wenn eine Behandlung jedoch durchgeführt werden
sollte, wurde das zu testende Produkt auf das Zökum aufgebracht, welches dann
sanft in die Bauchhöhle
zurückgeführt wurde.
-
- – Im
nächsten
Schritt wurde die oben beschriebene Klemme verwendet, die entworfen
worden war, um die der Peritonealwand zuzufügende Verletzung bezogen auf
deren Fläche,
Position und Tiefe zu standardisieren und somit ein Testmodell zu
gewährleisten,
in dem Adhäsionen
mit einer konstanten Häufigkeit
von 100% erzielt werden. Die Klemme wurde symmetrisch durch den
Einschnitt in der Mittellinie eingeführt, auf der dem Zökum gegenüber liegenden
Peritonealwand platziert und fixiert, wodurch eine konstante peritoneale
Oberfläche
von 2 cm2 bestimmt wurde, wo die Verletzung
erzeugt werden sollte. Die Klemme wurde dann umgedreht, um die Peritonealwand
freizulegen.
- – Die
freigelegte seröse
Oberfläche
wurde durch die erste muskuläre
Schicht hindurch mit 2 × 10
gekreuzten Schnitten konstanter Tiefe eingeschnitten.
-
Nach diesem Schritt wurde die eingeschnittene
Oberfläche
wieder auf das aufgescheuerte Zökum
gelegt, sofern keine Behandlung durchgeführt werden sollte. Wenn eine
Behandlung durchgeführt
wurde, wurde das Produkt auf die eingeschnittene Oberfläche aufgebracht,
die dann vorsichtig wieder auf das aufgescheuerte Zökum gelegt
wurde, derart, dass Zökum
und Peritonealwand durch das Produkt getrennt waren.
-
Dabei wurde darauf geachtet, jede
Bewegung, die ein Ausdehnen oder Strecken, insbesondere der peritonealen
Zökum-Seite,
zu vermeiden.
-
- – Der
Muskel wurde mit nicht-resorbierbarer Dermalon 2.0 genäht und die
Haut mit Dermalon 4.0 geschlossen.
- – Die
Identifizierung der Tiere wurde mittels eines elektronischen Identifizierungskennzeichens
(ZETES Electronic Inc.) durchgeführt,
das durch einen eindeutigen Kennbegriff aus 12 alphanumerischen
Zeichen definiert ist.
- – Die
Tiere durften sich dann im Labor erholen.
-
1.6 Blind-Kontrolle
-
Eine „Blindkontrolle" wurde durch Verfolgen
aller Schritte des chirurgischen Verfahrens, jedoch ohne Zufügen von
Einschnitten oder Aufschürfungen
durchgeführt.
Die Zeitbemessung während
des chirurgischen Eingriffs wurde streng beobachtet.
-
1.7 Töten der Versuchstiere
-
Die Versuchstiere wurden nach 10
Tagen getötet.
Die post-mortem-Studien der Viscera (Eingeweide) wurden durch einen
U-förmigen
abdominalen Einschnitt, der auf der Höhe der Leber begann, gemacht.
Die Adhäsionen
in dem Peritonealraum wurden von zwei unabhängigen Untersuchern bewertet.
-
1.8 Klassifizierung der
Adhäsionen
-
Die Adhäsionen wurden gemäß ihrer
Art und ihren Festigkeitscharakteristika aufgezeichnet.
-
1.8.1 Art der Adhäsion
-
Die Adhäsionen wurden in einer Tabelle,
entsprechend den an dem Prozess der Adhäsion beteiligten Organe, klassifiziert.
Adhäsionen
unter Beteiligung der Nähte
wurden ebenfalls aufgezeichnet, werden aber im Folgenden nicht als
Adhäsionen
aufgeführt.
-
Die Hauptadhäsionstypen, die beobachtet
und klassifiziert wurden, sind:
Zökum/Parietal (Zökum/Wand)
Visceral/Visceral
(viszeral/viszeral)
Fett/Parietal (Fett/Wand)
Fett/Visceral
(Fett/Viszeral)
Fett/Fett
-
In Verbindung mit der Angabe der „Art der
Adhäsion" wird der Name des
Fetts oder der Viscera ebenfalls in Klammern angegeben werden.
-
Z. B.: Grad 2-Adhäsion zwischen dem Fett des
Uterus und der Peritonealwand wird wie folgt wiedergegeben:
-
Ovarium (O), Colon (Co), Ileum (II),
Blase (Bl), und Omentum (Om) können
ebenfalls an dem Adhäsionsprozess
beteiligt sein.
-
1.8.2 Zugfestigkeitscharakteristika
-
Die Adhäsionen wurden abgezogen und
gemäß dem folgenden
makromorphologischen Klassifizierungsmaßstab für Adhäsionen bewertet:
0 : keine
Adhäsion
1
: häutig
(mild, leicht)
2 : adhäsive
Bänder
(mittel)
3 : ausgedehnte Adhäsionsbildung (ernst, schwer)
-
Der Wert der Zugfestigkeit der Adhäsionen wurde
wie oben beschrieben in der entsprechenden Spalte der jeweiligen
Tabelle mit der Art des Organs, das an dem Adhäsionsprozess beteiligt war,
aufgezeichnet.
-
1.9 Art der Beschichtung
-
Zwei verschiedene Anwendungsarten
wurden unter Verwendung eines Fibrin-Klebers (FK) durchgeführt: Ein „single
coating" (1 Schicht)
oder ein „double
coating" (2 Schichten).
-
1.9.1 Single coating/Einfachbeschichtung
-
Ein Fibrin-Kleber mit einer definierten
Thrombinkonzentration wurde als hämostatisches Agens bzw. als
Gewebereparaturpromotor verwendet.
-
Der Fibrin-Kleber wurde wie in Abschnitt
1.5 beschrieben als eine Einfachbeschichtung auf dem Zökum und
der Peritonealwand aufgebracht.
-
1.9.2 Double coating/Doppelbeschichtung
-
Es wurden zwei Fibrin-Kleber mit
zwei unterschiedlichen Thrombinkonzentrationen, einer niedrigen und
einer hohen, verwendet.
-
Der Fibrin-Kleber mit der niedrigen
Thrombinkonzentration wurde als erste Schicht der Doppelbeschichtung
verwendet.
-
Der Fibrin-Kleber mit der hohen Thrombinkonzentration,
der als zweite Schicht aufgebracht wurde, spielt die Rolle einer
mechanischen Barriere, die die Verletzung und die erste Schicht
vollständig überdeckt. Die
Kinetik der Fibrinbildung der zweiten Schicht ist schneller als
die der ersten Schicht und auch die physikalischen Eigenschaften
der beiden Schichten sind unterschiedlich.
-
1.10 Beschichtungsweise
-
Abhängig vom Protokoll wurde das
Zökum aufgeschürft bzw.
die Peritonealwand eingeschnitten und mit einer Einfach- oder Doppelschicht
eines Fibrin-Klebers (FK) beschichtet.
-
Der Fibrin-Kleber kann nacheinander
(sequenziell) oder gleichzeitig (simultan) auf die beiden verletzten
Oberflächen
aufgebracht werden.
-
Durch Kombinieren der Art der Beschichtung
(Einfach- oder Doppelbeschichtung) und der Beschichtungsweise (sequenziell
oder simultan) lassen sich vier verschiedene Fälle erhalten (vgl. 5):
Fall 1: Einfachbeschichtung & sequenzielles
Beschichten
Fall 2: Doppelbeschichtung & sequenzielles Beschichten
Fall
3: Einfachbeschichtung & simultanes
Beschichten
Fall 4: Doppelbeschichtung & simultanes Beschichten
(Fall
2 wird hierin nicht getestet. Fall 3 stellt die „in vivo"-Bedingungen für die Entwicklung von Adhäsionen dar.)
-
2. BEISPIELE
-
Beispiel 1: Herstellung
eines Fibrin-Films unter Verwendung einer Zwei-Spritzen-Vorrichtung
-
Der Fibrin-Film wurde unter Verwendung
einer kommerziellen Zwei-Spritzen-Vorrichtung, nach der Rekonstitution
der Ampullen eines kommerziellen Fibrin-Kleber-Kits gemäß den Instruktionen des Beipackzettels
des entsprechenden verwendeten Kits, gegossen. Beispielsweise kann
ein Kit eines Zwei-Komponenten-Fibrin-Klebers
verwendet werden, der die folgenden Bestandteile aufweist: Ampulle
(1) Humaner topischer Fibrinogen-Komplex (Trockenkonzentrat)
| Protein | 10–13 g/100
ml |
| gerinnbares
Protein | 80%
Minimum |
| Albumin
(human) | 0,5–1,5 g/100
ml |
| Plasminogen | 0,05
mg/ml Maximum |
| Faktor
XIII | 10–40 IU/ml |
| Polysorbat-80 | 0,3%
(w/v) Maximum |
| PH | 7,1–7,5 |
-
Ampulle (2) Steriles Wasser (3,5
ml) zum Rekonstituieren des Inhalts von Ampulle (1) bei 37°C in einem
Wasserbad
-
Ampulle
(3) humanes Thrombin
| Potenz/Wirkungsstärke | 300 ± 50 IU/ml |
| Albumin
(human) | 0,05 ± 0,01
g/ml |
| Glycin | 0,30
M ± 0,05
M |
| pH | 6,5–7,1 |
-
Ampulle (4) 35–45 mM CaCl2 (3,5
ml) zum Rekonstituieren des Inhalts von Ampulle (3) bei Raumtemperatur.
-
Nach Rekonstitution wurde die Fibrinogen-haltige
Lösung
bei Raumtemperatur gehalten. Weitere Thrombinverdünnungen
wurden mit 20 mM CaCl2 als Verdünnungsmittel
hergestellt. Unter Verwendung der Zwei-Spritzen-Vorrichtung wurde
das Gemisch „Fibrinogen-Thrombin" auf eine Petri-Schale
aufgebracht, während
darauf geachtet wurde, dass zu jeder Zeit gleiche Mengen der Fibrinogen-haltigen
und der Thrombin-haltigen Lösung
aus der jeweiligen Spritze herausgedrückt wurden. Bei geringen Thrombinkonzentrationen
wurde die Petri-Schale geneigt, um die Oberfläche mit einer regelmäßigen und
homogenen Dicke des Fibrin-Klebers zu
bedecken. Bei hohen Thrombinkonzentrationen wurde besonders darauf
geachtet, dass die Mischung der Fibrinogen-haltigen und der Thrombin-haltigen Lösung von
Beginn an gleichmäßig über die
Oberfläche
der Petri-Schale gesprüht
wurde. Die Petri-Schale wurde bei 37°C für zwei Stunden inkubiert. Wahlweise
können Desinfektionsmittel,
z. B. Methylen-Blau in einer Konzentration von 10 mg/l bis 10 g/l,
oder Arzneimittel in dem Inhalt der Ampullen (2) oder (4) gelöst werden,
bevor dieser zum Rekonstituieren der Inhalte von Ampulle (1) bzw.
(2) verwendet wird.
-
Der erhaltene Fibrin-Film kann luftgetrocknet
und vor Verwendung rehydratisiert werden. Wenn die Thrombinlösung nicht
bereits Substanzen wie Desinfektionsmittel oder auch Arzneimittel
zum Verstärken
des gewünschten
therapeutischen Effektes des Fibrin-Films enthielt, können die
Lösungen,
die zur Rehydratisierung verwendet werden, solche Substanzen einschließen.
-
Beispiel 2: Herstellung
eines Fibrin-Films unter Verwendung einer trockenen Fibrinogenplatte
-
Die Lösungen aus Beispiel 1 wurden
mit den folgenden Abänderungen
verwendet:
-
3,5 ml der rekonstituierten Fibrinogen-haltigen
Lösung
wurden in eine Petri-Schale
mit einem Durchmesser von 51 mm gegossen, die geneigt wurde, um
das Material über
die ganze Oberfläche
zu verteilen. Das in der Fibrinogen-haltigen Lösung enthaltende Wasser wurde
durch Lufttrocknung verdampft. Auf diese Weise wurde eine trockene
Fibrinogenplatte mit einer Dicke von 100 μm und einem Gewicht von 0,4291
g erhalten. 3,5 ml einer rekonstituierten Thrombin-haltigen Lösung wurden
in die Petri-Schale gegossen, die das trockene, flächige Fibrinogenmaterial
enthielt. Die Reaktionsmischung wurde dann für 2 Stunden bei 37°C gehalten.
Der auf diese Weise erhaltene Fibrin-Film kann entweder direkt verwendet
werden oder getrocknet und vor Gebrauch rehydratisiert werden. Alternativ
dazu kann das trockene, flächige
Fibrinogenmaterial erst vor Verwendung zu einem Fibrin-Film umgewandelt
werden.
-
Sowohl das trockene, flächige Fibrinogenmaterial
als auch der getrocknete Fibrin-Film
können
in einem kommerziellen Kit enthalten sein, der weiterhin Zusatzkomponenten
zum Weiterverarbeiten bzw. zur Rehydratisierung der flächigen („sheet-like") Materialien umfasst.
-
Beispiel 3: Herstellung
eines Fibrinverschlusses/Klebers („fibrin sealant/glue")
-
Die Herstellung eines Fibrin-Klebers
wurde gemäß den technischen
Instruktionen des Beipackzettels des verwendeten Kits durchgeführt. Der
Fibrin-Kleber wurde ohne weitere Vorbereitung mit unterschiedlichen Thrombinkonzentrationen,
z. B. 4, 5, 20, 100, 150 und 300 IU/ml, hergestellt und wie im Folgenden
beschrieben verwendet.
-
Beispiel 4: Kontrollgruppe
-
Die Tiere wurden operiert, um Adhäsionen zu
entwickeln und daher wurde keine Behandlung durchgeführt. Demgemäß wurde
keine Hämostase
erreicht und somit waren alle Bedingungen vorhanden, um mit einer
Häufigkeit
von 100% schwere Typ 3-Adhäsion
zwischen dem Zökum
und der Peritonealwand zu entwickeln.
-
Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle 1 wiedergegeben: Tabelle
1: Kontrollgruppe
-
Beispiel 5: Verwendung
des Fibrin-Films
-
Die verwendeten Fibrin-Filme wurden
in der Regel gemäß Beispiel
1 hergestellt.
-
Beispiel 5a: Blindkontrolle
mit Fibrin-Film (FF)
-
Zwei Tiere dienten als Blindkontrolle.
Eines erhielt einen Fibrin-Film, hergestellt unter Verwendung von 3
IU Thrombin und mit Wasser als Verdünnungsmittel (FF 3 IU), das
andere erhielt einen Fibrin-Film, hergestellt unter Verwendung von
20 IU Thrombin und mit 20 mM CaCl2 als Verdünnungsmittel
(FF 20 IU). Es wurden keine Verletzungen auf Zökum und Peritoneum induziert.
-
Bei beiden Tieren wurden keine Adhäsionen beobachtet.
-
Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle 2 wiedergegeben.
-
Tabelle
2: Blindkontrolle mit Fibrin-Film
-
Beispiel 5b: Verwendung eines Fibrin-Films
ohne Kontrolle der Hämostase
Die Fibrin-Filme FF 3 IU und FF 20 IU gemäß Beispiel 5a wurden als mechanische
Barriere verwendet, ohne dass die Hämostase der Verletzungen an
Zökum und
Peritoneum kontrolliert wurde. Alternativ dazu wurde ein Fibrin-Film
300 IU als mechanische Barriere verwendet.
-
Die Tiere, die nach 10 Tagen getötet worden
waren, zeigten mittlere caecoparietale Adhäsionen (Typ 2) und eine große Zahl
von Fett-Adhäsionen
unter hauptsächlicher
Beteiligung von Uterus und Blase. Überraschend und besonders wichtig
ist, dass die Tiere, die mit FF 300 IU behandelt wurden, praktisch überhaupt keine
Adhäsionen
entwickelten.
-
Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle 3 wiedergegeben: Tabelle
3: Fibrin-Film allein
-
Der erfindungsgemäße Fibrin-Film, der zur Behandlung
des Tiers Nr. 11 verwendet wurde, wurde durch ein alternatives Verfahren
wie folgt hergestellt:
-
Die erste, Fibrinogen-haltige Lösung wurde
in eine Petri-Schale mit einem Durchmesser von 91 mm gegossen. Die
Temperatur dieser Lösung
wurde durch Inkubieren der Petri-Schale für einige Minuten bei niedriger
Temperatur, hier für
eine Dauer von 4 Minuten bei –12°C, erniedrigt.
Dann wurde die zweite, Thrombin-haltige Lösung (RT) zugegeben und mit
der ersten Lösung
vermischt. Die Petri-Schale wurde bis zum Abschluss der Umwandlung
von Fibrinogen zu Fibrin inkubiert, hier für eine Dauer von 24 Stunden
bei 37°C.
-
Beispiel 6: Single Coating/Einfachbeschichtung
mit Fibrin-Klebern
-
Unter Verwendung von Thrombin-haltigen
Lösungen,
die 4 IU/ml (vgl. Beispiel 6a) und 100 IU/ml Thrombin (vgl. Beispiel
6b) umfassten, wurden Fibrin-Kleber als hämostatisches Agens auf jeweils
das aufgeschürfte
Zökum und
das eingeschnittene Peritoneum aufgetragen. Beispielsweise wird
dies in der folgenden Tabelle wie folgt gezeigt: FK 4 IU /-----/
FK 4 IU, wobei /-----/ andeutet, dass kein Fibrin-Film zwischen
die Verletzungen gelegt wurde. Der Fibrin-Kleber wurde nacheinander
auf die Verletzungen aufgebracht. Die Wartezeit, um ein Verfestigen/Gerinnen
(„setting") des Fibrin-Klebers
zu ermöglichen,
betrug 5 min. nach jedem Aufbringen.
-
In Beispiel 6a wurden schwere Ty
3-Adhäsionen
zwischen dem Zökum
und der Peritonealwand beobachtet.
-
Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle 4 gezeigt: Tabelle
4: Einfach-Beschichtung.
Sequenzielle Beschichtunszeit: 5 Minuten
-
In Beispiel 6b entwickelten zwei
Tiere schwere Typ 3-Adhäsionen
zwischen dem Zökum
und der Peritonealwand. Das Zökum
war teilweise in die Peritonealwand eingeschlossen. Zwei Tiere entwickelten
keine Adhäsionen.
-
Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle 5 wiedergegeben: Tabelle
5: Einfach-Beschichtung.
Sequenzielle Beschichtungszeit: 5 Minuten
-
Beispiel 7: Double-coating/Doppelbeschichtung
mit Fibrin-Klebern
-
Die Fibrin-Kleber wurden in zwei
verschiedenen Thrombinkonzentrationen aufgebracht.
-
Beispiel 7a:
-
Eine erste Schicht eines Fibrin-Klebers,
der unter Verwendung einer Thrombin-haltigen Lösung, die eine Konzentration
von 4 IU/ml Thrombin aufwies (FK 4 IU), wurde simultan (gleichzeitig,
d. h. nur mit einer durch die Handhabung bedingten minimalen zeitlichen
Versetzung) sowohl auf das abgeschürfte Zökum als auch die eingeschnittene
Peritonealwand aufgetragen.
-
Nach einer Wartedauer von 5 Minuten,
um die Polymerisation zuzulassen, wurde eine zweite Schicht eines
Fibrin-Klebers FK 100 IU simultan auf die gleichen Organe aufgebracht.
Dem folgte eine zweite Wartedauer von 5 Minuten, bevor der chirurgische
Eingriff fortgesetzt wurde.
-
Ein Tier entwickelte keine Adhäsion. Bei
einem Tier, das eine schwere Typ 3-Adhäsion
entwickelte, wurde ein verbliebenes Fibrinstück beobachtet. Drei Tiere entwickelten
zwischen dem Zökum
und der Peritonealwand milde/leichte Typ 1-Adhäsionen.
-
Die Ergebnisse sind in der folgende
Tabelle 6 wiedergegeben: Tabelle
6: Doppelbeschichtung mit FK 4 IU und FK 100 IU.
Simultane Beschichtungszeit:
5 Minuten
-
Beispiel 7b:
-
Es wurde ein Parallelexperiment unter
den gleichen Bedingungen durchgeführt, mit der einzigen Ausnahme,
dass höhere
Thrombinkonzentrationen (FK 5 IU und FK 150 IU verwendet wurden.
-
Vier Tiere entwickelten keine Adhäsionen.
Bei einem Tier, das eine milde Typ 2-Adhäsion
zwischen dem Zökum
und der Peritonealwand entwickelte, wurde ein verbliebenes Fibrinstück beobachtet.
-
Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle 7 wiedergegeben: Tabelle
7: Doppelbeschichtung mit FK 5 IU und FK 150 IU.
Simultane Beschichtungszeit:
5 Minuten
-
Beispiel 8: Sandwich-Verfahren
unter Verwendung einer Kombination eines Fibrin-Klebers und eines
Fibrin-Films
-
Das Sandwich-Verfahren kombiniert
die Verwendung eines Fibrin-Klebers als hämostatisches Agens bzw. Wundreparaturpromoters
und eines Fibrin-Films als mechanische Barriere. Es wurden drei
Typen von Fibrin-Filmen, die unter Verwendung von 4 IU, 20 IU und
300 IU Thrombin gemäß Beispiel
1 hergestellt worden waren, verwendet. Infolge der verschiedenen
Thrombinkonzentrationen der jeweiligen Filme variierte die für die vollständige Umsetzung
von Fibrinogen zu Fibrin benötigte
Zeit. Dies ist jedoch ohne Bedeutung, da die Fibrin-Filme für mehr als
zwei Stunden bei 37°C
gehalten wurden. Dieser Zeitraum ist größer als der theoretisch und
mittels Trübungsmessung
praktisch bestimmte Zeitraum.
-
Beispiel 8a:
-
Ein Fibrin-Kleber 100 IU, der als
hämostatisches
Agens verwendet wurde, wurde simultan mit einer Wartedauer von 5
Minuten auf sowohl das aufgeschürfte
Zökum als
auch die eingeschnittene Peritonealwand aufgetragen. Parallel dazu
(vgl. (ii)) wurde er sequenziell (nacheinander) mit einer Wartedauer
von jeweils 7 Minuten auf das aufgeschürfte Zökum und die eingeschnittene
Peritonealwand aufgetragen. In beiden Versuchen wurde ein Fibrin-Film
von 4 IU verwendet.
-
(i) Simultane Beschichtungszeit:
5 Minuten
-
Zwei Tiere entwickelten keine Adhäsionen zwischen
dem Zökum
und der Peritonealwand, während zwei
Tiere leichte Typ 1-Adhäsion
zwischen diesen beiden Oberflächen
entwickelten. Ein Tier entwickelte eine caecoparietale Adhäsion vom
Typ 2.
-
Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle 8 wiedergegeben: Tabelle
8: Sandwich-Verfahren. Simultane Beschichtungszeit: 5 Minuten
-
(ii) Sequenzielle Beschichtungszeit:
7 Minuten
-
Praktisch keines der Tiere entwickelte
Adhäsionen.
-
Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle 9 wiedergegeben: Tabelle
9: Sandwich-Verfahren. Sequenzielle Beschichtungszeit: 7 Minuten
-
Beispiel 8b:
-
In einem anderen Experiment wurden
ein Fibrin-Kleber 100 IU und ein Fibrin-Film 20 IU in Kombination miteinander
verwendet. Der Fibrin-Kleber wurde mit einer Wartedauer von jeweils
7 Minuten sequenziell (nacheinander) auf das abgeschürfte Zökum und
die eingeschnittene Peritonealwand aufgetragen.
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Keines der Tiere entwickelte Adhäsionen.
-
Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle 10 wiedergegeben:
Tabelle
10: Sandwich-Verfahren. Sequenzielle Beschichtungszeit: 7 Minuten
-
Beispiel 8c:
-
In einem weiteren Experiment wurde
ein Fibrin-Kleber 100 IU mit einem Fibrin-Film 300 IU kombiniert. Der erfindungsgemäße Fibrin-Film
wurde in Übereinstimmung
mit dem in Beispiel 5 erwähnten,
alternativen Verfahren (vgl. Tier Nr. 11), jedoch mit einer 10-minütigen Inkubation
bei –12°C, hergestellt.
Der so erhaltene Fibrin-Film wurde luftgetrocknet und dann rehydratisiert
(gewassert), bevor er wie ein Fibrin-Film, der gemäß Beispielen
1 und 2 hergestellt wurde, verwendet wurde. Wie in Beispiel 8b wurde
der Fibrin-Kleber sequenziell (nacheinander) mit einer Wartedauer
von jeweils 7 Minuten auf das aufgeschürfte Zökum und die eingeschnittene
Peritonealwand aufgetragen.
-
Ein Tier entwickelte eine sehr leichte
Adhäsion.
Die anderen vier Tiere entwickelten überhaupt keine Adhäsionen.
-
Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle 11 zusammengefasst:
Tabelle
11: Sandwich-Verfahren. Sequenzielle Beschichtungszeit: 7 Minuten
-
Beispiel 8d:
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Zusätzlich wurden Experimente durchgeführt, in
denen ein Fibrin-Kleber FK 20 IU in Kombination mit Fibrin-Filmen
von 20 IU bzw. 300 IU verwendet wurde. Die Fibrin-Filme wurden gemäß Beispiel
1 hergestellt, luftgetrocknet und dann vor Gebrauch rehydratisiert
(gewässert).
Wie in Beispiel 8c wurde der Fibrin-Kleber mit einer Wartedauer/Beschichtungszeit
von jeweils 7 Minuten sequenziell (nacheinander) auf das aufgeschürfte Zökum und
die eingeschnittene Peritonealwand aufgebracht.
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Keines der Tiere entwickelte irgendwelche
Adhäsionen.
-
Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle 12 zusammengefasst: Tabelle
12: Sandwich-Verfahren. Sequenzielle Beschichtungszeit: 7 Minuten
-
3. DISKUSSION
-
3.1 Verwendung eines Fibrin-Films
ohne Kontrolle der Hämostase
-
Wie in Beispiel 5b gezeigt, verhindern
Fibrin-Filme, die unter Verwendung von 3 IU und 20 IU hergestellt
wurden, wenn sie in einer unkontrollierten hämostatischen Umgebung verwendet
werden, nicht die Bildung von Adhäsionen. Andererseits verhinderte
der Gebrauch von Fibrin-Filmen mit hoher Thrombinkonzentration vollständig die
Bildung von Adhäsionen,
ohne dass eine Hämostase
durchgeführt
wurde.
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3.2 Verwendung einer Einfachbeschichtung
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Das sequenzielle Beschichten mit
einem Fibrin-Kleber 4 IU (vgl. Beispiel 6a) verhinderte die Bildung von
Adhäsionen überhaupt
nicht, während
ein sequenzielles Beschichten mit einem Fibrin-Kleber FK 100 IU (vgl.
Beispiel 6b) eine 50%ige Verhinderung der Adhäsionsbildung erlaubte. Diese
Ergebnisse legen nahe, dass die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin
auf sowohl Zökum
als auch Peritonealwand nicht vollständig war.
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3.3 Verwendung einer Doppelbeschichtung
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Die simultane Verwendung von FK 4
und FK 100 für
5 Minuten war noch zu kurz, um die Bildung von Adhäsionen zu
verhindern, verringerte aber den Grad und die Zugfestigkeitseigenschaften
der Adhäsionen (vgl.
Beispiel 7a).
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Anstatt die Beschichtungszeit/Wartezeit
für die
simultane Beschichtung zu erhöhen,
um eine vollständige
Fibrinogen-Fibrin-Umwandlung zu erreichen, wurden in Beispiel 7b
die Thrombinkonzentrationen erhöht, um
die Gerinnungszeit zu reduzieren. Tatsächlich wurde bei simultanem
Beschichten mit FG 5 und FK 150 für 5 Minuten die Zahl der Adhäsionen verringert.
-
Das Vorhandensein eines verbliebenen
Fibrinstückes
in den Beispielen 7a und 7b deutet jedoch an, dass das verwendete
Volumen besser kontrolliert hätte
werden müssen.
Es wird auch daraufhin gewiesen, dass die Doppelbeschichtung auf
eine verletzte Fläche
aufgebracht wurde, bei der das fibrinolytische System dramatisch
beeinträchtigt
war. Eine kontrolliertere Zuführung
(durch bessere Handhabung) und ein geringeres Volumen des Fibrin-Klebers
bei einer höheren
Thrombinkonzentration (zum Erzielen einer schnelleren und vollständigeren
Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin) scheinen geeigneter zu sein,
um das Ergebnis zu verbessern.
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3.4 Sandwich-Verfahren
unter Verwendung eines Fibrin-Klebers und eines Fibrin-Films
-
Wie in Tabelle 8 gezeigt, verhinderte
die simultane Verwendung von FK 100 IU/ FF 4 IU/FK 100 IU für 5 Minuten
nicht vollständig
die Bildung von Adhäsionen.
Der Fibrin-Film, der unter Verwendung von 4 IU Thrombin hergestellt
wurde, ist zwar ein stabilisierter Film mit einer vollständigen Umwandlung
von Fibrinogen zu Fibrin, aber es ist den Erfindern bewusst, dass
ein derartiger Fibrin-Film besonders große und geöffnete Poren besitzt. Andererseits
zeigt Tabelle 8, dass auch FK 100 IU, der mit einer Wartezeit von
5 Minuten aufgebracht wurde, nicht vollständig die Entwicklung von Adhäsionen verhinderte.
Es könnte
somit sein, dass FK 100 IU noch nicht die vollständige Fibrinogen-Fibrin-Umwandlung
erreicht hatte und derart mit FF 4 IU interagierte, dass keine vollständige Verhinderung
der Adhäsionsbildung
erreicht wurde.
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Dies könnte grundsätzlich dadurch vermieden werden,
dass entweder die Thrombinkonzentration des verwendeten Fibrin-Klebers
erhöht
wird (zum Erreichen eines schnelleren Gerinnens), oder dass die
sequenzielle Beschichtungszeit (zum Bereitstellen einer längeren Zeitdauer
für die
Umsetzung von Fibrinogen zu Fibrin) erhöht wird, oder dadurch, dass
die Thrombinkonzentration des Fibrin-Films (zum Bilden kleinerer Poren) erhöht wird.
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Wie in Tabelle 9 gezeigt, verhinderte
die Verwendung von FK 100 IU/FF 4 IU/ FK 100 IU die Bildung von
Adhäsionen,
wenn die sequenzielle Beschichtungszeit auf 7 Minuten erhöht wurde.
Gleichfalls wurde die Bildung von Adhäsionen verhindert, indem die
Thrombinkonzentration des Films auf 20 IU erhöht wurde, wie aus Tabelle 10
entnommen werden kann.
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Es erschien interessant, einen Fibrin-Film,
der unter Verwendung einer sehr hohen Thrombinkonzentration (300
IU) hergestellt worden war, zu testen. In diesem Fall (vgl. Tabelle
11) wurde die erste Beschichtung zur Kontrolle der Hämostase
(FK 100 IU) sowie die Art der Beschichtung und die Beschichtungsweise
beibehalten, um diese Situation mit den vorhergehenden Beispielen
zu vergleichen. Dem Durchschnittsfachmann wird auf Grundlage der
vorliegenden Offenbarung bewusst sein (vgl. Tabelle 12), dass verschiedene
Kombinationen eines Fibrin-Films
und eines Fibrin-Klebers zu hervorragenden Ergebnissen bei der Vorbeugung
der Bildung von Adhäsionen
führen
können.
Abschließend
wird noch einmal darauf hingewiesen, dass interessanterweise ein
Fibrin-Film FF 300 IU die Bildung von Adhäsionen vollständig verhinderte,
ohne dass eine Kontrolle der Hämostase
durchgeführt
wurde, während
dies unter Verwendung von FF 20 IU nicht erzielt wurde. Die oben
beschriebenen Experimente deuten an, dass bei dem Sandwich-Verfahren
sogar Fibrin-Filme mit einer Porengröße von über 5 μm verwendet werden können, während die
Fibrin-Filme vorzugsweise eine Porengröße unter 5 μm besitzen sollten, wenn sie
alleine, d. h. ohne Kontrolle der Hämostase, verwendet werden.
