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B e s c h r e i b u n g zu der Patentanmeldung Verfahren zur Herstellung
eines lagerfähigen Blutgerinnungskonzentrats aus menschlichem Plasma Die Erfindung
bezieht sich auf Blutgerinnungskomponenten und betrifft die Herstellung eines gereinigten
Mittels therapeutisch geeigneter Blutgerinnungskomponenten und ein Verfahren zur
Herstellung bzw. Isolierung derartiger Eomponenten aus leicht zugänglichen Substanzen.
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Es wird geschätzt, daß es in den Vereinigten Staaten 100 000 Bälle
angeborener Bluterkrankheit (Hämophilie) gibt.
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Hiervon sind ungefähr 20 000 Fälle von Hämophilie B, wobei das Blut
derartiger Patienten entweder keinerlei Plasma Thromboplastin enthält oder einen
erheblichen Mangel an Plasma-Thromboplastin aufweist.
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Die- Krankheit tritt daher in verschiedenen Schweregraden auf, die
eine Therapie von einmal wöchentlich bis zu ein- oder zweimal im Jahr erfordern.
Die Fälle, bei denen der Faktor,
völlig fehlt, erfordern eine Ersatztherapie
einmal wöchentlich.
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Die Fälle eines teilweisen Mangels erfordern eine Therapie nur wenn
Blutungen auftreten, was so selten wie einmal im Jahr der Fall sein kann. Die Blutungen
in Fällen eines angeborenen teilweisen Mangels werden im allgemeinen mehr durch
eine vorübergehende Anfälligkeit hervorgerufen als allein durch eine Verletzung.
Die intravenöse Injektion einer ausreichend großen Menge von frischem Plasma oder
einer entsprechenden Menge frischen Blutes gleicht diesen Mangel bei einem Patienten,
der an einem derartigen Mangel an Thromboplastin leidet, aus. Die günstige Wirkung
hält oft 2 oder 3 Wochen an, obwohl die mangelnde Gerinnungsfähigkeit, wie durch
in-vitro-Tests des Patienten-Bluts deutlich wird, nur für 2 oder 3 Tage verbessert
wird. Eine derartige Therapie mit frischem Plasma oder frischem Blut ist wirksam,
besitt jedoch einige ernste Nachteile: 1) ist es erforderliche eine große Menge
frisches Plasma leicht zur Verfügung zu haben, 2) muß die Verabreichung des Plasmas
stationär erfolgen, 3) wird eine große Zahl von Patienten gegenüberswiederholten
Blut- oder Plasmainfusionen sensibilisiert, was schließlich zu lebensbedrohlichen
Transfusionsreaktionen führen kann, 4) kann Plasma den Mangel bestenfalls nur teilweise
beheben und 5) ist eine längere Behandlung oder Operation nicht möglich, da die
großen Mengen von Blut oder Plasma, die ererforderlich sind zu einem akuten und
lebensbedrohlichen Ödem führen.
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Verschiedene Forscher haben bemerkt, daß ein Vermischen des Blutes
bestimmter hämophiler Patienten zu einem gegenseitigen Austausch des Mangels an
Gerinnungsfähigkeit jedes Blutes führt. Eine Interpretation dieser Befunde wurde
im laufe der Zeit von Aggeler und Mitarbeitern gegeben (Proc.Soc.Exptl.
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Biol. Med. 79:692-696 (1952) und S.G-. White et al (Blood 8: 101-124
(1953)). Diese Forscher untersuchten einen kranken Patienten mit einer schweren
hamorrhagischen Diathese verbunden
mit einer verlängerten Gerinnungszeit,
die klinisch nicht zu unterscheiden war von klassischer Hämophilie und forderten
die Existenz eines neuen Gerinnungsfaktors.
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Aggeler et al erkannten, daß der neue Faktor eine Vorstufe von Thromboplastin
war, und nannten ihn Plasma-Thromboplastin-Komponente (PTCI. Die Arbeit wurde bestätigt
durch Biggs et al (Brit. Med. J. 2:1378-1382) in England), der ihm den Namen Christmas-Faktor
gab und durch Soulier und Larrieu (New Eng. J.Med. 249:547-553 (1953)) in Frankreich,
der ihn antihämophilischen Faktor B nannte. Dieser Faktor wird jetzt offiziell als
Faktor IX bezeichnet. Die Rolle, die der Faktor IX sowie die Faktoren II, VII und
X spielen, ist bekannt.
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In Zusammenarbeit mit Aggeler et al wurde die erste fraktionierte
PTC-Zubereitung hergestellt (Revue d'Hematologie 9:447-455 (1954». Das PTC wurde
von Bariumsulfat aus einer Lösung von Cohn-Fraktion IV adsorbiert und mit 0,34 m
Natriumcitrat eluiert. Die Ausbeuten waren sehr gering und die in-vivo-Aktivität
nach der Infusion betrug nur ungefähr ein Viertel der aus in-vitro-UNtersuchungen
mit Hilfe eines Prothrombrominverbrauches-Tests veransgesagten Aktivität.
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Später wurde in Zusammenarbeit mit Aggeler et al ein Verfahren entwickelt,
bei dem PTC aus mit EDTA antikoaguliertem Plasma auf Bariumsulfat adsorbiert und
mit einem Natriumchlorid/Natriumcitrat-Puffer eluiert und durch Fraktionierung mit
kaltem Äthanol weiter gereinigt wurde. Dieses Präparat wurde klinisch mit ausgezeichneten
Ergebnissen angewandt (Aggeler, P.M. et al. Trans. 6th Congress, Internat. Soc.
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Hämatol. Grus & Stratton, N.Y. S. 490-497 (1958)). Das Verfahren
wurde später im Detail veröffentlicht und es wurde betont, daß das Verfahren-nie
kommerziell angewandt wurde da die als Nebenprodukte erhaltenen Albumin- und Plasmaprotein-Fraktion
mit möglicherweise gefährlichen Mangen Barium verunreinigt
waren
( Hink, J.H. und Johnson, F.P., The Homophilias, OH. 18, S. 156, herausgegeben von
Brinkhous, Univ.von North Carolina Pross (1964); Bigg6 et al in England fritz J.
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Haematol. 7:349-364 (1961) und Janiak und Soulier (Xhromb.
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et Diath. Haemorr. 8:406-424 (1962)) in Frankreich isolierten den
Faktor IX nach einem ähnlichen Verfahren, wobei sie Tricaliciumsulfat anstelle von
Bariumsulfat verwendeten.
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Es trat jedoch immer eine spontane Bildung von Thrombin ein und es
war immer erforderlich Heparin zuzusetzen, sowohl während als auch nach der Verarbeitung,
um das triöglicherweise gefährlicheThrombin zu neutralisieren.
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Tullis et al (New Eng. J.Med. 273:667-674 (1965) haben eine etwas
ähnliche Plasma-Fraktion hergestellt und untersucht, die sie als "Prothrombin-Komplex"
bezeichnen. Bei dem Tullis-Verfahren wurde mit Ionenaustauscherharz behandeltes
Plasma an DEAE-Cellulose adsorbiert mit Phosphat-RaCl,mit einem zunehmenden NaCl-Gradienten
eluiert, erneut an DEAE-Cellulose adsorbiert und wieder eluiert. Die Elution wurde
mit einem Natriumphosphat-Natriumchlorid-Pufer durchge führt, der mit EDTA stabilisiert
war. Klinische Untersuchungen über den "Prothrombin-Komplex" sind in dieser Veröffentlichung
beschrieben aber andere Daten, die den Komplex charakterisieren stehen nicht zur
VerfUgung.
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Die Hauptmenge an Blut allgemein und die zur Transfusion zur Verfügung
steht, wird durch Behandlung mit einem Citrat Antikoagulans vor der Gerinnung geschützt.
Solches Blut kann nur eine begrenzte Zeit lang verwendet werden. Nach dem Ablauf
dieser Zeit muß dieses Blut verworfen werden oder es kann zur Fraktionierung in
bestimmte wertvolle Komponenten verwendet werden. Natürlich ist die Hauptquelle
für ganzes Blut, das in Plasma zur Fraktionierung umgewandelt wird, zu alt gewordenes
Blut das durch Citrat-Antikoagulation geschützt gewesen ist. Es ist daher wichtig,
daß Verfahren
zur Fraktionierung von Plasma, wie zum arhalt eines
den Faktor IX enthaltenden Konzentrats auch/mit Citrat konserviertes und antikoaguliertes
Blut angewandt werden können.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen
Konzentrats geht daher von Plasma aus, das aus mit Citrat antikoaguliertem Blut
erhalten worden ist.
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Es ist auch wichtig, daß derartige Konzentrate kein Thrombin enthalten,
da- die Injektion von Thrombin bei einem Menschen als sehr gefährlich angesehen
wird. Obwohl es möglich ist, die Thrombin-Aktivität mit Heparin zu neutralisieren
ist es in 1. Linie vorzuziehen, kein Thrombin im Plasma zu haben. Heparin ist in
einem den Faktor IX enthaltenden Konzentrat unerwünscht, da es möglicherweise für
den Patienten ebenfalls gefährlich ist und da es zu Schwierigkeiten bei der Bestimmung
der Koagulationsfaktoren in dem Konzentrat führt. Bei der Verabreichung eines den
Faktor IX enthaltenden Konzentrats ist eine konstante Überwachung des Blutgerinnungszustandes
des Patienten erforderlich und das Vorhandensein von Heparin erschwert nicht nur
dieses Untersuchungesverfahren sondern macht auch die so erhaltenen Ergebnisse unz-uverlässig.
Das erfindungsgemäß hergestellte Konzentrat soll daher sowohl von Thrombin als auch
von Heparin frei sein.
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Es ist Aufgabe der Erfindung ein Konzentrat herzustellen, das die
Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X in Mengenverhältnissen enthält, die im wesentlichen
denjenigen entsprechen, die sich im Plasma finden, aber das frei ist von der aktivierten
Form von Faktor I, wodurch die Gefahr einer zu einer Ausfällung führenden Gerinnung
in den Gefäßen herabgesetzt wird. Das Konzentrat soll ferner frei sein von anti-Komplementwirkung,
die so oft mit Plasmaglobulinen verbunden ist und die die Verabreichung des Produktes
sehr gefährlich machen würde. Das sehr reine Produkt
wird erhalten
durch selektive Adsorption der aktiven Komponenten und weitere Selektivittt durch
fraktionierte Elution.
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Die Erfindung betrifft ein lyophilisiertes lagerfähiges Konzentrat
aus menschlichem Plasma zur Bekämpfung bzw.
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Regelung des Blutens bei Hämophilie und anderen Fällen von Mangel
an einem oder mehreren der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X, das frei ist von
Heparin, Thrombin, der aktivierten Form von Faktor X, Depressoraktivität und anti-Komplementaktivität
und die Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X in nicht aktivierter Form enthält,
in Anteilen, die im wesentlichen die gleichen sind wie im meschlichen Plasma und
daß in dem zur Infusion aufgeschlämmten Konzentrat eine Wirksamkeit des Faktors
Ix (Faktor lx reconstituted potency) von mindestens ungefähr 2000 % derjenigen von
normalem Plasma besitzt und eine spezifische Faktor IX-Aktivität von mindestens
ungefähr 0,5 klinischen Einheiten pro Milligramm Protein und eine biologische Halbwertzeit
des Faktors IX nach der Infusion von ungefähr 20 bis 50 h.
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Dieses KOnzentrat wird hergestellt, indem man nichtmodifiziertes mit
Citrat stabilisiertes menschliches Plasma oder eine Fraktion davon, enthaltend die
gesamten Koagulationsfaktoren II, VII, IX und X auf einem Ionenaustauscherharz aufbringt,
das schwach basische Gruppen enthält, die eine Anziehungskraft gegenüber Ionen der
entgegengesetzten Polarität besitzen,und die Koagulationskouiponenten des Plasmas
daran adsorbieren, das Harz selektiv mit einer Lösung eines flüchtigen Puffers mit
einem pH-Wert von ungefähr 7,3 bis ungefähr 8,2 und zunehmender Molarität eluiert,
die Eluatfraktion, die die Koagulationsfaktoren enthält abtrennt, die abgetrennte
Eluatfraktion einfriert und den flüchtigen Puffer daraus durch Lyophilisieren der
gefrorenen Fraktion entfernt.
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Obwohl ganzes mit Citrat behandeltes menschliches Plasma oder irgendeine
Fraktion davon, die alle die Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X enthält, als Ausgangsmaterial
für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann, ist das bevorzugte Ausgangsmaterial
die überstehende Lösung I (Supernatant I) nach dem Cohn-Verfahren 6 (siehe Kirk
& Othmer, "Encyclopedia of Chem. Tch." Bd. 2, S. 10-13 (1948), Interscience
Enc., Inc., N.Y. Cohn et al, J.Am.
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Chem.Soc., 68,, 459 (1946); Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
angewandten Ionenaustauscherharze sind die bekannten in Wasser oder Puffer dispergierbaren
Ionenaustauscherharze mit schwach basischen Gruppein, die eine Anziehungskraft gegenüber
Ionen entgegengesetzter Polarität ausüben. Beispiele sind Cellulose-und Polysaccharidionenaustauscherharze
mit derartigen Gruppen, wie die niederen-Alkylamino-niederen-Alkylcellulosen Diäthylaminoäthyl-(DEAE)-Cellulose
und Triäthylaminoäthyl-(TEAE)-Cellulose und Diäthylaminoäthyl-Sephadex. Derartige
Harze besitzen im allgemeinen eine verhältnismäßig geringe adsorptive Kapazität
z.B. von ungefähr 1,0 bis 5 mÄq /g.
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Z.B. besitzt DEAE-Cellulose eine Kapazität von 1,0 mÄq /g (Trockengewicht);
DEAE-Sephadex 3,5 + 0,5 mÄq /g und TEAE-Sephadex 0,55 bis 0,75 mÄq /g. Ein anderes
derartiges Harz ist Whatman DEAE-Cellulose-52 feinstkörnig (mikrogranular) (W &
R Balston Ltd. Hardstone, Kent, England).
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Das bevorzugte Ionenaustauscherharz ist DEAE-Sephadex, d.h.
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ein Ionenaustauscherharz bestehend im wesentlichen aus einer vernetzten
Dextrankette mit Diäthylaminoäthylgruppen, die an die Glukoseeinheiten der Polysaccharidketten
gebunden sind (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, N.J.).
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Eine Lösung des Ausgangsplasmas wird auf das ausgewählte Ionenaustauscherharz
aufgebracht, wodurch die Koagulationsfaktoren
II, VII, IX und X
zusammen mit einer kleinen Fraktion der anderen Plasmaproteine darauf adsorbiert
werden. Die nichtadsorbierten Proteine können gesammelt und wieder zu dem Plasmafraktionierungsverfahren
gegeben werden, wodurch kein Ausgangsplasma verloren geht.
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Das Harz wird dann mit einer flüchtigen Pufferlösung einer verhältnismäßig
niederen Molarität z.B. bis zu 0,3 m gewaschen bis das Harz von nichtadsorbierten
Proteinen freigewaschen ist. Das Harz wird fraktioniert mit einer Lösung eines flüchtigen
Puffers zunehmender polarität und einem vorzußsweise im wesentlichen konstanten
pR-Wert von 7,3 bis 8,2 eluiert. Der erfindungsgemäße Gerinnungskomplex wird bei
einer Polarität von 0,3 m bis 0,75 m eluiert.
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Der Puffer wird dann durch Gefriertrocknen aus dem Eluat entfernt.
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Das Verhältnis von Ionenaustauscherharz z.B. DEAE-Sephadex zu dem
Volumen des Ausgangsplasmas z.B. Supernatant I, kann in einem weiten Bereich variieren.
Die Anwendung eines hohen Verhältnisses von Ionenaustauscherharz führt zu höheren
Ausbeuten an dem Gerinnungskomplex mit einer geringeren Reinheit und einem größeren
Verlust an anderen Plasmaproteinen, die normalerweise in den folgenden Schritten
zurückgewonnen werden können. Die Anwendung eines niedrigeren Verhältnisses von
Ionenaustauscherharz führt zu einer geringeren Ausbeute an Produkt mit einer höheren
Reinheit.
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Obwohl DEAE Sephadex das bevorzugte anionische lonenaustauscherharz
ist, können offensichtlich auch andere Adsorbentien mit ähnlichen Adorptionscharakteristika
angewandt werden.
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Der Elutionsschritt mit flüchtigem Puffer mit einer steigenden Pufferkonzentration
ist extrem wichtig. Ammoniumbicarbonat ist bevorzugt aber andere flüchtigte Puffer,
z.B. Ammoniumacetat
bei ungefähr dem gleichen pH-Wert können ebenfalls
angewandt werden. Die einzigartige Selektivität, die durch die Elution mit einem
zunehmendem Salzgradienten erzielt wird1 zusammen mit der Flüchtigkeit des Puffers
sind kritisch für das erfindungsgemäße Verfahren und zwar aus den folgenden Gründen:
1.) Der Puffer, der ein flüchtiges Salz ist, wird vollständig aus dem getrockneten
Produkt entfernt, wodurch man eine vollständig salzfreie Proteinzubereitung erhält.
Das hat den Vorteil, daß das entstehende klinische Präparat leicht isotonisch gemacht
werden kann. Es ist auch wichtig für die Stabilität des Produktes.
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2.) Durch die Gewinnung eines salzfreien Proteins wird die Notwendigkeit
aufwendiger Verfahren zur Salzentfernung wie Dialyse , Gelfiltration, Ultrafiltration
usw. vermieden.
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So wird eine technisch durchführbare Arbeitsweise im großen Maßstab
erleichtert.
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3.) Es hat sich gezeigt, daß Ammoniumdicarbonat bei der Elution der
gebundenen Proteine zu einer Selektivität führt, die die leichteS4rennung von unerwünschten
Verunreinigungen wie Ceruloplasmin erlaubt. Dadurch werden die gewünschten Komponenten
in einer höheren Reinheit eluiert als sie mit üblichen Elutionsiösungen erreicht
werden kann.
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Ein pH-Bereich von ungefähr 7 bis 7,8 für die Elutionsschritte ist
bevorzugt. Obwohl höhere pH-Werte bis zu 8,2 angewandt werden können, tragen diese
leicht zu der Instabilität des Produktes bei.
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Die oben angegebenen Bedingungen machen weitere Fraktionierungen möglich.
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Die Stufen des Lösens des getrockneten Proteins in der
bevorzugten
Konzentration,die Art des Elektrolytpuffers und die Filtration sind alles Standardverfahrensstufen,
die von dem Fachmann entsprechend variiert werden können.
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Das bei dem oben beschriebenen Verfahren erhaltene Produkt ist ein
lyophilisiertes Produkt enthaltend die menschlichen Gerinnungsfaktoren II, VII,
IX und X in einem geeigneten Elektrolytpuffer, z. 3. Natriumchlorid-Natriumcitrat-Puffer.
Das Produkt ist frei von Thrombin, Thromboplastinaktivität, anti-Komplementaktivität
und Depressoraktivität.
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Es besitzt eine spezifische Aktivität von mindestens ungefähr 0,5
Faktor-IX-Einheiten pro mg Protein. Eine Faktor-IX-Einheit ist definiert als die
Menge an Faktor-IX-Aktivität, die in einem Kubikzentimeter frischem durchschnittlichen
Plasma enthalten ist. Die Bestimmungsergebnisse sind angegeben in Werten eines lyophilisierten
Vergleichsstandards, der 0,7 Einheiten pro cm3 nach der Wiederaufschlämmung enthält.
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Untersuchunen In-vitro-Untersuchung der Baktor-IX-Aktivität Die Untersuchung
beruht auf dem Verfahren der teilweisen Thromboplastinzeit nach Langdell, Wagner
und Brinkhous (J.Lab. Clin. Med. 41:637-647 (1953)) und dem Verfahren der Kaolingerinnungszeit
nach Proctor und Rapaport (Am. J.
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Clin. Path. 36:212-219 (1961)). Der Thrombozytenfaktor 3 wurde durch
eine Cephalinsuspension geliefert. Die maximale Oberflächenkontaktaktivierung wurde
mit einem Celitpulver erreicht. Alle übrigen Gerinnungsfaktoren (außer Faktor IX)
wurden durch ein Substrat geliefert, umfasserü Plasma von einem Patienten, der stark
an einem Mangel an Faktor IX litt, vermischt mit an Bariumsulfat adsorbiertem Rinderplasma.
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Die quantitatieBestimmung einer unbekannten Probe wurde durchgeführt
durch einen Vergleich der Gerinnungszeit bei
dem Versuch mit derjenigen,
die durch Verdünnung eines normalen Standards erzielt wurde Reagentien 1. Calciumchlorid-Lösung
0,05 m CaCl2 2, Veronalpuffer 2,94 g Natriumbarbital 3,67 g Natriumchlorid 105 cm3
0,1 n Salzsaure destilliertes Wasser auf 500 cm3 3. Celit. Analytische Filterhilfe,
Johns Manville.
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4. Cephalin-Suspension hergestellt aus Kaninchenhirn-Thromboplastin
nach Bell und Alton (Nature 174:880-881 (1954)) 5. Cephalin-Celit-Reagens Gleiche
Volumina von Cephalin-Suspension verdünnt 1:50 in Veronalpuffer bei pH 7,3 t 0,1
und Celit 1,0 g suspendiert in 5 cm 0,9 % NaCl-Lösung wurden miteinander vermischt.
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6. Verdünnungsflüss igke it -I (DF I) 50 cm3 0,1 m Natriumcitrat 300
cm3 0,15 m Natriumchlorid 7. Verdünnungsflüssigkeit II (DF II) 20 cm³ Veronalpuffer
60 cm30,15 m NaCl 8. Mit Bariumsulfat behandeltes Rinderplasma Mit Oxalat behandeltes
Rinderplasma wurde an 100 mg/cm3 Bariumsulfat adsorbiert und in kleinen Anteilen
bei -20°C
gelagert.
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9. Substratplasma 1 Teil mit Citrat behandeltes Plasma von einem Patienten,
der an einem starken Mangel an Faktor IX litt (in kleinen Mengen bei -200C aufbewahrt)
wurde mit 3 Teilen mit Bariumsulfat behandeltem Rinderplasma vermischt.
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10. Vergleichsstandard Lyophilisierter Plasmavergleichsstandard Nr.
788-27.
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Bestimmte Wirksamkeit = 0,7 Einheiten pro CH³ Das Cephalin-Celit-Reagens
wurde vor dem Gebrauch sorgfältig resuspendiert. Die Substratreagentien wurden unter
konstantem Rühren im Wasserbad bei 37°C aufgetaut, dann in einem Verhältnis von
1 Teil Patientenplasma zu 3 Teilen mit BaSO4 behandeltem Rinderplasma vermischt.
Es wurde dann zusammen mit allen andern Reagentien außer der Calciumlösung, die
in ein wasserbad von 370C gestellt wurde, in einem Bad mit schmelzendem Eis gehalten.
Ein Standardvergleichsplasma wurde 1:10, 1:50, 1:100 usw. mit den Verdünnungsflüssigkeiten
I und II nach dem Verfahren von Eis ort et al (J.Lab. Clin.t4ed. 46:89-97 (1955))
verdünnt. Die unbekannten Substanzen wurden in geeigneten Verdünnungen untersucht.
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1/10 cm³ des resuspendierten Cephalin-Celit-Reagenses, 0,1 cm³ Substratplasma
und 0,1 cm3 verdünnte unbekannte Substanz oder Standardplasma wurden in ein Glasröhrchen
in dem 37°C Wasserbad gegeben und eine Stoppuhr in Gang gesetzt. Das Gemisch wurde
während der 3 min Inkubationszeit leicht geschüttelt um das Celit in Suspension
zu halten. Am Ende der 3 min wurden 0,1 cm3 der CaCl2-Lösung zugegeben und eine
zweite Stoppuhr in Gang gesetzt. Das Röhrchen wurde bis zum Eintreten der Koagulation
leicht geschüttelt. Alle Versuche wurden zweimal durchgeführt und das Mittel der
Gerinnungszeiten genommen.
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Das Standard-Vergleichsplasma wurde mit jeder Versuchsreihe der unbekannten
Substanzen untersucht. Es wurde eine graphische Darstellung auf doppelt logarithmischem
Papier angefertigt, wobei die Gerinnungszeit auf der Ordinate und die Plasmakonzentrationen
auf der Abszisse aufgetragen wurden. Die Gerinnungszeiten der verschiedenen Verdünnungen
des Vergleichsplasmas wurden aufgetragen und die beste mögliche Gerade durch diese
Punkte gezogen. Die Konzentrationen an Aktor IX der unbekannten Proben wurden in
Beziehung auf dieses Diagramm bestimmt. Aus den für die verschiedenen Konzentrationen
der unbekannten Probe erhaltenen Werten wurde das Mittel genommen.
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In-vitro-Bestimmung des Faktors II (Prothrombin) Die Bestimmung des
Faktors II war eine typische Owren Einstufen-Bestimmung. Die Ergebnisse sind angegeben
in Einheiten pro cm3, wobei eine Prothrombineinheit definiert ist als die Prothrombinaktivität
die in einem cm eines gefrorenen Standardplasmas enthalten ist.
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In-vitro-Bestimmung von Thromboplastin und Thrombin Thromboplastin
und Thrombin wurden gleichzeitig durch eine typtische Untersuchung der Wiederverkalkungszeit
( recalcification time test) bestimmt. Die Gerinnungszeit in sec wurde für die Probe
und einen Vergleich folgendermaßen verglichen: Probe 0,1 cm3 Probe (bei verschiedenen
Verdünnungen) 0,1 cmmit Citrat behandeltes Plasma 0,1 cm3 0,05 m CaCl2 Vergleich
0,1 cm3 0,15 m NaCl 0,1 cm3 mit Citrat behandeltes Plasma 0,1 cm 0,05 mCaCl2
Die
"Probe" wurde bei verschiedenen Verdünnungen mit destilliertem Wasser untersucht,
da hohe Konzentrationen von neutralen Elektrolyten, die Gerinnung aufgrund von Thromboplastin
oder Thrombin hemmen.
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Bestimmung der Anti-Komplementaktivität Die anti-Kompleentbestimmung
wurde folgendermaßen durchgeführt: Reagentien 1. CF Salzlösung Ausgangs-Ca-I9g-Lösung
10 g CaCl2 4 g MgC12
auf 100 cm3 mit destilliertem Wasser 1 cm3 Ausgangslösung wurde zu 1 1 0,85 % NaCl-Lösung
gegeben.
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2. Alsever's-Lösung
20,5 g Dextrose |
4,2 g NaOl | auf 1 1 mit destilliertem Wasser |
8,0 g Na-Citrat |
0,55 g Zitronensäure; |
3. Rote Blutzellen vom Schaf (S-RBC) Ungefähr 20 cm3 Zellen wurden in 40 cm3 Alseverjs-Lösung
gezogen. Zur Untersuchung wurde ein Teil der Zellen dreimal mit normaler Salzlösung
gewaschen und dann wurde eine 2 Wige Suspension mit CF-Salzlösung als Verdünnungsmittel
hergestellt.
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4. Hämolysin Eine Ausgangslösung 1 : 100 wurde hergestellt unter Verwendung
von Phenol als Konservierungsmittel.
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5. Komplement Nach Vorschrift mit Verdünnungsmittel wieder aufgeschlämmt.
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6. Sensibilisierte RBC Vor der Verwendung 15-30 min auf 3700 erwärmt.
2 Einheiten pro 0,2 cm³ vol. Hämolysin} |
2 Vo S-RBC gleiches Volumen |
Titration 1. Hämolysin Doppelte Verdünnungen durch 1:32 der Ausgangslösung 1:100-Lösung
unter Verwendung von CF-Salzlösung als Verdünnungsmittel.
0,2 cm3 Hämolysinverdünnungen |
0,2 cm³ Komplement (1:30 mit CF-Salzlösung), |
0,2 cm³ 2% RBC inkubiert 30 min |
0,5 cm³ CF-Salzlösung bei 37°C |
Höchste Verdünnung von Hämolysin, die eine vollständige Lysis ergibt = 1 Einheit.
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Bei der Bestimmung angewandte Menge = 2 Einheiten pro 0,2 cm3/Vol
Vergleich (inkubiert 30 min bei 37°C) 1. 0,2 cm3 Hämolysin (nicht verdünnt) 0,2
cm3 2 % RBC 0,7 cm³ OF-Salzlösung 2. 0,2 cm³ Komplement (1:30) alle Vergleiche sollten
0,2 cm³ RBC negativ sein (keine Lysis) 0,7 cm³ CF-SAlzlösung 3. 0,2 cm3 2 % RBC
0,9 cm3 CF-Salzlösung 2. Komplement Röhrchennummer 1 2 3 4 5 6 7 8 Komplement 1:30
(cm3) 0,12 0,11 0,10 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 CP-Salzlösung (cm3) 0,48 0,49 0,50
0,51 0,52 0,53 0,54 0,55
Inkubation der Verdünnungen 30 min bei
3700 Zugabe von jeweils 0,4 cm3 30 @@ @@ 37 8 Inkubation 30 min bei 37°C Mindestmenge
C', die eine vollständige Lysis ergibt = "exacte" Einheit.
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Nachst höhere Menge = "volle" Einheit Bei der Bestimmung angewandte
Menge = 2 "volle" Einheiten pro 0,2 cm3 vol.
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Vergleich (inkubiert 30 min bei 37°C) 0,4 cm³ sensibiliserte RBC sollte
negativ sein 0,6 cm³ CF-Salzlösung (keine Lysis) Untersuchung 0,2 cm3 Probe (doppelte
Verdünnungen mit CF-Salzlösung als Verdünnungsmittel) 0,2 cm³ CF-Salzlösung 0,2
cm3 C' (2 Einheiten) Die Verdünnungen wurde 1 h bei 3700 inkubiert; 0,4 cm3 sensibilisierte
RBC wurden jeweils zugegeben.
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Inkubiert 30 min bei 37°C Endpunkt = stärkst verdünnte Probe, die
mindestens 50 % lysis zeigt.
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Vergleiche (inkubiert 30 min bei 3700) 1.)0,2 cm Probe (niedrigste
Verdünnung) 0,4 cm³ sensibilisierte sollte negativ sein 0,4 cm³ CF-Slazlösung (keine
Lysis) 2.)o,2 cm3 C' (2 Einheiten) 0,4 cm³ sensibilisiert RBC sollte negativ sein
0,4 cm3 CF-Salzlösung (keine Lysis) 3 3.90,4 cm³ sensibilisierte RBC sollte negativ
sein 0,6 cm 3 CF-Salzlösung (keine Lysis)
Depressor-Aktivität Die
Depressor-Aktivität wurde nach dem Depressorsubstanztest bestimmt, wie er in der
United States Pharmacopeia XVIII, Seite 843,-beschrieben ist.
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Die Eigenschaften verschiedener Ansätze des erfindungsgemäß hergestellten
Konzentrats der Gerinnungsfaktoren sind in Tabelle I angegeben.
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Tabelle I
Tabelle I Versuch *Ergebnisse Ausatz Nr.
A B C D Faktor IX 480 Einheiten 540 Einheiten 500 Einheiten 550 Einheiten Faktor
II 700 " 640 " 510 " 370 " Faktor VII 380 " 500 " 480 " 570 " Faktor X 1100 " 500
" 470 " 570 " Protein 962 mg 606 mg 484 mg 340 mg spezifische Aktivität 0,5 0,89
1,03 1,6 pH 6,9 6,8 6,8 7,2 Na+ 242 mÄq/l 237 mÄq/l 240 mÄq/l 237 mÄq/l Cl- 90 "
94 " 88 " 87,1 " Citrat (C6H5O7)- 51 " 48 " 51 " 50,2 " Thrombin-Thromboplastin
keines keines keines keines Depressor-Substanzen genügt den genügt den genügt den
genügt den Anforderungen Anforderungen Anforderungen Anforderungen (pass) (pass)
(pass) (pass) * angegeben als Werte pro Glas oder pro Volumeneinheit bei Wiederaufschlämmung
mit 20 cm³.
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Ein Ansatz des Gerinnungshomplexes wurde nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren hergestellt. Die Versuche zeigten, daß die Probe keine Depressoraktivität,Ghrombin
und Thromboplastin und anti-Komplement-Aktivität besaß. Der Ansatz wurde lyophilisiert
und bei Raumtemperatur gelagert und nach 3 und 6 Monaten erneut untersucht. Es zeigte
sich keine Depressorw aktivität Thrombin ode Thromboplastin.
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Um die Stabilität des erfindungsgemäßen Komplexes zu zeigen, wurde
eine große Anzahl von Flaschen von jeder von drei Proben bei drei verschiedenen
Temperaturen gelagert und nach entsprechenden Zeiträumen untersucht. Die Stabilitätsdaten
der Probe PR 2240 (1,8 % Feuchtigkeit) nach dem Aufschlämmen jeder Flasche mit 20
cm3 Wasser sind als Beispiele in Tabelle II angegeben.
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Tabelle II Zeit Faktor-IX-Einheiten /cm³ 51c Raumtemperatur 4000
anfangs 33,6 33,6 33;6 nach 5 Wochen --- --- 34,6 nach 9 Wochen --- 35,4 29,0 nach
3 Monaten 28,0 nach 3-1/2 Monaten --- --- 28,7 nach 4 Monaten 34,2 32,6 32,6 nach
5 Monaten --- --- 21,8 nach 6 Monaten 35,0-Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen
Komplexes wurde gezeigt, indem man einen Teil eines Ansatzes, der erfindungsgemäß
hergestellt worden war aufschlämmte und die Gerinnungsfaktoren bestimmte. Die Ergebnisse
als Prozent bezogen auf normales Plasma sind in Tabelle III angegeben.
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Tabelle III II 2550 % VII 2400 ffi IX 2500 % X 2350 i0 (Spezifische
Aktivität des Faktors IX 1,03 Einheiten pro mg Protein).
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Der erfindungsgemäße Komplex wurde untersucht und entsprach allen
Anforderungen dieser USP XVII-Untersuchung für Depressorsubstanzen. Die Ergebnisse
sind in Tabelle IV angegeben.
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Tabelle IV Dosis Änderung des mittleren arteriellen Drucks 0,05 mcg/kg
Histamin (freie Base)i.v. -35 0,10 mcg/kg Histamin (freie Base)i.v. -50 0,15 mcg/kg
Histamin (freie Base)i.v. -55 0,10 mcg/kg Histamin (freie Base)i.v. -50 0,10 mcg/kg
Histamin (freie Base)i.v. -50 erf.gem.Probe 0,2cm3/kg i.v. - 5 0,10 mcg/kg Histamin
(freie Base)i.v. -40 erf.gem. Probe 0,2cn'/kg i.v. - 5 0,10 mcg/kg Histamin (freie
Base) i.v. -40 (erf.gem.Probe verdünnt auf 3,0cm³) Die oben beschriebene Thromboplastin-Thrombin-Bestimmung
ergab die folgenden Ergebnisse wenn eine Probe des erfindungsgemäßen Komplexes untersucht
wurde:
Tabelle V untersuchte Probe Gerinnungszeit (sec) Salzlösung
(Vergleich) 135 erf.gem. Probe unverdünnt 180 erf. gem. Probe verdünnt 1:3 - 135
erf. gem. Probe verdünnt 1:10 135 Die Tatsache, daß die erfindungsgemäße Probe die
Gerinnungszeit von menschlichem Plasma nicht verstärkte liegt an der Abwesenheit
von Thrombin-Thromboplastin-Substanzen und der aktivierten Form des Faktors X.
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Klinische Ergebnisse Versuche an Menschen wurden mit dem erfindungsgemäßen
Koagulationskomplex durchgeführt an Patienten, die einen Mangel an Faktor IX besaßen
und mit Patienten, die einen Mangel an Faktor VII zeigten. Die Gerinnungsdaten von
einer dieser Untersuchungen an einem Patientenvmit einem Mangel an Faktor IX sind
in den Tabellen VI und VII angegeben. 48 h nach der Verabreichung des erfindungsgemäßen
Produktes enthaltend 2030 Einheiten Faktor IX traten keine Anomalien im Blutdruck,
Puls, Temperatur und Atmung auf.
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Außerdem trat bei zweimaliger Verabreichung des erfindungsgemäßen
Koaguiationskomplexes an den gleichen Patienten im Abstand von 13 Tagen keine Sensibilisierung
oder Antigenbildung auf.
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Tabelle VI
Tabelle VI Dosis: 290 cm³ (2030 Einheiten)
begonnen 11:10 beendet 12:25 Nr. Tag Uhr- verstrichene Gerinnungs-Faktoren zeit
Zeit h min II VII IX X 0 1 11:00 0 0 75 64 1,0 95 1 12:45 0 20 144 165 54,2 200
2 13:10 0 45 136 122 49,2 213
vorausgesagt Faktor IX = 56,4 ffi 3 14:20 1 55 123 83 46,0 193 4 15:30 3 5 105 87
44,5 170 5 16:25 4 00 105 103 48,5 176 6 17:30 5 5 110 75 39,2 185 7 20:05 7 40
107 75 43,5 183 8 22:30 10 5 106 62 29,0 183 9 2 2:00 13 35 94 48 24,3 125 10 8:35
20 10 100 40 13,4 148 11 11:20 22 55 100 33 13,1 151 12 14:30 26 5 79 34 10,4 147
13 16:35 28 10 101 35 10,8 132 14 3 10:05 45 40 99 55 9,1 139 15 13:00 48 35 101
51 9,6 138 16 16:30 52 5 106 58 9,2 141 17 4 10:15 69 50 95 37 7,0 117 18 5 11:00
94 35 92 39 5,9 121 19 6 11:15 118 50 85 42 3,35 97 20 7 14:10 143 45 80 47 2,9
98 Die Kurve, die das Verschwinden des Faktors IX nach der Infusion anzeigt ist
typisch zweiphasisch. T 1/2 der 1.
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Komponente ist 7-1/2 h und T 1/2 der 2. Komponente ist 47 h. Die Halbwertzeit
des Faktors IX nach der Infusion un ee h scheint bei verschiedenen Patienten von/20
h bis ungefähr
50 h zu variieren.
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Zuverlässige Koagulationsbestimmungen wurden für die 4 Koagulationskomponenten
nach der Verabreichung 8 verschiedener Proben an jeden von 2 oder mehr Patienten
gesammelt. Bei solchen Patienten, die als etwa normal angesehen werden konnten (einschließlich
Bluterpatienten aber ausschließlich solchen, die Fibrinolyse zeigten oder stark
verschobene Plasmavolumina), führte die Verabreichung von 1 Einheit pro 454 g Körpergewicht
zu einer ungefähr 4 Eigen Zunahme der Faktoren II,VII,IX und X . Die Zunahme des
Faktors X nach der Infusion ist im allgemeinen etwas höher als diejenige der anderen
3 Faktoren.
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Das erfindungsgemäße Produkt wurde von 14 Klinkern bei der Behandlung
von Notfallsituationen bei meLr als 65 Patienten angewandt. Das waren Patienten,
die entweder einen permanenten angeborenen Mangel an einem der Faktoren VII oder
IX oder X besaßen oder einen zeitlich erworbenen Mangel an allen 4 Faktoren (II,
VII, IX und X) und die entweder sehr stark auf Plasma reagierten oder t--as erforderliche
Volumen Plasma nicht vertragen konnten und die entweder an starken Blutungen litten
oder bei denen während einer größeren Notoperation ein Schutz erforderlich war.
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Die Art der Verabreichung ist für den Mediziner leicht ersichtlich.
Ganz allgemein wird das lyophilisierte Produkt mit Wasser zur Injektion aufgeschlämmt,
um eine isotonische Lösung herzustellen, die intravenös an den Patienten verabreicht
wird.
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Beispiel Supernatant I der Cohn-Methode 6 aus mit Citrat behandeltem
Standardplasma wurde auf frisch äquilibriertes DEAE Sephadex in einer Menge von
10 g (liaßggwicht) pro 1 Supernatant I bei
0 bis -3 0C adsorbiert.
Die behandelnde überstehende Lösung (Supernatant I) wurde wieder zu dem Plasmafraktionierungs-Verfahren
zur Ausfällung der Cohn-Fraktionen II und III zurückgegeben.
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Das DENKE Sephadexharz wurde mit 0,2 m Ammoniumbicarbonat bei einem
pH-Wert von 7,0 bis 7,8 gewaschen bis kein weiteres Protein eluiert wurde und die
Waschlösungen verworfen. Dann wurde das DEAE Sephadexharz mit O,3 m Ammoniumbicarbonat
bei pH 7,0 bis 7,8 gewaschen bis kein weiteres Protein eluiert wurde. Blaues Ceruloplasmin
wurde durch diese Waschung eluiert, das verworfen wurde. Als nächstes wurde das
1)EIE Sephadexharz mit O,75 m Ammoniumbicarbonat mit einem pH-Wert von 7,6 bis 7,8
eluiert bis die Faktor-IX-Fralction zusammen mit den Faktoren II, VII und X eluiert
war. Dieses Eluat wurde gefroren und lyophilisiert.
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Das Ammoniumbicarbonat sublimierte, wobei ein salzfreies Proteinpulver
entsprechend ungefähr 350 mg/l Supernatant I zurückblieb. Es wurde auf den Gehalt
an Faktor IX untersucht und in einem feuchtigkeitsgeschützten Behälter bei 50C oder
darunter aufbewahrt.
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Dieses Produkt kann folgendermaßen in ein trockenes Gemischt enthaltend
einen Elektrolytpuffer, das zur intravenösen Verabreichung geeignet ist, umgewandelt
werden: Das lyophilisierte Proteinpulver wird in einem Verdünnungsmittel aus einer
0,05 m Natriumcitrat- und 0,088 m Natriumchloridlösung bis zu eienr Endkonzentration
von 25 Einheiten Faktor IX pro cm³ gelöst. beim Lösen des Pulvers wird der pH-Wert
durch Zugabe von 1 n Natriumhydroxid auf 7,0 bis 7,5 gehalten. Der pH-Wert wird
schließlich auf 7,3 + 0,1 eingestellt. Die Lösung wird durch Filtration durch ein
steriles 0,2/um poröses Membranfilter sterilisiert und aseptisch in üblichen Anteilen
in sterile Flaschen gefüllt, getrocknet und lyophilisiert und bei 5 0C aufbewahrt.
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Zur Verabreichung an Menschen wird der Inhalt einer der oben angegebenen
Flaschen aseptisch in Wasser zur Injektion gelöst.
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Wahlweise kann das Produkt des Sublimationsschrittes steril eingefüllt
und zu einem salzfreien Produkt lyophilisiert erden.
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in diesem Falle wird mit einem geeigneten isotonischen Verdünnungsmittel
vor der Verabreichung an Menschen aufgeschlämmt.
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Patentansnrüche