CH630804A5 - Verfahren zur verhinderung des abbaus der biochemischen aktivitaet von antihaemophilie-globulin. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verhinderung des Abbaus der biochemischen Aktivität von Antihämo-philie-Globulin, das aus Blutplasmafraktionen erhalten wird.

Die Blutgerinnung ist ein komplizierter biochemischer Vorgang, der die Entwicklung verschiedener Substanzen ein-schliesst, die im normalen Vollblut enthalten sind. Es ist bekannt, dass bei einigen Individuen bestimmte Faktoren, die für den Mechanismus der Blutgerinnung erforderlich sind, fehlen oder erheblich verringert sind. So ist es bekannt, dass die klassische Form der Hämophilie (Hemophilia A) eine Mangelkrankheit ist, die durch das Fehlen von AHG (Faktor VIII) verursacht wird. Bei Individuen, die an der angeborenen Hämophilie B (Christmas disease) leiden, fehlt im Blut die Plasmathromboplastinkomponente (PTC, Faktor IX, Christmas factor). Verschiedene andere Faktoren, die für den Mechanismus der Blutgerinnung wichtig sind, sind die Faktoren II, VII und X (Prothrombin, Prokonvertin und Stuart-Prower' Faktor).

Bis vor wenigen Jahren bestand die Behandlung von Hämophilen darin, den Patienten Vollblut oder Blutplasma zu infundieren. Die ärztliche Kunst schreibt jedoch vor, dass -wenn möglich - den Patienten nur solche Blutbestandteile zugeführt werden, die ihm fehlen. Wegen der universellen Knappheit von Blut ist es auch vorteilhaft, das Blut in seine verschiedenen Bestandteile aufzutrennen, die dann je nach Bedarf für die Behandlung verschiedener Patienten verwendet werden können.

Es sind verschiedene Methoden der Auftrennung von Blut und Blutplasma in die verschiedenen Bestandteile oder Konzentrate bekannt. Die Arbeit von Edwin Cohn und seinen Mitarbeitern an der Harvard-Universität zur Entwicklung der Alkoholfraktionierungsmethode ist besonders erwähnenswert. Die kürzlich erteilten U.S. Patente 3 631 018 und 3 652 530 beschreiben verbesserte Verfahren zur Isolierung eines hochgereinigten Konzentrats von AHG.

Aufgrund der Untersuchungen von Wagner, Thelin, Brinkhous und anderen über die Herstellung von AHG wurde festgestellt, dass das Vorhandensein von Prothrombin (Faktor II) und dem damit verbundenen Komplex von Faktoren für die Stabilität des Faktors VIII (=AHG) schädlich ist, sowohl langfristig als auch kurzfristig. Die übliche Methode zur Beseitigung dieses Problems bestand darin, den Prothrombinkompiex mit verschiedenen Mitteln, beispielsweise Aluminiumhydroxyd, Magnesiumhydroxyd, Barium-carbonat, Bariumsulfat, «Rivanol» (6,9-Diamino-2-äthoxy-acridinlactat), IRC-50-Ionenaustauscherharz (XE-64-Rivanol) oder Glycinäthylester, zu entfernen.

Während die vorgehend erwähnten Mittel im allgemeinen wirksam sind, sind verschiedene schwere Nachteile ihrer klinischen Anwendung bekanntgeworden. Durch die Verwendung dieser Mittel wird tatsächlich der Faktor VIII stabilisiert, da die Entfernung von Prothrombin die Bildung von Thrombin verhindert. Thrombin ist hauptsächlich für die Zersetzung des Faktors VIII verantwortlich, wie von Kisker, Thromb. Diath. Haemorrhagica, Band 17, S. 381 (1967) und Penick und Brinkhous, Amer. J. Med. Sciences, Band 232, S. 434 (1956) berichtet wurde. Daher verwendet die Originalarbeit von Wagner et al. bei der Herstellung des Faktors VIII mit aliphatischen Aminosäuren Aluminiumhydroxyd um (1) die Zersetzung des Faktors VIII bei der Durchführung von Konzentrationsmethoden zu verringern und (2) die langfristige Stabilität zu erhöhen, sowohl nach der Gefriertrocknung als auch nach der Wiederverdünnung. The Hemophilias, K.M. Brinkhous Ed., International Symposium, Washington, D.C., Univ. of North Caroline Press, S. 81 (1964). Der Einschluss von Spuren Aluminium wurde jedoch als gefährlich angesehen.

Das Aufkommen der Gefrierfällung und der Einstufenherstellung von verhältnismässig hochwirksamen Konzentraten hat anscheinend die Verwendung von Mitteln zur Entfernung des Prothrombinkomplexes verringert. Pool et al., Nature, Vol. 203, S. 312 (1964). Es wurde jedoch in der Praxis festgestellt, dass bei den AHG-Ausbeuten grosse Schwankungen vorhanden waren und zwar bis zu 50% Streuung, bezogen auf die angegebenen Mittelwerte oder sogar noch darüber hinaus.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Verbindung des Abbaus der biochemischen Aktivität des Antihämophilie-Globulins bei der AHG-Gewinnung ist im Patentanspruch 1 charakterisiert.

Heparin hindert Thrombin daran, AHF zu inaktivieren. Dieser Vorgang ist in Details durch Verstraete et al. beschrieben worden: W. Vestraete and S. J. Machin; Scand J. of Haematology, Suppl. No. 36, Vol 25. Auf Seite 34 der genannten Arbeit zeigt ein Diagramm, wie Heparin und Antithrombin III, ein Plasmaprotein, miteinander einwirken, um die Thrombinaktivität zu eliminieren.

Der Mechanismus wird weiter unten, auf Seite 35 der genannten Veröffentlichung, beschrieben:

«Heparin verbindet sich zuerst mit (Antithrombin) und führt zu einer Konformationsänderung, welche (Antithrombin) reaktiver macht... In einem dritten Schritt reagiert Thrombin mit (Antithrombin) sehr wahrscheinlich mittels der Bildung der kovalenten Bindung... Heparin wirkt dabei als Katalysator für die Reaktion.»

Die Bindung von Heparin von Antithrombin ist sehr wahrscheinlich eine Kombination von Wasserstoff- und Ionen-Bindung. Die Auswirkung der Verbindung ist aber mehr als diejenige einer einfachen physikalischen Anlagerung, da Heparin als Katalysator wirkt, d.h. Heparin führt zu einer chemischen Änderung in Thrombin, ohne dabei selbst aufgebraucht zu werden.

Zusätzlich muss auf die sehr wichtige Tatsache hingewiesen werden, dass die Inaktivierung von Thrombin vermutlich von einer Ausbildung einer kovalenten Bindung in der Thrombinmolekul begleitet ist.

Heparin kann auch gegenüber andern proteolytischen Enzymen als Thrombin inhibierend wirken. Siehe dazu bei5

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spielsweise Bing, The Chemistry and Physiology of the Human Plasma Proteins, Seiten 353-368 (1979).

Gemäss Bing

«führt die Natur der Antithrombin-Heparin-Mechanis-musaktion zur Annahme, dass alle Serumproteasen innerhalb des Koagulationssystems durch Antithrombin neutralisiert werden und dass das Mykopolysaccharid (Heparin)

jede dieser Interaktionen beschleunigt (Seite 356).»

Der negative Effekt der genannten Proteasen gegenüber AHF wird von verschiedenen Autoren erwähnt. Beispielsweise ist es bekannt, dass wenn der Faktor IXa (eine Seram-protease des Koagulationssystems) sich mit AHF kombiniert, zuerst Antithrombin III und Faktor X, dann AHF aufgebraucht wird und dass der aktive Faktor X (Xa) produziert wird. Es ist aber auch bekannt, dass diese Reaktion durch die Zugabe von AHF irreversibel inhibiert wird (und dass dabei AHF nicht aufgebraucht wird), wenn Heparin vorliegt. Siehe dazu Ofosu et al., «Thrombosis Research» 20. 391-403 (1980). Das System kann aber den Faktor Xa nicht neu generieren, wenn ein Heparingegenspieler, Polybren, zugegeben wird. Es ist daher erlaubt zu folgern, dass die Reaktion nicht nur eine ionische oder physikalische Anlagerung umfasst, da der Heparineffekt irreversibel ist. Tatsächlich kann dabei eine kovalente Bindung ausgebildet werden, in Analogie mit der Inaktivierung von Thrombin mittels Heparin und Antithrombin.

In der beiliegenden Figur ist der Mechanismus der Blutgerinnung in Form eines Diagramms dargestellt. Die römischen Ziffern stellen die verschiedenen Blutgerinnungsfaktoren dar. Es versteht sich jedoch, dass dieses Diagramm lediglich eine Arbeitshypothese darstellt, die auf dem Stand der gegenwärtigen Forschung beruht; es ist durchaus möglich, dass durch weitere Forschungen die Vorstellungen über die Wirkungsweise vertieft oder auch abgeändert werden müssen.

Wie bereits oben festgestellt, wurde in der Praxis bei der Herstellung des AHG eine starke Streuung der Ausbeuten erhalten. Je länger die Durchführung der Konzentration dauert, desto geringer sind die Ausbeuten. Durch eine sehr sorgfältige Durchführung der Entfernung von Blutzellen konnten die Ausbeuteverluste etwas verringert werden. Diese Ergebnisse können unter Zuhilfenahme des Blutgerinnungsschemas der beiliegenden Zeichnung erklärt werden. Von besonderem Interesse ist der Rückkopplungsmechanismus, der durch die punktierten Linien dargestellt ist, die die Einwirkung des Faktors IIa (Thrombin) auf Faktor V (Proakzelerin) und auf Faktor VIII (AHG) zeigen. Wirkung besteht aus zwei Teilen. Die Wirkungen von VIII und V sind (1) zuerst durch geänderte tertiäre Struktur gesteigert und dann (2) vermindert, um überschüssige Gerinnung zu verhindern, die Blutkreislaufstörungen hervorrufen könnte.

Aus dem Gerinnungsschema ergibt sich deutlich, dass die Entfernung der Faktoren II, VII, X und IX (Prothrombin-komplex) den Rückkopplungsmechanismus ausschalten würde, da kein Faktor II vorhanden wäre, der IIa liefern könnte. Der technische Fortschritt, den die vorliegende Erfindung mit sich bringt, dass zellfreies Plasma bei der Konzentration höhere Ausbeuten an AHG ergibt, ist allenfalls aus dem Gerinnungsschema erklärbar, da Thromboplastin nicht produziert wird und daher die Gerinnung nicht einsetzen kann.

Die Stabilisation bzw. Konservierung während der Fraktionierung besteht bei der Herstellung von AHG im technischen Massstab führt zu einer erheblich verbesserten Ausbeute.

Es wurde festgestellt, dass im Gegensatz zu den bekannten Herstellungsmethoden ohne Konservierung (1) Zellverunreinigung, beispielsweise durch das Fraktionierverfah630 804

ren, keine schlechteren Ausbeuten ergibt, (2) Gewebeverunreinigung, die beispielsweise während der intravenösen Verabreichung auftritt, keine geringeren Ausbeuten ergibt, (3) längere Verarbeitungszeit die Ausbeute nicht vermindert und (4) die Stabilität der rückverdünnten Lösung gegenüber nicht heparinisierten Plasmakonzentraten erhöht ist und zwar mindestens um einen Faktor in der Grössenordnung von 30.

Die Menge an Heparin, die bei der Durchführung der er-findungsgemässen Konservierung während der Fraktionierung von AHG zugesetzt wird, kann innerhalb beträchtlicher Grenzen schwanken. Es wurde festgestellt, dass eine Konzentration von etwa einer Einheit Heparin pro Milliliter Plasmalösung oder Plasmafraktion etwa das Optimum darstellt. Konzentrationen von mehr als etwa 10 Einheiten pro Milliliter sind als überflüssig und gefährlich zu vermeiden. Konzentrationen von etwa 0,01 Einheiten pro Milliliter sind ebenfalls wirksam. Eine «Einheit» Heparin bedeutet hierbei eine U.S.P.-Einheit (Pharmakopoe der Vereinigten Staaten von Amerika). Die «U.S.P.-Einheit» für Heparin ist die Menge Heparin, die eine Stunde lang die Gerinnung von 1,0 ml mit Citrat versetztes Schafplasma an der Gerinnung hindert, nachdem 0,2 ml einer 1:100 CaCl2-Lösung zugesetzt worden sind. Unter dem Ausdruck «Heparin» ist auch das Natriumsalz des Heparins zu verstehen. Wegen seiner Wasserlöslichkeit wird das Natriumsalz des Heparins gegenüber der freien Säure bevorzugt.

Es wurde festgestellt, dass die hier beschriebene Stabilisierung bzw. Konservierung während verschiedener Verfahren von AHG-Konzentraten eingesetzt werden kann, und dass sie auf jedes beliebige Plasma und jede beliebige Plasmafraktion, das bzw. die AHG in Mischung mit irgendeinem Prothrombin-Komplex-Faktor enthält, anwendbar ist.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von AHG, für die die vorliegend beschriebene Stabilisierung bzw. Konservierung geeignet ist, ist das in U.S. Patentschrift 3 631 018 beschriebene Verfahren, nach dem Polyäthylenglykol und Glykol zur Fraktionierung eines Kälteniederschlages von AHG-Konzentrat verwendet werden.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1 Reagenzien

Citrat-Salzlösung (mit Citrat versetzte physiologische Kochsalzlösung) - ein Teil 0,1 m Natriumeitrat auf 4 Gewichtsteile 0,0% physiologische Kochsalzlösung.

Glycin-Citrat-Salzlösung - der wie oben hergestellten Citrat-Salzlösung wird so viel Glycin zugesetzt, dass die Lösung 0,1 m an Glycin ist.

Gepuffertes Waschwasser - zu destilliertem Wasser wird 1/100 seines Volumens an gepuffertem Citrat zugesetzt, das hergestellt worden ist, indem 0,5 m Natriumeitrat mit 0,5 m Citronensäure auf einem pH-Wert von 6,88 eingestellt worden ist.

Heparin - Es wird ein Material verwendet, das den Anforderungen der U.S. Pharmakopoe entspricht («Lipo-He-pin»-Natriumheparininjektion, wässrig).

Essigsäure, hergestellt sowohl als l,0n als auch 0,ln wässrige Lösung.

Glycin - hergestellt sowohl als 1,3m als auch 1,8m wässrige Lösung.

Von einem Blutspendezentrum wird menschliches Blutplasma in gefrorenem Zustand (unter 4 °C) bezogen. Das Plasma wird in Pfaudler-Kesseln gesammelt und durch kontinuierliche Fliesszentrifugation oder Becherzentrifugation zentrifugiert, während es bei einer Temperatur von -20 bis -40 °C gehalten wird. Dem Kälteniederschlag wird Glycin-

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Citrat-Salzlösung, die eine Einheit Heparin pro Milliliter enthält, zugesetzt, wobei die Menge ein Zehntel des Volumens des Plasmas, das den Kälteniederschlag darstellt, beträgt.

Die Auflösung erfolgt durch Vermischen des Kälteniederschlags und der Glycin-Citrat-Salzlösung in einer warmen Umgebung (normale Zimmertemperatur, jedoch nicht mehr als 30 °C).

Die Wasserstoffionenkonzentration des gelösten Kälteniederschlags wird mit 0,ln Essigsäure auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt. Dann wird der Lösung so viel Polyäthylenglykol 4000 (Molekulargewichtsmittel etwa 4000) zugesetzt, dass die Konzentration daran etwa 3,5 Gew.-% beträgt. Die Mischung wird 10 Minuten lang bei Zimmertemperatur schwach gerührt und dann 15 Minuten lang bei 5000 U/min. zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert, und der pH-Wert wird mit 0,ln Natriumhydroxyd auf 6,88 eingestellt. Dann wird so viel Polyäthylenglykol 4000 zugesetzt, bis eine Konzentration an Polyäthylenglykol von etwa 10% erreicht ist. Die Mischung wird 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur schwach gerührt und dann eine halbe Stunde lang mit 5000 U/Min. zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und verworfen. Der Niederschlag wird in kaltem Wasser (2 °C) gewaschen und dann wird 5 Minuten lang bei 5000 U/Min. und einer Temperatur von —4 °C Rotationswaschen (spin washing) durchgeführt. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert, und der Niederschlag wird in Glycin-Citrat-Salzlösung, die eine Einheit Heparin pro Milliliter enthält, aufgelöst. Wiederum beträgt die Menge der zur Auflösung verwendeten Lösung

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etwa 1 Zehntel des Volumens des Plasmas, das den Niederschlag darstellt.

Die Wasserstoffionenkonzentration des wiederaufgelö-sten Niederschlags wird mit 0,ln Essigsäure auf einen pH-Wert von 6,88 eingestellt und erneut mit wässrigem Glycin, das eine Molarität von 1,8 hat, gefallt. Während dieser Ausfällungsstufe wird so viel Glycin zugesetzt, dass die Mischung 1,8 molar hinsichtlich des Glycins ist. Die Mischung wird bei einer Temperatur von 2 bis 10 °C 46 bis 60 Minuten lang schwach gerührt und dann durch kontinuierliche Fliess-zentrifugation oder Becherzentrifugation zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wird gesammelt, mit gepuffertem Waschwasser vorsichtig gewaschen und erneut in Citrat-Salzlösung aufgelöst. Die Lösung wird durch Filtration durch ein 293-mm-Millipor-Filter (verwendete Membranen: 1,2 pm, 0,45 um, und 0,3 um) geklärt.

Das flüssige Produkt wird dann durch Schalengefrieren (shell freezing; — 60 °C) gefroren und mindestens 3 Stunden lang in einem Blitzkühler (flash freezer; — 20 bis — 30 °C) gelagert.

Das vorstehende Verfahren wurde wiederholt, wobei jedoch der Glycin-Citrat-Salzlösung, die zum Auflösen des anfänglichen Kälteniederschlags oder zur Auflösung des Niederschlags der Fraktionierung mit 10% Polyäthylenglykol verwendet wird, oder irgendeiner anderen Stufe der Fraktionierung kein Heparin zugesetzt wurde.

Die voranstehenden Verfahren sowohl mit als auch ohne Zusatz von Heparin wurden wiederholt.

In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse dieser 4 Fraktionierungen angegeben.

AHG-Ausbeute

Kälteausbeute %

Endprod. Ausbeute

Rückgewinnung

Gesamtvolumen in

AHG rückgewonnen

AHG rückgewonnen in %

Ausgangsplasma

aus Ausgangsplasma aus Ausgangsplasma

Ohne Heparin

35%

14,6%

38%

6000 Liter

Mit Heparin

35%

17%

49%

300 Liter

Ohne Heparin Mit Heparin

32% 33%

12,5% 17%

39% 52%

6000 Liter 300 Liter

Aus der Tabelle ergibt sich, dass die Endausbeute an AHG bei Verwendung von Heparin 17% betrug, während die Ausbeute ohne Heparinzusatz zwischen 12,5 und 13,6 betrug. Daher erhöht sich die Ausbeute durch Zugabe von Heparin um 25 bis 35% gegenüber dem Verfahren ohne Heparinzusatz. Wenn die Endausbeute an AHG durch die Kälteniederschlagsausbeute an AHG dividiert wird, ergibt sich, dass der Wirkungsgrad des Verfahrens von 38 und 39%

ohne Heparinzusatz auf 49 und 52% mit Heparinzusatz verbessert wird.

Wenn an Stelle von Polyäthylenglykol 4000 im obigen Beispiel eine äquivalente Menge PEG 6000 verwendet wird, werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten.

Beispiel 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde sowohl mit als auch ohne Heparinzusatz zur Lösung wiederholt, bis auf die Stufe

45 der Resuspendierung des ursprünglichen Kälteniederschlags in Glycin-Citrat-Salzlösung. Die Endausbeute an AHG bei diesen beiden Kälteniederschlagskonzentraten von AHG betrug 34% ohne Heparinzusatz und 41%, wenn Heparin zugesetzt wurde. Dies entspricht einer 21%igen Ausbeutever-50 besserung.

Beispiel 3

Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt, ausser dass die Kälteniederschlagskonzentrate sowohl mit als auch 55 ohne Heparin gefriergetrocknet und dann mit Wasser rückverdünnt und 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur (ca. 25 °C) stehen gelassen wurden. Die mit Heaprin versetzten Proben behielten 98% der ursprünglich vor der Lagerzeit vorhandenen AHG-Aktivität, während die Proben ohne He-60 parinzusatz bei dieser Prüfung nur 72% der ursprünglichen AHG-Aktivität behielten.

1 Blatt Zeichnungen

Claims (5)

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1. Verfahren zur Verhinderung des Abbaus der biochemischen Aktivität von Antihämophilie-Globulin, das aus Blutplasmafraktionen erhalten wird, dadurch gekennzeichnet, dass der Plasmafraktion 0,01 bis 10 Einheiten Heparin als biochemischer Inhibitor pro Milliliter Antihämophilie-Globulinhaltiger Lösung zugesetzt werden.

2. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Plasmafraktion ein Kälteniederschlagskonzentrat von Antihämophilie-Globulin ist.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Anwendung des Verfahrens gemäss Patentanspruch 1 auf eine Plasmafraktion, die durch Ausfallen eines Kälteniederschlagskonzentrats mit 3 bis 4 Gew.-% Polyäthylen-glykol, Ausfallen der erhaltenen überstehenden Lösung mit etwa 10 Gew.-% Polyäthylenglykol und Fraktionierung der erhaltenen überstehenden Lösung mit Glycin hergestellt wird.

4. Anwendung gemäss Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyäthylenglykol ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 4000 aufweist.

5. Anwendung gemäss Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Glycin eine Molarität von etwa 1,8 hat.