CH630804A5

CH630804A5 - METHOD FOR PREVENTING THE DECOMPOSITION OF THE BIOCHEMICAL ACTIVITY OF ANTIHAEMOPHILY GLOBULIN.

Info

Publication number: CH630804A5
Application number: CH700173A
Authority: CH
Inventors: Lajos F Fekete; Stephen L Holst
Original assignee: Baxter Travenol Lab
Priority date: 1972-05-17
Filing date: 1973-05-16
Publication date: 1982-07-15
Also published as: IL42221A0; DE2324717A1; ATA433573A; DK136016B; FR2184898B1; GB1372515A; SE430020B; JPS4956695A; DE2324717B2; USRE29698E; ES414823A1; JPS596845B2; IT1061433B; BE799525A; AU5584973A; IL42221A; DE2324717C3; FR2184898A1; AU465351B2; ZA733138B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verhinderung des Abbaus der biochemischen Aktivität von Antihämo-philie-Globulin, das aus Blutplasmafraktionen erhalten wird. The invention relates to a method for preventing the degradation of the biochemical activity of antihemophil globulin, which is obtained from blood plasma fractions.

Die Blutgerinnung ist ein komplizierter biochemischer Vorgang, der die Entwicklung verschiedener Substanzen ein-schliesst, die im normalen Vollblut enthalten sind. Es ist bekannt, dass bei einigen Individuen bestimmte Faktoren, die für den Mechanismus der Blutgerinnung erforderlich sind, fehlen oder erheblich verringert sind. So ist es bekannt, dass die klassische Form der Hämophilie (Hemophilia A) eine Mangelkrankheit ist, die durch das Fehlen von AHG (Faktor VIII) verursacht wird. Bei Individuen, die an der angeborenen Hämophilie B (Christmas disease) leiden, fehlt im Blut die Plasmathromboplastinkomponente (PTC, Faktor IX, Christmas factor). Verschiedene andere Faktoren, die für den Mechanismus der Blutgerinnung wichtig sind, sind die Faktoren II, VII und X (Prothrombin, Prokonvertin und Stuart-Prower' Faktor). Blood clotting is a complex biochemical process that involves the development of various substances that are found in normal whole blood. It is known that in some individuals certain factors that are necessary for the blood clotting mechanism are missing or significantly reduced. So it is known that the classic form of hemophilia (Hemophilia A) is a deficiency disease, which is caused by the lack of AHG (factor VIII). In individuals who suffer from congenital hemophilia B (Christmas disease), the plasma thromboplastin component (PTC, factor IX, Christmas factor) is missing in the blood. Various other factors that are important for the mechanism of blood coagulation are Factors II, VII and X (Prothrombin, Prokonvertin and Stuart-Prower 'factor).

Bis vor wenigen Jahren bestand die Behandlung von Hämophilen darin, den Patienten Vollblut oder Blutplasma zu infundieren. Die ärztliche Kunst schreibt jedoch vor, dass -wenn möglich - den Patienten nur solche Blutbestandteile zugeführt werden, die ihm fehlen. Wegen der universellen Knappheit von Blut ist es auch vorteilhaft, das Blut in seine verschiedenen Bestandteile aufzutrennen, die dann je nach Bedarf für die Behandlung verschiedener Patienten verwendet werden können. Until a few years ago, the treatment of hemophils was to infuse the patient with whole blood or blood plasma. However, medical art prescribes that, if possible, only those blood components that are missing are supplied to the patient. Because of the universal scarcity of blood, it is also advantageous to separate the blood into its various components, which can then be used to treat different patients as needed.

Es sind verschiedene Methoden der Auftrennung von Blut und Blutplasma in die verschiedenen Bestandteile oder Konzentrate bekannt. Die Arbeit von Edwin Cohn und seinen Mitarbeitern an der Harvard-Universität zur Entwicklung der Alkoholfraktionierungsmethode ist besonders erwähnenswert. Die kürzlich erteilten U.S. Patente 3 631 018 und 3 652 530 beschreiben verbesserte Verfahren zur Isolierung eines hochgereinigten Konzentrats von AHG. Various methods of separating blood and blood plasma into the various components or concentrates are known. The work of Edwin Cohn and his colleagues at Harvard University on the development of the alcohol fractionation method is particularly noteworthy. The recently issued U.S. Patents 3,631,018 and 3,652,530 describe improved methods for isolating a highly purified concentrate from AHG.

Aufgrund der Untersuchungen von Wagner, Thelin, Brinkhous und anderen über die Herstellung von AHG wurde festgestellt, dass das Vorhandensein von Prothrombin (Faktor II) und dem damit verbundenen Komplex von Faktoren für die Stabilität des Faktors VIII (=AHG) schädlich ist, sowohl langfristig als auch kurzfristig. Die übliche Methode zur Beseitigung dieses Problems bestand darin, den Prothrombinkompiex mit verschiedenen Mitteln, beispielsweise Aluminiumhydroxyd, Magnesiumhydroxyd, Barium-carbonat, Bariumsulfat, «Rivanol» (6,9-Diamino-2-äthoxy-acridinlactat), IRC-50-Ionenaustauscherharz (XE-64-Rivanol) oder Glycinäthylester, zu entfernen. Based on the studies by Wagner, Thelin, Brinkhous and others about the production of AHG, it was found that the presence of prothrombin (factor II) and the associated complex of factors is harmful to the stability of factor VIII (= AHG), both in the long term as well in the short term. The usual method of eliminating this problem was to use various means such as aluminum hydroxide, magnesium hydroxide, barium carbonate, barium sulfate, rivanol (6,9-diamino-2-ethoxy-acridine lactate), IRC-50 ion exchange resin ( XE-64-Rivanol) or glycine ethyl ester.

Während die vorgehend erwähnten Mittel im allgemeinen wirksam sind, sind verschiedene schwere Nachteile ihrer klinischen Anwendung bekanntgeworden. Durch die Verwendung dieser Mittel wird tatsächlich der Faktor VIII stabilisiert, da die Entfernung von Prothrombin die Bildung von Thrombin verhindert. Thrombin ist hauptsächlich für die Zersetzung des Faktors VIII verantwortlich, wie von Kisker, Thromb. Diath. Haemorrhagica, Band 17, S. 381 (1967) und Penick und Brinkhous, Amer. J. Med. Sciences, Band 232, S. 434 (1956) berichtet wurde. Daher verwendet die Originalarbeit von Wagner et al. bei der Herstellung des Faktors VIII mit aliphatischen Aminosäuren Aluminiumhydroxyd um (1) die Zersetzung des Faktors VIII bei der Durchführung von Konzentrationsmethoden zu verringern und (2) die langfristige Stabilität zu erhöhen, sowohl nach der Gefriertrocknung als auch nach der Wiederverdünnung. The Hemophilias, K.M. Brinkhous Ed., International Symposium, Washington, D.C., Univ. of North Caroline Press, S. 81 (1964). Der Einschluss von Spuren Aluminium wurde jedoch als gefährlich angesehen. While the aforementioned agents are generally effective, several serious disadvantages to their clinical use have been known. By using these agents, factor VIII is actually stabilized, since the removal of prothrombin prevents the formation of thrombin. Thrombin is mainly responsible for the decomposition of factor VIII, as by Kisker, Thromb. Diath. Haemorrhagica, Volume 17, p. 381 (1967) and Penick and Brinkhous, Amer. J. Med. Sciences, volume 232, p. 434 (1956). Therefore, the original work by Wagner et al. in the production of factor VIII with aliphatic amino acids aluminum hydroxide to (1) reduce the decomposition of factor VIII when using concentration methods and (2) increase long-term stability, both after freeze-drying and after redilution. The Hemophilias, K.M. Brinkhous Ed., International Symposium, Washington, D.C., Univ. of North Caroline Press, p. 81 (1964). The inclusion of traces of aluminum was considered dangerous.

Das Aufkommen der Gefrierfällung und der Einstufenherstellung von verhältnismässig hochwirksamen Konzentraten hat anscheinend die Verwendung von Mitteln zur Entfernung des Prothrombinkomplexes verringert. Pool et al., Nature, Vol. 203, S. 312 (1964). Es wurde jedoch in der Praxis festgestellt, dass bei den AHG-Ausbeuten grosse Schwankungen vorhanden waren und zwar bis zu 50% Streuung, bezogen auf die angegebenen Mittelwerte oder sogar noch darüber hinaus. The advent of freeze precipitation and one-step preparation of relatively highly effective concentrates appear to have reduced the use of prothrombin complex removal agents. Pool et al., Nature, Vol. 203, p. 312 (1964). In practice, however, it was found that there were large fluctuations in the AHG yields, namely up to 50% scatter, based on the stated mean values or even beyond.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Verbindung des Abbaus der biochemischen Aktivität des Antihämophilie-Globulins bei der AHG-Gewinnung ist im Patentanspruch 1 charakterisiert. The method according to the invention for connecting the degradation of the biochemical activity of the antihemophilia globulin in the extraction of AHG is characterized in claim 1.

Heparin hindert Thrombin daran, AHF zu inaktivieren. Dieser Vorgang ist in Details durch Verstraete et al. beschrieben worden: W. Vestraete and S. J. Machin; Scand J. of Haematology, Suppl. No. 36, Vol 25. Auf Seite 34 der genannten Arbeit zeigt ein Diagramm, wie Heparin und Antithrombin III, ein Plasmaprotein, miteinander einwirken, um die Thrombinaktivität zu eliminieren. Heparin prevents thrombin from inactivating AHF. This process is described in detail by Verstraete et al. described: W. Vestraete and S. J. Machin; Scand J. of Haematology, Suppl. 36, Vol 25. On page 34 of the work mentioned, a diagram shows how heparin and antithrombin III, a plasma protein, interact with one another in order to eliminate thrombin activity.

Der Mechanismus wird weiter unten, auf Seite 35 der genannten Veröffentlichung, beschrieben: The mechanism is described below, on page 35 of the publication mentioned:

«Heparin verbindet sich zuerst mit (Antithrombin) und führt zu einer Konformationsänderung, welche (Antithrombin) reaktiver macht... In einem dritten Schritt reagiert Thrombin mit (Antithrombin) sehr wahrscheinlich mittels der Bildung der kovalenten Bindung... Heparin wirkt dabei als Katalysator für die Reaktion.» «Heparin first combines with (antithrombin) and leads to a conformational change that makes (antithrombin) more reactive ... In a third step, thrombin reacts with (antithrombin) very likely by forming the covalent bond ... heparin acts as a catalyst for the reaction. »

Die Bindung von Heparin von Antithrombin ist sehr wahrscheinlich eine Kombination von Wasserstoff- und Ionen-Bindung. Die Auswirkung der Verbindung ist aber mehr als diejenige einer einfachen physikalischen Anlagerung, da Heparin als Katalysator wirkt, d.h. Heparin führt zu einer chemischen Änderung in Thrombin, ohne dabei selbst aufgebraucht zu werden. The binding of heparin from antithrombin is most likely a combination of hydrogen and ion binding. However, the effect of the compound is more than that of a simple physical attachment, since heparin acts as a catalyst, i.e. Heparin leads to a chemical change in thrombin without being used up.

Zusätzlich muss auf die sehr wichtige Tatsache hingewiesen werden, dass die Inaktivierung von Thrombin vermutlich von einer Ausbildung einer kovalenten Bindung in der Thrombinmolekul begleitet ist. In addition, the very important fact must be pointed out that the inactivation of thrombin is presumably accompanied by the formation of a covalent bond in the thrombin molecule.

Heparin kann auch gegenüber andern proteolytischen Enzymen als Thrombin inhibierend wirken. Siehe dazu bei5 Heparin can also act as a thrombin inhibitor against other proteolytic enzymes. See also at 5

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spielsweise Bing, The Chemistry and Physiology of the Human Plasma Proteins, Seiten 353-368 (1979). for example, Bing, The Chemistry and Physiology of the Human Plasma Proteins, pages 353-368 (1979).

Gemäss Bing According to Bing

«führt die Natur der Antithrombin-Heparin-Mechanis-musaktion zur Annahme, dass alle Serumproteasen innerhalb des Koagulationssystems durch Antithrombin neutralisiert werden und dass das Mykopolysaccharid (Heparin) «The nature of the antithrombin-heparin mechanism leads to the assumption that all serum proteases within the coagulation system are neutralized by antithrombin and that the mycopolysaccharide (heparin)

jede dieser Interaktionen beschleunigt (Seite 356).» each of these interactions accelerates (page 356). »

Der negative Effekt der genannten Proteasen gegenüber AHF wird von verschiedenen Autoren erwähnt. Beispielsweise ist es bekannt, dass wenn der Faktor IXa (eine Seram-protease des Koagulationssystems) sich mit AHF kombiniert, zuerst Antithrombin III und Faktor X, dann AHF aufgebraucht wird und dass der aktive Faktor X (Xa) produziert wird. Es ist aber auch bekannt, dass diese Reaktion durch die Zugabe von AHF irreversibel inhibiert wird (und dass dabei AHF nicht aufgebraucht wird), wenn Heparin vorliegt. Siehe dazu Ofosu et al., «Thrombosis Research» 20. 391-403 (1980). Das System kann aber den Faktor Xa nicht neu generieren, wenn ein Heparingegenspieler, Polybren, zugegeben wird. Es ist daher erlaubt zu folgern, dass die Reaktion nicht nur eine ionische oder physikalische Anlagerung umfasst, da der Heparineffekt irreversibel ist. Tatsächlich kann dabei eine kovalente Bindung ausgebildet werden, in Analogie mit der Inaktivierung von Thrombin mittels Heparin und Antithrombin. The negative effect of the proteases mentioned against AHF is mentioned by various authors. For example, it is known that when factor IXa (a seram protease of the coagulation system) combines with AHF, first antithrombin III and factor X, then AHF is used up and that the active factor X (Xa) is produced. However, it is also known that this reaction is irreversibly inhibited by the addition of AHF (and that AHF is not used up) when heparin is present. See Ofosu et al., "Thrombosis Research" 20, 391-403 (1980). However, the system cannot regenerate the factor Xa if a heparin antagonist, polybrene, is added. It is therefore reasonable to conclude that the reaction does not only involve ionic or physical attachment, since the heparin effect is irreversible. In fact, a covalent bond can be formed, in analogy to the inactivation of thrombin by means of heparin and antithrombin.

In der beiliegenden Figur ist der Mechanismus der Blutgerinnung in Form eines Diagramms dargestellt. Die römischen Ziffern stellen die verschiedenen Blutgerinnungsfaktoren dar. Es versteht sich jedoch, dass dieses Diagramm lediglich eine Arbeitshypothese darstellt, die auf dem Stand der gegenwärtigen Forschung beruht; es ist durchaus möglich, dass durch weitere Forschungen die Vorstellungen über die Wirkungsweise vertieft oder auch abgeändert werden müssen. The accompanying figure shows the mechanism of blood coagulation in the form of a diagram. The Roman numerals represent the various blood coagulation factors. It should be understood, however, that this diagram is only a working hypothesis based on the current state of research; it is quite possible that further research will have to deepen or even change the ideas about how it works.

Wie bereits oben festgestellt, wurde in der Praxis bei der Herstellung des AHG eine starke Streuung der Ausbeuten erhalten. Je länger die Durchführung der Konzentration dauert, desto geringer sind die Ausbeuten. Durch eine sehr sorgfältige Durchführung der Entfernung von Blutzellen konnten die Ausbeuteverluste etwas verringert werden. Diese Ergebnisse können unter Zuhilfenahme des Blutgerinnungsschemas der beiliegenden Zeichnung erklärt werden. Von besonderem Interesse ist der Rückkopplungsmechanismus, der durch die punktierten Linien dargestellt ist, die die Einwirkung des Faktors IIa (Thrombin) auf Faktor V (Proakzelerin) und auf Faktor VIII (AHG) zeigen. Wirkung besteht aus zwei Teilen. Die Wirkungen von VIII und V sind (1) zuerst durch geänderte tertiäre Struktur gesteigert und dann (2) vermindert, um überschüssige Gerinnung zu verhindern, die Blutkreislaufstörungen hervorrufen könnte. As already stated above, in practice a large dispersion of the yields was obtained in the production of the AHG. The longer the concentration takes, the lower the yields. The loss of yield could be somewhat reduced by carrying out the removal of blood cells very carefully. These results can be explained using the blood coagulation scheme in the accompanying drawing. Of particular interest is the feedback mechanism, which is shown by the dotted lines that show the effect of factor IIa (thrombin) on factor V (proaccelerin) and on factor VIII (AHG). Effect consists of two parts. The effects of VIII and V are (1) first increased by altered tertiary structure and then (2) reduced to prevent excess clotting that could cause circulatory disorders.

Aus dem Gerinnungsschema ergibt sich deutlich, dass die Entfernung der Faktoren II, VII, X und IX (Prothrombin-komplex) den Rückkopplungsmechanismus ausschalten würde, da kein Faktor II vorhanden wäre, der IIa liefern könnte. Der technische Fortschritt, den die vorliegende Erfindung mit sich bringt, dass zellfreies Plasma bei der Konzentration höhere Ausbeuten an AHG ergibt, ist allenfalls aus dem Gerinnungsschema erklärbar, da Thromboplastin nicht produziert wird und daher die Gerinnung nicht einsetzen kann. The coagulation scheme clearly shows that the removal of factors II, VII, X and IX (prothrombin complex) would switch off the feedback mechanism since there would be no factor II that could provide IIa. The technical progress that the present invention brings with it that cell-free plasma gives higher yields of AHG at the concentration can only be explained from the coagulation scheme, since thromboplastin is not produced and therefore cannot coagulate.

Die Stabilisation bzw. Konservierung während der Fraktionierung besteht bei der Herstellung von AHG im technischen Massstab führt zu einer erheblich verbesserten Ausbeute. The stabilization or preservation during fractionation in the production of AHG on an industrial scale leads to a considerably improved yield.

Es wurde festgestellt, dass im Gegensatz zu den bekannten Herstellungsmethoden ohne Konservierung (1) Zellverunreinigung, beispielsweise durch das Fraktionierverfah630 804 It was found that, in contrast to the known production methods without preservation, (1) cell contamination, for example by the fractionation process 630 804

ren, keine schlechteren Ausbeuten ergibt, (2) Gewebeverunreinigung, die beispielsweise während der intravenösen Verabreichung auftritt, keine geringeren Ausbeuten ergibt, (3) längere Verarbeitungszeit die Ausbeute nicht vermindert und (4) die Stabilität der rückverdünnten Lösung gegenüber nicht heparinisierten Plasmakonzentraten erhöht ist und zwar mindestens um einen Faktor in der Grössenordnung von 30. no poorer yields, (2) tissue contamination that occurs during intravenous administration, for example, does not result in lower yields, (3) longer processing times do not reduce the yield, and (4) the stability of the rediluted solution with respect to non-heparinized plasma concentrates is increased and at least by a factor of the order of 30.

Die Menge an Heparin, die bei der Durchführung der er-findungsgemässen Konservierung während der Fraktionierung von AHG zugesetzt wird, kann innerhalb beträchtlicher Grenzen schwanken. Es wurde festgestellt, dass eine Konzentration von etwa einer Einheit Heparin pro Milliliter Plasmalösung oder Plasmafraktion etwa das Optimum darstellt. Konzentrationen von mehr als etwa 10 Einheiten pro Milliliter sind als überflüssig und gefährlich zu vermeiden. Konzentrationen von etwa 0,01 Einheiten pro Milliliter sind ebenfalls wirksam. Eine «Einheit» Heparin bedeutet hierbei eine U.S.P.-Einheit (Pharmakopoe der Vereinigten Staaten von Amerika). Die «U.S.P.-Einheit» für Heparin ist die Menge Heparin, die eine Stunde lang die Gerinnung von 1,0 ml mit Citrat versetztes Schafplasma an der Gerinnung hindert, nachdem 0,2 ml einer 1:100 CaCl2-Lösung zugesetzt worden sind. Unter dem Ausdruck «Heparin» ist auch das Natriumsalz des Heparins zu verstehen. Wegen seiner Wasserlöslichkeit wird das Natriumsalz des Heparins gegenüber der freien Säure bevorzugt. The amount of heparin that is added when carrying out the preservation according to the invention during the fractionation of AHG can vary within considerable limits. It has been found that a concentration of approximately one unit of heparin per milliliter of plasma solution or plasma fraction is approximately the optimum. Concentrations of more than about 10 units per milliliter are to be avoided as unnecessary and dangerous. Concentrations of about 0.01 units per milliliter are also effective. A "unit" of heparin means a U.S.P. unit (Pharmacopoeia of the United States of America). The "U.S.P. unit" for heparin is the amount of heparin that prevents coagulation of 1.0 ml of citrated sheep plasma from coagulating for one hour after 0.2 ml of a 1: 100 CaCl2 solution has been added. The term “heparin” also means the sodium salt of heparin. Because of its water solubility, the sodium salt of heparin is preferred over the free acid.

Es wurde festgestellt, dass die hier beschriebene Stabilisierung bzw. Konservierung während verschiedener Verfahren von AHG-Konzentraten eingesetzt werden kann, und dass sie auf jedes beliebige Plasma und jede beliebige Plasmafraktion, das bzw. die AHG in Mischung mit irgendeinem Prothrombin-Komplex-Faktor enthält, anwendbar ist. It has been found that the stabilization or preservation described here can be used during various methods of AHG concentrates and that it contains any plasma and any plasma fraction which contains the AHG in a mixture with any prothrombin complex factor , is applicable.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von AHG, für die die vorliegend beschriebene Stabilisierung bzw. Konservierung geeignet ist, ist das in U.S. Patentschrift 3 631 018 beschriebene Verfahren, nach dem Polyäthylenglykol und Glykol zur Fraktionierung eines Kälteniederschlages von AHG-Konzentrat verwendet werden. A preferred method for producing AHG for which the stabilization or preservation described here is suitable is that described in U.S. Pat. Patent 3 631 018 described method according to which polyethylene glycol and glycol are used for the fractionation of a cold deposit of AHG concentrate.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert. The invention is explained in more detail below with the aid of examples.

Beispiel 1 Reagenzien Example 1 Reagents

Citrat-Salzlösung (mit Citrat versetzte physiologische Kochsalzlösung) - ein Teil 0,1 m Natriumeitrat auf 4 Gewichtsteile 0,0% physiologische Kochsalzlösung. Citrate saline (citrated physiological saline) - one part 0.1 m sodium citrate to 4 parts by weight 0.0% physiological saline.

Glycin-Citrat-Salzlösung - der wie oben hergestellten Citrat-Salzlösung wird so viel Glycin zugesetzt, dass die Lösung 0,1 m an Glycin ist. Glycine Citrate Saline - Add enough glycine to the citrate saline solution prepared as above to make the solution 0.1 m glycine.

Gepuffertes Waschwasser - zu destilliertem Wasser wird 1/100 seines Volumens an gepuffertem Citrat zugesetzt, das hergestellt worden ist, indem 0,5 m Natriumeitrat mit 0,5 m Citronensäure auf einem pH-Wert von 6,88 eingestellt worden ist. Buffered Wash Water - To distilled water is added 1/100 of its volume of buffered citrate, which has been made by adjusting pH to 6.88 with 0.5 M sodium citrate with 0.5 M citric acid.

Heparin - Es wird ein Material verwendet, das den Anforderungen der U.S. Pharmakopoe entspricht («Lipo-He-pin»-Natriumheparininjektion, wässrig). Heparin - A material is used that meets the requirements of U.S. Pharmacopoeia corresponds («Lipo-He-pin» sodium heparin injection, aqueous).

Essigsäure, hergestellt sowohl als l,0n als auch 0,ln wässrige Lösung. Acetic acid, prepared both as 1.0n and 0.1l in aqueous solution.

Glycin - hergestellt sowohl als 1,3m als auch 1,8m wässrige Lösung. Glycine - made as both 1.3m and 1.8m aqueous solutions.

Von einem Blutspendezentrum wird menschliches Blutplasma in gefrorenem Zustand (unter 4 °C) bezogen. Das Plasma wird in Pfaudler-Kesseln gesammelt und durch kontinuierliche Fliesszentrifugation oder Becherzentrifugation zentrifugiert, während es bei einer Temperatur von -20 bis -40 °C gehalten wird. Dem Kälteniederschlag wird Glycin- Frozen human blood plasma (below 4 ° C) is obtained from a blood donation center. The plasma is collected in Pfaudler kettles and centrifuged by continuous flow centrifugation or beaker centrifugation while being kept at a temperature of -20 to -40 ° C. The cold precipitation is glycine

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Citrat-Salzlösung, die eine Einheit Heparin pro Milliliter enthält, zugesetzt, wobei die Menge ein Zehntel des Volumens des Plasmas, das den Kälteniederschlag darstellt, beträgt. Citrate salt solution containing one unit of heparin per milliliter was added, the amount being one tenth of the volume of the plasma which represents the cold precipitation.

Die Auflösung erfolgt durch Vermischen des Kälteniederschlags und der Glycin-Citrat-Salzlösung in einer warmen Umgebung (normale Zimmertemperatur, jedoch nicht mehr als 30 °C). It is dissolved by mixing the cold precipitation and the glycine-citrate salt solution in a warm environment (normal room temperature, but not more than 30 ° C).

Die Wasserstoffionenkonzentration des gelösten Kälteniederschlags wird mit 0,ln Essigsäure auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt. Dann wird der Lösung so viel Polyäthylenglykol 4000 (Molekulargewichtsmittel etwa 4000) zugesetzt, dass die Konzentration daran etwa 3,5 Gew.-% beträgt. Die Mischung wird 10 Minuten lang bei Zimmertemperatur schwach gerührt und dann 15 Minuten lang bei 5000 U/min. zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert, und der pH-Wert wird mit 0,ln Natriumhydroxyd auf 6,88 eingestellt. Dann wird so viel Polyäthylenglykol 4000 zugesetzt, bis eine Konzentration an Polyäthylenglykol von etwa 10% erreicht ist. Die Mischung wird 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur schwach gerührt und dann eine halbe Stunde lang mit 5000 U/Min. zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und verworfen. Der Niederschlag wird in kaltem Wasser (2 °C) gewaschen und dann wird 5 Minuten lang bei 5000 U/Min. und einer Temperatur von —4 °C Rotationswaschen (spin washing) durchgeführt. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert, und der Niederschlag wird in Glycin-Citrat-Salzlösung, die eine Einheit Heparin pro Milliliter enthält, aufgelöst. Wiederum beträgt die Menge der zur Auflösung verwendeten Lösung The hydrogen ion concentration of the dissolved cold precipitate is adjusted to pH 6.5 with 0.1 l acetic acid. Then so much polyethylene glycol 4000 (average molecular weight about 4000) is added to the solution that the concentration thereon is about 3.5% by weight. The mixture is gently stirred at room temperature for 10 minutes and then at 5000 rpm for 15 minutes. centrifuged. The supernatant liquid is decanted and the pH is adjusted to 6.88 with 0.1 in sodium hydroxide. Then as much polyethylene glycol 4000 is added until a concentration of polyethylene glycol of about 10% is reached. The mixture is gently stirred at room temperature for 30 minutes and then at 5000 rpm for half an hour. centrifuged. The supernatant liquid is decanted and discarded. The precipitate is washed in cold water (2 ° C) and then at 5000 rpm for 5 minutes. and a temperature of -4 ° C spin washing. The supernatant is decanted and the precipitate is dissolved in glycine citrate saline containing one unit of heparin per milliliter. Again, the amount of solution used for dissolution is

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etwa 1 Zehntel des Volumens des Plasmas, das den Niederschlag darstellt. about 1 tenth of the volume of the plasma that represents the precipitate.

Die Wasserstoffionenkonzentration des wiederaufgelö-sten Niederschlags wird mit 0,ln Essigsäure auf einen pH-Wert von 6,88 eingestellt und erneut mit wässrigem Glycin, das eine Molarität von 1,8 hat, gefallt. Während dieser Ausfällungsstufe wird so viel Glycin zugesetzt, dass die Mischung 1,8 molar hinsichtlich des Glycins ist. Die Mischung wird bei einer Temperatur von 2 bis 10 °C 46 bis 60 Minuten lang schwach gerührt und dann durch kontinuierliche Fliess-zentrifugation oder Becherzentrifugation zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wird gesammelt, mit gepuffertem Waschwasser vorsichtig gewaschen und erneut in Citrat-Salzlösung aufgelöst. Die Lösung wird durch Filtration durch ein 293-mm-Millipor-Filter (verwendete Membranen: 1,2 pm, 0,45 um, und 0,3 um) geklärt. The hydrogen ion concentration of the redissolved precipitate is adjusted to a pH of 6.88 with 0.1 l acetic acid and again with aqueous glycine which has a molarity of 1.8. So much glycine is added during this precipitation step that the mixture is 1.8 molar with respect to the glycine. The mixture is gently stirred at a temperature of 2 to 10 ° C for 46 to 60 minutes and then centrifuged by continuous flow centrifugation or beaker centrifugation. The precipitate obtained is collected, washed carefully with buffered wash water and redissolved in citrate-brine. The solution is clarified by filtration through a 293 mm Millipor filter (membranes used: 1.2 pm, 0.45 µm, and 0.3 µm).

Das flüssige Produkt wird dann durch Schalengefrieren (shell freezing; — 60 °C) gefroren und mindestens 3 Stunden lang in einem Blitzkühler (flash freezer; — 20 bis — 30 °C) gelagert. The liquid product is then frozen by shell freezing (shell freezing; - 60 ° C) and stored in a flash cooler (flash freezer; - 20 to - 30 ° C) for at least 3 hours.

Das vorstehende Verfahren wurde wiederholt, wobei jedoch der Glycin-Citrat-Salzlösung, die zum Auflösen des anfänglichen Kälteniederschlags oder zur Auflösung des Niederschlags der Fraktionierung mit 10% Polyäthylenglykol verwendet wird, oder irgendeiner anderen Stufe der Fraktionierung kein Heparin zugesetzt wurde. The above procedure was repeated except that no heparin was added to the glycine citrate saline used to dissolve the initial cold precipitation or to dissolve the precipitate of fractionation with 10% polyethylene glycol or any other stage of fractionation.

Die voranstehenden Verfahren sowohl mit als auch ohne Zusatz von Heparin wurden wiederholt. The above procedures were repeated with and without the addition of heparin.

In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse dieser 4 Fraktionierungen angegeben. The results of these 4 fractions are given in the following table.

AHG-Ausbeute AHG yield

Kälteausbeute % Cold yield%

Endprod. Ausbeute Final product yield

Rückgewinnung Recovery

Gesamtvolumen in Total volume in

AHG rückgewonnen AHG recovered

AHG rückgewonnen in % AHG recovered in%

Ausgangsplasma Output plasma

aus Ausgangsplasma aus Ausgangsplasma speak from original plasma from original plasma speak

Ohne Heparin Without heparin

35% 35%

14,6% 14.6%

38% 38%

6000 Liter 6000 liters

Mit Heparin With heparin

35% 35%

17% 17%

49% 49%

300 Liter 300 liters

Ohne Heparin Mit Heparin Without heparin With heparin

32% 33% 32% 33%

12,5% 17% 12.5% 17%

39% 52% 39% 52%

6000 Liter 300 Liter 6000 liters 300 liters

Aus der Tabelle ergibt sich, dass die Endausbeute an AHG bei Verwendung von Heparin 17% betrug, während die Ausbeute ohne Heparinzusatz zwischen 12,5 und 13,6 betrug. Daher erhöht sich die Ausbeute durch Zugabe von Heparin um 25 bis 35% gegenüber dem Verfahren ohne Heparinzusatz. Wenn die Endausbeute an AHG durch die Kälteniederschlagsausbeute an AHG dividiert wird, ergibt sich, dass der Wirkungsgrad des Verfahrens von 38 und 39% The table shows that the final yield of AHG when using heparin was 17%, while the yield without heparin was between 12.5 and 13.6. Therefore, the yield increases by adding heparin by 25 to 35% compared to the process without the addition of heparin. If the final yield of AHG is divided by the cold precipitation yield of AHG, it results that the efficiency of the process is 38 and 39%

ohne Heparinzusatz auf 49 und 52% mit Heparinzusatz verbessert wird. without heparin addition to 49 and 52% with heparin addition.

Wenn an Stelle von Polyäthylenglykol 4000 im obigen Beispiel eine äquivalente Menge PEG 6000 verwendet wird, werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten. If an equivalent amount of PEG 6000 is used in place of polyethylene glycol 4000 in the example above, essentially the same results are obtained.

Beispiel 2 Example 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wurde sowohl mit als auch ohne Heparinzusatz zur Lösung wiederholt, bis auf die Stufe The procedure of Example 1 was repeated with and without the addition of heparin to the solution, down to the step

45 der Resuspendierung des ursprünglichen Kälteniederschlags in Glycin-Citrat-Salzlösung. Die Endausbeute an AHG bei diesen beiden Kälteniederschlagskonzentraten von AHG betrug 34% ohne Heparinzusatz und 41%, wenn Heparin zugesetzt wurde. Dies entspricht einer 21%igen Ausbeutever-50 besserung. 45 resuspending the original cold precipitation in glycine citrate saline. The final yield of AHG at these two cold precipitation concentrates from AHG was 34% without heparin addition and 41% when heparin was added. This corresponds to a 21% improvement in yield.

Beispiel 3 Example 3

Das Verfahren des Beispiels 2 wurde wiederholt, ausser dass die Kälteniederschlagskonzentrate sowohl mit als auch 55 ohne Heparin gefriergetrocknet und dann mit Wasser rückverdünnt und 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur (ca. 25 °C) stehen gelassen wurden. Die mit Heaprin versetzten Proben behielten 98% der ursprünglich vor der Lagerzeit vorhandenen AHG-Aktivität, während die Proben ohne He-60 parinzusatz bei dieser Prüfung nur 72% der ursprünglichen AHG-Aktivität behielten. The procedure of Example 2 was repeated, except that the cold precipitation concentrates were freeze-dried both with and 55 without heparin and then rediluted with water and left to stand at room temperature (approx. 25 ° C.) for 24 hours. The samples spiked with Heaprin retained 98% of the AHG activity originally present before the storage period, while the samples without He-60 added added only 72% of the original AHG activity in this test.

1 Blatt Zeichnungen 1 sheet of drawings

Claims

630 804

1. A method for preventing the degradation of the biochemical activity of anti-hemophilia globulin, which is obtained from blood plasma fractions, characterized in that 0.01 to 10 units of heparin are added as a biochemical inhibitor per milliliter of solution containing anti-hemophilia globulin to the plasma fraction.

2. The method according to claim 1, characterized in that the plasma fraction is a cold precipitation concentrate of anti-hemophilia globulin.

2nd

PATENT CLAIMS

3. Application of the method according to claim 1 to a plasma fraction by precipitation of a cold precipitation concentrate with 3 to 4 wt .-% polyethylene glycol, precipitation of the supernatant solution obtained with about 10 wt .-% polyethylene glycol and fractionation of the supernatant solution obtained with glycine will be produced.

4. Application according to claim 3, characterized in that the polyethylene glycol has an average molecular weight of about 4000.

5. Application according to claim 3, characterized in that the glycine has a molarity of about 1.8.