AT407704B - Verwendung von humanem protein c zur verhinderung und behandlung von thrombozytenablagerungen - Google Patents

Description

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   Die Erfindung betrifft einen neuen Anwendungsbereich von humanem Protein C bzw. eine pharmazeutische Präparation zur Behandlung von thromboembolischen Krankheitszuständen. 



   Protein C ist ein Vitamin K-abhängiges Protein, das in der Leber synthetisiert wird und in einer Konzentration von 4 mg/l als inaktives Zymogen zirkuliert. Es wird an der Gefässwandoberfläche (Endothel) durch den Thrombin-Thrombomodulinkomplex in die aktive Serinprotease (aktiviertes Protein C) übergeführt. Es ist bekannt, dass aktiviertes Protein C profibrinolytische Eigenschaften hat. Es wirkt auch antikoagulatorisch, weil es den Faktor Va, den Kofaktor für die Faktor Xa-induzierte Prothrombinaktivierung (Thrombinbildung) und den Faktor   Vllla,   den Kofaktor für die Faktor IXa-induzierte Faktor X-Aktivierung, durch Proteolyse abbaut. 



   Die Aktivierung von Protein C in vivo stellt eine negative Feedback-Reaktion der Thrombingenerierung dar. Um optimale biologische Aktivität zu entfalten, ist ein Kofaktor (Protein S) notwendig. 



   In der europäischen Patentanmeldung EP 0 406 216 ist eine pharmazeutische Präparation beschrieben, die Protein S gegebenenfalls in Kombination mit aktiviertem Protein C enthält und zur Behandlung bzw. Verhinderung von Thrombosen und thromboembolischen Komplikationen eingesetzt werden kann. 



   Gemäss der EP 0 519 900 ist die Verwendung eines Protein C-hältigen pharmazeutischen Präparates gemeinsam mit einer thrombolytisch wirkenden Substanz zur Behandlung von Thrombosen und zur Verhinderung der Reocclusion möglich. Es wurde gefunden, dass während der Thrombolysetherapie ein Mangel an Protein C auftritt, weshalb die Substitution mit Protein C angebracht ist. 



   Die Wirkung des inaktiven Zymogens Protein C unterscheidet sich grundsätzlich von der des aktiven Enzyms, aktiviertes Protein C. 



   Aktiviertes Protein C ermöglicht die Verhinderung arterieller Thrombose oder Stenose, vorzugsweise in Kombination mit einem thrombolytisch wirksamen Agens (Gewebsplasminogenaktivator, tPA), siehe dazu EP 0 318 201. 



   Ebenso ist bekannt, dass in Blutplättchen-angereichertem Plasma (PRP) aktiviertes Protein C die Plättchenaggregation, welche durch Thrombinaktivierung induziert ist, unterdrückt. Allerdings führt eine höhere Konzentration an aktiviertem Protein C zu einem gegenteiligen Effekt, nämlich zur Aggregation der Blutplättchen (E. N.Santander et al., Acta   Physiologica   Latino-Americana 33 (2), 1983). 



   Aktivierte bzw. stimulierte Blutplättchen verfügen über den Glykoprotein IIb-IIa Komplex, der als Rezeptor für verschiedene Adhäsionsmoleküle fungiert. Zu den Adhäsionsproteinen, die an GP   Ilb-Illa   von stimulierten Blutplättchen binden, zählen Fibrinogen, von Willebrand Faktor und Fibronectin. Es wird vermutet, dass eine Tripeptidsequenz, nämlich Arg-Gly-Asp (RGD), der Adhesionsproteine an den Rezeptor bindet. Zu den Proteinen mit einer RGD-Sequenz zählen auch humanes Protein C und aktiviertes Protein C. Jedoch ist die Wechselwirkung von Protein C oder aktiviertem Protein C mit Blutplättchen ungewiss. Es wurde beispielsweise gefunden, dass aktiviertes Protein C an nicht stimulierte Blutplättchen in Gegenwart von Protein S bindet, und so die Inaktivierung von Faktor Va potenziert wird.

   Protein C bindet jedoch nicht an die Blutplättchen (J.Biol.Chem.,   260   (4), 2007-10, 1985). 



   Mit Hilfe der "Flow Cytometry" für Thrombozyten können Thrombozytenoberflächen untersucht werden. Die "Flow Cytometry" erlaubt die schnelle und sensitive Analyse von Rezeptorproteinen auf einer einzelnen Zelle. Bei den Untersuchungen wird eine Flussrate von 400 -1000 Thrombozyten pro Sekunde eingesetzt Die Grösse der Thrombozyten wird durch die Lichtstreuung (light scattering) ausgedrückt. Durch den Einsatz von mit Fluorescein-Isothiocyanat gekoppelten Antikörpern kann die Bindung von Liganden (Adhäsionsproteinen) an einem Thrombozyten gemessen werden (Beschreibung der Methode in Blood, 86 (1), 173-179,1986). 



   Die Bindung von Fibrinogen an stimulierten Thrombozyten führt letztlich zur Aggregation bzw. 



  Ablagerung dieser an verletztem Endothel und damit zum Wundverschluss. Thromboembolische Komplikationen bzw. Stenosis sind ebenso auf die Bindung von Fibrinogen an stimulierten Thrombozyten zurückzuführen. Nach erfolgter Ballonanglioplastie kommt es beispielsweise zu einer Verletzung des Endothels und damit zu einer Prädisposition für arterielle Restenose. 



   Die Erfindung stellt sich zur Aufgabe, den Anwendungsbereich von humanem Protein C zu erweitern und ein Präparat zur Verfügung zu stellen, das zur Verhinderung und Behandlung von 

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 Ablagerung und/oder Aggregation von Thrombozyten verabreicht werden kann. 



   Die Aufgabe wird erfindungsgemäss durch eine neue Verwendung von humanem Protein C zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation gelöst, welche zur Verhinderung und Behandlung der Ablagerung bzw. Aggregation von Thrombozyten, Thrombozytenmikropartikeln (dust) und Leukozyten mit prokoagulatorischer Aktivität geeignet ist. Protein C verhindert die Ablagerung an Gefässoberflächen bzw. Gefässstenosen, insbesondere an verletztem, virusinfiziertem oder geschädigtem Endothel bzw. an exponiertem Subendothel oder künstlichen Gefässoberflächen bzw. Gefässprothesen mit oder ohne Endothel. Es wurde gefunden, dass die Bindung von Fibrinogen an stimulierten Blutplättchen durch den Zusatz von humanem Protein C in dosisabhängiger Weise unterbunden werden kann. PRP wurde durch Zusatz von Adenosindiphosphat (ADP) stimuliert und die Fibrinogenbindung gemessen.

   Der Zusatz eines Fluorescein-Isothiocyanat gekoppelten Antikörpers gegen Fibrinogen ermöglichte den Nachweis des im PRP befindlichen Fibrinogens, gebunden an Thrombozyten, durch Messung am "Flow Cytometer". Die Verhinderung der Fibrinogenbindung an stimulierten Thrombozyten war umso überraschender, da aktiviertes Protein C keinen Einfluss auf die Fibrinogenbindung hatte. Es ist also wahrscheinlich, dass die RGD-Sequenz in einem Protein nicht allein für die Verhinderung der Fibrinogenbindung verantwortlich gemacht werden kann. 



   Versuche mit monoklonalen Antikörpern (z. B. PAC-1, ein IgM Antikörper, der nur die aktivierte Form des IIb-IIa Komplexes erkennt; S.J.Shattil, J.BioLChem. 260, 11107,1985) machten deutlich, dass der durch Aktivierung von Thrombozyten freigemachte GP IIb-IIa Komplex in Gegenwart von Protein C nicht gebunden wird. Es wird daher eine kompetitive Bindung von Protein C an GP   Ilb-Illa   vermutet. Anstelle des PAC-1 ist aber auch die Verwendung anderer monoklonaler Antikörper gegen Thrombozytenaktivierung abhängige Epitope möglich, z. B. PADGEM   (J.Clin.Invest.,   78, 130,1986), GMP (J.BioLChem., 264, 1816,1989) und 2.28 (Blood 70 838, 1987). Daher ist die Bindungsstelle von Fibrinogen blockiert. Im Gegensatz zu den anderen Adhäsionsproteinen wird dadurch die Aggregation der Thrombozyten nicht gefördert, sondern verhindert.

   Versuche mit einer Perfusionskammer zeigten, dass Protein C die Adhäsion von Thrombozyten in einer Kaninchenaorta, die mit Blut gespült wird, verhindert. Das Endothel wird also in Gegenwart von Protein C stabilisiert, wodurch die Adhäsion von stimulierten Thrombozyten unterbunden wird. 



   Protein C kann als natives Protein, als dessen Derivat oder Mutante mit einer RGD-Sequenz, erfindungsgemäss angewandt werden. Protein C ist in seiner inaktiven Form als Zymogen anwendbar. Dies hat den Vorteil, dass das Protein nicht aktiviert werden muss, um die Fibrinogenbindung oder von Willebrand Faktor-Bindung an stimulierte Blutplättchen zu unterbinden. Daher kann Protein C auch in bestimmten Krankheitszuständen wie Homocyteinurie, Diabetes oder Urämie, in denen die endogene Aktivierung von Protein C gehemmt ist, erfindungsgemäss angewandt werden. Das Zymogen Protein C hat auch nicht den Nachteil des aktivierten Protein C, nämlich dass es in hohen Konzentrationen zu einer Aggregation der Thrombozyten führt
Die Untersuchungen mit Hilfe der "Flow Cytometry" bestätigen, dass humanes Protein C vor allem zur Verhinderung der arteriellen Restenose geeignet ist.

   Protein C kann daher erfindungsgemäss bei allen Interventionen der Angioplastie aber auch bei Verwendung eines Katheters angewandt werden, um negative Wechselwirkungen mit stimulierten Thrombozyten untereinander, mit Leukozyten und mit dem Endothel zu unterbinden. 



   Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verhinderung der Ablagerung bzw. 



  Aggregation von Thrombozyten in vitro durch Zusatz einer wirksamen Menge an humanem Protein C. 



   Aufgrund des gefundenen Wirkungsmechanismus von Protein C ist erfindungsgemäss ein Verfahren zur extrakorporalen Behandlung von Körperflüssigkeiten, wie Blut oder Aszites, möglich, bei dem in einer Zirkulationsvorrichtung die Ablagerung bzw. Aggregation von Thrombozyten verhindert werden soll. Dieses Verfahren findet beispielsweise Anwendung für eine Dialysevorrichtung bzw. eine künstliche Niere. 



   Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung näher beschrieben. 



   Fibrinogenbindung an aktiviertem PRP 
10 ml Blut wurden abgenommen in Citrat. PRP wurde durch übliche Zentrifugation gewonnen. 



  Die Zugabe von ADP bewirkte die Stimulierung der Thrombozyten. Anschliessend wurde ein Fluor- 

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 escein-Isothiocyanat gekoppelter Antikörper gegen Fibrinogen zugesetzt und das Fibrinogen, gebunden an Thrombozyten, durch Messung am "Flow Cytometer"   (FACScan,   Becton,Dickinson) bestimmt. Die Fibrinogenbindung wurde durch die "Green Fluorescence Intensity" (one parameter statistics, X-Achse "Log-Green-Fluorescence" (gebundenes Antifibrinogen), Y-Achse "Number of Cells") sowie durch die "light scattering" (two parameter analysis, X-Achse "Log-Green Fluorescence", Y-Achse "Log-Light Scatter" (Grösse der Thrombozyten)) bestimmt. 



   Fig. 1 - 3 zeigen die Intensität der Fluoreszenz, d. h. die Fibrinogenbindung an stimulierten Thrombozyten sowie die Grösse der Thrombozyten. Abbildung 1 zeigt die Fibrinogenbindung im PRP nach ADP-Stimulation. Der Einsatz des Agonisten führt zu einer Fibrinogenbindung an der Zelloberfläche, aber auch zu einer Veränderung der Thrombozytengrösse. Im Vergleich dazu zeigt Abbildung 2 die Fibrinogenbindung nach ADP-Stimulation in Gegenwart von Protein C in einer Konzentration, die der 4-fachen Plasmakonzentration entspricht. Eine signifikante Reduktion der Fibrinogenbindung ist erkennbar. Im Gegensatz dazu führt aktiviertes Protein C in diesem Testgemisch zu keiner Abnahme der Fibrinogenbindung an Thrombozyten. 



   Bindung von PAC-1 an aktivierten Thrombozyten 
Der monoklonale Antikörper PAC-1 reagiert mit dem Glykoprotein   Ilb-Illa   Komplex an der Thrombozytenoberfläche nach Aktivierung der Thrombozyten mit ADP. 



   Die Blutabnahme erfolgte in EDTA/Trasylol. Danach wurde mit Plättchen angereichertes Blutplasma (PRP) und Plasma, in dem Blutplättchen abgereichert wurden (PPP) durch konventionelle Zentrifugation hergestellt. PRP wurde 1:40 in PPP verdünnt. Danach wurde PAC-1 mit ADP und gegebenenfalls Protein C oder aktiviertes Protein C zugesetzt und 10 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zusatz eines Anti-Maus-Antikörpers (fluorescence conjugated, FITC von Sigma Chemical Co. ) und einer weiteren Inkubationszeit von 20 min. wurde die Bindung des PAC-1 an Thrombozyten durch Flow cytometrische Untersuchung detektiert. 



   Fig. 4
Bindung des PAC-1 an PRP /ADP
Fig. 5
Die PAC-1 Bindung an Thrombozyten ist in Gegenwart von Protein C unterbunden. 



   Fig. 6
Aktiviertes Protein C führt zu keiner Beeinflussung der PAC-1 Bindung an ADP stimulierten Thrombozyten. 



   Blutplättchenablagerung am Subendothel im Perfusionsversuch 
Venöses Blut wurde antikoaguliert mit Citrat-Phosphat-Dextrose (19 mM). Protein C (Immuno AG) wurde rekonstituiert und zu 20 ml des antikoagulierten Blut vor der Perfusion zugegeben. Perfusionen wurden bei 37 C in einer Perfusionskammer durchgeführt (Versuchsbeschreibung in Thromb. Haemost., 37,1-16, 1977). Enzymatisch behandelte Aortastücke von Kaninchen wurden in eine Perfusionskammer eingebracht. Mittels einer Hämodialyse-Blutpumpe (Renal Systems, Minneapolis, Minn., USA) wurde eine angemessene Flussrate eingestellt. Nach 5 Minuten Perfusion wurden die Aortastücke mit Puffer gespült und fixiert (Glutaraldehyd:Formaldehyd= 2% :3% (v/v)). 



  Danach wurden diese in JB4 (Polyscience, Warrington, USA) eingebettet, mit Toluidinblau angefärbt und morphometrisch untersucht. Mit Hilfe eines Computer-Programms (beschrieben in Hae-   mostasis, 16, 8-14,1986) wurden die Blutplättchen folgendermassen klassifiziert : Adhäsion(Blut-   plättchenschicht <   5m),   Thromben   (Aggregationen #     5m),   beides ausgedrückt in % der Gesamtlänge des Blutgefässes. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angeführt. Bei Konzentrationen von weniger als 16  g/ml zeigte Protein C im Vergleich zur Kontrolle keine Wirkung auf die Adhäsion der
Blutplättchen. Bei Konzentrationen von 16 und 32  g/ml wurde die bedeckte Fläche signifikant reduziert. 

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   Tabelle 1   Blutplättchenablagerung   an Subendothel im Perfusionsversuch mit Citrat-antikoaguliertem Blut in Abhängigkeit von der Protein C-Konzentration (n=3, x SD) (Flussrate = 800 s-1) 
 EMI4.1 
 
<tb> 
<tb> beschichtete
<tb> Oberfläche <SEP> Adhäsion <SEP> Thromben
<tb> KONTROLLE <SEP> 18,15,3 <SEP> 9,3 <SEP> 4,5 <SEP> 8,8 <SEP> ¯ <SEP> 1,9
<tb> Protein <SEP> C
<tb> 
 
 EMI4.2 
 
 EMI4.3 
 
<tb> 
<tb> Protein <SEP> C
<tb> 32 <SEP>  g/ml <SEP> 9,6 <SEP> 5,7 <SEP> 4 <SEP> 2,5 <SEP> 5,6 <SEP> 3,4
<tb> 
 
PATENTANSPRÜCHE: 1. Verwendung von humanem Protein C zur Herstellung einer pharmazeutischen Präparation zur Verhinderung und Behandlung der Ablagerung bzw. Aggregation von Thrombozyten,
Thrombozytenmikropartikeln (dust) und Leukozyten mit prokoagulatorischer Aktivität an
Gefässoberflächen bzw.

   Gefässstenosen, insbesondere an verletztem, virusinfiziertem oder geschädigtem Endothel bzw. an exponiertem Subendothel oder künstlichen Gefässoberflä- chen bzw. Gefässprothesen mit oder ohne Endothel.

Claims (1)

1. 2. Verwendung nach Anspruch 1, mit der Massgabe, dass Protein C als natives Protein, als dessen Derivat oder Mutante mit einer R-G-D- Sequenz verwendet wird.

   3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, mit der Massgabe, dass das Präparat zur Verhinde- rung der arteriellen Restenose geeignet ist.

   4. Verfahren zur Verhinderung der Ablagerung bzw. Aggregation von Thrombozyten in vitro durch Zusatz einer wirksamen Menge an humanem Protein C.

   5. Verfahren zur Verhinderung der Ablagerung bzw. Aggregation von Thrombozyten in einer Zirkulationsvorrichtung zur extrakorporalen Behandlung von Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, dass eine geeignete Konzentration von Protein C der extrakorporal behan- delten Körperflüssigkeit zugegeben wird.

   HIEZU 6 BLATT ZEICHNUNGEN