ES2875875T3

ES2875875T3 - Pegamento de fibrina de un componente que comprende zimógenos

Info

Publication number: ES2875875T3
Application number: ES14830890T
Authority: ES
Inventors: Yair Pilpel; Ashley Deanglis; Yuri Zherdev; Sivan Doron; Anne J Gorman; Israel Nur
Original assignee: Omrix Biopharmaceuticals Ltd; Ethicon Inc
Current assignee: Omrix Biopharmaceuticals Ltd; Ethicon Inc
Priority date: 2013-12-24
Filing date: 2014-12-04
Publication date: 2021-11-11
Anticipated expiration: 2034-12-04
Also published as: AU2014372151A1; US10555991B2; CN105979960B; JP2017506089A; EP3875123A1; CN105979960A; US9814765B2; US20150174215A1; EP3086817A1; JP7146712B2; IL246150A0; IL246150B; EP3086817B1; US20170290949A1; IL291757A; JP2020000912A; BR112016014756A2; WO2015097687A1; BR112016014756A8; BR112016014756B1

Abstract

Una formulación de sellante que comprende fibrinógeno, zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K que comprenden por lo menos Factor II y Factor X, y por lo menos un inhibidor reversible de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K; en donde la formulación está libre de un inhibidor de trombina irreversible añadido, y en donde la proporción de zimógenos de coagulación dependientes de la vitamina K con el fibrinógeno es de 0,1 a 0,2 U/mg de proteína coagulable, normalizada al Factor II.

Description

DESCRIPCIÓN

Pegamento de fibrina de un componente que comprende zimógenos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

En la presente se proporciona una formulación de sellante de un solo componente, por ejemplo, en una forma líquida, métodos para su preparación, y métodos de uso de la misma.

ANTECEDENTES

Los sellantes de fibrina, también conocidos como pegamento de fibrina, se han usado en la clínica durante décadas (ver, por ejemplo, Tabélé, et al. J Pharm Pharmaceut Sci 2012, 15:124-140; Dickneite, G et al. Thrombosis Res 2003 112:73-82). A menudo, el sellante de fibrina consiste de dos componentes líquidos, un componente que comprende fibrinógeno y un componente que comprende trombina, que se almacenan congelados debido a su inestabilidad inherente. A veces, los productos sellantes de fibrina consisten de dos componentes secados por congelación, que requieren reconstitución inmediatamente antes de su uso y administración mediante una jeringuilla conjunta u otro dispositivo de administración de doble cilindro. Las formulaciones secadas por congelación son típicamente estables, pero el componente de fibrinógeno es difícil de reconstituir.

Un coágulo de sellante de fibrina se forma por reacciones enzimáticas que implican fibrinógeno, trombina y factor XIII. La trombina convierte el fibrinógeno en fibrina por acción enzimática a una tasa determinada por la concentración de trombina. El factor XIII, una enzima del sistema de coagulación sanguínea, reticula y estabiliza el coágulo de fibrina. Este proceso pasa por alto la mayoría de los pasos de la coagulación normal e imita su última fase. Algunos fabricantes añaden agentes antiproteolíticos a la formulación de pegamento de fibrina (por ejemplo, como se describe en la WO93/05822) o eliminan específicamente el plasminógeno para detener o retrasar la fibrinólisis (por ejemplo, como se describe en las Patentes de Estados Unidos N° 5.792.835 y 7.125.569).

El componente de trombina contiene la enzima trombina, que es una serina proteasa, y puede ser de origen humano o animal (por ejemplo, bovino o porcino) o producirse de manera recombinante. El componente de fibrinógeno puede ser de origen humano o animal o producirse de manera recombinante. Tras mezclar las soluciones de dos componentes, la trombina escinde el fibrinógeno, permitiendo por tanto que este último genere polímeros/sellante de fibrina.

La trombina muestra una alta especificidad hacia el fibrinógeno y escinde una secuencia definida en la molécula de fibrinógeno; sin embargo, a concentraciones muy altas, la trombina puede experimentar autoproteolisis. Las propiedades autoproteolíticas de la trombina pueden dar como resultado una actividad reducida e inestabilidad del componente de trombina del sellante de fibrina.

La técnica anterior incluye las Patentes de Estados Unidos N° 5.219.328; 5.318.524; 8.367.802; 6.500.427; 5.750.657; 6.262.236; 6.268.483; y la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2013/0149292.

La WO 2008/121330 se refiere a un método para elaborar una composición de fibrinógeno concentrado añadiendo un agente catiónico a un fluido que contiene fibrinógeno par formar un precipitado de fibrinógeno, recoger el precipitado de fibrinógeno, y suspender o solubilizar el concentrado de fibrinógeno en un vehículo líquido. La composición puede comprender uno o más factores de coagulación seleccionados del grupo que consiste de Factor II, Factor IX, Factor X y Factor XIII. La WO 97/29792 se refiere a una composición sellante de tejido de un solo componente que comprende tromboplastina y fibrinógeno como elementos esenciales. La composición puede comprender además iones de calcio y también se le pueden añadir factores de coagulación de la sangre adicionales como Factores II, V, VII, X y XII.

La WO 2012/045569 se refiere a un método para tratar trastornos hemostáticos que comprende administrar un tratamiento de factor de coagulación seleccionado de Factor II, concentrado de complejo de protrombina, y una combinación de tres factores de Factores II, X y VIIa. El tratamiento de factor de coagulación puede administrarse en combinación con fibrinógeno.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En la presente se proporcionan formulaciones de sellante estables de un solo componente, métodos de fabricación y las formulaciones de sellante para su uso en un método de cirugía, curación y/o reducción de la pérdida de sangre en un sujeto con necesidad de ello, que eliminan los pasos complicados implicados en la fabricación, preparación y/o uso de las formulaciones de sellante conocidas.

El alcance de esta invención está definido por las reivindicaciones. Las realizaciones en la descripción referentes a métodos de tratamiento no están cubiertas por las reivindicaciones. Cualquier “realización” del “ejemplo” que se divulga en la descripción pero no esté cubierta por las reivindicaciones debe considerarse que se presenta solamente con propósitos ilustrativos.

En un aspecto, se proporciona en la presente una formulación de sellante que comprende una cantidad eficaz de fibrinógeno, zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K que comprende por lo menos Factor II (FII) y Factor X (FX), y por lo menos un inhibidor reversible de por lo menos uno del zimógeno de coagulación dependiente de vitamina K; en donde la formulación está libre de un inhibidor de trombina irreversible añadido, y en donde la proporción de zimógenos de coagulación dependientes de la vitamina K con el fibrinógeno es de 0,1 a 0,2 U/mg de proteína coagulable, como se normaliza al Factor II.

El término "cantidad eficaz" para el fibrinógeno, los zimógenos de coagulación dependientes de la vitamina K y el inhibidor reversible son tales que, eficazmente, tiene lugar poca o ninguna activación prematura (por ejemplo, coagulación, coagulación y/o conversión de zimógeno a una enzima activa), pero la formulación se coagula espontáneamente y forma un sellante tras la dilución, neutralización, bloqueo y/o eliminación del inhibidor reversible. Por ejemplo, puede producirse coagulación espontánea y formación de sellante por contacto con una superficie de sangrado, después del intercambio de moléculas pequeñas y/o la adición de un activador, por ejemplo, calcio libre.

En algunas realizaciones, la formulación comprende además Factor V (FV).

En algunas realizaciones, los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K comprenden además Factor IX (FIX).

En algunas realizaciones, los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K comprenden además Factor VII (FVII).

En algunas realizaciones, el Factor X, el Factor VII y/o el Factor IX están, por lo menos parcialmente, en su forma activa.

En algunas realizaciones, la formulación está en forma líquida. En algunas realizaciones, la formulación comprende un portador farmacéuticamente aceptable. La formulación líquida muestra una estabilidad prolongada y permanece estable durante por lo menos 14 días a una temperatura ambiente seleccionada del grupo que consiste de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8° C. En algunas realizaciones, la formulación líquida permanece estable durante aproximadamente 30, 35, 45 días, 60 días y hasta 90 días o más, a una temperatura de aproximadamente 2° C a 8° C. "Temperatura ambiente" es la temperatura en el entorno donde se mantiene la formulación del sellante.

En algunas realizaciones, la formulación líquida es estable durante aproximadamente o por lo menos 7 días a una temperatura ambiente en un intervalo de aproximadamente 2° C y hasta la temperatura ambiente.

En ciertas realizaciones, la formulación líquida es estable durante aproximadamente 30 días a temperatura ambiente.

La "temperatura ambiente" se refiere típicamente a una temperatura de aproximadamente 20° C a 25° C. La formulación líquida puede ser una formulación líquida acuosa.

La estabilidad puede determinarse observando la coagulación espontánea mínima o su ausencia en la formulación, por ejemplo, la formulación no muestra o tiene coagulación espontánea en ausencia de un activador, tal como calcio libre, y retiene su nivel de actividad de coagulación tras la exposición al calcio. El nivel de actividad de coagulación o la capacidad de la formulación para formar un sellante puede determinarse in vitro y/o in vivo. La estabilidad también puede determinarse midiendo y observando la presencia de formación de fibrina mínima o su ausencia en la formulación acuosa lista para almacenamiento.

La polimerización o coagulación de fibrina puede medirse, por ejemplo, midiendo la longitud de migración en una superficie inclinada (o modelo de prueba de caída) o mediante cualquier otro método conocido en la técnica. La polimerización completa puede evaluarse interrumpiendo el flujo de la formulación líquida tras la inversión. La polimerización rápida puede medirse usando un analizador de coagulación Stat4 Stago Diagnostics o un coagulómetro similar.

El término "activador" se refiere a un agente que puede iniciar, facilitar y/o acelerar la conversión de un zimógeno en una enzima activa. El término "activador" en la presente es intercambiable con el término "iniciador".

En una realización, la fuente de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K es Protrombina-Proconvertina-Factor de Stuart-Factor antihemofílico B (PPSB) y/o un Concentrado de Complejo de Protrombina (PCC) de tres o cuatro factores.

En algunas realizaciones, el PPSB incluye los Factores II, VII, IX y X.

En algunas realizaciones, el PCC incluye los Factores II, IX y X (PCC de tres factores) y puede incluir además el Factor VII (PCC de cuatro factores).

En varias realizaciones, los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K son un concentrado de zimógenos de coagulación dependientes de la vitamina K que comprenden por lo menos FII y FX, concentrados aproximadamente de 2 a 50 veces en comparación con la concentración de estos zimógenos en plasma, normalizados al Factor II. El concentrado puede concentrarse de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 veces, aproximadamente 10 veces o aproximadamente 20 veces.

En varias realizaciones, los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K son un concentrado de PPSB, o zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K concentrados que comprenden por lo menos FII, FIX y FX, concentrados en aproximadamente 2-50 veces en comparación con la concentración de estos zimógenos en plasma, normalizados al Factor II. El concentrado de PPSB puede concentrarse de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 veces, aproximadamente 10 veces o aproximadamente 20 veces.

En algunas realizaciones, el fibrinógeno está presente en la formulación en una cantidad eficaz de aproximadamente 1 a 2 mg/ml, 1 a 110 mg/ml, 10 a 110 mg/ml, como de aproximadamente 40 mg/ml a 70 mg/ml.

En una realización, la proporción de los componentes activos: fibrinógeno, zimógenos de coagulación dependientes de la vitamina K y el inhibidor reversible de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de la vitamina K es tal que, tiene lugar efectivamente, una activación prematura mínima o nula (por ejemplo coagulación, coagulación y/o conversión de zimógeno en una enzima activa), sin embargo, la formulación se coagula espontáneamente y forma un sellante tras la dilución, eliminación del inhibidor reversible, bloqueo y/o neutralización del inhibidor, por ejemplo, por contacto con una superficie sangrante y/o después del intercambio de moléculas pequeñas y/o la adición de un activador, por ejemplo calcio libre.

"Un inhibidor reversible de un zimógeno de coagulación dependiente de vitamina K" es un agente que previene o reduce eficazmente la activación prematura (por ejemplo, coagulación, coagulación y/o conversión de un zimógeno en una enzima activa).

En algunas realizaciones, la formulación está libre de trombina añadida. Por consiguiente, no hay necesidad de un inhibidor de trombina y la formulación está libre de inhibidor de trombina irreversible añadido o está esencialmente libre de inhibidor de trombina irreversible. Un inhibidor de trombina irreversible comprende un grupo de moléculas que se unen a la trombina covalentemente o con una afinidad muy alta (por ejemplo, a un nivel picomolar), por ejemplo, hirudina, y/o destruyen un grupo funcional de la trombina o inactivan la trombina. Por ejemplo, la hirudina y la antitrombina III se consideran en la presente como ejemplos de tales inhibidores de trombina irreversibles. En algunas realizaciones, la formulación está libre de hirudina. En una realización, la formulación está libre de antitrombina III.

El término "libre de adición" en relación con los términos "libre de trombina añadida" y "libre de inhibidor de trombina irreversible añadido" significa que la formulación no está suplementada con trombina o inhibidor de trombina irreversible. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la formulación puede comprender cantidades bajas de trombina (por ejemplo, menos de 1 IU/ml de formulación) y/o inhibidor de trombina irreversible (por ejemplo, menos de 5 gM) originalmente presentes en la formulación y/o trombina formada espontáneamente en la formulación.

La formulación incluye por lo menos un inhibidor reversible de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K. Dicho inhibidor es un agente que puede prevenir sustancialmente el inicio y/o retarda la conversión de un zimógeno en una enzima activa. El inhibidor puede seleccionarse de heparina, un quelante de calcio, un inhibidor del sitio activo de serina proteasa reversible y una combinación de tales inhibidores.

Típicamente, un inhibidor reversible se refiere a un inhibidor de baja afinidad que no tiene un efecto permanente sobre la actividad de la proteína. Por lo tanto, típicamente la dilución eliminará el efecto inhibidor.

Por lo menos un inhibidor reversible del zimógeno de coagulación dependiente de la vitamina K puede ser la heparina. El inhibidor reversible del zimógeno de coagulación dependiente de vitamina K que inhibe la generación de una enzima activa puede ser un quelante de calcio, por ejemplo, un ion de citrato, EDTA, EGTA, oxalato o una combinación de tales quelantes de calcio.

En algunas realizaciones, el quelante de calcio es un ion de citrato, por ejemplo proporcionado por citrato de sodio. La formulación puede incluir de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM de citrato de sodio, o de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 25 mM de citrato de sodio. En algunas realizaciones, el quelante de calcio es EDTA y/o EGTA. La formulación puede incluir de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 2,5 mM de EDTA y/o EGTA. En algunas realizaciones, el quelante de calcio es oxalato. En algunas realizaciones, la formulación incluye una combinación de un ion de citrato, oxalato y EDTA y/o EGTA, por ejemplo EDTA y un ion de citrato proporcionado por citrato de sodio. En algunas realizaciones, la formulación comprende de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 2,5 mM de EDTA y/o EGTA.

En algunas realizaciones, el por lo menos un inhibidor reversible del zimógeno de coagulación dependiente de vitamina K es un inhibidor del sitio activo de la serina proteasa, por ejemplo, arginina, lisina, benzamidina o una combinación de tales inhibidores del sitio activo de la serina proteasa. La formulación puede incluir, por ejemplo, arginina en una cantidad de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 5% (p/v), de aproximadamente al 0,5% a aproximadamente el 4% (p/v) de arginina, o aproximadamente el 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5% o 4% (p/v) de arginina.

De acuerdo con la invención reivindicada, la proporción de zimógenos de coagulación (U) dependientes de vitamina K, que incluyen PPSB, zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K que comprenden por lo menos FII, FIX y FX, o PCC, a fibrinógeno (mg de proteína coagulable) es de 0,01 a 0,2, normalizado al Factor II. En algunas realizaciones, la proporción de aproximadamente 0,05 a 0,2, o de aproximadamente 0,1 a 0,2.

En algunas realizaciones, la proporción de zimógenos de coagulación (U) dependientes de vitamina K, que incluyen PPSB, zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K que comprenden por lo menos FII, y FX, o PCC, a fibrinógeno (mg de proteína coagulable) es de 0,01 a 0,2, normalizado al Factor II. En algunas realizaciones, la proporción es de aproximadamente 0,05 a 0,2, o de aproximadamente 0,1 a 0,2.

La formulación es preferiblemente estéril y libre de patógenos, por ejemplo mediante pasteurización y/o filtración.

Las formulaciones divulgadas anteriormente en la presente son útiles, por ejemplo, en hemostasis, curación y/o cirugía, que incluyen, sin limitación, fijación de injertos, curación de heridas y sellado de sitios de anastomosis. La formulación también puede usarse en cirugía plástica, por ejemplo, abdominoplastia; fijación de injertos de piel y órganos internos; curación de tejidos; tratamiento de quemaduras; y/o atenuar el sangrado de la herida. Además, la formulación es útil para el sellado de la duramadre, por ejemplo, en cirugía craneal o espinal.

Por consiguiente, en un aspecto, se proporciona una formulación de acuerdo con la invención para su uso en un método para proporcionar tratamiento hemostático; fijación de injerto, curación de heridas y/o anastomosis, a una superficie en un sujeto, que comprende aplicar a la superficie una formulación de acuerdo con la invención. El método incluye, sin limitaciones, abdominoplastia; curación de tejidos; tratamiento de quemaduras; y sellado de duramadre. El sujeto puede ser un sujeto humano.

En otro aspecto, se proporciona una formulación de acuerdo con la invención para su uso en curación, hemostasia y/o cirugía. Los usos incluyen, sin limitación, fijación de injertos; curación de heridas; anastomosis; abdominoplastia; curación de tejidos; tratamiento de quemaduras; y sellado de duramadre.

También se divulga un método para preparar un sellante en una superficie que comprende:

a) proporcionar una formulación de acuerdo con la invención; y

b) aplicar la formulación a la superficie en condiciones que faciliten la polimerización de fibrina en la superficie.

La superficie puede ser una superficie sangrante o no sangrante en un sujeto. La superficie también puede ser, por ejemplo, una superficie corporal, un órgano corporal externo o interno, un vaso sanguíneo o un tejido u órgano de injerto.

En algunas realizaciones, las condiciones descritas en el método anterior implican aplicar la formulación directamente a una superficie sangrante o no sangrante en un sujeto.

Se divulgan varias condiciones de activación. Por ejemplo, la mezcla de PPSB y fibrinógeno puede aplicarse directamente sobre un sitio de sangrado, en cuyo caso los inhibidores se diluyen y los zimógenos concentrados y el fibrinógeno funcionan para provocar rápidamente la hemostasia.

En algunas realizaciones, las condiciones implican (i) eliminar, diluir, bloquear y/o neutralizar el inhibidor reversible de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K y/o (ii) añadir un activador de moléculas pequeñas de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de la vitamina K.

El activador de moléculas pequeñas puede ser un fosfolípido o un catión, por ejemplo, un catión de calcio u otros cationes divalentes como magnesio, hierro o zinc o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el catión es un catión de calcio, proporcionado por CaCl2.

En algunas realizaciones, el activador de moléculas pequeñas es un fosfolípido como fosfatidilserina, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol o fosfatidiletanolamina.

Un activador de moléculas pequeñas o un inhibidor reversible tiene un peso molecular de hasta 1 kilodalton. En varias realizaciones, el paso de eliminar o diluir el inhibidor de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K se lleva a cabo pasando la formulación a través de un dispositivo de intercambio de moléculas pequeñas, por ejemplo, una columna antes o durante la aplicación a la superficie de un sujeto.

Típicamente, el intercambio de moléculas pequeñas es el reemplazo de un conjunto de moléculas pequeñas por otro conjunto. A menudo, la resina en la columna se preequilibra con las moléculas pequeñas que se desean en la formulación final y/o moléculas pequeñas que facilitan y/o aceleran la conversión de un zimógeno en una enzima activa. Las perlas de resina son típicamente porosas, estando los poros en el intervalo de pesos moleculares de aquellas moléculas que se van a reemplazar. En una realización, se hace pasar una formulación líquida que comprende los zimógenos y fibrinógeno a través de una columna que está empaquetada con la resina porosa. Los zimógenos y el fibrinógeno en la solución serán demasiado grandes para entrar en los poros de la resina y pasarán rápidamente a través de la columna. Sin estar limitados por el mecanismo, una molécula pequeña en la solución o formulación, por ejemplo los inhibidores reversibles, se desplazará por un camino más tortuoso, ya que pueden entrar y volver a salir de los poros de la resina, ralentizando de este modo en gran medida su tasa de migración a través del lecho de resina. Aquellas moléculas pequeñas con las que se ha preequilibrado la resina disfrutan de la ventaja de una ventaja significativa y, por tanto, salen de la resina junto con las proteínas (los zimógenos y el fibrinógeno). Por tanto, las sales de tampón y otras moléculas pequeñas se intercambian en este paso.

En algunas realizaciones, el por lo menos un inhibidor de zimógeno de coagulación dependiente de vitamina K se diluye en la superficie de la herida sangrante o no sangrante o en un órgano interno o externo de un sujeto. El sujeto puede ser un paciente humano. El dispositivo de intercambio de moléculas pequeñas incluye, por ejemplo, agua, solución salina, CaCl2 u otros cationes divalentes y/o un fosfolípido.

En algunas realizaciones, el paso de añadir el activador de moléculas pequeñas se lleva a cabo pasando la formulación a través de un dispositivo de intercambio de moléculas pequeñas que incluye el activador de moléculas pequeñas antes o durante la aplicación a la superficie.

En otra realización, la molécula pequeña se añade manualmente. En algunas realizaciones, el activador de moléculas pequeñas se selecciona de un fosfolípido y un catión divalente, como un catión de calcio y hierro. El dispositivo de intercambio de moléculas pequeñas puede contener, por ejemplo, un tampón que contiene catión de calcio.

En algunas realizaciones del método de formación/preparación/fabricación de un sellante, y/o en donde la formulación de sellante es para su uso en un método de tratamiento, los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K en la formulación comprenden por lo menos Factor II, Factor X y pueden comprender además Factor VII y/o Factor IX. La fuente de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K puede ser, por ejemplo, protrombina-proconvertina-Factor de Stuart-Factor antihemofílico B (PPSB) y/o concentrado de complejo de protrombina (PCC). En algunas realizaciones, el PPSB incluye los Factores II, VII, IX y X. El PCC puede incluir los Factores II y X y puede incluir opcionalmente además Factor IX, Factor V y/o Factor VII. En una realización, la fuente de zimógeno de coagulación dependiente de vitamina K es un concentrado de PPSB, concentrado aproximadamente de 2 a 50 veces en comparación con la concentración de zimógenos en plasma, normalizado a Factor IX y/o al Factor II. El concentrado de PPSB puede concentrarse aproximadamente de 4 a 40 veces, aproximadamente de 5 a 40 veces, aproximadamente 10 veces o aproximadamente 20 veces.

En algunas realizaciones del método de formación/preparación/fabricación de un sellante, y/o en donde la formulación de sellante es para su uso en un método de tratamiento, la formulación incluye un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la formulación es una formulación líquida.

En realizaciones preferidas de los métodos, la formulación líquida permanece estable durante por lo menos 14 días a una temperatura ambiente de aproximadamente 2° C a 8° C. En algunas realizaciones, la formulación líquida permanece estable durante por lo menos 30 días, 45 días, 60 días, hasta 90 días o más, a una temperatura ambiente de aproximadamente 2° C a 8° C.

En algunas realizaciones, la formulación líquida es estable durante aproximadamente o por lo menos 7 días a una temperatura ambiente en un intervalo de aproximadamente 2°C y hasta la temperatura ambiente.

En algunas realizaciones, la formulación está libre de trombina añadida y está esencialmente libre de un inhibidor de trombina irreversible como hirudina. Preferiblemente, la formulación está libre de antitrombina III añadida o sustancialmente libre de antitrombina III, un inhibidor de trombina irreversible.

El inhibidor de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K se selecciona de heparina (en ausencia de antitrombina III añadida), un quelante de calcio, un inhibidor del sitio activo de serina proteasas reversible y una combinación de tales inhibidores. El inhibidor de los zimógenos de coagulación dependiente de la vitamina K puede ser la heparina. El inhibidor de zimógenos de coagulación dependiente de vitamina K puede ser un quelante de calcio, por ejemplo, un ion de citrato, oxalato, EDTA, EGTA o una combinación de tales quelantes de calcio. En algunas realizaciones, el quelante de calcio es un ion de citrato, por ejemplo proporcionado por citrato de sodio. La formulación puede incluir de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM de citrato de sodio, o de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 25 mM de citrato de sodio.

En algunas realizaciones, el quelante de calcio es EDTA y/o EGTA. La formulación puede incluir de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 2,5 mM de EDTA y/o EGTA. En algunas realizaciones, el quelante de calcio es oxalato. La formulación puede incluir una combinación de un ion de citrato y EDTA y/o EGTA, por ejemplo, citrato de sodio y EDTA.

En algunas realizaciones del método de formación/preparación/fabricación de un sellante, y/o en donde la formulación de sellante es para su uso en un método de tratamiento, el por lo menos un inhibidor reversible de por lo menos un zimógeno de coagulación dependiente de vitamina K en la formulación es un inhibidor del sitio activo de la serina proteasa, por ejemplo, arginina, lisina, benzamidina o una combinación de tales inhibidores reversibles del sitio activo de la serina proteasa. La formulación puede incluir arginina en una cantidad de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 5% (p/v) de arginina, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 4%, o aproximadamente el 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5% o 4% de arginina.

En algunas realizaciones del método de formación/preparación/fabricación de un sellante, y/o en donde la formulación de sellante es para su uso en un método de tratamiento, la proporción de PPSB, zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K o PCC (U) a fibrinógeno (mg de proteína coagulable) en la formulación es de 0,01 a 1,0, normalizada al Factor II. En algunas realizaciones, la proporción es de aproximadamente 0,05 a 0,2, o de aproximadamente 0,1 a 0,2.

Se proporciona además un recipiente que comprende una formulación divulgada en la presente. En algunas realizaciones, el recipiente es una ampolla, un vial, un tubo de ensayo o una jeringuilla y similares. La formulación puede ser líquida o sólida.

En varias realizaciones, se proporciona una jeringuilla o un aplicador que contiene la formulación de la invención que se une a un dispositivo de intercambio de moléculas pequeñas. El dispositivo comprende un activador de moléculas pequeñas de un zimógeno de coagulación dependiente de vitamina K. El activador de moléculas pequeñas puede ser, por ejemplo, un fosfolípido o un catión divalente, como un catión de calcio y/o catión de hierro. El dispositivo de intercambio de moléculas pequeñas puede contener, por ejemplo, un tampón que contiene catión de calcio.

En otro aspecto, se proporciona un kit que comprende un recipiente como una ampolla, un vial o una jeringuilla que incluye la formulación como se ha divulgado en la presente anteriormente; opcionalmente, el kit incluye un dispositivo de intercambio de moléculas pequeñas y/o instrucciones de uso. Un kit puede incluir por lo menos un recipiente y por lo menos una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, ampollas, viales, jeringuillas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden estar hechos, por ejemplo, de vidrio, metal o plástico.

En algunas realizaciones, el dispositivo de intercambio de moléculas pequeñas es una columna de filtración en gel, por ejemplo, una columna de desalación desechable de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 ml para su uso mediante flujo por gravedad y/o centrifugación. El dispositivo puede incluir un solvente, por ejemplo agua o solución salina, y/o puede incluir una activador de moléculas pequeñas de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K, tal molécula siendo, por ejemplo, CaCl2. El dispositivo también puede ser cualquier dispositivo de filtración en gel disponible comercialmente de cualquier conformación.

Se divulga además en la presente un método de fabricación de una formulación de sellante de acuerdo con la invención, el método incluye los pasos de:

a) proporcionar un componente de fibrinógeno;

b) proporcionar un componente que comprende los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K que comprenden por lo menos FII, FX y opcionalmente FIX y/o FVII;

c) proporcionar un componente que comprende por lo menos un inhibidor reversible de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K; y

d) mezclar los componentes de a) a c);

en donde los componentes mezclados están libres de inhibidor de trombina irreversible añadido y libres de un activador de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K, y en donde la proporción de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K con el fibrinógeno es de 0,01 a 0,2 U/mg de proteína coagulable, normalizada al Factor II.

Los componentes pueden proporcionarse en cualquier combinación, por ejemplo, el componente de fibrinógeno puede combinarse con el componente que comprende el inhibidor reversible; el componente de fibrinógeno puede combinarse con el componente de zimógenos de coagulación dependiente de vitamina K; y/o el componente de zimógenos de coagulación dependiente de vitamina K puede combinarse con el inhibidor reversible.

El término "mezclar" significa mezclar los componentes en cualquier orden, cualquier combinación y/o subcombinación.

En algunas realizaciones, por lo menos uno de los componentes comprende FV. En otra realización, se mezcla un componente adicional que comprende FV con los componentes a) a c).

En algunas realizaciones, por lo menos uno de los componentes se proporciona en forma líquida, dando como resultado de este modo una formulación líquida.

Una formulación líquida puede secarse incluyendo un paso de secado como la liofilización.

En una realización, el método de fabricación comprende además un paso de secado, lo que da como resultado una formulación seca.

Se proporciona además una formulación de sellante que puede obtenerse mediante el método de fabricación de una formulación de sellante de acuerdo con la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona una formulación de sellante que comprende fibrinógeno; zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K que comprenden por lo menos Factor II, Factor IX y Factor X; y por lo menos un inhibidor reversible de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K, en donde la formulación está libre de inhibidor de trombina irreversible añadido. En otro aspecto, la invención proporciona un método para preparar un sellante en una superficie que comprende: proporcionar la formulación divulgada anteriormente en la presente; y aplicar la formulación a la superficie en condiciones que faciliten la polimerización de fibrina en la superficie.

En ciertas realizaciones, las condiciones que facilitan la polimerización de fibrina comprenden eliminar, neutralizar, bloquear y/o diluir el inhibidor reversible de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K pasando la formulación a través de un dispositivo de intercambio de moléculas pequeñas antes o durante la aplicación a la superficie de un sujeto. En algunas realizaciones, el por lo menos un inhibidor de zimógeno de coagulación dependiente de vitamina K se diluye en la superficie de la herida sangrante o no sangrante o en un órgano interno o externo de un sujeto. El sujeto puede ser un paciente humano. El dispositivo de intercambio de moléculas pequeñas incluye, por ejemplo, agua, solución salina, CaCl2 u otros cationes divalentes y/o un fosfolípido.

En varias realizaciones, la eliminación, bloqueo, neutralización o dilución del inhibidor de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K se lleva a cabo aplicando la formulación directamente a la superficie de una parte del cuerpo de un sujeto. Por ejemplo, la superficie puede ser un vaso sanguíneo o tejido u órgano sangrante.

En otro aspecto, la invención proporciona una formulación de sellante libre de calcio. Tal formulación puede obtenerse capturando todo el calcio inicialmente presente en uno de los componentes, por ejemplo, capturando el calcio usando un quelante como EDTA o EGTA, y eliminando el complejo de calcio-quelante formado, por ejemplo, usando un filtro de exclusión por tamaño.

Por consiguiente, en la presente se proporciona una formulación de sellante libre de calcio, por ejemplo, en forma líquida que comprende fibrinógeno; y zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K que comprenden por lo menos Factor II, Factor X y opcionalmente Factor IX.

El término "libre de calcio" significa que la formulación contiene menos de 1,25 mmol/l.

De acuerdo con la invención reivindicada, la formulación también está libre de inhibidor de trombina irreversible añadido.

En algunas realizaciones, dicha formulación libre de calcio no contiene ningún agente quelante.

En algunas realizaciones, los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K comprenden además Factor VII.

En algunas realizaciones, los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K son una PPSB, una fracción de plasma de PPSB o PCC.

En algunas realizaciones, los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K son una fracción de plasma de PPSB o PCC.

En algunas realizaciones, la formulación está libre de trombina añadida.

En algunas realizaciones, el inhibidor de trombina irreversible se selecciona del grupo que consiste de hirudina, inhibidores de trombina de moléculas pequeñas y antitrombina III.

Los inhibidores reversibles e irreversibles mencionados en la presente pueden ser sintéticos o naturales. Los zimógenos de coagulación dependientes de la vitamina K pueden ser un concentrado, concentrado aproximadamente de 2 a 50 veces en comparación con la concentración en plasma de zimógenos de coagulación dependientes de la vitamina K, normalizada al Factor IX y/o el Factor II, por ejemplo, un concentrado de complejo de protrombina (PCC) de PPSB. En algunas realizaciones, el PCC es un PCC de tres factores o un PCC de cuatro factores. La proporción de PPSB o PCC (U) a fibrinógeno (mg de proteína coagulable) es de 0,01 a 0,2 normalizada al Factor II.

La formulación puede comprender además un inhibidor reversible de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K, en donde el inhibidor de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K se selecciona del grupo que consiste de heparina (en ausencia de antitrombina añadida III), un inhibidor del sitio activo de la serina proteasa y una combinación de tales inhibidores de los zimógenos de coagulación dependientes de la vitamina K.

En algunas realizaciones, el inhibidor reversible de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K es un inhibidor del sitio activo de la serina proteasa. En algunas realizaciones, el inhibidor del sitio activo de la serina proteasa se selecciona del grupo que consiste de arginina, lisina, benzamidina y una combinación de dichos inhibidores del sitio activo de la serina proteasa. En una realización, el inhibidor del sitio activo de la serina proteasa es arginina.

La formulación puede usarse en hemostasis, sellado, adhesión de tejidos, fijación de injertos, curación de heridas o anastomosis.

También se divulga un método para preparar un sellante en una superficie que comprende: proporcionar la formulación líquida libre de calcio y aplicar la formulación a la superficie en condiciones que faciliten la polimerización de fibrina en la superficie.

En algunas realizaciones, la superficie es un vaso sanguíneo o un órgano corporal interno o externo.

En algunas realizaciones, las condiciones comprenden añadir un activador de moléculas pequeñas de zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K, por ejemplo, catión de calcio, provocando de este modo la polimerización de fibrina.

En varias realizaciones, la adición del activador de moléculas pequeñas se lleva a cabo pasando la formulación a través de un dispositivo de intercambio de moléculas pequeñas antes o durante la aplicación a la superficie de un sujeto. El dispositivo de intercambio de moléculas pequeñas incluye, por ejemplo, agua, solución salina, CaCl2 u otro catión divalente y/o un fosfolípido.

Las formulaciones de acuerdo con la invención pueden conservarse en un recipiente, por ejemplo una ampolla, un tubo de ensayo, un vial o una jeringuilla.

También se divulga un kit que comprende la formulación o el recipiente de acuerdo con la invención, un dispositivo de intercambio de moléculas pequeñas; y opcionalmente instrucciones de uso.

También se divulga un método de fabricación de la formulación de sellante libre calcio que comprende los pasos de:

a) proporcionar un componente de fibrinógeno;

b) proporcionar un componente que comprende zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K que comprenden por lo menos FII, FX y opcionalmente FIX y/o FVII;

c) proporcionar el inhibidor de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K; d) mezclar los componentes de a) a c), en donde los componentes mezclados están libres de inhibidor de trombina irreversible añadido, y en donde la proporción de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K con fibrinógeno es de 0,01 a 0,2 U/mg de proteína coagulable, normalizada al Factor II.

En algunas realizaciones, se proporciona por lo menos uno de los componentes en forma líquida, dando como resultado de este modo una formulación líquida. En algunas realizaciones, la formulación se seca.

En otro aspecto, se proporciona la formulación de sellante descrita en la presente para su uso en un método para proporcionar tratamiento hemostático; fijación de injerto, curación de heridas y/o anastomosis, a una superficie en un sujeto, que comprende aplicar a la superficie una formulación de sellante libre de calcio que comprende una cantidad eficaz de fibrinógeno; y zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K que comprende por lo menos FII, FX y un inhibidor de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K y/o Factor IX y/o Factor VII; en donde la formulación está libre de un inhibidor de trombina irreversible.

La formulación de sellante puede usarse para tratar, sin limitación, abdominoplastia; curación de tejidos; tratamiento de quemaduras; y sellado de la duramadre, hemostasis; fijación de injerto; curación de heridas; anastomosis. La superficie puede ser una superficie sangrante o no sangrante.

La invención proporciona la formulación de sellante descrita en la presente para su uso en un método para curar y/o reducir la pérdida de sangre en un sujeto con necesidad de ello, que comprende aplicar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación de acuerdo con la invención.

El término "una cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la dosis requerida para prevenir, mejorar y/o tratar una enfermedad, trastorno o afección. La dosis eficaz puede cambiarse dependiendo de la edad y el peso del sujeto, la enfermedad o afección, su gravedad y otros factores que pueden ser reconocidos por los expertos en la técnica.

También se divulga una formulación de sellante libre de calcio que comprende una cantidad eficaz de fibrinógeno; y zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K que comprende por lo menos FII, FX y un inhibidor reversible de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K y/o FIX; en donde la formulación está libre de un inhibidor de trombina irreversible para uso en hemostasis; fijación de injertos; curación de heridas; anastomosis. El uso incluye, sin limitación, abdominoplastia; curación de tejidos; tratamiento de quemaduras; y sellado de duramadre,

Los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K en las formulaciones divulgadas en la presente pueden comprender además Factor IX y/o Factor VII.

Las formulaciones divulgadas en la presente pueden comprender además Factor V.

El fibrinógeno puede prepararse a partir de la composición de sangre inicial. La composición de sangre puede ser sangre completa o fracciones de sangre, es decir, un producto de sangre completa como plasma. El fibrinógeno puede ser autólogo, humano, incluyendo plasma agrupado, o de origen no humano. También es posible que el fibrinógeno se prepare mediante métodos recombinantes o pueda modificarse químicamente.

En una realización de la invención, la solución de fibrinógeno está compuesta por un componente biológicamente activo (BAC) que es una solución de proteínas derivadas del plasma sanguíneo que además puede comprender agentes antifibrinolíticos como ácido tranexámico y/o estabilizantes como arginina, lisina, sus sales farmacéuticamente aceptables o mezclas de los mismos. El BAC puede derivarse de crioprecipitado, en particular crioprecipitado concentrado.

El término "crioprecipitado" se refiere a un componente sanguíneo que se obtiene a partir de plasma congelado preparado a partir de sangre completa. Un crioprecipitado puede obtenerse cuando el plasma congelado se descongela en frío, típicamente a una temperatura de 0-4° C, dando como resultado la formación de un precipitado que contiene fibrinógeno y factor XIII. El precipitado puede recogerse, por ejemplo, mediante centrifugación y disolverse en un tampón adecuado como un tampón que contiene cloruro de sodio 120 mM, citrato trisódico 10 mM, glicina 120 mM, clorhidrato de arginina 95 mM. La solución de BAC puede comprender factores adicionales como, por ejemplo, factor VIII, fibronectina, factor de von Willebrand (vWF), vitronectina, etc., por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 6.121.232 y la WO9833533. La composición de BAC puede comprender estabilizantes como ácido tranexámico y clorhidrato de arginina. La cantidad de ácido tranexámico en la solución de BAC puede ser de aproximadamente 80 a aproximadamente 110 mg/ml.

En otra realización, la concentración de plasminógeno y plasmina en la composición de BAC se reduce a igual o menos de 15 pg/ml como, por ejemplo, 5 pg/ml o menos de plasminógeno, por ejemplo, usando un método como se describe en la US 7.125.569, la EP 1.390.485 y la WO02095019. En otra realización de la invención, cuando se reduce la concentración de plasminógeno y plasmina en la composición de BAC, la composición no contiene ácido tranexámico ni aprotinina.

La solución de fibrinógeno puede ser el componente BAC2 (de EVICEL®) o cualquier otra solución que contenga fibrinógeno, como fibrinógeno recombinante purificado o crioprecipitado producido a partir de plasma humano.

Estos y otros aspectos y realizaciones de la invención resultarán evidentes con referencia a la siguiente descripción detallada de la invención y las figuras.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Fig. 1 muestra la coagulación de fibrina de una formulación líquida de PPSB/BAC2 (BAC2 como fuente de fibrinógeno) después de su aplicación sobre un trozo de corion (derivado de piel bovina) recubierto con factor tisular y calcio. La formación de coágulos se determinó monitorizando la gelificación de la formulación y el hecho de que la formulación dejó de fluir. La formación de trombina (placa izquierda, flechas) se observó por coloración (se añadió un sustrato cromogénico para trombina a las muestras) del coágulo 30 segundos después de la aplicación al corion recubierto. La Fig. muestra el coágulo 3 minutos después de la aplicación. No se observó coagulación o color con una solución líquida que comprendía solución salina y BAC2 (placa derecha).

La Fig. 2A es un gráfico que muestra el efecto de añadir un porcentaje creciente de PPSB preparado a una concentración 10X (10 IU de Factor Il/ml) a BAC2 (fibrinógeno) sobre el tiempo de coagulación.

La Figura 2B es un gráfico que muestra el efecto de cambiar la proporción de Factor II y BAC2 sobre el tiempo de coagulación.

La Fig. 3 muestra el tiempo de coagulación de una formulación que incluye PPSB preparada a una concentración 10X (10 IU de Factor II/ml) y BAC2 frente a una formulación que incluye plasma y BAC2 en diferentes proporciones.

La Fig. 4A muestra una formulación líquida de PPSB-fibrinógeno sometida a intercambio de moléculas pequeñas haciendo pasar la formulación a través de una columna comercial pre-equilibrada con un tampón que carece de CaCl2. No se produjo coagulación incluso después de varios días.

La Fig. 4B muestra una formulación líquida de PPSB-fibrinógeno sometida a un intercambio de moléculas pequeñas haciendo pasar la formulación a través de una columna comercial pre-equilibrada con un tampón que incluye 40 mM de CaCl2. Después del intercambio, se formó espontáneamente un coágulo de fibrina en el plazo de 12-24 minutos.

La Fig. 5 muestra el efecto de aumentar la concentración de calcio en una formulación de PPSB-BAC2 sobre la velocidad de formación de coágulos (8-40 mM).

La Fig. 6 muestra el tiempo de coagulación para formulaciones líquidas de PPSB: fibrinógeno con o sin heparina almacenadas a 4° C o 23° C.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la invención se refiere a una formulación de sellante como se define en la reivindicación 1, dicha formulación comprendiendo fibrinógeno; zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K que comprenden por lo menos Factor II y Factor X; y un inhibidor reversible de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K, en donde la formulación está libre de un inhibidor de trombina irreversible añadido, y en donde la proporción de zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K con fibrinógeno es de 0,01 a 0,2 U/mg de proteína coagulable, normalizada a Factor II.

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que una única formulación que comprende zimógenos de protrombina (por ejemplo, PPSB que incluye los Factores II, IX, X y VII) y fibrinógeno (por ejemplo, BAC2) es útil como sellante biológico, es estable y presenta una vida útil prolongada, determinada por la capacidad de la formulación para formar un coágulo, por ejemplo, después de un almacenamiento prolongado. La estabilidad puede determinarse observando una coagulación espontánea mínima o su ausencia en la formulación, por ejemplo, la formulación no muestra o tiene coagulación espontánea en ausencia de un activador, como calcio libre, y tiene un nivel de actividad de coagulación aceptable tras la exposición al activador.

Se descubrió que el almacenamiento de una formulación de PPSB: fibrinógeno a 2-8° C durante hasta 28 días o hasta 90 días dio como resultado una formulación estable que tiene un tiempo de coagulación rápida tras la adición de CaCl2. Sin desear estar limitados por la teoría, después del almacenamiento a 2-8° C, puede producirse una conversión de los zimógenos del Factor X, VII y/o IX en una conformación activa, aunque la inhibición de la arginina y el citrato, acortando de este modo el tiempo requerido para la generación de trombina activa (después de la adición de calcio) y, en consecuencia, de formación de coágulos. Se descubrió que esta coagulación rápida se evita cuando la formulación almacenada a 2-8°C comprendía 0,125 lU/ml de heparina.

Se descubrió que el almacenamiento de una formulación de PPSB: fibrinógeno a RT durante hasta 28 días dio como resultado una formulación estable que tiene un tiempo de coagulación sustancialmente inalterado tras la adición de CaCl2.

En una realización, la formulación comprende Factor X, VII y/o IX en su forma activa.

Se descubrió que se obtenía un tiempo de coagulación rápido en presencia tanto de CaCl2 como de factor tisular.

En otro aspecto, la invención se refiere a una formulación libre de calcio e incluye fibrinógeno y zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K que comprenden por lo menos Factor II y Factor X.

En algunas realizaciones, las formulaciones comprenden además factor IX y/o Factor VII.

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que una única formulación que comprende zimógenos de protrombina y fibrinógeno es útil como sellante biológico, es estable y muestra una larga vida útil, determinada por la capacidad de la formulación para formar un coágulo. La estabilidad puede determinarse observando una coagulación espontánea mínima o ausencia de ella en la formulación, por ejemplo, la formulación no muestra o tiene coagulación espontánea en ausencia de un activador como calcio libre, y tiene un nivel de actividad de coagulación aceptable tras la exposición al activador.

Los términos "estable" y "estabilidad" cuando se refieren a una mezcla líquida, significan sustancialmente una ausencia de polimerización/coagulación de fibrina en la formulación antes de que entre en contacto con el activador y/o antes de que se elimine, neutralice, bloquee y/o diluya el inhibidor reversible.

El nivel de actividad de coagulación o la capacidad de la formulación para formar un sellante puede determinarse in vitro y/o in vivo. La estabilidad también puede determinarse midiendo y/o observando la presencia de formación de fibrina mínima o ausencia de ella en la formulación acuosa lista para almacenamiento.

La coagulación puede medirse, por ejemplo, midiendo la longitud de migración en una superficie inclinada (o modelo de prueba de caída) o mediante cualquier otro método conocido en la técnica. La coagulación completa puede evaluarse interrumpiendo el flujo de la formulación líquida, por ejemplo, tras la inversión. La polimerización rápida puede medirse usando un analizador de coagulación Stat4 Stago Diagnostics o un coagulómetro equivalente.

Un nivel de actividad de coagulación aceptable significa, por ejemplo, la capacidad de la formulación para formar un coágulo en el plazo de 30 minutos o menos después de la adición de calcio, y menos de 5 minutos después de la adición de calcio y factor tisular; y/o in vivo, por ejemplo, en el plazo de 5 minutos después de la adición de calcio y/o al contacto con el factor tisular (por ejemplo, factor tisular endógeno).

En una realización, la capacidad de la formulación para formar un coágulo varía entre 30 segundos y 120 segundos en una superficie sangrante que contiene factor tisular, y entre 60 segundos y 600 segundos en una superficie no sangrante.

La protrombina, el precursor inactivo de la trombina, no muestra actividad proteolítica hasta que la forma activa de la enzima se genera mediante la escisión proteolítica de la protrombina por el Factor Xa (factor X activado). Cuando se desea, la protrombina puede activarse a trombina para convertir el fibrinógeno en fibrina y la polimerización de fibrina concomitante. La protrombina y el fibrinógeno, a diferencia de la trombina y el fibrinógeno, son estables juntos en solución.

En una realización de la formulación divulgada en la presente, la protrombina (Factor II) se incluye junto con el Factor X para su activación. El Factor VII y el Factor IX se incluyen opcionalmente. Sin desear estar limitados por la teoría, la presencia de protrombina y la ausencia de trombina concomitante proporciona una formulación en la que la conversión cinética de fibrinógeno en fibrina puede controlarse bien. Por lo tanto, el sellante de fibrina puede usarse en indicaciones en las que el sellante clásico es ineficaz, por ejemplo, en la fijación de injertos. Los zimógenos activados endógenos pueden facilitar la conversión de protrombina en trombina en el sitio de la herida.

En una realización, a una mezcla de precursores enzimáticos inactivos (también denominados zimógenos) se hace referencia como PPSB.

En algunas realizaciones, un concentrado del PPSB es un concentrado de complejo de protrombina (PCC). El PCC puede ser un PCC de tres factores (3F-PCC) con FII, FIX y FX, o un PCC de cuatro factores (4F-PCC) que también incluye el Factor VII.

En la presente se divulga un sellante de fibrina en el que todos los componentes requeridos para formar una fibrina se encuentran en una única formulación que puede aplicarse con una sola jeringuilla, lo que mejora la facilidad de uso y la conveniencia.

Como se usa en la presente, los artículos indefinidos "un" y "uno" significan "por lo menos uno" o "uno o más" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Como se usa en la presente, los términos "que comprende", "que incluye", "que tiene" y variantes gramaticales de los mismos deben tomarse como especificación de las características, pasos o componentes indicados, pero no excluyen la adición de una o más características, pasos, componentes o grupos de los mismos adicionales.

Cuando un valor numérico está precedido por el término "aproximadamente", se pretende que el término "aproximadamente" indique /- 10%.

"Trombina" o "polipéptido de trombina" es una serina proteasa de mamífero que forma parte de la cascada de coagulación sanguínea y convierte el fibrinógeno en monómeros de fibrina que se ensamblan en cadenas insolubles de fibrina, además de catalizar otras reacciones relacionadas con la coagulación. En los humanos, la protrombina está codificada por el gen F2, y el polipéptido resultante se escinde proteolíticamente en la cascada de coagulación para formar trombina. La trombina sirve, entre otras cosas, como componente activo en varios productos de hemostasis. Por ejemplo, los sellantes de fibrina comprenden típicamente un componente de fibrinógeno y un componente de trombina. Cuando se mezclan ambos componentes (por ejemplo, cuando se aplica a una herida sangrante), la trombina escinde el fibrinógeno y se forma un polímero de fibrina.

La trombina es una serina proteasa que resulta de la escisión de la protrombina (Factor II), un precursor del zimógeno, por otra serina proteasa (Factor Xa). La trombina humana es una proteína de 295 aminoácidos compuesta por dos cadenas de polipéptidos unidas por un enlace disulfuro.

En la técnica se reconocen varios inhibidores de trombina. Un inhibidor de trombina irreversible comprende un grupo de moléculas que se unen covalentemente a trombina o se unen a la trombina con una afinidad muy alta y/o un grupo de moléculas que destruyen un grupo funcional en la trombina o hacen que la trombina sea inactiva. Por ejemplo, la hirudina y la antitrombina III se consideran en la presente como inhibidores de trombina irreversibles. La trombina se une a la antitrombina III de tal manera que la trombina no se libera del complejo. Como se usa en la presente, un inhibidor de trombina que se une a trombina con una afinidad alta (sub-microM) se considera irreversible. Un ejemplo de ello es la hirudina, que se une a la trombina en el rango picoM.

En algunas realizaciones, la formulación divulgada en la presente está libre de trombina añadida y está libre de un inhibidor de trombina. Pueden proporcionarse zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K como, por ejemplo, PPSB o PCC. Un ejemplo de un concentrado de PCC 20xveces es Octaplex® (Octapharma, Viena). Los ejemplos no limitativos de PCC incluyen Beriplex®, Ocplex®, Kcentra®, Cofact®, entre otros.

Para el almacenamiento a largo plazo, la formulación se divide en alícuotas en viales, ampollas u otros recipientes estériles, por ejemplo, una jeringuilla u otro aplicador, que luego se sellan. En una realización, se usa un recipiente que permite la extracción de la formulación con una jeringuilla a través del sello. El recipiente se etiqueta de acuerdo con la práctica estándar en el campo de dispositivos médicos o farmacéuticos. Para su uso, la formulación de sellante puede usarse directamente desde el recipiente de acuerdo con las necesidades del paciente individual y la gravedad del sangrado. La formulación puede aplicarse al tejido sangrante para lograr la hemostasis.

La formulación líquida divulgada en la presente es ventajosa porque permanece estable durante por lo menos 14 días, 30 días, 45 días, 60 días o hasta 90 días, a una temperatura ambiente de aproximadamente 2° C a 8° C o por lo menos 7 días a una temperatura ambiente en un intervalo de aproximadamente 2° C y hasta temperatura ambiente o durante aproximadamente 30 días a temperatura ambiente.

Se evalúa la estabilidad de la formulación probando su capacidad para formar un sellante cuando (i) se elimina, diluye, neutraliza y/o bloquea el inhibidor de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de la vitamina K y/o (ii) se añade un activador de moléculas pequeñas de los zimógenos de coagulación dependientes de la vitamina K.

La formulación de acuerdo con la presente invención puede congelarse o liofilizarse.

Entre otras, las ventajas de las presentes formulaciones son múltiples y pueden ser por lo menos una de las siguientes: larga vida útil, por ejemplo, estable como se define en la presente; buen control de la cinética de generación de fibrina, por ejemplo, efectivamente sin polimerización prematura; no se requiere la purificación de trombina, reduciendo de este modo el costo asociado con la fabricación; y/o fácil de usar y conveniente de preparar; es decir, menos componentes y no se requiere ensamblaje por parte del médico asistente.

El término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier diluyente o vehículo que sea adecuado para uso humano o en otro animal. Por ejemplo, "un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable" se refiere a reactivos, compuestos, materiales, composiciones, diluyentes que son compatibles con los constituyentes de la formulación y adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otra complicación excesiva acorde con una relación beneficio/riesgo razonable. Un portador farmacéuticamente aceptable adecuado para su uso con la formulación divulgada en la presente incluye materiales líquidos, semisólidos y sólidos.

Una "superficie" es una posición o ubicación donde se desea formar el sellante o el pegamento. La superficie depende del uso del sellante. El sellante puede usarse, por ejemplo, en hemostasis, fijación de tejidos, fijación de injertos, curación de heridas y anastomosis. Las formulaciones, métodos y kits divulgados en la presente pueden usarse interna y externamente, para la fijación de injertos de órganos y tejidos, para sellar una herida quirúrgica, en cirugía vascular que incluye proporcionan hemostasis y para anastomosis como anastomosis arteriales, gastrointestinales y traqueales.

La superficie puede ser una superficie externa de la piel que puede verse sin ayuda y una superficie de una parte interna del cuerpo que forma parte de la anatomía interna de un organismo. Las superficies externas incluyen, pero no se limitan a, la piel de la cara, la garganta, el cuero cabelludo, el pecho, la espalda, las orejas, el cuello, la mano, el codo, la cadera, la rodilla y otras zonas de la piel. Los ejemplos de partes internas del cuerpo incluyen, pero no se limitan a, cavidades corporales o aberturas anatómicas que están expuestas al ambiente externo y órganos internos como las fosas nasales; los labios; los oídos; el área genital, incluyendo el útero, la vagina y los ovarios; los pulmones; el ano; el bazo; el hígado; y el músculo cardíaco. La superficie puede ser un sitio sangrante o no sangrante. La superficie también puede ser una superficie de trabajo fuera del cuerpo.

Un "sujeto", como se usa en la presente, incluye animales de origen mamífero, incluyendo humanos. En una realización, un sujeto es un paciente quirúrgico o un paciente herido.

Aunque los siguientes ejemplos demuestran ciertas realizaciones de la invención, no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención, sino más bien como una contribución a una descripción completa de la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Preparación de una formulación de sellante de un único componente que comprende zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K y fibrinógeno

El PPSB, una fuente de los zimógenos de coagulación dependientes de la vitamina K, se produjo de manera estándar como se describe en la técnica (Production of plasma proteins for therapeutic use. Joseph Bertolini, Neil Goss, John Curling. 2013 Wiley Press).

Brevemente, el PPSB concentrado se produjo cargando plasma humano crio-empobrecido en una columna de intercambio aniónico DEAE y eluyendo con una solución salina concentrada (NaCl 0,25 M) que también incluye citrato de sodio 10 mM (NaCitrato). El PPSB se concentró entre 4 y 16 veces frente al plasma, determinado por la concentración de protrombina (Factor II).

La mezcla comprendía todos los zimógenos de coagulación dependientes de la vitamina K que típicamente se unen a las columnas de intercambio aniónico (como FVII, FIX, proteína C y proteína S y FX), sus cozimógenos asociados (FV y FVIII) y cualquier otra proteína que se coeluye.

Los inhibidores de zimógenos de coagulación dependientes de la vitamina K (por ejemplo, NaCitrato, EDTA) sirvieron para quelar los iones de calcio y prevenir la activación prematura de cualquiera de los complejos de protrombina que comprenden FII, FV y FX, o cualquier otro proceso dependiente de Ca2+ como la activación del complejo Tenase (FVIII y FIX) o activación de FXIII.

Se añadió un concentrado de PPSB 10 veces mayor a una solución de fibrinógeno, la mezcla compuesta entre una concentración del 3-4% de proteína coagulable (fibrinógeno al 7% diluido 1:1 con PPSB). La solución de fibrinógeno usada en los Ejemplos fue BAC2 (un componente que comprende fibrinógeno de sellante de fibrina EVICEL®). La proporción final entre FIX y fibrinógeno fue de 0,14 unidades/mg (es decir, 0,14 Unidades (U) de FIX por mg de fibrinógeno). Se demostró que esta mezcla era estable a 2-8° C durante por lo menos tres meses sin mostrar ninguna formación prematura de coágulos de fibrina.

Ejemplo 2: Formación de coágulos usando la formulación de sellante de un solo componente

Para evaluar la capacidad de la formulación del sellante de un solo componente para formar un coágulo, se creó un sitio de sangrado simulado usando un trozo de corion (piel bovina) recubierto con una capa de reactivo PT (tiempo de protrombina) que contenía factor tisular (Diagnostica Stago STA Neoplastin CI Plus, N° de Cat. 00606) y calcio, a aproximadamente 15-25 mM.

Se aplicó una solución líquida que comprendía volúmenes iguales de PPSB y BAC2 (como se preparó en el Ejemplo 1) al corion recubierto de factor tisular y se evaluó la tasa de formación de coágulos mediante el ensayo PT, una prueba que mide cuánto tiempo se tarda en formar un coágulo, típicamente, después de la adición de factor tisular y calcio.

La arginina presente en BAC2 tiene un efecto inhibidor sobre la actividad de la trombina, sin embargo, no es suficiente para inhibir o inactivar completamente la trombina que se genera (a partir de la protrombina) a través de la vía del factor tisular. Típicamente, el NaCitrato, presente en BAC2 y PPSB, inhibe la generación de enzimas activas mediante la quelación del calcio. Sin embargo, el reactivo de PT contiene calcio a un nivel suficiente para superar el efecto inhibidor del NaCitrato.

La coagulación se observó inicialmente ~30 segundos después de aplicar la solución líquida sobre el corion recubierto y el coágulo era completamente sólido después de aproximadamente 1 minuto y 30 segundos. Como control, se aplicó una solución que comprendía volúmenes iguales de BAC2 y solución salina al corion recubierto y se evaluó la formación de coágulos. En ausencia de PPSB, no se formó ningún coágulo durante el período de observación (más de 30 minutos).

Para evaluar adicionalmente las propiedades enzimáticas de la formulación de sellante líquida (PPSB/BAC2), se añadió un sustrato de trombina cromogénica [HD-Fenilalanil-L-pipecolil-Larginina-p-nitroanilina diclorhidrato. S-2238TM Chromogenix] a las dos muestras (PPSB/BAC2 y BAC2/solución salina). La muestra de PPSB/BAC2 (placa izquierda en la Fig. 1) se volvió amarilla debido a la generación de trombina y la escisión del sustrato cromogénico. Sin embargo, la muestra de BAC2/solución salina (placa derecha) no se volvió amarilla, lo que indica que no se generó trombina en la muestra.

La Fig. 1 muestra la coloración del coágulo de PPSB/BAC2 después de una incubación de tres minutos (izquierda). Esta coloración ya era evidente 30 segundos después de la aplicación. No se observó color con la muestra de BAC2/solución salina (derecha).

Ejemplo 3: Efecto de la proporción de zimógenos (PPSB) a fibrinógeno sobre el tiempo de coagulación En este experimento, se usaron BAC2 con una concentración de fibrinógeno de 70 mg/ml y PPSB, ambos como se ha descrito anteriormente. La cantidad de Factor IX y protrombina (Factor II) presentes en el PPSB fue aproximadamente 10 veces mayor que la cantidad presente en el plasma, es decir, aproximadamente 9,8 IU/ml de Factor IX y 10 IU/ml de Factor II. El PPSB y el BAC2 se mezclaron en diferentes proporciones, ver la Fig. 2A, y el tiempo de coagulación se midió mediante el ensayo PT usando un analizador de coagulación (Diagnostica Stago Start4). La coagulación se indujo añadiendo el reactivo Neoplastin PT que comprende tanto calcio como factor tisular que se unen al Factor VII iniciando de este modo la vía extrínseca de la coagulación. Se combinaron 100 pl de reactivo Neoplastin PT (bien mezclado a 37° C) con 50 pl de muestra de prueba (la mezcla de BAC2 y PPSB en las diferentes proporciones de volumen, por ejemplo, 90:10, 80:20, 70:30 y así sucesivamente, respectivamente). La muestra de prueba se incubó a 37° C durante 60 segundos antes del ensayo en los pocillos de incubación del analizador. La concentración de fibrinógeno fue variable dependiendo de la proporción de volumen de BAC2 y PPSB, sin embargo, en cualquier caso, el fibrinógeno estaba presente en la muestra en exceso (incluso si se diluyó 20:1 con PPSB), y por lo tanto, sin estar limitados a la teoría, el factor de limitación de la tasa fue la tasa de activación enzimática.

Las Figs. 2A-2B y la Tabla 1 muestran el tiempo de coagulación de las diferentes formulaciones. La Fig. 2A muestra la coagulación en función del porcentaje de PPSB en BAC2, y la Fig. 2B y la Tabla 1 muestran la coagulación en función de la proporción de Factor II a fibrinógeno (U por mg). Típicamente, el Factor II se usa para expresar la actividad de PPSB en productos disponibles comercialmente. La cantidad de Factor IX y protrombina presentes en la PPSB es aproximadamente 10 veces mayor que la cantidad presente en el plasma, es decir, 10 IU/ml de Factor II.

Tabla 1: Tiempo de coagulación (en seg.) de solución de PPSB:BAC2 que tiene if r n r r i n FII fi rin n ni r m .

Los resultados en la Fig. 2A y la Tabla 1 muestran que el volumen de PPSB creciente (normalizado por el Factor II) en comparación con el volumen de fibrinógeno (BAC2) disminuyó el tiempo de coagulación de la mezcla. Al 50% de PPSB en BAC, el tiempo de coagulación fue de aproximadamente 17,5 segundos y disminuyó ligeramente con cantidades mayores de PPSB.

Ejemplo 4: Efecto de la sustitución del plasma por PPSB

El presente experimento examina el efecto de usar plasma en lugar de PPSB en la formulación.

Las formulaciones que comprenden plasma/BAC2 y PPSB/BAC2 se prepararon en las siguientes proporciones de volumen: 1-50% de ^pP^sB 50% de BAC2; 2-20% de PPSB 80% de BAC2; 3-20% de plasma 80% de BAC2; y 4-50% de plasma 50% de BAC2. Se preparó PPSB como en el Ejemplo 1 (FIX concentrado 10x, FII en comparación con plasma),

Como en el Ejemplo 3 anterior, se indujo la coagulación con factor tisular (TF) y calcio.

Los resultados de la Fig. 3 muestran que utilizando formulaciones de igual porcentaje de volumen (1-4 y 2 3), se obtuvo un tiempo de coagulación más rápido con la formulación de PPSB/BAC2 (1 y 2) en comparación con la formulación de plasma/BAC2 (3 y 4, respectivamente).

Estos resultados demuestran que puede usarse el PPSB, que está enriquecido en zimógenos de coagulación dependientes de la vitamina K, y el fibrinógeno para acelerar la formación de coágulos.

Ejemplo 5: Formación de coágulos de fibrina usando una columna de intercambio de moléculas pequeñas Se preparó una formulación que comprendía PPSB y BAC2 de la siguiente manera: se preparó PPSB como en el Ejemplo 1 y se mezcló en una proporción volumétrica de uno a uno con BAC2, proporcionando finalmente aproximadamente un 3,5% (p/v) de proteína coagulable [la BAC2 inicial contenía 70 mg/ml (o 7% de proteína coagulable, principalmente fibrinógeno)] y un PPSB que se concentró aproximadamente 5 veces en comparación con el plasma (aproximadamente 0,14 unidades internacionales (IU) de Factor II por mg de fibrinógeno). La formulación también incluía 1-2 mM de EDTA, 10 mM de NaCitrato, 1% (p/v) de arginina*HCl y tampón de glicina y acetato (pH 7,0; el tampón comprendía un 1% (p/v) de glicina y 20 mM de acetato).

La formulación se pasó a través de una columna giratoria de intercambio de tampón disponible comercialmente (columnas de desalación PD-10 desechables, código de producto: 17-0851-01, GE Healthcare) o preequilibrada con solución de CaCl2 (40-50 mM) o con agua 1% (p/v) de tampón de glicina que contiene un 2% (p/v) arginina (pero no CaCh) y se recogió el flujo a través de la formulación en un tubo.

La coagulación se evaluó invirtiendo el tubo que contenía la formulación intercambiada con tampón.

Los resultados muestran que una formulación que pasó por la columna preequilibrada con CaCl2 coaguló espontáneamente (Figura 4B) en el plazo de menos de 30 minutos, mientras que la formulación que pasó a través del tampón sin CaCl2 no coaguló, incluso después de varios días (Figura 4A).

Ejemplo 6: El efecto de la concentración de CaCl2 sobre la tasa de formación de coágulos de fibrina

El siguiente ejemplo explora el efecto de añadir una concentración diferente de CaCl2 a la formulación del sellante de un solo componente sobre la tasa de formación de coágulos.

Se mezcló una formulación de PPSB10 IU FII/ml de PPSB10:BAC2 enriquecida 10 veces (1:1 preparada como en el ejemplo 1, y sin EDTA) con un reactivo PT (una mezcla de factor tisular y fosfolípidos y que carece de calcio). Se suplementó CaCl2 a concentraciones crecientes a la mezcla y se midió el tiempo de coagulación.

Los resultados se ven en la Fig. 5. Se observó una coagulación rápida (<20 segundos medido usando un analizador de coagulación Stat4 Stago Diagnostics) a de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 30 mM de calcio.

Ejemplo 7: Efecto del CaCl2 sobre la formación de coágulos

Se ha descubierto que se formó un coágulo tras la adición de calcio a la formulación estable. En este experimento, no se añadió reactivo PT (es decir, no se añadió factor tisular ni fosfolípidos). Los experimentos con PPSB enriquecido 10 veces (en comparación con el plasma) mezclado 1:1 con BAC2 mostraron que el tiempo de coagulación se podía lograr entre 5-10 minutos añadiendo calcio 10 mM en ausencia de factor tisular.

Ejemplo 8: Evaluación de la estabilidad de formulación de PPSB:BAC2 a 2-8° C.

En este ejemplo, se evaluó la estabilidad de la formulación de sellante de fibrina de un solo componente que contiene PPSB y fibrinógeno a una temperatura de 2-8° C.

Para este propósito, se incubó una formulación de PPSB-BAC2 (proporción de 0,14 U FII por mg de fibrinógeno) a 2-8° C para diferentes puntos temporales (hasta 90 días), y se probó la capacidad de la formulación para formar un coágulo en el plazo de 30 minutos.

La formación de coágulos se inició sometiendo la formulación a una columna preempaquetada PD-10 (Sephadex™ G-25, GE Healthcare 17-0851-01). La columna se equilibró con 5 ml de tampón que contenía CaCl250 mM (Sigma) y NaAcetato 20 mM pH 7,00 (Sigma) tres veces en modo de gravedad. Se aplicaron 5 ml adicionales de CaCl2 a la columna y la columna se centrifugó durante 2 min a 1000 g a 20° C. La columna se usó para eliminar completamente los inhibidores de moléculas pequeñas, incluido el EDTA, que estaba presente en la formulación a una concentración de 2,5 mM.

La formulación de PPSB-BAC2 preincubada se calentó durante 10 minutos en un baño de agua a 37° C, se aplicó a la columna, la columna se centrifugó durante 2 min a 1000 g a 20° C (ver la Tabla 2 para el volumen de formulación aplicado a la columna) y se recogió el flujo de columna a través de la solución.

Después de la recogida, se evaluó el tiempo para el inicio de la coagulación/gelificación en el material recogido observando visualmente un cambio en la coloración (de transparente a opaco). Además, se evaluó el tiempo para completar la coagulación mediante el cese del flujo del material recogido tras la inversión.

Los resultados de la iniciación del coágulo y el tiempo completo de coagulación se presentan en la Tabla 2, a continuación.

Tabla 2: Iniciación del coágulo y tiempo de coagulación completo de la formulación incubada a 2-8° C durante if r n ri i m

El tiempo para completar la coagulación fue en todo momento menor o igual a 25 minutos. Se produce cierto acortamiento del tiempo requerido, sin querer estar limitados por la teoría, por la lenta conversión de una pequeña cantidad de los zimógenos de PPSB a una conformación activa, aunque inhibida por la arginina y el citrato, acortando de este modo el tiempo requerido para la generación de trombina activa. Los resultados indican que la formulación es estable durante por lo menos hasta 90 días a una temperatura de 2-8° C.

Ejemplo 9: Modelo animal para la evaluación in vivo de la formulación

El modelo de hemostasis de riñón de rata es un modelo común para probar la capacidad de una formulación probada para lograr la hemostasis (Raccuia JS et al., Am J Surg. 1992. 163(2):234-8. Comparative efficacy of topical hemostatic agents in a rat kidney model).

Brevemente, se disecó el riñón del lado del peritoneo y se colocaron almohadillas a su alrededor para absorber cualquier sangrado. Se colocó una pinza en los vasos sanguíneos que irrigan el riñón y se realizó un corte transversal a través del riñón. Se aplicó la formulación probada y se retiró la pinza. El sangrado se evaluó durante un período de una hora, después de lo cual se pesó la cantidad total de sangrado. Posteriormente, se raspó la formulación y se permitió que se reanudara el sangrado y se cuantificó como bajo, medio o alto (para evaluar que el potencial de sangrado aún existía). A todas las ratas se les infundieron 300 IU de heparina/kg de peso del animal para hacer más desafiante el modelo de sangrado.

Una rata albina que pesaba 406 gramos (g) se anestesió y se sometió al modelo de hemostasis de riñón de rata usando la formulación PPSB:BAC2 con una concentración final de 5 UI/ml de PPSB: 3,5% de fibrinógeno. Se usó como referencia un sellante de fibrina comercial clásico de 2 componentes.

Resultados:

Se mezcló una formulación de PPSB:BAC2 con CaCl2 (concentración final 25 mM en la formulación; se añadió manualmente CaCl2 a la formulación) y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de la aplicación a la superficie del riñón. Se formó un coágulo en la superficie inmediatamente después de la aplicación y el sangrado se detuvo por completo después de 38 minutos. La pérdida total de sangre fue de 5,9 g durante el período de una hora del modelo.

El uso de un sellante de fibrina comercial clásico de 2 componentes dio como resultado la formación inmediata de un coágulo y una pérdida total de sangre en el intervalo de 0-10,3 g (en 15 animales). El sellante de fibrina comercial se aplicó directamente sobre la superficie del riñón sin incubación.

Por tanto, la formulación de sellante de fibrina basada en PPSB todo en uno divulgada en la presente tiene un buen potencial hemostático.

Ejemplo 10: Evaluación de la estabilidad de la formulación de PPSB:BAC2 a temperatura ambiente y 2-8° C con o sin heparina

En este ejemplo, se evaluó la estabilidad de una formulación de sellante de fibrina de un solo componente que contenía PPSB y fibrinógeno.

El PPSB se preparó como se describe en el Ejemplo 1. Se usó BAC2 (Componente Biológicamente Activo 2) como componente de fibrinógeno, que contenía aproximadamente 100 mg/ml de proteína total, incluyendo 70 mg/ml de fibrinógeno coagulable, 20 mg/ml de arginina, 10 mM de citrato de sodio y excipientes que incluyen glicina y cloruro de sodio). El PPSB se combinó con BAC2 en volúmenes iguales para generar la formulación de sellante de fibrina de un solo componente.

Las muestras de la formulación de sellante de fibrina de un solo componente se dividieron en alícuotas y se almacenaron o a temperatura ambiente (20-25°C) o en el frigorífico (2-8°C).

A un segundo conjunto de muestras, se añadió heparina no fraccionada a 0,25 lU/ml al PPSB, lo que dio como resultado una concentración final de heparina de 0,125 lU/ml en la formulación de sellante de fibrina de un solo componente.

La estabilidad se evaluó usando un ensayo de tiempo de protrombina (PT) estándar en varios puntos temporales durante un período de 28 días. Para realizar el ensayo de PT, se combinaron 50 pl de la muestra calentada a 37° C con 100 pl de reactivo de PT (Diagnostica Stago STA Neoplastin Cl Plus), que consistía en factor tisular y calcio 10 mM. Se usó un analizador de coagulación Diagnostica Stago STart4 para determinar la tasa de formación de coágulos. Los resultados se muestran en la Fig. 6. Los resultados muestran que a los 6 días, los tiempos de coagulación para todas las formulaciones almacenadas a cualquier temperatura con/sin heparina fueron comparables a los valores de tiempo de coagulación de referencia. La formulación refrigerada sin heparina mostró una reducción en los tiempos de coagulación a los 18 días y a los 28 días la muestra se gelificó debido a la activación de los factores de coagulación. No se observaron tendencias en los tiempos de coagulación durante el estudio de estabilidad de 28 días para la formulación con heparina añadida almacenada en el refrigerador o las formulaciones almacenadas a temperatura ambiente.

Aunque en la presente se han descrito varias realizaciones, pueden implementarse muchas modificaciones y variaciones de esas realizaciones. Además, cuando se divulgan materiales para ciertos componentes, pueden usarse otros materiales. Se pretende que la descripción anterior y las siguientes reivindicaciones cubran todas estas modificaciones y variaciones.

La cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no se interpretará como una admisión de que dicha referencia está disponible como estado de la técnica de la invención.

Los encabezamientos de las secciones se usan en la presente para facilitar la comprensión de la memoria descriptiva y no deben interpretarse como necesariamente limitativas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación de sellante que comprende fibrinógeno, zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K que comprenden por lo menos Factor II y Factor X, y por lo menos un inhibidor reversible de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K; en donde la formulación está libre de un inhibidor de trombina irreversible añadido, y en donde la proporción de zimógenos de coagulación dependientes de la vitamina K con el fibrinógeno es de 0,1 a 0,2 U/mg de proteína coagulable, normalizada al Factor II.

2. La formulación de la reivindicación 1, en donde la formulación está en forma líquida y comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

3. La formulación de la reivindicación 1 o 2, en donde la formulación comprende además Factor V.

4. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K comprenden además Factor VII y/o Factor IX.

5. La formulación de la reivindicación 4, en donde el Factor X, el Factor VII, y/o el Factor IX están, por lo menos parcialmente, en su forma activa.

6. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde la formulación líquida permanece estable por lo menos 7 días a una temperatura ambiental de 2° C y hasta temperatura ambiente, opcionalmente en donde la formulación líquida es estable durante 30 días a temperatura ambiente.

7. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que está libre de trombina añadida.

8. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la fuente de zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K es concentrado de complejo de protrombina (PCC) de tres factores o cuatro factores.

9. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el inhibidor reversible se selecciona del grupo que consiste de:

(i) heparina;

(ii) un quelante de calcio, opcionalmente en donde el quelante de calcio se selecciona del grupo que consiste de un ion de citrato, oxalato, EDTA, EGTA, y una combinación de tales quelantes de calcio, opcionalmente en donde el quelante de calcio es un ion de citrato, opcionalmente en donde el ion de citrato es proporcionado por citrato de sodio;

(iii) un inhibidor de sitio activo de serina proteasa, opcionalmente en donde el inhibidor reversible es arginina; y (iv) una combinación de los mismos.

10. La formulación de la reivindicación 9, en donde la formulación líquida permanece estable durante por lo menos 14 días a una temperatura ambiental de 2° C a 8° C.

11. La formulación de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, que comprende de 1 mM a 50 mM de citrato de sodio, opcionalmente de 5 mM a 25mM de citrato de sodio; o de 0,1 mM a 2,5 mM de ECTA y/o EGTA; o del 0,1% al 5% (p/v) de arginina.

12. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para su uso en un método de cirugía.

13. Un recipiente que comprende la formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

14. Un método para fabricar una formulación de sellante, que comprende los pasos de:

a) proporcionar un componente de fibrinógeno;

b) proporcionar un componente que comprende los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K que incluyen por lo menos Factor II, Factor X y opcionalmente que comprenden además Factor VII y/o Factor IX; c) proporcionar un componente que comprende por lo menos un inhibidor reversible de por lo menos uno de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K; y

d) mezclar los componentes de a) a c), y opcionalmente Factor V;

en donde los componentes mezclados están libres de inhibidor de trombina irreversible añadido, y en donde la proporción de los zimógenos de coagulación dependientes de vitamina K con el fibrinógeno es de 0,01 a 0,2 U/mg de proteína coagulable, normalizada al Factor II.

15. El método de la reivindicación 14, en donde el fibrinógeno y el inhibidor reversible son proporcionados en el mismo componente.

16. El método de la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en donde por lo menos uno de los componentes es proporcionado en forma líquida, dando como resultado de este modo una formulación líquida.

17. Una formulación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para su uso en un método para curar y/o reducir la pérdida de sangre en un sujeto con necesidad de ello, el método comprendiendo aplicar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la formulación.