BR112021002705A2

BR112021002705A2 - composições de trombina líquidas e estáveis

Info

Publication number: BR112021002705A2
Application number: BR112021002705-0A
Authority: BR
Inventors: Erez Ilan; Omri Faingold; Sivan Doron
Original assignee: Omrix Biopharmaceuticals Ltd.
Priority date: 2018-08-16
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2021-05-11
Also published as: JP2021534171A; IL261190A; CN112566624A; CA3108744A1; EP3836896A2; US20240173388A1; AU2019321775A1; MX2021001827A; IL280625A; US11911448B2; WO2020035848A2; WO2020035848A3; KR20210046699A; JP7387715B2; US20200054720A1

Abstract

A presente invenção se refere a métodos para a preparação em larga escala de composição de trombina líquida estéril e estável compreendendo glicerol; composições de trombina líquida estável; e composição e kits hemostáticos. A presente invenção fornece adicionalmente composições hemostáticas compreendendo trombina líquida, glicerol e gelatina. Adicionalmente é fornecido aqui um método para a produção em larga escala de uma composição de trombina líquida estéril que compreende glicerol.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPO- SIÇÕES DE TROMBINA LÍQUIDAS E ESTÁVEIS".

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere, entre outras, a composições de trombina líquidas e estáveis compreendendo glicerol, sua prepara- ção, e kits hemostáticos compreendendo as mesmas. A presente inven- ção se refere, ainda, a composições de trombina líquidas e estéreis que compreendem glicerol.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O controle do sangramento é essencial e crítico, especial- mente em procedimentos cirúrgicos para minimizar a perda de sangue, reduzir complicações pós-cirúrgicas e encurtar a duração da cirurgia na sala de operação. Embora preparações hemostáticas contendo trombina estejam disponíveis, a trombina ou é congelada ou fornecida sob a forma de pó, devido à sua função autocatalítica, o que torna a trombina instável. Várias preparações de trombina líquida são atual- mente conhecidas, por exemplo:

[0003] A patente europeia n° EP0277096 revela formulações de trombina tornadas estáveis à temperatura ambiente com o uso de quan- tidades estabilizantes de um poliol e de um tampão com pH específico.

[0004] A patente US n° US4696812 revela soluções de trombina tornadas estáveis para armazenamento com o uso de quantidades es- tabilizadoras de um tampão antiautolítico em combinação com baixos níveis de solução salina e glicerol para evitar desnaturação.

[0005] A patente US n° US4965203 revela formulações de trombina melhoradas, estáveis à temperatura ambiente com o uso de quantidades estabilizantes de um poliol e de um tampão com pH específico.

[0006] O pedido de patente US n° US20060270015 revela formu- lações líquidas estabilizadas contendo trombina com alto grau de pu- reza e uma alta atividade específica e métodos para produzir e usar tais formulações.

[0007] O pedido de patente US n° US20140120078 revela hidrogéis reticulados e kits que incluem os mesmos, que podem adicionalmente compreender um plastificante (por exemplo, glicerol), e um agente bioativo como trombina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0008] Preparações líquidas de trombina podem ser produzidas como uma preparação médica liofilizada, que é usada após dissolução no mo- mento do uso.

[0009] As composições e métodos atualmente conhecidos para esta- bilizar a trombina na forma líquida são insatisfatórios e incluem, por exem- plo, o seguinte: inclusão de vários componentes inespecíficos (por exem- plo, proteínas carreadoras em batelada, como albuminas, açúcares esta- bilizantes diferentes, inibidores gerais de protease, etc.); formulações de trombina com inibidores da atividade de trombina, que, embora possam ser eficientes, podem inativar ou inibir a trombina reduzindo, portanto, sua eficácia; e formulações de uma solução com baixa concentração de trom- bina que necessitam de administração de quantidades maiores da formu- lação.

[0010] A presente invenção fornece preparações líquidas que são vantajosas em comparação com as preparações liofilizadas por satisfa- zerem a necessidade não atendida de administrar facilmente composi- ções estáveis de trombina líquida sem uma etapa adicional de dissolu- ção em um solvente antes do uso. Além disso, a presente invenção for- nece composições farmacêuticas líquidas prontas para uso que com- preendem trombina líquida que são vantajosas em comparação com composições farmacêuticas liofilizadas compreendendo trombina, sendo que elas satisfazem a necessidade não atendida de fácil e rápida administração de composições de trombina líquidas e estáveis em ar-

mazenamento. O termo "líquido farmacêutico" se refere a qualquer lí- quido que compreende uma substância que tem valor terapêutico ou medicinal.

[0011] Em um certo aspecto, a presente invenção fornece um kit he- mostático que compreende: a. um recipiente contendo uma composição de trombina líquida que compreende mais de 50 % v/v de glicerol; e b. um recipiente contendo gelatina.

[0012] Em algumas modalidades do kit hemostático, a composição de trombina líquida compreende cerca de 60 cerca de 100 % v/v de glicerol, ou 80 a cerca de 100 % v/v de glicerol.

[0013] Em algumas modalidades do kit hemostático, a solução de trombina compreende cerca de 60 a cerca de 100 % v/v de glicerol, ou 80 a cerca de 100 % v/v de glicerol. Em uma modalidade do kit hemos- tático, a solução de trombina compreende mais de 60 %, mais de 65 %, mais de 70 %, ou mais de 75 % v/v de glicerol, como, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 %, incluindo qualquer valor e faixa entre os mesmos.

[0014] Em algumas modalidades do kit hemostático, o kit adicional- mente compreende cálcio. Em algumas modalidades do kit hemostático, a composição de trombina líquida compreende adicionalmente um ou mais excipientes selecionados do grupo que consiste em cloreto de só- dio, manitol, albumina e acetato de sódio. Em algumas modalidades do kit hemostático, a composição de trombina líquida compreende entre 1 e cerca de 5.000 UI/ml de trombina. Em algumas modalidades do kit he- mostático, a composição de trombina líquida compreende entre cerca de 1 cerca de 2.000, ou 100 e cerca de 2.000 UI/ml de trombina.

[0015] Em algumas modalidades do kit hemostático, a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 70% ativa após cerca de 20 horas a uma temperatura de cerca de 50°C. Em algumas modalida- des do kit hemostático, a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 70% ativa após cerca de 2 minutos a uma temperatura de cerca de 100°C. O kit pode adicionalmente conter instruções de uso.

[0016] De acordo com um outro aspecto, a presente invenção for- nece uma composição hemostática compreendendo trombina, gelatina, e glicerol, e o glicerol está a uma razão acima de 30 % dos sólidos em peso.

[0017] Em algumas modalidades da composição hemostática, a composição compreende adicionalmente cálcio. Em algumas modalida- des da composição hemostática, a composição compreende adicional- mente um ou mais excipientes selecionados do grupo que consiste em cloreto de sódio, manitol, albumina e acetato de sódio. Em algumas mo- dalidades da composição hemostática, a composição compreende entre 1 e cerca de 2.500 UI/ml, ou cerca de 100 a cerca de 2.000 UI/ml de trombina. Em algumas modalidades da composição hemostática, a composição é para uso tópico para auxiliar a hemostasia.

[0018] De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para a produção em larga escala de uma compo- sição de trombina líquida estéril ("método de produção em larga es- cala") que compreende mais de 50 % v/v de glicerol, sendo que o mé- todo compreende as seguintes etapas: a. preparar uma solução de trombina através da mistura de trombina com uma solução de glicerol para obter uma solução com mais de 50 % v/v de glicerol; b. aquecer a solução de trombina obtida até pelo menos cerca de 40°C; e c. esterilizar a solução de trombina passando-a por pelo me- nos um filtro com um tamanho de poro de cerca de 0,22 µm ou menos, para assim obter uma composição de trombina líquida estéril que com- preende mais de 50 % v/v de glicerol.

[0019] Em algumas modalidades do método de produção em larga escala, o método compreende adicionalmente uma etapa de inativação viral realizada através de inativação por calor. Em algumas modalidades do método de produção em larga escala, a solução de trombina compre- ende cerca de 60 a cerca de 100 v/v de glicerol ou 80 a cerca de 100 % v/v de glicerol. Em uma modalidade do método, a solução de trombina compreende mais de 60 %, mais de 65 %, mais de 70 %, ou mais de 75 % v/v de glicerol, como, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou cerca de 100 % v/v de glicerol, inclu- indo qualquer valor e faixa entre os mesmos.

[0020] Em algumas modalidades do método de produção em larga escala, a solução de trombina compreende adicionalmente cálcio. Em algumas modalidades do método de produção em larga escala, a solu- ção de trombina compreende adicionalmente um ou mais excipientes selecionados do grupo que consiste em cloreto de sódio, manitol, albu- mina e acetato de sódio.

[0021] Em algumas modalidades do método de produção em larga escala, a solução de trombina compreende entre 1 e cerca de 2.500 UI/ml de trombina, ou cerca de 100 cerca de 2.000 UI/ml de trombina. Em algumas modalidades do método de produção em larga escala, a trombina nas composições de trombina líquidas é pelo menos 70 % ativa após cerca de 20 horas a uma temperatura de cerca de 50 °C. Em algumas modalidades do método de produção em larga escala, a trom- bina na composição de trombina líquida é pelo menos 70% ativa após cerca de 2 minutos a uma temperatura de cerca de 100°C.

[0022] De acordo com ainda um outro aspecto, a presente inven- ção fornece uma composição de trombina líquida estéril que compre- ende mais de 50% v/v de glicerol obtido pelo método da invenção.

[0023] De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção for- nece uma composição de trombina líquida estéril que compreende mais de 50 % v/v de glicerol.

[0024] Em algumas modalidades da composição de trombina lí- quida estéril, a composição compreende cerca de 60 cerca de 100 % v/v de glicerol. Em algumas modalidades, a composição de trombina líquida estéril compreende cerca de 60 % a cerca de 100 % v/v de gli- cerol ou 80 a cerca de 100 % v/v de glicerol. Em uma modalidade da composição de trombina líquida estéril, a solução de trombina compre- ende mais de 60 %, mais de 65 %, mais de 70 %, ou mais de 75 % v/v de glicerol, como 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % vv de glicerol, incluindo qualquer valor e a faixa entre os mesmos.

[0025] Em algumas modalidades da composição de trombina lí- quida estéril, a composição compreende adicionalmente cálcio. Em al- gumas modalidades da composição de trombina líquida estéril, a com- posição compreende um ou mais excipientes selecionados do grupo que consiste em cloreto de sódio, manitol, albumina e acetato de sódio. Em algumas modalidades da composição de trombina líquida estéril, a composição compreende entre 1 e cerca de 2.500 UI/ml de trombina,

ou cerca de 100 a cerca de 2.000 UI/ml de trombina. Em algumas mo- dalidades da composição de trombina líquida estéril, a trombina é pelo menos 70 % ativa após cerca de 20 horas a uma temperatura de cerca de 50 °C. Em algumas modalidades da composição de trombina líquida estéril, a trombina é pelo menos 70 % ativa após cerca de 2 minutos a uma temperatura de cerca de 100°C. Em algumas modalidades da composição de trombina líquida estéril, a composição compreende adi- cionalmente gelatina.

[0026] De acordo com ainda um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição hemostática que compreende trombina, gela- tina, e glicerol a uma faixa de concentração superior a 30% dos sólidos em peso.

[0027] De acordo com ainda um outro aspecto, a presente invenção fornece uma formulação selante que compreende trombina e mais de 50 % v/v glicerol. Em algumas modalidades da formulação selante, a for- mulação compreende cerca de 60 a cerca de 100 % v/v de glicerol ou 80 a cerca de 100 % v/v de glicerol. Em uma modalidade da formulação se- lante, a formulação compreende mais de 60 %, mais de 65 %, mais de 70 %, ou mais de 75 % v/v de glicerol, como 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, incluindo qual- quer valor e a faixa entre os mesmos.

[0028] Em algumas modalidades da formulação selante, a formu- lação compreende cerca de 60 a cerca de 100 % v/v de glicerol ou 80 a cerca de 100 % v/v de glicerol. Em algumas modalidades da formu- lação selante, a formulação compreende adicionalmente cálcio. Em al- gumas modalidades da formulação selante, a formulação compreende entre 1 e cerca de 2.500 UI/ml de trombina, ou cerca de 100 cerca de

2.000 UI/ml de trombina.

[0029] De acordo com ainda um outro aspecto, a presente inven- ção fornece uma composição hemostática que compreende trombina, gelatina, e glicerol em uma faixa de concentração superior a 30 % dos sólidos em peso. Em uma modalidade da composição hemostática es- téril, a composição compreende mais de 60 %, mais de 65 %, mais de 70 %, ou mais de 75 % v/v de glicerol, como 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % v/v de glicerol, incluindo qualquer valor e faixa entre os mesmos.

[0030] De acordo com ainda outro aspecto, a presente invenção for- nece uma formulação selante estéril que compreende trombina e mais de 50 % v/v de glicerol.

[0031] Em algumas modalidades da formulação selante estéril, a formulação compreende 65 a cerca de 100 %, 65 a cerca de 100 % v/v de glicerol, ou 80 a cerca de 100 % v/v de glicerol. Em uma modalidade da formulação selante estéril, a formulação compreende mais de 60 %, mais de 65 %, mais de 70 %, ou mais de 75 % v/v de glicerol, como 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % ou cerca de 100 % v/v glicerol, incluindo qualquer valor e faixa entre os mesmos.

[0032] Em algumas modalidades da formulação selante, a formu- lação compreende adicionalmente cálcio. Em algumas modalidades da formulação selante, a formulação compreende entre 1 e cerca de 2.500 UI/ml de trombina, ou cerca de 100 cerca de 2.000 UI/ml de trombina.

[0033] Em algumas modalidades, a formulação selante compreende um componente de fibrinogênio.

[0034] Em algumas modalidades em qualquer aspecto do kit, com- posições, formulações e métodos aqui fornecidos, o kit, composições e/ou formulações são pelo menos kit com dois componentes, composi- ções com dois componentes, e formulações com dois componentes, respectivamente. Em algumas modalidades de qualquer aspecto das composições com dois componentes, e das formulações com dois com- ponentes, um dos componentes compreende fibrinogênio.

[0035] Por exemplo, o kit pode ser aplicado com o uso de um dis- positivo aplicador e pode ser usado para administrar várias injeções sequenciais da substância de pelo menos dois componentes (por exemplo um selante de fibrina como o EVICEL). Em uma modalidade, o dispositivo aplicador possibilita múltiplas injeções de uma dose fixa dos componentes misturados em uma superfície 2-D de um tecido en- quanto move o dispositivo. Em uma modalidade, o aplicador tem uma agulha de injeção, que é opcionalmente retraída automaticamente da pele do paciente após a injeção ser concluída sem que o administrador precise levantar o dispositivo a partir da superfície de injeção. Em uma modalidade, o kit pode ser usado para a administração de selante de fibrina com um componente de fibrinogênio e um componente de trom- bina em quaisquer modalidades de qualquer aspecto dos mesmos.

[0036] Como usado aqui e na técnica, o termo "fibrinogênio" se re- fere a uma proteína precursora da matriz de coágulo sanguíneo. O fi- brinogênio tem um peso molecular de cerca de 340.000 Daltons e con- siste em 3 pares de cadeias polipeptídicas não idênticas, Aα, Bβ e γ, ligadas por ligações dissulfeto. Tipicamente, o fibrinogênio tem uma estrutura trinodular: dois domínios globulares terminais D idênticos e um domínio globular central E conectados por α-hélices superenovela- das.

[0037] Em algumas modalidades, o fibrinogênio é ou se origina de concentrado de fibrinogênio. Em algumas modalidades, o fibrinogênio é um concentrado de fibrinogênio derivado de sangue.

[0038] Ao longo desta descrição, os termos "se origina de" ou "deri- vado de" são usados de forma intercambiável e se referem a uma origem ou fonte do componente relevante, que pode incluir moléculas de ocorrên- cia natural, recombinantes, processadas, não purificadas ou purificadas (por exemplo, a proteína relevante). Em algumas modalidades, o fibrino- gênio compreende fibrinogênio crioprecipitado. Em algumas modalidades, o fibrinogênio se origina de fibrinogênio crioprecipitado. Em algumas mo- dalidades, o componente de solução de fibrinogênio e a solução de trom- bina são combinadas a uma razão (v/v) de 1:2 a 2:1, por exemplo, cerca de 1:1.

[0039] Em algumas modalidades, o fibrinogênio crioprecipitado é con- siderado o componente biologicamente ativo (BAC) do plasma sanguíneo. Em algumas modalidades, o BAC é inativado viral. Em algumas modalida- des, o BAC é um componente biologicamente ativo que compreende um agente antifibrinolítico como, mas não se limitando a, ácido tranexâmico. Um BAC exemplificador não limitador que compreende ácido tranexâmico é um produto denominado "Quixil" (Omrix, Israel). Ele é considerado um BAC de segunda geração e é chamado na técnica de "BAC2". Durante a preparação do BAC2, o plasminogênio (o precursor enzimático de plas- mina, que decompõe o fibrinogênio e a fibrina), é removido. Algumas rotas não limitadoras de preparação de BAC são descritas na patente US n°

6.121.232 e/ou WO 1998033533, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência. Em algumas modalidades, uma composição de BAC com- preende um ou agentes antifibrinolíticos (por exemplo, ácido tranexâmico) e cloridrato de arginina. Em algumas modalidades, a concentração do agente antifibrinolítico, como o ácido tranexâmico no BAC, se situa na faixa de cerca de 80 a cerca de 110 mg/ml. Em algumas modalidades, o BAC2 é preparado de acordo com a revelação do documento EP 534178, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência. Por exemplo, o BAC2 pode ser preparado a partir de crioprecipitado concentrado que é, então, submetido à inativação viral, por exemplo através de tratamento com de- tergente solvente e pasteurização. Em vista da remoção de plasmina/plas- minogênio do crioprecipitado, não há necessidade de se adicionar agentes antifibrinolíticos, como o ácido tranexâmico, aprotinina ou similares. Con- sequentemente, em algumas modalidades, o BAC2 não compreende ácido tranexâmico.

[0040] Vários materiais hemostáticos, como o SURGICEL®, po- dem ser eficazmente utilizados em combinação com o kit e/ou as for- mulações de trombina revelados. Por exemplo, a solução de trombina revelada pode ser adicionada a uma gelatina, por exemplo, matriz de gelatina fluxível antes do uso. Uma vez misturada a gelatina com a formulação de trombina, uma ponta aplicadora adequada pode ser fi- xada a uma seringa para aplicação do produto sobre o local de san- gramento ou tecido, ou como um auxílio à hemostasia sempre que hou- ver acesso ao gotejamento de sangue ou a pequenas hemorragias de capilares e pequenas vênulas e para controle do sangramento.

[0041] O termo "tecido" se refere a uma associação de células e/ou de componentes celulares reunidos para cumprirem uma função espe- cífica. As células no tecido pode ser todas de um único tipo ou de mais de um tipo. O tecido pode ser um tecido artificial no qual as células são cultivadas para funcionar de maneira similar a um tecido em um orga- nismo vivo. O tecido pode ser um tecido do corpo humano ou um tecido animal.

[0042] A composição de dois componentes pode ser fornecida pela combinação (por exemplo, mediante misturação) dos dois componen- tes, obtendo assim uma composição, e simultaneamente, ou subse- quentemente, pela aplicação da composição obtida diretamente no local em que a redução ou prevenção do sangramento é necessária. Em al- gumas modalidades, a aplicação da composição é auxiliada por meio de aspersão ou gotejamento da composição sobre a área a ser tratada.

[0043] Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado, con- forme comumente compreendido pelo versado na técnica ao qual a inven- ção se aplica. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou testes das moda- lidades da presente invenção, são aqui descritos materiais e métodos exemplificadores. Em caso de conflito, prevalecerá o presente relatório descritivo, incluindo as definições. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não são necessariamente limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0044] A Figura 1 mostra gráficos que apresentam o efeito de vá- rias concentrações de glicerol sobre a atividade da trombina a 50 °C por 24 horas (h). A trombina foi suspensa em várias concentrações diferentes de glicerol em água duplamente destilada (DDS) e mantida a 50 °C por 24 horas. A atividade foi medida em 1, 4,5, 8 e 24 horas. linha cinza contínua com pontos: 0 % de glicerol; linha preta contínua: 50 % v/v de glicerol; linha cinza tracejada: 60 % v/v de glicerol; linha pontilhada: 80 % v/v de glicerol; n=4

[0045] As Figuras 2A e B mostram gráficos de barras apresen- tando o efeito de várias concentrações de glicerol sobre a atividade de trombina a 25°C e 4°C. A trombina foi suspensa em várias concentra- ções diferentes de glicerol em DDW e mantida a 25°C por 6 meses e a 4°C por 12 meses. A Figura 2A apresenta a atividade medida em 3 e 6 meses a 25°C. A Figura 2B apresenta a atividade medida em 12 meses a 4°C. As barras de topo aqui e nos gráficos de barras apresen- tados abaixo representam o desvio padrão.

[0046] A Figura 3 mostra gráficos que apresentam o efeito de vá- rias concentrações de glicerol sobre a atividade de trombina a 100°C (medida após 2 minutos). A trombina foi suspensa em várias concen- trações diferentes de glicerol em DDW, e mantida a 100°C. A atividade foi medida após 2 minutos. linha preta contínua com pontos: 50 % v/v de glicerol; linha cinza contínua: 60 % v/v de glicerol; linha pontilhada: 80% v/v de glicerol; n=2.

[0047] A Figura 4 mostra um gráfico de barras apresentando o efeito de várias concentrações de glicerol sobre a atividade de trombina in vivo em um modelo porcino de punção biópsia. A trombina foi suspensa nas concentrações indicadas de glicerol em DDW; e usada em lugar da trom- bina reconstituída em um kit de gelatina para preparar uma pasta de gela- tina compreendendo trombina em várias concentrações de glicerol. A ati- vidade da trombina foi medida de acordo com o número de tamponamen- tos necessários para parar os sangramentos; da esquerda: pasta de gela- tina com trombina em 0 % v/v de glicerol; pasta de gelatina com trombina em 50 % v/v de glicerol; pasta de gelatina com trombina em 60% v/v de glicerol; e pasta de gelatina pasta com trombina em 100% v/v de glicerol; n=5.

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES DA INVENÇÃO

[0048] A trombina é amplamente usada como um material hemostá- tico para controlar sangramentos; entretanto, ela é uma enzima autocata- lítica e por isso é instável em sua forma líquida. A duração da estabilidade de trombina líquida é diminuída conforme a concentração de trombina au- menta e/ou à medida que a temperatura aumenta. Como resultado, pre- parações comerciais de trombina são encontradas na forma de pó ou de líquido congelado. Isso tem algumas desvantagens, incluindo um tempo de preparação relativamente longo pois a trombina em pó precisa ser re- constituída e a trombina congelada precisa ser descongelada; restrições de transporte devido à necessidade de envio em baixa temperatura; além de potencial comprometimento da esterilização caso a preparação re- queira a reconstituição da trombina em pó.

[0049] Para uso aqui, o termo "pó" se refere a uma pluralidade de partículas de um sólido caracterizado por tamanho pequeno, tipica- mente na faixa de 0,1 a 1000 micrômetros.

[0050] O termo "sólido" caracteriza o estado do composto ou com- posição à temperatura ambiente (por exemplo, 25°C) e à pressão at- mosférica (760 mmHg), ou seja, um composto ou uma composição de alta consistência que retém sua forma durante o armazenamento. Esse termo no presente pedido também se refere a partículas não fluidas, ou à substância dissolvida. Em oposição a compostos e composições "lí- quidas(os)", o sólido não flui sob seu próprio peso.

[0051] Como usado aqui, "trombina" denota uma enzima ativada que resulta da clivagem proteolítica de protrombina (fator II). A trom- bina pode ser produzida por uma variedade de métodos de produção conhecidos na técnica, e inclui, porém não se limita a, trombina recom- binante e trombina derivada de plasma. A trombina humana é uma pro- teína de 295 aminoácidos composta de duas cadeias de polipeptídeo unidas por uma ligação de dissulfeto. Tanto a trombina humana quanto a não humana (por exemplo, bovina) pode ser usada dentro do escopo da presente revelação.

[0052] A origem da trombina usada nesta invenção pode ser de uma ou de várias fontes incluindo, mas não se limitando a: bactérias e/ou células recombinantes (Vu et al., 2016, J. Viet. Env. 8(1):21-25), sangue total (agrupado a partir de várias doações ou não) e/ou fração do sangue (que pode ser agrupada de várias doações, por exemplo, de plasma). A trombina é disponibilizada por fabricantes como Johnson & Johnson, Baxter e CSL Behring, quer como um produto indepen- dente, por exemplo o EVITHROM®, ou como componente de um pro- duto, por exemplo EVICEL®, TISEEL®, Beriplast®, e similares.

[0053] Os inventores surpreendentemente descobriram que altas concentrações de glicerol, acima de 50% v/v na solução de trombina, re- sultam no aumento da estabilidade da enzima trombina por exemplo, sob temperaturas elevadas, bem como na otimização da atividade de trombina in vivo.

[0054] Conforme mostrado na Figura 1, embora a trombina prepa- rada sem glicerol perca cerca de 90 % de atividade após 24 horas a 50°C, a atividade da trombina com 50 % de glicerol ou mais é completamente mantida. Adicionalmente, a Figura 3 mostra que após 2 minutos a 100°C, que normalmente reduz por completo a atividade enzimática, 75% da ati- vidade é mantida com 50% de glicerol, e pelo menos 90% de atividade é mantida com 60% ou 80% de glicerol. Esse aumento de estabilidade sob temperaturas elevadas permite o uso de trombina líquida de maneiras que não eram possíveis anteriormente, como transporte, manuseio e ar- mazenamento em estado líquido sem a necessidade de refrigeração. Adi- cionalmente, o Exemplo 3 abaixo demonstra que o glicerol, que é, de modo geral, considerado viscoso demais para esterilização por filtração, pode ser eficazmente filtrado em temperaturas de 40°C e 50°C. A com- binação dos resultados acima possibilita a esterilização por filtração de trombina líquida em uma solução contendo uma alta concentração de gli- cerol (por exemplo acima de 60% em peso) mediante aumento da tem- peratura de filtração, conforme descrito aqui.

[0055] O termo "filtro", e qualquer inflexão gramatical do mesmo, significa interceptar, inibir, impedir ou interferir com a passagem de partículas em um fluido, por exemplo, fluxo de líquido.

[0056] Entretanto, um problema potencial é que um meio viscoso como o glicerol pode interferir na interação da trombina com suas mo- léculas alvo e, portanto, afetar a formação, cinética ou qualidade do coágulo formado. Com base nisso, um habilitado na técnica não pode- ria conceber a combinação de trombina com uma alta concentração de glicerol.

[0057] No entanto, como foi surpreendentemente descoberto pelos inventores, a situação é diferente in vivo. A Figura 3 descreve a atividade in vivo de gelatina preparada com uma solução de trombina líquida que compreende glicerol. Um kit de gelatina (Surgiflo®) compreende gelatina e trombina em pó misturadas pouco antes da aplicação em/sobre um lo- cal de sangramento. Visto que a trombina é fornecida em um estado de pó, ela requer reconstituição pelo profissional.

[0058] Em contraste com as questões de viscosidade discutidas acima, descobriu-se que concentrações elevadas de glicerol em trombina reconstituída com glicerol correspondiam à capacidade aumentada da for- mulação em reduzir sangramentos, conforme mostrado na Figura 4. Adi- cionalmente, uma vantagem importante da formulação de trombina líquida da invenção é poupar a etapa de reconstituição, evitando assim o incô- modo e economizando tempo para o profissional, bem como minimizando o risco de contaminação.

[0059] Os termos "composição de trombina líquida", "solução de trombina líquida", "solução de trombina" e "formulação de trombina lí- quida" são usados de forma intercambiável em todo este relatório des- critivo, e se referem a uma composição líquida que compreende trom- bina. Em algumas modalidades a "composição de trombina líquida" é uma solução aquosa, ou seja, que compreende 1% a menos que 50% (% v/v) de água.

[0060] O termo "líquido" se refere a uma substância que pode fluir, que não tem formato fixo, e que não é um sólido ou um gás.

[0061] Consequentemente, a composição de trombina líquida estável da invenção pode ser usada para substituir a trombina em pó ou congelada como material hemostático. A trombina líquida da invenção pode ser for- necida como uma solução de trombina independente, por exemplo, uma solução de trombina independente estéril e estável, como parte de um kit,

como no kit Surfiglo®, ou um kit de selante de fibrina em vez dos compo- nentes de trombina contidos nesses kits.

[0062] Consequentemente, a presente invenção fornece em um aspecto um kit hemostático que compreende um recipiente contendo uma composição de trombina líquida que compreende mais de 50 % v/v de glicerol; e um recipiente contendo gelatina. A presente invenção também fornece um kit hemostático que compreende um recipiente contendo uma composição de trombina líquida estéril estável para ar- mazenamento que compreende mais de 50% v/v de glicerol; e um re- cipiente contendo gelatina.

[0063] O termo "estável para armazenamento" deve ser entendido como se referindo à formulação, composição, que está opcionalmente presente em um recipiente por exemplo, frasco, que é estável sob con- dições de armazenamento pré-selecionadas (ver abaixo), incluindo temperatura de armazenamento pré-selecionada, estado físico pré-se- lecionado da formulação (por exemplo, fluido/líquido). A estabilidade pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica, por exem- plo, mediante teste da ausência de agregados visíveis e/ou de coágu- los de fibrina na formulação sob a condição de armazenamento pré- selecionada, por exemplo, quando a formulação está na forma líquida. Adicionalmente, de acordo com a presente revelação, ao se referir a uma formulação selante estável, deve-se entendê-la como uma formu- lação que, durante o uso, tem um tempo de coagulação eficaz inde- pendentemente das condições de armazenamento da formulação, por exemplo, a formulação selante coagula essencialmente no mesmo pe- ríodo de tempo independentemente se ela foi ou não armazenada à temperatura ambiente (por exemplo de 8 a 40°C) ou em temperaturas mais baixas (por exemplo, abaixo de 8°C).

[0064] Em algumas modalidades, as condições de armazenamento pré-selecionadas compreendem armazenamento à temperatura ambi- ente (por exemplo, de 10 a 30°C) e a formulação selante é estável por pelo menos 5 minutos, às vezes por pelo menos 15 minutos, ou por pelo menos 1 hora, por pelo menos um dia, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou mesmo 7 dias, às vezes por exemplo durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou mesmo 24 meses, ou mais, incluindo qualquer valor e faixa entre os mesmos.

[0065] Em algumas modalidades, as condições de armazena- mento pré-selecionadas compreendem armazenamento à baixa tem- peratura (por exemplo, de 2 a 10 °C) e a formulação selante é estável por pelo menos 5 minutos, às vezes por pelo menos 15 minutos, ou por pelo menos 1 hora, por pelo menos um dia, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou mesmo 7 dias, às vezes por exemplo durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou mesmo 24 meses, ou mais, incluindo qualquer valor e faixa entre os mesmos.

[0066] O termo "recipiente" pode se referir a qualquer estrutura ge- nérica como um recipiente ou frasco, que pode conter por exemplo, um líquido.

[0067] Em uma modalidade, este kit é armazenado à temperatura am- biente, como em uma temperatura na faixa de 8 a 40°C.

[0068] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um kit he- mostático para armazenamento a 2 a 8°C, que compreende um recipiente contendo uma composição de trombina líquida compreendendo mais de 10 %, mais de 15 %, mais de 20 %, mais de 25 %, mais de 30 %, mais de 35 %, mais de 40 %, mais de 45 %, mais de 50 %, mais de 55 %, mais de 60 %, mais de 65 %, mais de 70 %, mais de 75 %, mais de 80 %, mais de 85 %, ou mais de 90 % v/v de glicerol, por exemplo, 60 % a 100 % ou 80 % a 100 % v/v de glicerol; e um recipiente contendo gelatina.

[0069] O kit hemostático da invenção pode ser um kit para uso na redução, prevenção ou interrupção do fluxo sanguíneo, por exemplo em feridas abertas, e pode ser usado para reduzir, prevenir ou interromper o fluxo sanguíneo durante um procedimento, como durante um procedi- mento cirúrgico como, por exemplo, uma cirurgia laparoscópica, neuro- cirurgia, cirurgia abdominal, cirurgia cardiovascular, cirurgia torácica, ci- rurgia de cabeça e pescoço, cirurgia pélvica e procedimentos em tecidos cutâneos e subcutâneos. O kit pode ser usado para reduzir ou evitar o fluxo sanguíneo a partir da pele ou de órgãos internos.

[0070] O termo "solução líquida" também abrange uma solução vis- cosa. O termo "solução viscosa" se refere a uma solução que tem maior resistência ao fluxo, e que ainda assim é capaz de fluir, tipicamente, mas não exclusivamente, com uma viscosidade maior que cerca de 1 unidade de centipoises e menor que cerca de 10.000 unidades de cen- tipoise.

[0071] A composição de trombina líquida para o kit pode ser estéril e obtida com o método de produção em larga escala que compreende as seguintes etapas: a. preparar uma solução de trombina através da mistura de trombina com uma solução de glicerol para obter uma solução com mais de 50 % v/v de glicerol; b. aquecer a solução de trombina obtida até pelo menos 40°C; e c. esterilizar a dita solução de trombina passando-a por pelo menos um filtro com um tamanho de poro de 0,22 µm ou menos, para assim obter uma solução de trombina líquida estéril que compre- ende mais de 50% v/v de glicerol.

[0072] O termo "larga escala" como usado aqui se refere a um pro- cesso no qual pelo menos 1 litro de solução é produzido, tipicamente compreendendo pelo menos cerca de 400 UI de trombina.

[0073] A fonte de gelatina para a invenção pode ser sintética (por exemplo gelatina recombinante) ou derivada de animais como porcos.

A fonte de gelatina pode ser estéril e pode apresentar diferentes for- mas, como pasta, pó ou esponja. O termo "pasta", como usado aqui, se refere à consistência da composição em pelo menos uma tempera- tura ao redor da temperatura ambiente, e pode se referir a uma mistura fluida de partículas sólidas.

[0074] A gelatina usada na invenção pode ser reticulada antes da sua utilização. A reticulação da gelatina pode ser executada por qual- quer número de métodos adequados revelados na técnica. Por exem- plo, a gelatina pode ser reticulada por aquecimento a 150°C por 3 ho- ras (Nagura et al., 2002, Polymer Journal 34: 761 a 766).

[0075] Em algumas modalidades, a gelatina é dissolvida em um solvente para formar uma pasta de gelatina. Em algumas modalidades, a pasta de gelatina compreende glicerol. Em algumas modalidades, a pasta de gelatina compreende glicerol em mais de 30 % dos sólidos em peso.

[0076] Em algumas modalidades, a composição de trombina líquida é estéril.

[0077] Em algumas modalidades, a composição de trombina com- preende mais de 50 % v/v de glicerol. Em algumas modalidades, a com- posição de trombina líquida compreende pelo menos cerca de 55 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, ou pelo menos cerca de 95 % v/v de glicerol, incluindo qualquer valor e faixa entre os mesmos. Em algumas modalidades, a composição de trombina líquida compreende 100 % v/v de glicerol. Em algumas modalidades, a compo- sição de trombina líquida compreende entre cerca de 50 % e cerca de 80 % v/v de glicerol. Em algumas modalidades, a composição de trom- bina líquida compreende entre cerca de 60 % e cerca de 80 % v/v de glicerol. Em algumas modalidades, a composição de trombina líquida compreende entre cerca de 60 % e cerca de 100 % v/v de glicerol. Em algumas modalidades, a composição de trombina líquida compreende entre cerca de 70 % e cerca de 100 % v/v de glicerol. Em algumas mo- dalidades, a composição de trombina líquida compreende entre cerca de 80 % e cerca de 100 % v/v de glicerol. Em algumas modalidades, a composição de trombina líquida compreende mais de 65 %, mais de 67 %, ou mais de 70 %, e até cerca de 100 % v/v (por volume de sol- vente) v/v de glicerol.

[0078] Salvo indicação em contrário, a definição de concentração de glicerol como "% v/v", ou "%" no contexto de glicerol, se refere à percentagem do volume de glicerol em relação ao volume total dos solventes (por exemplo, água) na composição de trombina líquida. Como usado aqui, o termo "solvente" se refere a um material que se dissolve ou dispersa em uma outra substância, embora não altere seu estado físico.

[0079] O cálcio é um elemento importante na cascata de coagula- ção. O cálcio é necessário para ativação do fator XIII em fator XIIIa, que reticula e estabiliza a fibrina para gerar um coágulo insolúvel.

[0080] Consequentemente, em algumas modalidades, o kit e/ou composições revelados em modalidades dos mesmos compreendem adicionalmente cálcio. O cálcio usado com a invenção pode estar sob a forma de um sal, por exemplo, sal de cloreto de cálcio. Alternativamente, sais adicionais podem ser usados, como acetato de cálcio e/ou citrato de cálcio. No kit, o sal de cálcio pode ser fornecido na composição de trombina líquida. Alternativamente, o sal de cálcio pode ser fornecido no kit em um recipiente separado, ou o sal de cálcio pode ser fornecido no kit no mesmo recipiente que contém o componente de gelatina.

[0081] A composição de trombina líquida em qualquer aspecto reve- lado aqui pode compreender um ou mais dos seguintes excipientes: cál-

cio, albumina, sacarídeos, derivados de sacarídeos, poliol (polióis), ace- tato, citrato, aminoácidos, polietileno glicol, cloreto de sódio e água. A fonte de cálcio pode ser cloreto de cálcio e pode estar em uma faixa de concentração de 2 a 60 mm. A albumina pode estar em uma faixa de concentração de 0,05 a 1 % (p/v) ou na faixa de 0,5 a 1 % (p/p). A fonte de sacarídeos pode ser sacarose e pode estar em uma concentração de 5 g/l. A fonte de derivados de sacarídeo pode ser ácido glucônico. A fonte de poliol (polióis) pode ser manitol e pode estar em uma concentração de 2 % (p/p). A fonte de acetato pode ser acetato de sódio e pode estar em uma concentração de 10 mM. A fonte de citrato pode ser citrato de sódio. Os aminoácidos podem ser histidina e podem estar em uma concentra- ção de 10 mM. A fonte de polietileno glicol pode ser PEG-3350 e pode estar, por exemplo, em uma concentração de 0,03 %. O cloreto de sódio pode estar em uma faixa de 50 a 175 mm.

[0082] A solução de trombina pode estar em uma faixa de pH de cerca de 5,0 a 8,5.

[0083] O termo "excipiente" como usado aqui denota um agente não terapêutico adicionado a uma composição farmacêutica, por exemplo para fornecer uma consistência desejada ou efeito estabilizante.

[0084] Exemplos de soluções de trombina compreendem, mas não se limitam a: 800 a 1200 UI/ml de trombina, 20 mM de acetato de sódio, 40 mM de CaCl2, 110 mM de NaCl, 0,5 % p/p de albumina humana e 2 % p/p de manitol a um pH de 6,8 a 7,2; cloreto de cálcio (40 µmol/ml de), albu- mina (humana), cloreto de sódio, água para injeção; 500 UI/ml de proteína trombina, 1 % de albumina, 10 mM de acetato de sódio e 75 mM de cloreto de sódio; 500 UI/ml de trombina, 2 % de manitol, 10 mM de histidina, 0,03 % de PEG-3350 e 175 mM de cloreto de sódio; 500 UI/ml de trom- bina/ml de albumina humana a uma concentração entre 0,1 % e 1 % (p/v) e cloreto de sódio a uma concentração de 0,05 M a um pH entre 5,0 e 8,5.

[0085] A albumina é, por exemplo, albumina humana. Entretanto,

a albumina pode também ser de uma fonte não humana, ou albumina recombinante. Em algumas modalidades de qualquer aspecto revelado aqui, a composição de trombina líquida compreende água para inje- ção.

[0086] Consequentemente, em algumas modalidades, a composi- ção de trombina líquida compreende adicionalmente excipientes seleci- onados dentre, mas não se limitando a, cloreto de sódio, manitol, albu- mina e acetato de sódio.

[0087] A trombina purificada concentrada na forma líquida apresenta uma redução na atividade durante armazenamento prolongado, principal- mente, como resultado de clivagem autocatalítica. Por exemplo, a trom- bina líquida aquosa a uma concentração de 1000 unidades internacionais (UI)/ml pode sofrer clivagem autocatalítica à temperatura ambiente provo- cando uma perda significativa de atividade da trombina.

[0088] Em algumas modalidades, a solução ou composição de trombina compreende 1 a 10.000, ou 100 a 10.000 UI de trombina/ml, como 100 a 4000 ou 100 a 2500 UI de trombina/ml. Como usado em todo relatório descritivo, o termo "UI" denota "unidades internacionais" e pode ser determinado pelo teste de coagulação contra um padrão de referência interno para a medição de concentração de potência que foi calibrado em relação, por exemplo ao Segundo padrão internacional para trombina, 01/580 da Organização Mundial da Saúde (OMS). A unidade (U) é equivalente a uma unidade internacional (UI).

[0089] Em preparações comerciais, a trombina é tipicamente usada em cerca de 400 a 1.200 UI/ml.

[0090] Consequentemente, em algumas modalidades, a composi- ção de trombina líquida da invenção compreende entre 1 e 2.500 UI/ml de trombina. Em algumas modalidades, a composição de trombina com- preende entre 100 e 2.000 UI/ml de trombina. Em algumas modalidades,

a composição de trombina compreende entre 400 e 1.200 UI/ml de trom- bina. Em algumas modalidades, a composição de trombina compreende entre cerca de 800 e 1.200 UI/ml de trombina. Em algumas modalida- des, a composição de trombina compreende entre 400 e 800 UI/ml de trombina. Em algumas modalidades, a composição de trombina com- preende entre 400 e 600 UI/ml de trombina.

[0091] Em algumas modalidades, a concentração de trombina situa- se entre cerca de 1 e cerca de 20 µM. Em algumas modalidades, a con- centração de trombina situa-se entre cerca de 5 e cerca de 15 µm. Em algumas modalidades, a concentração de trombina situa-se entre cerca de 5 e cerca de 10 µM.

[0092] Conforme discutido acima, a trombina é uma enzima auto- catalítica e por isso é instável na forma líquida. A estabilidade diminui à medida que a concentração de trombina ou a temperatura aumen- tam. Surpreendentemente, as composições de trombina líquida da in- venção, que incluem mais de 50% de glicerol, são estáveis em tempe- raturas muito altas, conforme descrito na presente invenção, o que fa- cilita a esterilização, inativação viral por calor, transporte, armazena- mento e manuseio da trombina líquida sem refrigeração.

[0093] Os termos "estabilidade" ou "estável", como usados aqui, se referem à atividade da enzima trombina após a exposição a uma certa temperatura. De modo geral, uma composição de trombina líquida é de- finida como estável após certo período a uma certa temperatura se a trombina for pelo menos 70% ativa.

[0094] Consequentemente, em algumas modalidades a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 70 % ativa após 24 horas a uma temperatura de cerca de 50°C. Em algumas modalidades, a trom- bina na composição de trombina líquida é pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou 100 % ativa após 24 horas a uma temperatura de cerca de 50°C.

[0095] Em algumas modalidades, a composição de trombina lí- quida compreende mais de 50 % de glicerol e a trombina na composi- ção de trombina líquida é pelo menos 70 % ativa após 24 horas a uma temperatura de cerca de 50°C. Em algumas modalidades, a composi- ção de trombina compreende mais de 60 % de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 70 % ativa após 24 ho- ras a uma temperatura de cerca de 50°C. Em algumas modalidades, a composição de trombina compreende mais de 80 % de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 70 % ativa após 24 horas a uma temperatura de cerca de 50°C.

[0096] Em algumas modalidades, a composição de trombina líquida compreende mais de 50 % de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 80 % ativa após 24 horas a uma tempe- ratura de cerca de 50°C. Em algumas modalidades, a composição de trombina compreende pelo menos 60 % de glicerol e a trombina na com- posição de trombina líquida é pelo menos 80 % ativa após 24 horas a uma temperatura de cerca de 50°C. Em algumas modalidades, a com- posição de trombina compreende pelo menos 80 % de glicerol e a trom- bina na composição de trombina líquida é pelo menos 80 % ativa após 24 horas a uma temperatura de cerca de 50°C.

[0097] Em algumas modalidades, a composição de trombina líquida compreende mais de 50 % de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 90 % ativa após 24 horas a uma tempe- ratura de cerca de 50°C. Em algumas modalidades, a composição de trombina compreende pelo menos 60 % de glicerol e a trombina na com- posição de trombina líquida é pelo menos 90 % ativa após 24 horas a uma temperatura de cerca de 50°C. Em algumas modalidades, a com- posição de trombina compreende pelo menos 80 % de glicerol e a trom- bina na composição de trombina líquida é pelo menos 90 % ativa após 24 horas a uma temperatura de cerca de 50°C.

[0098] Faz-se agora referência às Figuras 2A-2B que mostram o efeito de várias concentrações de glicerol sobre a atividade da trombina em várias temperaturas. Consequentemente, em algumas modalidades a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 70 % ativa após pelo menos 6 meses a uma temperatura de cerca de 25°C. Em algumas modalidades, a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 50 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou 100 % ativa após pelo menos 6 meses a uma temperatura de cerca de 25°C.

[0099] O termo "pelo menos 6 meses" se refere, por exemplo, a 6 me- ses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 13 me- ses, 14 meses, 15 meses, ou mais, incluindo qualquer valor e faixa entre os mesmos.

[0100] O termo "pelo menos 50 %" se refere, por exemplo, a 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 %, incluindo qualquer valor e faixa entre os mesmos.

[0101] Em algumas modalidades, a composição de trombina líquida compreende mais de 50 % de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 70 % ativa após pelo menos 6 meses a uma temperatura de cerca de 25 °C. Em algumas modalidades, a composição de trombina compreende mais de 60 % de glicerol e a trombina na com- posição de trombina líquida é pelo menos 70% ativa após pelo menos 6 meses a uma temperatura de cerca de 25°C. Em algumas modalidades, a composição de trombina compreende mais de 80% de glicerol e a trom- bina na composição de trombina líquida é pelo menos 70% ativa após pelo menos 6 meses a uma temperatura de cerca de 25°C.

[0102] Em algumas modalidades, a composição de trombina líquida compreende mais de 50 % de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 70 % ativa após pelo menos 6 meses a uma temperatura de cerca de 25 °C. Em algumas modalidades, a com- posição de trombina compreende pelo menos 60 % de glicerol e a trom- bina na composição de trombina líquida é pelo menos 80% ativa após pelo menos 6 meses a uma temperatura de cerca de 25°C. Em algumas modalidades, a composição de trombina compreende pelo menos 80% de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 80% ativa após pelo menos 6 meses a uma temperatura de cerca de 25°C.

[0103] Em algumas modalidades a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 70 % ativa após pelo menos 6 meses a uma temperatura de cerca de 0°C. Em algumas modalidades, a trom- bina na composição de trombina líquida é pelo menos 75 %, pelo me- nos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou 100% ativa após pelo menos 6 meses a uma temperatura de cerca de 0°C.

[0104] Em algumas modalidades, a composição de trombina lí- quida compreende mais de 50 % de glicerol e a trombina na composi- ção de trombina líquida é pelo menos 70 % ativa após 6 meses a uma temperatura de cerca de 0°C. Em algumas modalidades, a composição de trombina compreende mais de 60 % de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 70 % ativa após 6 meses a uma temperatura de cerca de 0°C. Em algumas modalidades, a com- posição de trombina compreende mais de 80 % de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 70 % ativa após pelo menos 6 meses a uma temperatura de cerca de 0°C.

[0105] Em algumas modalidades, a composição de trombina líquida compreende mais de 50 % de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 80 % ativa após pelo menos 6 meses a uma temperatura de cerca de 0°C. Em algumas modalidades, a compo- sição de trombina compreende pelo menos 60 % de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 80 % ativa após pelo menos 6 meses a uma temperatura de cerca de 0°C. Em algumas mo- dalidades, a composição de trombina compreende pelo menos 80% de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 80% ativa após pelo menos 6 meses a uma temperatura de cerca de 0°C.

[0106] Em algumas modalidades, a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 70 % ativa após minutos a uma tempe- ratura de cerca de 100°C. Em algumas modalidades, a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou 100 % ativa após 2 minutos a uma temperatura de cerca de 100°C. Em algumas modalidades, a composição de trombina líquida compreende mais de 50 % de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 70 % ativa após 2 minutos a uma temperatura de cerca de 100°C. Em algumas modalidades, a composição de trombina compre- ende pelo menos 60 % de glicerol e a trombina na composição de trom- bina líquida é pelo menos 70 % ativa após 2 minutos a uma tempera- tura de cerca de 100 °C. Em algumas modalidades, a composição de trombina compreende pelo menos 80% de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 70 % ativa após 2 minu- tos a uma temperatura de cerca de 100°C.

[0107] Em algumas modalidades, a composição de trombina líquida compreende pelo menos 60 % de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 80 % ativa após 2 minutos a uma tempera- tura de cerca de 100 °C. Em algumas modalidades, a composição de trom- bina compreende pelo menos 80 % de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 80 % ativa após 2 minutos a uma tem- peratura de cerca de 100°C.

[0108] Em algumas modalidades, a composição de trombina líquida compreende pelo menos 60 % de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 90 % ativa após 2 minutos a uma tempera- tura de cerca de 100 °C. Em algumas modalidades, a composição de trom- bina compreende pelo menos 80 % de glicerol e a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 90 % ativa após 2 minutos a uma tem- peratura de cerca de 100°C.

[0109] Em algumas modalidades, a trombina nas composições de trombina líquidas reveladas é pelo menos 70 % ativa após 24 meses à temperatura ambiente (por exemplo 25°C). Em algumas modalidades, a trombina nas composições de trombina líquidas reveladas é pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou 100 % ativa após 24 meses à temperatura ambiente. Em algu- mas modalidades, a trombina na composição de trombina líquida é pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou 100 % ativa após 24 meses a uma temperatura de 2 a 8°C. Em algumas modalidades, a trombina na composição de trombina líquida revelada é pelo menos 70 % ativa após 24 meses a uma tempera- tura de 2 a 8°C.

[0110] Em algumas modalidades, a trombina na composição de trombina líquida da invenção é pelo menos 70 % ativa após 2 anos a - 20 °C.

[0111] Em algumas modalidades, a trombina na composição de trombina líquida da invenção é pelo menos 70 % ativa após 3 anos a - 20 °C.

[0112] Em algumas modalidades, o kit hemostático compreende uma seringa contendo a composição de trombina líquida e uma seringa contendo a gelatina. Em algumas modalidades, ao menos um dos re- cipientes no kit é uma seringa pré-preenchida. Em algumas modalida- des, uma seringa é fornecida juntamente com os recipientes do kit. Em algumas modalidades, o recipiente tem um tipo específico, como um frasco ou um aplicador.

[0113] O kit descrito acima pode compreender um componente de trombina e um componente de gelatina, que são misturados um ao ou- tro antes da aplicação. Por exemplo, os componentes são misturados por um cirurgião ou um outro profissional quando houver a necessi- dade de reduzir o sangramento, por exemplo, durante uma operação. A misturação dos componentes do kit forma uma composição hemos- tática.

[0114] Consequentemente, em um aspecto adicional, a presente in- venção fornece uma composição hemostática compreendendo trombina, gelatina, e glicerol em uma faixa acima de 30 % dos sólidos em peso na composição hemostática.

[0115] Em algumas modalidades, a composição hemostática com- preende glicerol em mais de 31 %, mais de 35 %, mais de 40 %, mais de 45 %, mais de 50 %, mais de 55 %, mais de 60 %, mais de 65 %, mais de 70 %, mais de 75 %, mais de 80 %, mais de 85 %, mais de 90 %, mais de 95 %, ou que se aproxima de 100 % dos sólidos em peso.

[0116] Em algumas modalidades, o sólido proeminente nas composi- ções hemostáticas aqui descritas é gelatina.

[0117] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece a composi- ção hemostática da invenção para uso tópico para auxiliar na hemostasia.

[0118] Hemostasia (ou hemostase) é o primeiro estágio de cura de ferimentos. É um processo que interrompe o sangramento. "Auxiliar na hemostasia" significa ajudar a reduzir ou interromper o sangramento.

[0119] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende trombina e gelatina, glice- rol acima de 30 % dos sólidos em peso, e um excipiente farmaceutica- mente aceitável.

[0120] Excipientes, por exemplo, para uma composição farmacêu- tica, são aqui descritos acima e podem incluir adicionalmente qualquer excipiente farmaceuticamente adequado, como cloreto de cálcio, albu- mina humana, manitol, acetato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio diidrato, tampão de gluconato, sacarose, glicina, acetato de só- dio, histidina, e PEG.

[0121] Qualquer preparação para uso terapêutico precisa ser esté- ril. Especialmente para o manuseio de produtos derivados de sangue, a questão da esterilização é crucial e, especificamente, a questão da ina- tivação viral. Em geral, a inativação viral pode ser executada por qual- quer método, incluindo, por exemplo, detergente solvente, inativação por calor, irradiação e nanofiltração, ou qualquer combinação dos mes- mos. Tipicamente, o padrão para inativação viral requer a utilização de dois métodos diferentes. Adicionalmente, o padrão de esterilização da Food and Drug Administration (FDA) requer filtração.

[0122] Entretanto, visto que a trombina líquida é instável, especial- mente sob altas temperaturas, a esterilização da trombina líquida é im- praticável utilizando inativação por calor ou irradiação, devido ao seu efeito negativo sobre a atividade da trombina. Por outro lado, prepara- ções de trombina que compreendem altas concentrações de glicerol e que são, portanto, mais estáveis, são viscosas demais para esteriliza- ção por filtração à temperatura ambiente. A descoberta surpreendente da presente invenção de que preparações de trombina incluindo glice- rol não só são estáveis sob altas temperaturas, mas também têm uma maior atividade in vivo em comparação com as preparações que não incluem glicerol, facilita a esterilização por filtração a altas temperatu- ras, em que o glicerol é menos viscoso. Isso possibilita a produção em larga escala de uma composição de trombina líquida estéril e estável compreendendo glicerol. Adicionalmente, a estabilidade da trombina líquida contendo glicerol a temperaturas elevadas possibilita também a inativação viral através de tratamento por calor.

[0123] O termo "estéril" como usado aqui significa ter uma baixa carga biológica, sendo efetivamente livres de germes, exemplo, livre de microorganismos, por exemplo bactérias e vírus. Esterilização é o processo para reduzir a carga biológica para um nível efetivamente li- vre de germes. Um líquido estéril é, de modo geral, definido como um líquido que foi esterilizado por filtração. Consequentemente, em algu- mas modalidades, uma solução de trombina estéril ou uma composi- ção de trombina líquida é uma solução de trombina ou uma composi- ção de trombina líquida que foi esterilizada por filtração estéril, por exemplo, mediante passagem por um filtro de 0,22 µm ou menos.

[0124] Conforme discutido acima, não existe atualmente nenhum método para uma preparação em larga escala de uma composição de trombina líquida estável e estéril. Isto se deve, por um lado, à falta de estabilidade da trombina (especialmente em altas temperaturas), e, por outro lado, à alta viscosidade do glicerol que poderia tornar difícil e demorada a etapa de filtração necessária. A descoberta surpreendente de que as formulações de trombina líquida compreendendo glicerol são estáveis a temperaturas elevadas e que mostram uma maior ca- pacidade de reduzir a hemorragia abre caminho para uma preparação em larga escala de composições de trombina líquida estéril, que inclui filtragem a temperaturas elevadas, em que o glicerol é menos viscoso.

[0125] O termo "preparação" se refere a uma fisiologicamente aceitá- vel adequada para uso terapêutico.

[0126] Em alguns aspectos, é fornecida uma formulação selante que compreende trombina e mais de 50 % v/v de glicerol.

[0127] No contexto da presente invenção, o termo "formulação se- lante" deve ser entendido como um único adesivo/cola/hemostático ou um adesivo/cola/hemostático de componente único, sendo que a for- mulação tem ingredientes que, mediante contato com um tecido e/ou sangue, por exemplo nas proximidades do tecido, reagem para subse-

quentemente formar um coágulo, atuando como um adesivo de teci- dos, e assim evitar, reduzir ou interromper o sangramento, unir estru- turas e/ou vedar vazamentos fisiológicos, por exemplo, de líquidos ce- rebroespinhais (CSF), linfa, bile, fuga de ar dos pulmões, etc. Em al- gumas modalidades, a formulação selante também compreende agen- tes terapêuticos de modo que mediante degradação natural do coágulo formado no corpo, o agente terapêutico seja aplicado. O agente tera- pêutico pode ser, mas não se limita a, um fármaco, como antibióticos, analgésicos, fármacos anti-inflamatórios, fármacos para tratamento de câncer, etc., células que incluem, por exemplo, qualquer tipo de células estaminais, por exemplo células-tronco embrionárias (ES), células- tronco adultas, células-tronco pluripotentes (iPSCs), etc. de origem hu- mana ou de outra origem.

[0128] Também é possível que o selante de fibrina compreenda componentes que estimulam a formação do coágulo, como Ca, Fator VIII, fibronectina, vitronectina, fator de von Willebrand (vWF) que podem ser fornecidos como um componente separado ou formulados com com- ponentes líquidos.

[0129] Às vezes, a formulação selante é chamada de "selante à base de trombina" e no contexto descrito aqui, ela deve ser entendida como uma formulação que forma ou que significa uma cola de fibrina, selante de fibrina, adesivo de fibrina, filme de fibrina, rede de fibrina, retícula de fibrina, malha de fibrina, tela de fibrina e gel de fibrina.

[0130] As formulações reveladas em qualquer aspecto das mes- mas, por exemplo, a formulação selante líquida, podem ser aplicadas sobre o tecido com o uso de um dispensador que ejeta o selante direta- mente sobre o tecido ou outro substrato ou superfície de trabalho com ou sem aspersão de ar, por exemplo por gotejamento. Em uma modali- dade da invenção, o selante é borrifado a uma pressão de ar de 15 PSI. Exemplos de dispensadores de selante de tecido são mostrados nas

Patentes US nos. 4.631.055, 4.846.405, 5.116.315, 5.582.596,

5.665.067, 5.989.215, 6.461.361 e 6.585.696, 6.620.125 e 6.802.822, e Publicação PCT No. WO 96/39212, WO 2007/059801 e WO 2010/095128, estando todos aqui incorporados a título de referência.

[0131] As modalidades da composição de trombina líquida e da composição de trombina líquida estéril anteriormente descritas são in- corporadas ao aspecto da formulação selante revelada.

[0132] Dessa forma, em algumas modalidades, a formulação se- lante compreende trombina e mais de 50% v/v de glicerol. Em algumas modalidades, a formulação selante compreende cerca de 60 a cerca de 100% v/v de glicerol. Em algumas modalidades, a formulação se- lante compreende cálcio. Em algumas modalidades, a formulação se- lante compreende entre cerca de 1 e cerca de 5.000 UI/ml, entre cerca de 1 e cerca de 2.000 UI/ml, ou entre cerca de 100 e cerca de 2.000 UI/ml de trombina.

[0133] Consequentemente, em um aspecto adicional, a presente in- venção fornece um método para a produção em larga escala de uma composição de trombina líquida estéril que compreende mais de 50 % v/v de glicerol, sendo que o método compreende as seguintes etapas: a. preparar uma solução de trombina através da mistura de trombina com uma solução de glicerol para obter uma solução com mais de 50% v/v de glicerol; b. aquecer a solução de trombina obtida até pelo menos 40°C; e c. esterilizar a dita solução de trombina passando-a por pelo menos um filtro com um tamanho de poro de 0,22 µm ou menos, para assim obter uma solução de trombina líquida estéril que compre- ende mais de 50 % v/v de glicerol.

[0134] O termo "larga escala" como usado aqui se refere a um pro- cesso no qual pelo menos 1 litro de solução é produzido, tipicamente incluindo pelo menos cerca de 400 UI de trombina.

[0135] Em algumas modalidades, a solução é aquecida até pelo menos 45°C, pelo menos 50°C, pelo menos 55°C, pelo menos 60°C, pelo menos 65°C, pelo menos 70°C, pelo menos 75°C, pelo menos 80°C, pelo menos 85°C, pelo menos 90°C, pelo menos 95°C, ou até cerca de 100°C.

[0136] Em algumas modalidades, o filtro pode ser um filtro hidrofó- bico.

[0137] Em algumas modalidades, mais de um filtro é usado. Em algu- mas modalidades, pelo menos dois filtros são usados. Em algumas moda- lidades, pelo menos três filtros são usados.

[0138] Tipicamente, a filtração é filtração estéril, que é definida como um processo de filtração que não permite a passagem de micro- organismos quando testada com pelo menos 107 organismos por cm2 de área de filtração eficaz. Tais filtros têm geralmente um tamanho de poro nominal de 0,22 µm ou menos (ver 2004 FDA Guidance for Industry Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing — Current Good Manufacturing Practice).

[0139] A solução de trombina e/ou os elementos da filtração, como filtros, podem ter a temperatura controlada antes e/ou durante o pro- cesso de filtração. O controle de temperatura pode ser executado atra- vés de vários meios como um banho circulado sob temperatura con- trolada.

[0140] Para aumentar a escala para capacidades maiores (como vários quilos de filtrado), um cartucho de filtro de membrana (como Su- por EX Grade ECV disponível junto à Pall Corporation®, tamanho 5” número da peça AB05UECV2PH4, 10” AB1UECV7PH4, 20” AB2UECV2PH4 ou 30” AB3UECV2PH4) pode ser usado. Em modali- dades exemplificadoras, a cápsula Mini kleenpak™ (área superficial de 0,023 m2) mencionada no Exemplo 3 abaixo é usada visto que ela tem uma razão conhecida entre o filtrado e a área superficial do filtro que pode ser duplicada em maior escala mediante o uso de cartuchos de filtro, conforme anteriormente mencionado.

[0141] Considera-se que as formulações de trombina líquida que in- cluem um alto teor de glicerol também são mais estáveis sob pressões aumentadas. Esse recurso pode ser útil em momentos de aumento de pressão aleatório no sistema, o que normalmente causa perda de ativi- dade da trombina, ou quando existe a necessidade de aumentar a pressão para reduzir o tempo de processamento.

[0142] O recipiente que contém a solução que está sendo filtrada pode ser conectado a uma fonte de energia que pode empurrar o lí- quido através do filtro. A fonte de energia pode ser ar comprimido. O recipiente pode ser conectado à fonte de energia através de um ou mais elementos que monitoram e/ou controlam a saída de energia. Tal elemento (elementos) pode ser uma válvula de pressão e um medidor de pressão. A quantidade de energia permitida para aplicação na so- lução de trombina pode ser restrita. A restrição pode ser de até 1 bar de pressão na solução de trombina.

[0143] Consequentemente, em algumas modalidades, a filtração é conduzida sob uma pressão de cerca de 1 bar. Em algumas modalida- des, a filtração é conduzida sob uma pressão acima de 1 bar. Em algu- mas modalidades, a filtração é conduzida sob uma pressão de 1,5 bar, acima de 2 bar, acima de 2,5 bar, acima de 3 bar, acima de 3,5 bar, acima de 4 bar, acima de 4,5 bar, ou acima de 5 bar.

[0144] Em algumas modalidades, a taxa de filtração é menor que uma hora por 1 kg de solução. Em algumas modalidades, a taxa de fil- tração é menor que 30 minutos por 1 kg de solução. Em algumas mo- dalidades, a taxa de filtração se situa entre cerca de 20 e cerca de 30 minutos por 1 kg de solução.

[0145] A segurança é uma questão crucial no que se refere aos ris- cos de produtos derivados de humanos. Como os vírus podem ser trans- mitidos para o processo de produtos derivados de humanos, esses pro- dutos precisam passar por etapas de inativação viral para garantir sua segurança. Tradicionalmente, dois métodos de inativação viral são in- dependentemente usados para assegurar a redução eficaz da carga vi- ral potencial. Alguns exemplos de métodos de inativação viral usados são descritos a seguir:

[0146] Inativação viral por nanofiltração - esse método pode utilizar exclusão de tamanho para filtrar tanto os vírus envelopados quanto os não envelopados. Os filtros usados tipicamente têm um tamanho de poro menor que 70 nm como o Planova20N, Planova 35N, Viresolve 70, Viresolve 180.

[0147] Inativação viral por detergente solvente (S/D) - esse método pode utilizar detergentes e/ou solventes para eliminar lipídios encontra- dos em vírus envelopados ou revestidos com lipídios. Os detergentes e/ou solventes usados, como o Triton X-45, Triton X-100 ou o polisor- bato 80, fosfato de tri(n-butila) (TnBP), di ou trialquil fosfatos tornam ina- tivos os vírus envelopados ou revestidos com lipídios. Tradicionalmente, 10 a 100 mg/ml de detergente são usados a uma temperatura na faixa de 2 a 37 °C com um nível de pH na faixa de 5 a 8 por 30 minutos a 24 horas. Após o tratamento do produto com S/D, o S/D é geralmente re- movido do produto. A combinação e concentração de detergentes e sol- ventes usados são conhecidas na técnica. Por exemplo, uma combina- ção de > 0,1 % TnBP e > 0,1 % Triton X-100 pode ser usada. Em um outro exemplo, uma combinação de 1 % de Triton X-100 e 0,3 % TnBP pode ser usada.

[0148] Inativação viral através inativação por calor - a inativação por calor, também conhecida como pasteurização, utiliza altas temperaturas que podem afetar vários tipos de patógenos incluindo os vírus envelopa- dos e os não envelopados. A pasteurização pode ser alcançada através de várias técnicas que normalmente combinam níveis de temperatura com tempo de exposição. Por exemplo, a temperatura pode ser de 60°C por um período de 10 horas. Em um outro exemplo, a técnica de temperatura mais alta x tempo mais curto (Higher Heat Shorter Time) é usada, por exemplo a 100°C por um período menor que 2 segundos.

[0149] Entretanto, pelo menos para inativação viral por calor, essa opção não está disponível para trombina líquida devido à sua falta de estabilidade. No entanto, tendo em vista os achados descritos na pre- sente revelação, a composição de trombina líquida revelada contendo um alto teor de glicerol pode ser submetida à inativação por calor.

[0150] Consequentemente, em algumas modalidades, o método para a produção em larga escala de uma composição de trombina líquida estéril compreendendo mais de 50 % v/v de glicerol da invenção adicionalmente compreende uma etapa de inativação viral através de inativação por calor.

[0151] Em algumas modalidades, a inativação por calor pode ser executada a uma temperatura de cerca de 60 a 100°C. Em algumas modalidades, a inativação por calor pode ser executada a cerca de 60 °C por cerca de 10 horas. Em algumas modalidades, a inativação por calor pode ser executada a cerca de 100°C por menos de 2 segundos.

[0152] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição de trombina líquida estéril que compreende mais de 50% v/v de glicerol obtido pelos métodos descritos acima.

[0153] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição de trombina líquida estéril que compreende mais de 50% v/v de glicerol.

[0154] A composição de trombina líquida da invenção pode ser usada como uma composição independente para reduzir ou interromper o sangramento. Ela também pode ser usada como parte de kits para substituir a trombina congelada ou em pó, ou em adição a outros agen- tes hemostáticos.

[0155] Em um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para tratamento de um ferimento que compreende a etapa de apli- car (por exemplo, colocar em contato) a composição líquida em qualquer aspecto e modalidade da mesma sobre e/ou dentro do ferimento de um indivíduo que precisa da mesma.

[0156] Entende-se que "tratar um ferimento" abrange adicionalmente reduzir a perda de sangue no local de sangramento de um tecido, por exemplo, em um paciente submetido à cirurgia.

[0157] Consequentemente, em algumas modalidades, o método consiste em reduzir a perda de sangue em um local de sangramento de um tecido, por exemplo, em um paciente submetido à cirurgia, que com- preende colocar a composição ou formulação revelada em uma moda- lidade da mesma em contato com o local do sangramento.

[0158] Em algumas modalidades, a composição ou formulação usada para reduzir a perda de sangue em um local de sangramento de um tecido compreende trombina e pelo menos 50 % de glicerol, por exemplo, cerca de 60 % a cerca de 100 %, ou cerca de 80 % a cerca de 100 % v/v de glicerol. Em algumas modalidades, a composição ou formulação compreende adicionalmente gelatina e/ou água, por exem- plo, em uma quantidade suplementar.

[0159] Como usado aqui, o termo "indivíduo" significa qualquer ani- mal incluindo, sem limitação, um ser humano, camundongo, rato, coe- lho, primata não humano, ou qualquer outro mamífero. Em algumas mo- dalidades, o indivíduo é humano, por exemplo um paciente humano. O indivíduo pode ser do sexo feminino ou masculino, ou um macho ou fêmea.

[0160] Tem-se por objetivo que pelo menos as modalidades relaci-

onadas com a % de glicerol, cálcio e excipientes, a fonte e concentra- ções de trombina, bem como a estabilidade de trombina mencionadas acima, sejam incluídas em todos os aspectos do presente pedido.

[0161] O termo "cerca de" como usado aqui significa que os valores que estão 10 % acima ou abaixo do valor indicado também são destinados à inclusão. De modo geral, todos os valores no presente pedido pretendem incluir o termo "cerca de".

[0162] Os termos "compreende", "compreendendo", "tem", "tendo", "contém", "contendo" e seus conjugados significam "inclui, mas não se limita a". O termo "consistindo em" significa "inclui, mas se limita a". O termo "consistindo essencialmente em" significa que a composição, mé- todo ou estrutura pode incluir ingredientes adicionais, etapas e/ou par- tes, mas apenas se os ingredientes, etapas e/ou partes adicionais não alterarem substancialmente as características básicas e inovadoras da composição reivindicada, método ou estrutura.

[0163] A palavra "exemplificador (a)" é usada aqui para significar "servir como um exemplo, instância ou ilustração". Qualquer modalidade descrita como "exemplificadora" não deve ser necessariamente inter- pretada como preferencial ou vantajosa em relação a outras modalida- des e/ou como excluindo a incorporação de características de outras modalidades.

[0164] A palavra "opcionalmente" é usada aqui para significar "é fornecido (a) em algumas modalidades e não fornecido (a) em outras modalidades". Qualquer modalidade específica da invenção pode in- cluir uma pluralidade de características "opcionais", salvo se tais ca- racterísticas causarem conflito.

[0165] Como usada aqui, a forma no singular "um", "uma" e "o", "a" incluem as referências no plural a menos que o contexto claramente determine de outro modo. Por exemplo, o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, inclu- indo misturas dos mesmos.

[0166] Ao longo deste pedido, várias modalidades da presente in- venção podem ser apresentadas em um formato de faixa. Deve-se compreender que a descrição em formato de faixa é apenas para con- veniência e concisão e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível ao escopo da invenção. Consequentemente, a descrição de uma faixa deve ser considerada como tendo especificamente revela- das todas as possíveis subfaixas, bem como os valores numéricos in- dividuais incluídos naquela faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa como de 1 a 6 deve ser considerada como tendo subfaixas espe- cificamente reveladas como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., bem como números individuais dentro daquela faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isso se aplica independentemente da extensão da faixa.

[0167] Sempre que uma faixa numérica for indicada aqui, isso sig- nifica que ela inclui qualquer número citado (fracionário ou inteiro) den- tro da faixa indicada. As expressões "na faixa entre" um primeiro nú- mero indicado e um segundo número indicado e "na faixa de" um pri- meiro número indicado "a" um segundo número indicado são usadas aqui de forma intercambiável e destinam-se a incluir o primeiro e o se- gundo números indicados e todos os números fracionários e inteiros entre os mesmos.

[0168] Como usado aqui, o termo "método" se refere a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para executar uma determinada ta- refa incluindo, mas se limitando àquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos quer sejam eles conhecidos ou prontamente desenvol- vidos a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conheci- dos pelos versados nas técnicas química, farmacológica, biológica, bi- oquímicas e médica.

[0169] Como usado aqui, o termo "tratar" no contexto de trata- mento médico inclui anular, substancialmente inibir, desacelerar ou re- verter a progressão de uma doença, substancialmente melhorar os sin- tomas clínicos ou estéticos de uma doença ou substancialmente evitar o aparecimento de sintomas clínicos ou estéticos de uma doença.

[0170] Como usado aqui, o termo "sangramento" se refere ao extra- vasamento de sangue de qualquer componente do sistema circulatório. "Sangramento" dessa forma abrange sangramento indesejado, descon- trolado e com frequência excessivo relacionado à cirurgia, trauma ou outras formas de dano aos tecidos, bem como sangramentos indeseja- dos em pacientes com distúrbios hemorrágicos.

[0171] Como usados aqui, os termos "controlar", "evitar" ou "reduzir", que podem ser usados aqui de forma intercambiável no contexto de san- gramento, incluindo qualquer inflexão gramatical dos mesmos, indicam que a taxa do sangue extravasado está essencialmente anulada ou re- duzida, por exemplo, em 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, ou mesmo 100 %, da taxa inicial de san- gramento, em comparação com a situação sem o contato da composição revelada no/sobre o local de sangramento. Os métodos para determinar um nível de aparecimento de sangramento são conhecidos na técnica.

[0172] Adicionalmente, em algumas modalidades, os termos "con- trolar", "evitar" ou "reduzir", no contexto do sangramento também são destinados a abranger pelo menos parcialmente a vedação de vasos sanguíneos no local de sangramento, por exemplo, em tecidos moles.

[0173] Nos casos em que é usada uma convenção análoga a "pelo menos um dentre A, B ou C, etc.", em geral essa interpretação se destina a ter o sentido pelo qual um versado na técnica entenderia a convenção (por exemplo, "um sistema que tem ao menos um dentre A, B e C" incluiria, mas não se limitaria a, sistemas que têm A sozinho, B sozinho, C sozinho,

A e B juntos, A e C juntos, B e C juntos, e/ou A, B e C juntos, etc.). Será adicionalmente entendido pelos versados na técnica que tipicamente uma palavra e/ou uma frase disjuntiva apresentando dois ou mais termos alter- nativos, quer na descrição, nas reivindicações ou nos desenhos, deve ser entendida como contemplando as possibilidades de incluir um dos termos, qualquer um dos termos ou ambos os termos. Por exemplo, a frase "A ou B" será tipicamente entendida como incluindo as possibilidades de "A" ou "B" ou de "A e B".

[0174] Deve-se considerar que certas características da invenção, que são, para maior clareza, descritas no contexto de modalidades se- paradas, podem também ser fornecidas em combinação em uma única modalidade. Inversamente, várias características da invenção que são, por brevidade, descridas no contexto de uma única modalidade, podem também ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação ou conforme adequado em qualquer outra modalidade descrita da in- venção. Certas características descritas no contexto de várias modali- dades não devem ser consideradas elementos essenciais dessas mo- dalidades, a menos que a modalidade seja inoperante sem esses ele- mentos.

[0175] Várias modalidades e aspectos da presente invenção, con- forme apresentados anteriormente e conforme reivindicados na seção de reivindicações abaixo, encontram respaldo experimental nos exem- plos a seguir. Exemplos

[0176] Faz-se agora referência aos seguintes exemplos que, jun- tamente com as descrições acima, ilustram algumas modalidades da invenção de forma não limitadora. Materiais e métodos

[0177] Preparação de várias concentrações de glicerol: Para cada concentração de glicerol, um volume de DDW foi aspirado para uma se- ringa de 5 ml (lote de seringa de 5 ml Yoel Naim: 20130815) e adicionado em um frasco. Um volume de glicerol (lote de glicerol anidro J.T Baker 500 ml: 0000136697) foi aspirado para uma seringa de 5 ml e adicionado ao mesmo frasco. Cada frasco contendo DDW e/ou glicerol foi, então, mistu- rado com um vórtice (Scientific Industries, Vortex-genie 2 modelo G560E. ajuste de velocidade 5) durante 30 segundos à temperatura ambiente.

[0178] Reconstituição de trombina: Para cada concentração de gli- cerol, 2 ml de líquido contendo as diferentes concentrações de glicerol foram aspirados para uma seringa de 5 ml. Os 2 ml de líquido foram injetados nos frascos de trombina liofilizada contendo cerca de 2000 UI e colocados sobre um misturador de rolos (Stuart, misturador de rolos modelo SART6) durante 24 a 72 horas (h) para reconstituição à temperatura ambiente.

[0179] Em resumo, uma curva padrão de trombina foi criada entre 4 a 10 unidades internacionais (UI)/ml. 40 ml de trombina ou de uma amos- tra diluída foram, então, adicionados a 160 ml de uma solução de fibrino- gênio a 0,1% em uma cubeta de teste. O tempo para coagulação foi tes- tado em uma máquina de coagulação automática (coagulômetro) (Stat4, Stago Diagnostica). A máquina gera um campo eletromagnético oscilante que move uma pequena esfera de metal dentro da cubeta. Determina-se que a coagulação ocorreu quando for detectado que o movimento da es- fera parou. A concentração de trombina nas amostras de teste é extrapo- lada a partir dos tempos de coagulação contra a curva padrão. Exemplo 1: Estabilidade da trombina líquida

[0180] 24 horas de estabilidade a 50°C: Várias concentrações de glicerol foram preparadas conforme descrito acima de acordo com a Tabela 1 abaixo que apresenta a preparação de soluções de trombina com várias concentrações de glicerol.

Tabela 1 % de glicerol ((por volume de Quantidade de glicerol Quantidade de DDW Quantidade total solvente (v/v)) 0% 0 ml 5 ml 5 ml 50 % 2,5 ml 2,5 ml 5 ml 60 % 3 ml 2 ml 5 ml 80 % 4 ml 1 ml 5 ml

[0181] A trombina foi reconstituída conforme descrito acima, e amostras de 300 µl foram coletadas com o uso de uma seringa de 1 ml (lote de seringa de 1 ml Terumo: 1001015) em tubos Eppendorf (Sars- tedt, microtubos 1,5 72.690.001) e congeladas (-20°C) para análise fu- tura como ponto no tempo 0 (0 hora). Os frascos contendo o restante da trombina reconstituída foram colocados em um forno (venticell 222, SN: B020251) conforme necessário para a temperatura indicada, por exemplo, 50°C, pelo tempo indicado (por exemplo, 24 horas). Em cada um dos pontos no tempo que foram os seguintes: 1, 4,5, 8 e 24 horas; amostras de 300 µl foram coletadas com o uso de uma seringa de 1 ml para tubos Eppendorf e congeladas para análise futura para o respec- tivo ponto no tempo. A atividade da trombina nas amostras de teste foi avaliada com base em uma curva padrão, conforme descrito acima.

[0182] Os resultados médios de 4 repetições de atividade de trom- bina para diferentes concentrações de glicerol no estudo de estabili- dade de 24 horas a 50°C são apresentados na Figura 1. Conforme mostrado na Figura 1, a atividade da trombina foi totalmente mantida por 25 horas a 50°C, em concentrações de glicerol de 50%, 60% e 80%.

[0183] Estabilidade a longo prazo: O efeito de várias concentrações de glicerol sobre a atividade da trombina em várias temperaturas (°C) foi adicionalmente testado. A trombina foi suspensa em várias concentrações diferentes de glicerol em DDW e mantida a 25°C por 6 meses e a 4°C por 12 meses. A Figura 2A apresenta a atividade medida aos 3 e 6 meses a 25°C. A Figura 2B apresenta a atividade medida em 12 meses a 4°C. Os resultados demonstraram a estabilidade a longo prazo das amostras de glicerol testadas, já que cerca de 90 % a cerca de 100 % da atividade foi mantida, para cada tempo indicado. Exemplo 2: Estabilidade da trombina líquida durante 2 minutos a 100°C

[0184] Várias concentrações de glicerol foram preparadas conforme descrito acima de acordo com a Tabela 1 acima (50 %, 60 % e 80 %).

[0185] A trombina foi reconstituída conforme descrito acima, e amostras de 300 µl foram coletadas com o uso de uma seringa de 1 ml (lote de seringa de 1 ml Terumo: 1001015) em tubos Eppendorf (Sars- tedt, microtubos 1,5 72.690.001) para análise futura como ponto no tempo 0 (0 hora). Os frascos contendo o restante da trombina reconsti- tuída foram colocados em um forno (venticell 222, SN: B020251) ajus- tados para 100°C durante 2 minutos. Após 2 minutos, amostras de 300 µl foram coletadas de cada concentração com o uso de uma seringa de 1 ml para tubos Eppendorf. A atividade da trombina nas amostras de teste foi avaliada com base em uma curva padrão, conforme descrito acima, e normalizada pelo resultado para 0 % de glicerol no ponto de tempo 0.

[0186] Os resultados médios de 2 repetições de atividade de trom- bina para diferentes concentrações de glicerol no estudo de estabili- dade de 2 minutos a 100°C são apresentados na Figura 3. Conforme pode ser visto na Figura 3, após 2 minutos a 100°C, menos de 75% de atividade da trombina foi mantida com 50% de glicerol, enquanto nas soluções com 60% e 80% de glicerol, 90% de atividade da trom- bina foi mantida. Exemplo 3: Taxa de filtração de glicerol anidro em várias temperaturas

[0187] Para produzir um líquido estéril com o uso de filtração, o lí- quido precisa passar por um filtro com um tamanho de poro igual ou in- ferior a 0,22 µM (2004 FDA Guidance for Industry Sterile Drug Products

Produced by Aseptic Processing — Current Good Manufacturing Prac- tice). Entretanto, sabe-se que líquidos viscosos como o glicerol são difí- ceis de passar por tal filtro, o que resulta em um procedimento muito longo, o que o torna, na melhor das hipóteses, ineficaz. Consequente- mente, os inventores testaram se o aumento da temperatura de filtração poderia tornar o glicerol menos viscoso e a filtração mais eficaz. Entre- tanto, isso só pode ser executado se a atividade da trombina não for afe- tada no processo. Conforme mostrado acima no Exemplo 1, os invento- res estabeleceram agora que a trombina com mais de 50 % de glicerol é estável a 50°C por 24 horas. Adicionalmente, conforme mostrado no Exemplo 2, os inventores também estabeleceram que a trombina em uma solução com mais de 50% de glicerol é estável por 2 minutos a 100°C. Como resultado, a temperatura mais alta também pode também ser usada para o processo de filtração. Neste exemplo, os inventores analisaram o efeito da temperatura sobre a taxa de filtração de glicerol.

[0188] Em procedimentos exemplificadores, glicerol (lote de glice- rol anidro J.T Baker: 0000136697) foi colocado em um recipiente sob pressão (Sartorius Stedim modelo 17530) e filtrado em um filtro de cáp- sula Mini Kleenpak™ de 0,2 µM (PALL Corporation®, REF KA02ECV2FT, lote IB2616) com o uso de tubulação de silicone e um sistema de ar comprimido (CA) conectado a um medidor de pressão (até 1 bar) para manter a pressão de 0,9 a 1 bar durante o processo. O recipiente de pressão com o glicerol e o filtro foram incubados du- rante 45 minutos antes e durante o processo de filtração dentro de um banho circulado sob temperatura controlada. Para avaliar o efeito da temperatura sobre a taxa de filtração, o banho circulado sob tempera- tura controlada foi ajustado em uma de três temperaturas diferentes, uma para cada teste. As temperaturas analisadas foram as seguintes: 25°C, 40°C e 50°C.

[0189] A taxa de filtração foi medida mediante pesagem do filtrado ao longo do tempo. Os resultados são mostrados na Tabela 2 abaixo que demonstra o efeito da temperatura de filtração sobre a taxa de fil- tração. Tabela 2 Temperatura de filtração (°C) Vazão (kg/h) 25 0,42 40 1,02 50 2,22

[0190] Conforme pode ser visto na Tabela 2, a vazão de filtração de glicerol a 25°C foi relativamente baixa, ou seja, abaixo de 0,5 kg por hora, tornando o processo ineficaz. Entretanto, a vazão de filtração de glicerol a 40°C e 50°C foi cerca de 2,5 vezes e cerca de 5 vezes mais rápida, respectivamente, em comparação com o processo à tempera- tura ambiente, tornando o processo muito mais eficaz quando condu- zido em altas temperaturas. Consequentemente, a filtração de aproxi- madamente 1 kg de glicerol, que é necessária para uma preparação de larga escala, pode ser alcançada em menos de meia hora a 50°C, em comparação com aproximadamente 2,5 horas a 25°C. Exemplo 4: Preparação em larga escala de uma solução de trombina líquida estéril e estável

[0191] Com base nos achados combinados dos Exemplos 1 e 2, mostrando a estabilidade da trombina sob altas temperaturas, e do Exemplo 3, que mostra uma taxa de filtração mais alta de glicerol em temperaturas elevadas, uma solução de trombina líquida que compre- ende mais de 50% de glicerol poderia ser esterilizada por filtração me- diante o aumento da temperatura de solução e passagem da mesma por um filtro com tamanho de poro de 0,22 µM ou menos.

[0192] Em procedimentos exemplificadores, a trombina é misturada com glicerol (glicerol anidro J.T. Baker) e DDW para produzir um volume final de 2 litros de solução de trombina contendo 1000 UI/ml de trombina em 80 % de glicerol v/v. A solução de trombina é colocada dentro de um equipamento Sartorius Stedim modelo 17530, que é conectado a um filtro de cápsula Mini Kleenpak™ de 0,2 µM (PALL Corporation® REF KA02ECV3FT, lote IB2616) e um sistema de ar comprimido (CA) através de um medidor de pressão e válvula. O recipiente de pressão contendo a solução de trombina e os elementos de filtração são colocados em um ba- nho circulado sob temperatura controlada que é ajustado para 50°C. Após a solução de trombina e os elementos filtrantes atingirem 50°C, a pressão é ajustada entre 0,9 e 1 bar mediante o controle do fluxo de ar comprimido pela válvula de pressão e pelo medidor de pressão. Uma vazão maior que 0,5 kg por hora é esperada, o que resulta em 1 kg de solução de trombina estéril filtrada em menos de 2 horas. De fato, com base nos experimentos do Exemplo 3, pode-se esperar uma vazão de aproximadamente 2 kg por hora, o que resulta em 1 kg de solução de trombina estéril filtrada em me- nos de meia hora. É reconhecido e esperado que a elevação da tempera- tura resulte em uma taxa de filtração ainda mais alta. Exemplo 5: Teste in vivo de trombina líquida combinada com gelatina

[0193] Várias concentrações de glicerol foram preparadas conforme descrito acima de acordo com a Tabela 3, de modo similar ao mostrado na Tabela 1: Tabela 3 Concentrações de glicerol (por vo- Quantidade de glicerol Quantidade de DDW Quantidade total lume de solvente) 50 % 2,5 ml 2,5 ml 5 ml 60 % 3 ml 2 ml 5 ml 100 % 5 ml 0 ml 5 ml

[0194] Para cada concentração de glicerol, 8 ml de gelatina em pasta (do kit Surgiflo®) preparados com 1.600 a 2.400 IU de trombina reconstituída com 2 ml das várias concentrações de glicerol foram usa- dos (em vez da trombina reconstituída com água de acordo com o kit). Todas as composições hemostáticas testadas compreenderam: trom-

bina, gelatina e glicerol, sendo que o glicerol estava a uma concentra- ção acima de 30 % dos sólidos, em peso.

[0195] Cada seringa preparada foi identificada com a concentração de glicerol usada para a reconstituição da trombina. A atividade da trom- bina foi testada com o uso de modelo porcino de punção biópsia in vivo, conforme descrito abaixo.

[0196] O procedimento animal usado foi similar ao procedimento anteriormente relatado em MacDonald et al. 2017, Medical Devices: Evidence and Research 10: 273 a 279, com as seguintes modificações: - uma punção biópsia descartável de 8 mm com batente ajus- tado em 4 mm foi utilizada; - um tamponamento foi aplicado por 10 segundos após a apli- cação do artigo de teste e a presença de sangue de fluxo livre foi monito- rada por 2 minutos; e - o número de tamponamentos necessários para não obter sangue de fluxo livre foi indicado.

[0197] Resumidamente, foi feita uma incisão abdominal na linha mé- dia ventral e a porção craniana da incisão na linha média foi ampliada para melhorar a exposição do fígado. O fígado foi posicionado conforme neces- sário para maximizar a disponibilidade da superfície de teste. Os órgãos abdominais foram mantidos úmidos com solução salina e esponjas de la- parotomia embebidas em solução salina durante todo o procedimento. Fo- ram criados defeitos parenquimais do fígado na superfície diafragmática de áreas acessíveis dos lobos esquerdo, direito e quadrado com o uso de uma punção biópsia descartável de 8 mm com um batente de profundi- dade ajustado em 4 mm. A porção central da biópsia foi pinçada e forte- mente dissecada a partir da superfície subjacente causando hemorragia leve a moderada.

[0198] O local do defeito foi deixado sangrar por vários segundos antes da aplicação do produto para possibilitar a caracterização da he- morragia resultante. O sangramento em cada local de defeito foi clas- sificado em uma faixa de 0 a 5 no momento da criação do ferimento e antes do tratamento. Defeitos classificados como 1 ou menos foram excluídos, não sendo realizado nenhum teste nos mesmos. O local do ensaio foi enxuto com gaze e, então, um dos artigos de teste foi apli- cado. Para os propósitos deste estudo, hemostasia eficaz foi definida como a cessação do sangramento de fluxo livre. Sangramentos pete- quiais ou pontuais que surgiram mas que não evoluíram não foram considerados sangramentos de fluxo livre. O artigo de teste foi dispen- sado sobre o defeito (local de sangramento) pelo aplicador Surgiflo®. O tamponamento inicial foi aplicado por aproximadamente 10 segun- dos usando pressão digital sobre uma gaze. Após os 10 segundos ini- ciais de tamponamento, a bandagem foi removida. Se a hemostasia não fosse alcançada após 120 segundos, o tamponamento era reapli- cado e mantido por mais 10 segundos seguidos por um outro período de observação. Esse processo foi repetido até alcançar a hemostasia eficaz, sendo registrado o número de tamponamentos necessários.

[0199] A média de 5 repetições de resultados de eficácia da trombina reconstituída com glicerol combinada com gelatina no modelo porcino de punção biópsia in vivo é apresentada na Figura 4.

[0200] Conforme pode ser visto na Figura 4, a % de glicerol na solução de trombina afetou diretamente os resultados, com 50% de glicerol resultando em média em cerca de 2,8 repetições de tampona- mento, 60% de glicerol resultando em média em cerca de 1,8 repeti- ções de tamponamento, e 100% de glicerol resultando em menos de 1,5 repetições de tamponamento em média.

[0201] Para comparação, foi anteriormente relatado que o Surgi- cel® (pó hemostático absorvível) era superior ao AR (partículas he- mostáticas absorvíveis Arista™ AH) e ao PC (sistema hemostático de polissacarídeo PerClot®) em um modelo similar (MacDonald et al., mencionado acima). Naquele modelo, tanto Arista™ quanto PerClot® tiveram um tempo até a hemostasia igual ou superior a 4,75 minutos. Considerando que cada observação após cada tamponamento é de no máximo 2 minutos, os resultados de Arista e PerClot® são equivalen- tes a igual ou superior a 2,3 tamponamentos.

[0202] Portanto, os resultados deste estudo demonstram o aumento da eficácia para trombina reconstituída em 60% de glicerol ou mais em comparação com os produtos existentes de trombina reconstituída em água sem glicerol.

[0203] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com mo- dalidades específicas da mesma, fica claro que muitas alternativas, mo- dificações e variações serão evidentes aos versados na técnica. Con- sequentemente, tem-se por objetivo abranger todas estas alternativas, modificações e variações no espírito e no escopo amplo das reivindica- ções em anexo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Kit hemostático caracterizado por compreender: a. um recipiente contendo uma composição de trombina líquida que compreende mais de 50% v/v de glicerol; e b. um recipiente contendo gelatina.

2. Kit hemostático, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado por a composição de trombina líquida compreender cerca de 60 a cerca de 100% v/v de glicerol, opcionalmente cerca de 80 a cerca de 100% v/v de glicerol.

3. Kit hemostático, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizado por compreender adicionalmente cál- cio.

4. Kit hemostático, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizado por a composição de trombina líquida compreender adicionalmente um ou mais excipientes selecionados do grupo que consiste em cloreto de sódio, manitol, albumina e acetato de sódio.

5. Kit hemostático, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações precedentes, caracterizado por a composição de trombina lí- quida compreender entre cerca de 100 e cerca de 2.000 UI/ml de trom- bina.

6. Kit hemostático, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizado por a trombina na composição de trom- bina líquida ser pelo menos 70% ativa após cerca de 20 horas a uma tem- peratura de cerca de 50°C.

7. Kit hemostático, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizado por a trombina na composição de trom- bina líquida ser pelo menos 70% ativa após cerca de 2 minutos a uma temperatura de cerca de 100°C.

8. Composição hemostática, caracterizada por compreender trombina, gelatina e glicerol a uma faixa de concentração superior a 30 % dos sólidos, em peso.

9. Composição hemostática, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por compreender adicionalmente cálcio.

10. Composição hemostática, de acordo com a reivindica- ção 8 ou 9, caracterizada por compreender adicionalmente um ou mais excipientes selecionados do grupo que consiste em cloreto de sódio, manitol, albumina e acetato de sódio.

11. Composição hemostática, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizada por compreender entre cerca de 100 e cerca de 2.000 UI/ml de trombina.

12. Composição hemostática, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizada por ser para uso tópico para au- xiliar a hemostasia.

13. Método para a produção em larga escala de uma compo- sição de trombina líquida estéril que compreende mais de 50 % v/v de gli- cerol, sendo o método caracterizado por compreender as seguintes eta- pas: a. preparar uma solução de trombina através da mistura de trombina com uma solução de glicerol para obter uma solução com mais de 50% v/v de glicerol; b. aquecer a solução de trombina obtida até pelo menos cerca de 40°C; e c. esterilizar a dita solução de trombina passando-a por pelo menos um filtro com um tamanho de poro de cerca de 0,22 µm ou me- nos, para assim obter uma composição de trombina líquida estéril que compreende mais de 50% v/v de glicerol.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracteri- zado por compreender adicionalmente uma etapa de inativação viral conduzida através de inativação por calor.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, carac- terizado por a solução de trombina compreender cerca de 60 a cerca de 100% v/v de glicerol, opcionalmente cerca de 80% a cerca de 100 % v/v de glicerol.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado por a solução de trombina compreender adicional- mente cálcio.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 13 a 16, caracterizado por a solução de trombina compreender adicionalmente um ou mais excipientes selecionados do grupo que consiste em cloreto de sódio, manitol, albumina e acetato de sódio.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 13 a 17, caracterizado por a solução de trombina compreender entre cerca de 100 e cerca de 2.000 UI/ml de trombina.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 18, caracterizado por a trombina na composição de trombina líquida ser pelo menos 70% ativa após cerca de 20 horas a uma temperatura de cerca de 50°C.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 19, caracterizado por a trombina na composição de trombina líquida ser pelo menos 70% ativa após cerca de 2 minutos a uma temperatura de cerca de 100°C.

21. Composição de trombina líquida estéril, caracterizada por compreender mais de 50% v/v de glicerol obtido através do método, como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 20.

22. Composição de trombina líquida estéril, caracterizada por compreender mais de 50% v/v de glicerol.

23. Composição de trombina líquida estéril, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por compreender cerca de 60 a cerca de 100 % v/v de glicerol, opcionalmente cerca de 80 % a cerca de 100 % v/v de glicerol.

24. Composição de trombina líquida estéril, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizada por compreender adicionalmente cálcio.

25. Composição de trombina líquida estéril, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizada por compre- ender adicionalmente um ou mais excipientes selecionados do grupo que consiste em cloreto de sódio, manitol, albumina, e acetato de só- dio.

26. Composição de trombina líquida estéril, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, caracterizada por compreen- der entre cerca de 100 e cerca de 2.000 UI/ml de trombina.

27. Composição de trombina líquida estéril, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, caracterizada por a trombina ser pelo menos 70% ativa após cerca de 20 horas a uma temperatura de cerca de 50°C.

28. Composição de trombina líquida estéril, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 27, caracterizada por a trombina ser pelo menos 70% ativa após cerca de 2 minutos a uma temperatura de cerca de 100°C.

29. Composição de trombina líquida estéril, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 28, caracterizada por compreender adicionalmente gelatina.

30. Formulação selante caracterizada por compreender trombina e mais de 50% v/v de glicerol.

31. Formulação selante, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada por compreender cerca de 60 a cerca de 100% v/v de glicerol, opcionalmente cerca de 80% a cerca de 100% v/v de glicerol.

32. Formulação selante, de acordo com a reivindicação 30 ou

31, caracterizada por compreender adicionalmente cálcio.

33. Formulação selante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 32, caracterizada por compreender entre cerca de 100 e cerca de 2.000 UI/ml de trombina.

34. Formulação selante, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 30 a 33, caracterizada por compreender um componente de fibrinogênio.