CN117750985A - 可流动的止血糊剂 - Google Patents

Abstract

本文公开了双组分可流动的组合物，包含：(i)具有氧化纤维素、纤维蛋白原和凝血酶的粉末，该粉末中的该氧化纤维素与该纤维蛋白原的重量比分别在约1:5至约2:1范围内；以及(ii)包含甘油和水性溶液的分散剂，该组合物在室温下呈糊状悬浮液的形式。还公开了这些组合物用于治疗出血组织的用途，以及制备这些组合物的方法。

Description

可流动的止血糊剂

技术领域

本发明尤其涉及可流动的止血组合物，该可流动的止血组合物包含纤维蛋白原、凝血酶和分散剂的共混物。

背景技术

在外科手术期间的各种情况下，治疗剂铺展在人体内，以防止外科手术后出血。现有药剂具有例如片剂难以置于微创外科手术(MIS)中的缺点。

用于控制出血的适当方法或产品的选择取决于许多因素，这些因素包括但不限于出血严重程度；出血源的解剖位置和邻近关键结构的接近程度，无论出血是来自离散的出血源还是来自更大的表面区域；出血源的可见度和精确识别；对出血源的触及。

在解决上述问题的努力中，已开发出用于控制过量出血的材料。局部可吸收止血剂(TAH)广泛用于外科应用中。TAH涵盖基于氧化纤维素(OC)、明胶、胶原、甲壳质、脱乙酰壳多糖等的产品。为了改善止血性能，可将基于上述材料的支架与生物来源的凝血因子(诸如凝血酶和纤维蛋白原)组合。

由于其生物降解能力以及其杀菌和止血特性，基于氧化纤维素(OC)的材料诸如氧化再生纤维素(ORC)长期以来被用作局部止血剂。基于OC和ORC的材料也用作粘连屏障。基于ORC的产品被用于多种外科手术中，包括：神经外科手术、腹部外科手术、心血管外科手术、胸外科手术、头颈外科手术、骨盆外科手术以及皮肤和皮下组织手术。用于基于OC材料形成各种类型的止血剂的若干方法是已知的，而无论止血剂被制成粉末、织造、非织造、针织和其他形式。目前使用的止血剂包括粉末或包含ORC的织物。

然而，由于控制出血在外科手术中对于最小化失血、减少术后并发症以及缩短手术室中外科手术的持续时间是必不可少且关键的，因此需要有利于易于施用(尤其在出血部位和难以触及的区域中)的改进的形式和材料。

美国专利申请2020/0,139,021公开了由氧化纤维素(OC)和甘油构成的组合物，其中甘油与OC的比率为至少约0.5:1w/w甘油与OC，并且/或者其中组合物的粘度比甘油的粘度高至少10％并且组合物的粘度低于约2.6×10⁹cP，其中总水含量小于约8％w/w。

美国专利9,265,858号公开了一种干燥组合物，其在添加水性介质后形成适合用于止血程序的基本上均匀的糊剂。

发明内容

本发明尤其涉及可流动的止血组合物，该可流动的止血组合物包含纤维蛋白原、凝血酶和分散剂的共混物。

本发明的目的是提供一种用于制备具有治疗或药用价值的可铺展的糊状止血剂的组合物，该组合物可容易地施用于有需要的部位，包括在身体的难以触及的区域中。

纤维蛋白原与凝血酶会在水性介质中相互作用。找到具有适当稠度的合适制剂并非易事，因为不能在不损害糊性、粘合性和/或止血功能的情况下使用常用的分散剂诸如水或亲水性分散剂。因此，对于包含纤维蛋白原和凝血酶两者的稳定液体/可流动的组合物，在施用于出血部位上例如以进行密封和止血之前，通常使用非水性介质(分散剂)。找到使OC达到适当稠度的合适制剂也并非易事，因为不能在不损害OC的活性功能的情况下使用常用的溶剂化物或非溶剂化物，诸如水或油。

本发明人已经开发了包含例如氧化纤维素(OC)的组合物，用于制备用作止血剂的可铺展的糊剂或粉末，其可以容易地施用于需要的部位。

因此，本发明基于以下令人惊讶的发现：包含分散在包含例如甘油和水性溶液的分散剂中的OC、纤维蛋白原、凝血酶的粉末的这种糊状悬浮液提供优异的止血功能。因此，这种组合物可以施用于需要的部位以获得生物活性，例如控制出血，特别是在身体的难以触及的区域中。

在这样的悬浮液中使用水性溶液是违反直觉的，并且可以假设，不受任何特定理论或机制的约束，在将粉末混合在分散剂中之后，均匀分散的生物制剂在甘油/盐水系统中形成纤维蛋白，其与OC一起形成多孔糊剂，富含凝血酶保留在系统中。此后，在施用于出血部位时，多孔可流动ORC-纤维蛋白基质(其不溶于水)允许血液容易地渗透通过其空间并暴露于高浓度的凝血酶，从而加速与血液接触时内源纤维蛋白凝块的形成。因此，在不受理论束缚的情况下，可以假设这种OC-纤维蛋白的多孔基质还提供了红细胞和血小板粘附和聚集的环境，并且可流动基质可以流入深腔隙和不规则部位中以在被轻柔地按压之后紧密地粘附到出血部位。

因此，已经证实，所公开的组合物是易于使用、稳定且有效的止血剂。

根据本公开的一个方面，提供了一种双组分可流动的组合物，该组合物包含：(i)包含氧化纤维素、纤维蛋白原和凝血酶的粉末，该粉末中的氧化纤维素与纤维蛋白原的重量比分别在1:5至2:1范围内；以及(ii)包含甘油和水溶液的分散剂，该组合物在室温下呈糊状悬浮液形式。

在一些实施方案中，OC与纤维蛋白原的重量比在1:2至2:1范围内。

参考图2，其显示每1.2g粉末提供3ml分散剂(包含50体积％甘油的水性溶液)也是稠的组合物，并且在使用5ml时，组合物变得非常稀。因此，在一些实施方案中，分散剂以分别在约2.5:1至约5:1(v/w，以ml/g计)范围内，例如2.5:1、3:1、3.5:1、4:1或5:1(包括其间任何值和范围)的分散剂与粉末比率存在。

在一些实施方案中，OC包括氧化再生纤维素(ORC)。

在一些实施方案中，粉末的至少一部分呈聚集形式。在一些实施方案中，OC呈研磨形式。

在一些实施方案中，组合物还包含纤维蛋白原。在一些实施方案中，纤维蛋白是至少部分交联的。

在一些实施方案中，凝血酶以每1克粉末约2000IU至约4000IU的量存在。

在一些实施方案中，组合物包含钙盐。

在一些实施方案中，组合物包含缓冲剂，例如呈粉末形式。在一些实施方案中，缓冲剂选自Tris、赖氨酸或它们的组合。

在一些实施方案中，至少90％的粉末的粒度在10至2,000μm范围内。在一些实施方案中，粒度在约200至约900μm范围内。

在一些实施方案中，甘油按分散剂的体积计以高于约15％的浓度存在。在一些实施方案中，甘油按分散剂的体积计以高于约40％的浓度存在。在一些实施方案中，甘油按分散剂的体积计以最高约70％的浓度存在。

在一些实施方案中，组合物在约室温下在4.5至6.5的pH下稳定至少约20小时。

在一些实施方案中，水性溶液包含盐水。

在一些实施方案中，粉末是喷雾干燥的和/或高剪切混合的。

在一些实施方案中，按粉末的重量计，纤维蛋白原以60％至95％或70％至90％的浓度范围存在。在一些实施方案中，组合物用作组织的出血部位中的止血剂。

在一个方面，提供组合物在其任何实施方案中在治疗出血组织的方法中的用途，该方法包括将组合物施用到出血组织上。在一些实施方案中，该方法包括微创手术(MIS)，诸如腹腔镜手术。

在另一个方面，提供了在其任何实施方案中制备组合物的方法，该方法包括在允许形成OC纤维/粉末、纤维蛋白原和凝血酶的聚集形式的条件下将OC(例如，ORC)纤维/粉末与纤维蛋白原粉末和凝血酶粉末组合，并且将聚集物与包含甘油和水性溶液的分散剂组合。

在一些实施方案中，条件允许纤维蛋白原至少部分转化为纤维蛋白。在一些实施方案中，条件允许纤维蛋白至少部分交联。在一些实施方案中，条件选自如下(i)至(iii)中的一种或多种条件：(i)温度在0℃至30℃范围内，(ii)pH在4.5至6.5范围内，以及(iii)分散剂的分散剂与粉末的比率分别在3:1至4:1(v/w ml/g)范围内。

在另一方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括：容纳在其任何实施方案中的组合物的容器；和用于将组合物施用于组织上的施用装置；以及任选地，使用说明书。

在另一个方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括：容纳包含氧化纤维素、纤维蛋白原和凝血酶的粉末的容器，该粉末中的氧化纤维素与纤维蛋白原的重量比分别在约1:5至约2:1范围内；以及容纳包含甘油和水性溶液的分散剂的容器，以及任选地，使用说明书。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和/或科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管类似于或等同于本文所述那些的方法和材料可用于本发明的实施方案的操作或试验，但下文描述的是示例性方法和材料。如发生矛盾，应以专利说明书及其定义为准。另外，材料、方法和示例仅为示例性的，而非旨在进行必需的限制。

附图说明

本文仅以举例的方式结合附图来描述本发明的一些实施方案。现在具体参考附图，需要强调的是，所示的细节是以举例的方式并且出于例示性讨论本发明的实施方案的目的。就这一点而言，结合附图进行的描述使本领域的技术人员明白如何实践本发明的实施方案。

图1呈现了对比照片图像，证明了如实施例2中所述的所选样品(含1.2g粉末的4ml50体积％甘油在盐水中)的流动性；从左至右：分别具有2:1的ORC与纤维蛋白原重量比的粉末(具有凝血酶，即3300IU剂量/1.2g)；(ii)分别具有2:1的ORC与纤维蛋白原重量比的不具有凝血酶的粉末；(iii)包含ORC与BSA的重量比为2:1的ORC和BSA(牛血清白蛋白)的具有凝血酶的粉末；(iv)ORC；(v)包含ORC和凝血酶(不含纤维蛋白原)的粉末。

图2呈现了对比照片图像，证明了根据以下实施例部分中的表1的所选样品的流动性(从左至右，每组具有对应样品编号)。

图3A至图3D呈现了对比照片图像，证明了分别具有2:1至1:5范围内的各种ORC与纤维蛋白原重量比(“比率”)的测试样品的流动性和各自的凝固时间，其中70％或80％甘油在盐溶液中，按体积计：80％甘油，比率为2:1、1:1、1:2和1:5(图3A，从左至右)；70％甘油，比率为1:2和1:5(图3B，从左至右)；血液凝固(对于比率为1:5的80％甘油；在180秒以上之后；图3C)；血液凝固(对于比率分别为1:2和1:5的70％甘油；在70秒之后；图3D，从左至右)。

图4呈现了显示按体积计分散在80％甘油盐水溶液中的重量比为2:1(“1”)、1:1(“2”)、1:2(“3”)和1:5(“4”)的ORC与纤维蛋白原的不同样品的比较的时间依赖性粘度曲线的图。

图5呈现了显示按体积计分散在50％含甘油盐水溶液中的量比为2:1(“1”，“1'”)、1:1(“2”，“2'”)、1:2(“3”，“3'”)和1:5(“4”，“4'”)的ORC与纤维蛋白原的不同样品上进行的振幅扫描测试的结果的图。在图中：正方形符号是指G'；三角形符号是指G”。

图6呈现了证明如实施例4中所述在重构后2小时和20小时后(盐水和各种浓度的甘油)样品的不同制剂的猪血液凝固时间的图(离体测试)的图(参见“pH和甘油浓度对稳定性的影响”；圆形显示样品6在20小时后的固液相分离)。

图7呈现了证明如实施例4所述在重构后0.5小时、2小时和20小时后(盐水和各种浓度的甘油)不同样品的猪血凝结时间和pH的图(参见表3)。

图8呈现了证明如实施例5中所述在各种pH值下(在盐水+各种浓度的甘油中)在2:1和1:1比率的ORC与纤维蛋白原制剂的情况下甘油浓度随时间对凝血酶稳定性的影响的图(参见表4)。

图9呈现了证明如实施例5中所述在各种pH值下(在盐水+甘油50体积％中)在2:1和1:1的ORC与纤维蛋白原比率制剂的情况下pH随时间对凝血酶稳定性的影响的图(参见表5)。

图10呈现了证明如实施例6中所述所选ORC与纤维蛋白原比率样品(1.2g在4ml 50体积％甘油+盐水中)随时间的厚度(mm)的图(参见表6)。

图11呈现了显示脾活检穿孔模型中使用的出血水平等级的示意图的图像。白色圆圈表示穿孔，灰色圆表示组织的背景，黑色圆圈表示从活检穿孔部位流动的血液(从左图到右：无出血“0”；渗出“1”；极轻度“2”；轻度“3”；中度“4”；重度“5”)。

图12呈现了总结针对不同制剂在肝素化条件下用6mm活检穿孔器使用脾活检穿孔模型在体内猪穿孔模型测试中测定的止血成功率的柱状图(N＝5；参见实施例7)。

图13呈现了总结针对不同制剂在肝素化条件下用6mm活检穿孔器使用脾活检穿孔模型在体内犬穿孔模型测试中测定的止血成功率的柱状图(N＝5；参见实施例7)。

具体实施方式

易于制备和应用于难以接近的出血部位的手术中使用的纤维蛋白复合基质的可流动止血剂的生产是具有挑战性的，特别是在微创手术(MIS)，例如内窥镜检查期间。

本发明的一个目的是提供一种组合物，该组合物可以容易地施用于有需要的出血部位，特别是在身体的难以触及的区域中。本发明的组合物的另一个优点是它们是可生物吸收的，因此可在外科手术后留下而不会引起任何副作用。

“施用于有需要的出血部位”是指例如将组合物局部施用于组织的出血手术部位处或其上/附近。

根据本公开的一个方面，提供了一种可流动的组合物，该组合物包含：(i)包含氧化纤维素、纤维蛋白原和凝血酶的粉末；(ii)包含多元醇化合物和水性溶液的分散剂。在一些实施方案中，组合物在大约室温下呈悬浮液的形式。在一些实施方案中，悬浮液是糊状悬浮液。在一些实施方案中，多元醇化合物包括糖醇，例如甘油。在一些实施方案中，氧化纤维素与纤维蛋白原的重量比分别在约1:5至约2:1范围内。在一些实施方案中，组合物为双组分组合物。

在一些实施方案中，该组合物是生物可吸收的。术语“生物可吸收的”是指组织相容性材料在植入到无毒产品中之后在体内降解的能力，该无毒产品最终从身体中消除或代谢。

如本文所用，并且除非另行指出，否则术语“重量比”、“按重量计”、“w/w”、“重量百分比”或“重量％”在本文中可互换使用，它们描述特定物质在相应混合物、溶液、悬浮液、制剂或组合物的总重量中的浓度。如本文所用，并且除非另行指出，否则术语“体积比”、“按体积计”、“v/v”、“体积百分比”或“体积％”在本文中可互换使用，它们描述特定物质在相应混合物、溶液、悬浮液、制剂或组合物的总重量中的浓度。

双组分组合物可以通过将第一组分和第二组分混合以制备悬浮液来制备。如本文所用，术语“双组分组合物”是指包含至少两种组分的组合物。典型地，但非排他地，将两种组分储存在分开的容器中并混合以产生混合物或其悬浮液，然后将混合物或悬浮液施用到基底上。具体地，在用于本发明的双组分组合物的实施方案中，将第一组分和第二组分在2小时内或在一些情况下在0.5小时内混合以制备其分散混合物，然后将混合物施用于基底，例如出血部位。

如本文所用，术语“混合物”是指但不限于任何物理形式(例如，共混物、溶液、悬浮液、分散体等等)的组分的组合。

如本文所用，术语“悬浮液”或其任何语法衍生词是指分散在液体或溶剂样相中的细溶质样微粒中的固体的非均质混合物。典型地，悬浮液将具有沉降的倾向，即固体物质的细粒可以具有在一段时间后沉淀的倾向，在一些实施方案中，该段时间高于20小时。时间段可取决于许多因素，诸如微粒和液体的物质、温度、pH和其他物理参数(如搅拌和振荡)以及其他物质(诸如分散剂、乳化剂、表面活性剂、增稠剂等)的存在。

如本文所用，术语“出血”是指血液从循环系统的任何组分外渗。因此“出血”涵盖与外科手术、创伤或其他形式的组织损伤有关的非期望、非受控且通常过多的出血以及患有出血性疾病的患者中的非期望的出血。术语“血液”或其任何语法变型还包括血液级分，诸如血浆。

术语“创伤”被定义为由物理力引起的损伤；非限制性示例包括车辆事故、枪击和烧伤的后果。

术语“粉末”是指固体微粒材料，通常为分散的干燥固体粒子，例如呈通常在0.1微米到1000微米范围内，有时低于100微米的其至少一个维度的较小大小为特征的多个固体粒子的形式。

术语“固体”表征化合物或组合物在室温(例如，25℃)和大气压(760mmHg)下的状态，即，在储存期间保持其形态的高稠度的化合物或组合物。在本申请中该术语还涉及非流体粒子或溶解的物质。与“液体”化合物和组合物相反，固体不在其自身重量下流动。“粉末状”和“微粒”在本文中可互换使用。

如本文所用，术语“糊剂”涉及组合物在约室温的至少一个温度处的稠度，并且定义固体粒子的流体混合物。通常，糊剂没有固定形状，并且因此不是固体或气体。根据本公开的术语“糊剂”还可包括浆液、药膏和油膏。浆液可在功能上被认为是稀薄的油状糊剂。根据本公开的糊剂还可包括包含可膨胀气体(诸如空气)的孔。因此，在一些实施方案中，组合物是糊剂，或在大约室温下的至少一个温度下呈糊状稠度。

术语“可流动的”还涵盖粘稠溶液。术语“粘性溶液”是指具有增加的流动阻力但仍能够流动的溶液。在一些实施方案中，氧化纤维素与纤维蛋白原的重量比分别在1:5至2:1范围内，并且组合物具有大于约400Pa·s且小于约3000Pa·s的粘度。在这方面参考图4。

在一些实施方案中，糊剂的特征在于粘度为400Pa·s至2950Pa·s，例如400Pa·s、500Pa·s、600Pa·s、700Pa·s、800Pa·s、900Pa·s、1000Pa·s、1100Pa·s、1200Pa·s、1300Pa·s、1400Pa·s、1500Pa·s、1600Pa·s、1700Pa·s、1800Pa·s、1900Pa·s、2000Pa·s、2100Pa·s、2200Pa·s、2300Pa·s、2400Pa·s、2500Pa·s、2600Pa·s、2700Pa·s、2800Pa·s、2900Pa·s或2990Pa·s，包括它们之间的任何值和范围。

术语“粘度”是指流体和浆液的特性，其指示它们的流动阻力，定义为剪切应力与剪切速率的比率。粘度通常具有规定的或已知的剪切速率。在本文中，除非另有说明，否则在粘度的情形中，剪切速率为0.5秒^-1，并且粘度在环境压力和温度条件下测量(称为“环境条件”，即大约室温和大气压)。术语“剪切速率”是指在流体流动通道的直径上测量的速度梯度，该流体流动通道可以是管、环或其他形状。剪切速率是一层流体通过相邻层的速度的变化速率。

在一个实施方案中，组合物是呈可注射形式。如本文所用，短语“可注射形式”是指可流动的组合物(例如，可包含粒子形式的交联的纤维蛋白原、聚合的纤维蛋白和/或交联的纤维蛋白，该等粒子足够小以允许注射到人类受试者中，例如经由注射器和针头注射)，以及具有用于注射到受试者中的合适纯度和无毒性。该组合物应当是均匀的，并且具有在通过各种内径(例如，14-32号)的针注射时能顺利通过的流变特性。因此，在一些实施方案中，组合物能够通过施用装置。

在一些实施方案中，该组合物是均质的。如本文所用，所谓的“均质的”意指在整个油性介质中均匀的组成和质地，也就是说，粉末基本上均匀地分散在整个分散剂中。在本文中，“基本上均匀分散”是指在整个分散剂中，分散剂内粉末的浓度在小于±30重量％、小于±20重量％、小于±10重量％、小于±5重量％的范围内变化，即没有明显的固-液相分离。通常，术语“均质的”是指在8℃至40℃、10℃至30℃或20℃至30℃下耐受液相/固相分离(例如，按重量计小于4％)的均匀呈现的产品(例如，糊剂)。

术语“液体介质”、“介质”或“分散剂”在本文通篇可互换使用。本文中，术语“分散剂”意指液体介质，任选地具有糊状稠度或能够提供糊状稠度的液体介质。因此，术语“分散剂”以一般含义使用，并且不同于词语“溶剂”，可仅用于阐明由例如纤维蛋白原、凝血酶和OC纤维或粉末构成的所公开共混物或粉末基本上不可溶于这类液体介质中，而是形成固体-液体体系。

所谓“大约室温”意指在10℃至40℃、或15℃至37℃，例如10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或40℃范围内的至少一个温度值，包括它们之间的任何值。

在一些实施方案中，OC与纤维蛋白原的重量比分别在1:5至2:1范围内。在一些实施方案中，OC与纤维蛋白原的重量比分别在1:4至2:1范围内。在一些实施方案中，OC与纤维蛋白原的重量比分别在1:3至2:1范围内。在一些实施方案中，OC与纤维蛋白原的重量比分别在1:2至2:1范围内。参考实施例部分，例如图10，显示当ORC与纤维蛋白原的比率低于2:1(1:1、1:2和1:5)时，重构的糊剂变得更硬，具有更高的厚度，在约1:5比率时变得太硬。

术语“氧化纤维素”(或“OC”)是指其中例如葡糖酐单元的碳6上的至少一些伯醇基团被氧化成羧酸并且任选地被官能化的纤维素衍生物。

可通过在纤维素上施加氧化剂来制备OC。氧化剂可选自但不限于氯、过氧化氢、过乙酸、二氧化氯、二氧化氮、过硫酸盐、高锰酸盐、重铬酸盐-硫酸、次氯酸、次卤酸盐、高碘酸盐、或它们的任何组合、和/或多种金属催化剂。根据氧化剂的性质和反应条件，作为原料纤维素的初始羟基基团的替代或补充，氧化纤维素还可包含羧酸、醛和/或酮基团。

用于本公开的组合物中的OC通常但非排他性地呈纤维或粉末的形式(也称为颗粒化OC、经研磨/碾磨的OC或呈聚集形式的经研磨/碾磨的OC)。经研磨/碾磨的OC可通过各种方法制备，包括由现有产品制备，并且此类产品的一些非限制性示例如下文所述。由于现有产品中的一些产品呈织物的形式，因此可通过碾磨或研磨织物以获得粉末来制备OC粉末。

在一些实施方案中，OC包括氧化再生纤维素(ORC)。

织造或非织造ORC材料、切碎或经球磨的ORC材料可以进一步经辊压实以达到所需的低纵横比和高密度ORC粒子。

呈聚集形式或可被碾磨或研磨的且因此可用于制备组合物的粒子的基于OC的产品的示例包括但不限于可吸收粘连屏障、/>原装可吸收止血剂、/>NU-/>可吸收止血剂、/>FIBRILLAR^TM可吸收止血剂、SNoW^TM可吸收止血剂和/>粉末可吸收止血剂、来自GelitaMedical BV,Amsterdam,The Netherlands的/>可吸收纤维素手术敷料。

应当理解，虽然OC的常见来源是植物材料，但OC也可源于细菌来源。在一些实施方案中，OC源于植物来源。

如本文所述，在一个实施方案中，用于制备所公开组合物的纤维或粉末通过研磨纤维素源材料来制备；在研磨步骤之前，可通过裁切和切割纤维素源材料来形成材料片。

在一些实施方案中，所公开组合物具有羧基含量为约12％至约24％的OC。

如本文相对于OC所用，术语“氧化水平”、“氧化度”、“羧基含量”和“羧化水平”是可互换的，并且可根据美国药典(USP)23-NF18测定。

因此，在一些实施方案中，OC的羧基含量为约12％-24％(w/w)。在一些实施方案中，OC的羧基含量为12％-23％(w/w)。在一些实施方案中，OC的羧基含量为12％-22％(w/w)。在一些实施方案中，OC的羧基含量为约12％至约21％(w/w)。

非限制性示例性粉末包括包含ORC纤维和/或颗粒剂(也称为“颗粒化ORC”)的固体粒子。

术语“甘油”是指1,2,3-丙三醇，并且也被称为“甘油”，并且还可以包括其衍生物。术语“衍生物”是指含有母体的基本元素的化合物。

如本文所用，“凝血酶”表示因凝血酶原(因子II)的蛋白水解裂解产生的活化酶。凝血酶可通过本领域已知的多种生产方法来产生，并且包括但不限于重组凝血酶和血浆源性凝血酶。

人凝血酶是由通过二硫键连接的两个多肽链构成的295个氨基酸的蛋白质。人和非人(例如，牛)凝血酶均可在本公开的范围内使用。

本公开中使用的凝血酶的起源可来自一个或若干个来源，包括但不限于：血浆(例如，猪血浆)、重组细菌和/或细胞(参加例如，Vu等人，2016，J.Viet.Env.，8(1):21-25)、全血(从或不从若干献血汇集)和/或血级分(可从若干献血汇集，例如血浆)。凝血酶可由诸如强生公司(Johnson and Johnson)、百特公司(Baxter)和杰特贝林公司(CSL Behring)之类的制造商以独立产品的形式(例如，)或以产品的组分的形式(例如，等)提供。

在一些实施方案中，凝血酶以每1克粉末约2000IU至约4000IU的量存在。在一些实施方案中，凝血酶以每1克粉末约3000IU的量存在。在一些实施方案中，凝血酶以每1克粉末约2000IU、3000IU或4000IU的量存在，包括它们之间的任何值和范围。

本文中“U”表示凝血因子单位，即1ml人正常血浆中凝血因子的生理测量值单位。

“IU”是指凝血因子的国际单位，是给定样品中与适当的有意标准相比的生理测量值，例如，如通过针对效能浓度测量的内部参考标准进行的凝血测定所确定，该内部参考标准已经针对例如用于凝血酶的世界卫生组织(WHO)第二国际标准01/580进行校准。

术语“纤维蛋白原”(不具有更多)旨在包括任何类型的纤维蛋白原。“纤维蛋白原”是指具有单体结构(AαBβγ)的单体和二聚体纤维蛋白原分子、杂合分子及它们的变体，而无论是天然存在的、修饰的还是合成的。术语“纤维蛋白原”可指来自人的纤维蛋白原，但是可包括任何物种的纤维蛋白原，尤其是哺乳动物物种，诸如从猪血浆产生的纤维蛋白原。

术语“水性溶液”是指包含水作为溶剂的溶液。该术语可包括水、盐水或出血部位。在一些实施方案中，水性介质选自水、盐水、氯化钙溶液或缓冲的水性介质。

在示例性实施方案中，水溶液包含盐水。如本文所用，术语“盐水”是指含有浓度大于约0.5重量％且小于约20重量％的盐的水，例如含约0.9w/w％氯化钠溶液的软化水。

在一些实施方案中，粉末的至少部分呈聚集体或颗粒的形式。术语“聚集体”描述由组装的组分形成的粒子。聚集体可任选地通过以下步骤来制备：加湿粉末组合物；压实，例如，通过辊压和/或重压粉末以形成聚集体；除湿；研磨；筛分聚集体；以及任选地将所得聚集体定量添加到储存容器中或递送装置中。术语“颗粒”或“颗粒材料”可具体地表示通常低于900微米、低于800微米、低于700微米或甚至低于500微米的粒子的凝聚体。即，粒子的至少部分不是离散固体的形式。在一些实施方案中，利用高剪切混合将纤维蛋白原、凝血酶和任选地CaCl₂和ORC的粒子组装成聚集体。

在另一个实施方案中，组合物呈混合物的形式。在示例性实施方案中，混合物可包含喷雾干燥的第一微粒与喷雾干燥的第二微粒的组合，该喷雾干燥的第一微粒包含纤维蛋白原，该喷雾干燥的第二微粒包含凝血酶(例如，人凝血酶)，这两种微粒一起形成例如10微米至约等于或超过250微米的粒子。

附加地或另选地，任选地使用如美国专利10,034,957中所述的干燥、研磨/碾磨和筛分的步骤，将包含纤维和化合物的根据本公开的粉末组合物压实成聚集体的形式。所用的筛限定粉末的粒度。

在本公开的任何方面的一些实施方案中，多个粒子的特征在于最高约900μm的中值粒度。

在一些实施方案中，至少90％的粉末的粒度在10μm至2,000μm范围内。在一些实施方案中，至少90％的粉末的粒度在10μm至1,000μm范围内。在一些实施方案中，至少90％的粉末的粒度在100μm至1,000μm范围内。在一些实施方案中，至少90％的粉末的粒度在200μm至1,000μm范围内。在一些实施方案中，至少90％的粉末的粒度在100μm至900μm范围内。在一些实施方案中，至少90％的粉末的粒度在200μm至900μm范围内。

在本公开的任何方面的一些实施方案中，多个粒子的特征在于约100μm至约900μm的中值粒度。在本公开的任何方面的一些实施方案中，多个粒子的特征在于约200μm至约900μm的中值粒度。

在粒度的上下文中，术语“中值”(也称为“D50”)是指将群体分成两半，使得50％的群体大于或小于此粒度的粒度。

术语“粉末的至少部分呈聚集形式”是指粉末中粒子群的一部分，例如至少10％至100％形成聚集体。

在一些实施方案中，组合物还包含纤维蛋白原。

术语“纤维蛋白”不仅指完全凝固的纤维蛋白原，而且还包括在使用凝血酶由纤维蛋白原形成纤维蛋白期间可能发生的纤维蛋白和纤维蛋白原的任何混合物，并且因此包括任何比率的纤维蛋白原/纤维蛋白以及任何等级的可想到的凝胶化和/或凝结，只要其对组合物的最终糊状质地没有负面影响。此外，术语“纤维蛋白”还包括任何部分或完全交联、胶凝或凝结形式。

因此应当理解，纤维蛋白本身作为包含原纤维的聚合的不溶性基质存在，每个原纤维包含许多纤维蛋白分子。

在一些实施方案中，甘油按分散剂的体积计以高于约15％的浓度存在。在一些实施方案中，甘油按分散剂的体积计以高于约40％的浓度存在。在一些实施方案中，甘油按分散剂的体积计以最高约80％的浓度存在。在一些实施方案中，甘油按分散剂的体积计以最高约70％的浓度存在。在一些实施方案中，甘油按分散剂的体积计以最高约60％的浓度存在。

在一些实施方案中，甘油按分散剂的体积计以高于约15％至约80％的浓度存在。在一些实施方案中，甘油按分散剂的体积计以高于约15％至约80％的浓度存在。在一些实施方案中，甘油按分散剂的体积计以高于约15％至约60％的浓度存在。在一些实施方案中，甘油按分散剂的体积计以高于约40％至约80％的浓度存在。在一些实施方案中，甘油按分散剂的体积计以高于约40％至约60％的浓度存在。

在一些实施方案中，甘油按分散剂的体积计以以下浓度存在：约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％或约80％，包括它们之间的任何值和范围。

参考图3A至图3D，其显示70％甘油样品在分散于上述分散剂中时提供糊状组合物，而80％甘油样品表现出更高的流动性，主要对于2:1至1:2样品的ORC与纤维蛋白原重量比(“比率”)，导致组合物不太能够停留在伤口部位，并且还导致较慢的凝结速率(对于1:5样品高于180秒；对于70％甘油样品(1:2和1:5比率)，凝血时间为70秒)。进一步的结果显示(i)对于2:1至1:1的ORC与纤维蛋白原重量比，分散剂中甘油的优选浓度(不损害酶活性，如下文所述)为大于15体积％至小于50体积％，从而为每个时间点提供小于60秒的凝结时间；并且(ii)在20小时后，15％甘油样品发生液-固相分离，如图6所示。

在一些实施方案中，将粉末喷雾干燥和/或高剪切混合。

术语“喷雾干燥”在本文中以广泛的含义使用，其包括但不限于用于将溶解或悬浮于液体中的固体转变为粉末状的方法。通常，喷雾干燥是用于由溶液、悬浮液或乳液形成粉末的干燥方法，该溶液、悬浮液或乳液在热气流中通过喷雾嘴雾化并且立即干燥。用于产生维持其活性的凝血酶和纤维蛋白原粉末的喷雾干燥工艺可通过若干工艺参数来控制，其中一些参数是但不限于：柱空气流量和温度、喷嘴尺寸和雾化空气流速和材料流速。下文实施例部分中提供了为了建立用以产生维持其活性的凝血酶和纤维蛋白原的共混物(例如，呈粉末形式)的稳健工艺所使用的非限制性示例性参数。

术语“高剪切混合”通常意指湍流式混合。在一些实施方案中，高剪切混合的特征在于范围从150rpm至500rpm的混合叶片的速度和/或切割刀片的速度。

附加地或另选地，可使用其他方法来获得干燥组合物，这些方法诸如但不限于纤维蛋白原溶液和/或凝血酶溶液的冻干，然后是微粉化。通常，在溶液的冻干之后，获得多孔和海绵状固体材料，其被称为“饼块”(在本文中也可被称为“固体组合物”)。

当例如从固体组合物产生的粒子的直径仅几微米时，使用术语“微粉化”。微粉化可通过包括但不限于喷射研磨、珠球研磨、高压均质化、RESS(超临界溶液快速膨胀法)工艺、SAS(超临界抗溶剂)方法或PGSS(气体饱和溶液微粒形成)方法的工艺来实现。通常但非排他性地，微粉化导致蛋白质粉末从其原始尺寸缩小30至400倍。

在一些实施方案中，该组合物是稳定的。

当涉及所公开的糊剂时，术语“稳定的”和“稳定性”是指例如凝血酶中的活性成分在一定温度和一定持续时间后保持至少70％的活性，即能够形成纤维蛋白凝块。

在一些实施方案中，组合物为储存稳定的组合物。术语“储存稳定的”应当理解为是指通常存在于容器(例如，小瓶或注射器)中并且在预先选择的储存条件(例如，pH)下稳定的制剂、组合物，这些预先选择的储存条件包括预先选择的储存温度、预先选择的制剂的物理状态。稳定性可通过本领域已知的方法来确定，例如通过在预先选择的储存条件下(例如，在组合物呈液体或糊剂形式时)测试制剂中的可见聚集、残余物和/或纤维蛋白凝块的不存在。此外，根据本公开，当提及稳定的密封剂组合物或制剂时，其应当理解为不论一些制剂的储存条件如何，在使用时都具有有效凝血时间的制剂，例如，不论储存在室温(例如，8℃至40℃)还是甚至更低的温度(例如，低于8℃)，密封剂制剂都在基本上相同的时间段凝结。

在一些实施方案中，组合物在约室温下具有约4至约6.5的pH。关于这一点，参考下面的实施例部分，例如图7至图9。在一些实施方案中，组合物具有约4、4.5、5的pH。在约室温下为5.5、6或约6.5，包括它们之间的任何值和范围。

在一些实施方案中，组合物在其任何实施方案中在约室温下在4至6.5的pH下保持稳定至少约20小时。在一些实施方案中，组合物在其任何实施方案中在约室温下在4至5的pH下保持稳定至少约20小时。

在一些实施方案中，在约室温下在4至6.5的pH下在至少20小时、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天或至少7天之后检测到小于25重量％、小于24重量％、小于23重量％、小于23重量％、小于22重量％、小于21重量％或小于20重量％的残余物。

在一些实施方案中，组合物在其任何实施方案中还包含含于组合物内或组合物表面上的另外的药物活性剂。

在一些实施方案中，药物活性剂选自治疗活性剂和标记剂。

在一些实施方案中，治疗活性剂选自由以下组成的组：干细胞、生长因子、骨形态发生蛋白、细胞、细胞因子、激素、药物、矿物质、具有治疗潜力的质粒以及它们的组合。如本文所述，在一些实施方案中，组合物还可包含至少一种生物活性剂。可包含在该组合物中的非限制性生物活性剂包括钙，以及治疗剂，诸如抗生素、抗炎剂、生长因子或凝血因子。具体地，所公开的组合物还可能包含促进凝块形成的组分，诸如但不限于钙盐、因子VIII、因子XIII、纤连蛋白、玻连蛋白、血管性血友病因子(vWF)，这些组分可作为单独组分提供或者与共混物或糊剂一起配制。

药物活性剂任选地与蛋白质(即纤维蛋白原或纤维蛋白)基质连接(例如，与蛋白质共价连接)。该试剂可以在基质制备后附着于基质和/或附着于成分(例如，蛋白质和/或还原糖)，其然后用于制备蛋白质基质，例如交联的纤维蛋白。

另选地或附加地，药剂被交联的蛋白质基质吸收。吸收可以例如通过使交联的纤维蛋白原或纤维蛋白基质或非交联的纤维蛋白基质与含有药剂的溶液接触(例如，通过浸渍、浸泡、洗涤)，或通过在交联之前添加药剂(例如，将药剂包含在交联溶液中，将药剂包含在纤维蛋白原和凝血酶的溶液中)来获得。

如果需要，本文所述的组合物以及上述试剂盒的内容物可存在于包装或分配器装置中，该包装或分配器装置可含有一个或多个单位剂型，该单位剂型含有组合物或成分(例如，纤维蛋白原)和/或用于制备组合物的试剂(例如，分散剂)。包装可例如包括金属或塑料箔，诸如泡罩包装。包装或分配器装置可附有施用说明书。包装或分配器装置还可以附有由管理药物生产、使用或销售的政府机构规定的形式的注意事项，该注意事项反映了该机构批准组合物用于人类或兽类施用的形式。此类注意事项例如可包括经美国食品药品监督管理局(FDA)批准的处方药的标签或批准的产品插页。还可以制备包含在药学上可接受的载体中配制的本发明制备物的组合物，将其放置在适当的容器中，并且标记以用于指定的应用和/或用于治疗指定的病症，如本文进一步详述。术语“制备物”是指生理上适于治疗使用。

应当理解，本公开的实施方案的组合物可以附着于或包含于医疗装置中，诸如用于促进伤口愈合。

在本公开的另一方面，所公开组合物在其任何方面或实施方案中用于通过将其任何方面或实施方案中的所公开组合物施用在组织的表面上来制备受试者的受损组织中/上的纤维蛋白密封剂的方法中。

在本公开的另一方面，提供了一种在其任何方面或实施方案中通过将所公开的组合物作为止血剂施用在组织的表面上来制备受试者的受损组织中/上的纤维蛋白密封剂的方法。

在本公开的另一方面，提供了一种根据其实施方案制备组合物的方法，该方法包括在允许形成ORC纤维、纤维蛋白原和凝血酶的聚集形式的条件下将OC或ORC纤维与纤维蛋白原粉末和凝血酶粉末组合，并且将聚集物与包含甘油和水性溶液的分散剂组合。

在一些实施方案中，这样的条件允许纤维蛋白原至少部分转化为纤维蛋白。在一些实施方案中，该等条件允许纤维蛋白的至少部分聚合，例如通过在分散剂中添加一定量的水性溶液，如本文所详述。

允许形成粉末/聚集形式的ORC纤维、纤维蛋白原和凝血酶的条件包括但不限于粉末和OC纤维的微粉化(例如，通过高剪切工艺)、分散剂的pH(例如，4至6)和温度范围(诸如但不限于10℃至50℃、45℃至50℃或20℃至30℃)。

在本发明的情形中，术语“密封剂”，也称为“纤维蛋白密封剂”和“生物胶”，应理解为粘合剂、胶或止血剂，例如源自或衍生自所公开组合物，具有在接触或接近组织和/或血液时发生反应以随后形成凝块的成分，可进一步充当组织粘合剂并由此防止、减少或停止出血，接合结构和/或密封生理渗漏，例如脑脊液(CSF)、淋巴、胆汁、胃肠(GI)内容物的渗漏、肺的空气渗漏等。在一些实施方案中，密封剂制剂还包含一种或多种治疗剂，使得在身体中形成的凝块自然降解时，该治疗剂释放。治疗剂可以是(而不限于)药物(诸如抗生素、止痛药、抗炎药、抗癌药等)、细胞(该细胞包括例如任何类型的干细胞，例如来自人或其他来源的胚胎干(ES)细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)等)。

术语“止血”是指例如通过促进血凝块形成来防止、减少或停止血液例如从伤口，诸如手术或创伤的伤口损失的能力。

止血(“Hemostasis”或“haemostasis”)是指伤口愈合的第一阶段。其是使出血停止的过程。所谓“辅助止血”意指帮助减少或停止出血。所谓“施用于出血部位”意指例如在出血部位(例如，在外科部位)处局部施用组合物以控制出血。在包括伤口治疗的多种情况下需要控制出血。

如本文所用，术语“控制”、“防止”或“减少”(它们可在本文中的出血上下文中互换使用，包括其任何语法变化)指示与所公开的组合物没有在出血部位中/上接触的情况相比，血液的渗出率基本上被消除或降低例如初始出血率的10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或甚至100％。用于确定出血出现的水平的方法在本领域中是已知的。

此外，在一些实施方案中，出血上下文中的术语“控制”、“防止”或“减少”还意在涵盖至少部分地封闭出血部位处(例如，软组织中)的血管。

如本文所用，术语“受检者”应意指任何动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、非人灵长类或任何其他哺乳动物。在一些实施方案中，受检者是人，例如人类患者。受检者可为雄性或雌性。

如本文所用，术语“受损组织”(或“损伤组织”)是指由物理(例如，机械)力引起的对结构的正常连续性的破坏，诸如由外科手术、生物(例如，热或光化力)或化学手段引起的切口。术语“受伤组织”还涵盖挫伤组织，以及切伤、刺伤或撕伤的组织，以及例如通过撕裂、挠抓、挤压和啃咬引起的开口、刺伤和损伤。术语“受损组织”还涵盖如本文通篇所述的伤口和出血部位。

术语“组织”可以指选自软组织和骨组织的组织。

如本文所用，术语“软组织”涉及未硬化或钙化的身体组织。该术语尤其涉及血管化的软组织，因此可能是出血的来源。此类组织的示例包括但不限于结缔组织(诸如肌腱、韧带、筋膜、皮肤、纤维组织、脂肪和滑膜)、肌肉和内部器官。一般来讲，软组织意在排除骨组织。

因此，在一些实施方案中，所公开组合物在其任何实施方案中可例如在微创外科(MIS)(诸如例如，内窥镜检查)期间在难以触及的出血部位中施用。内窥镜检查的常见形式中的一种形式是腹腔镜检查，腹腔镜检查是腹腔内部的微创检查和手术。

术语“外科”还涵盖外科手术或诊断过程期间或之后的时间。手术的其他非限制性示例包括神经外科手术、腹部外科手术、心血管外科手术、胸外科手术、头颈外科手术、盆腔外科手术及皮肤和皮下组织手术。对于这些情况中的至少一种情况，本发明的组合物可用作合适的密封剂，其可允许粘连到出血伤口，并且因此实现止血而不依赖于受伤组织的状况，例如出血的严重程度。密封剂的形成在相对短的凝血时间段内发生，随后在其任何方面和/或实施方案中将所公开组合物施用在受损组织上。通常，在使用1分钟至3分钟填塞之后，可形成不完全的凝块，该不完全的凝块能够停止出血，但是可能需要更长的时间来使凝结反应达到糊剂表面，从而形成完全的凝块。

在本发明的另一个方面，提供了一种治疗伤口的方法，该方法包括将其任何方面和/或实施方案中的所公开组合物施用(例如，接触)到对其有需要的受试者的伤口上和/或中的步骤。

所谓“治疗伤口”进一步意在涵盖减少例如接受外科手术的患者中的组织(体内)的出血部位处的失血。参考图12和图13，其显示本文公开的测试样品的高止血成功率(高于60％)。

因此，在一些实施方案中，该方法用于减少例如接受外科手术的患者中的组织的出血部位处的失血和/或在此类组织中/上形成密封剂层，该方法包括在其一个实施方案中使所公开的组合物与出血部位和/或其附近接触。任选地，该方法包括首先在此类组织上施用水性溶液(诸如盐水)，并且然后在水性溶液上施用所公开的组合物，以便促进快速凝结时间。因此，在一些此类实施方案中，组合物在其任何实施方案中用作组织出血部位中的止血剂。

根据本发明的实施方案的另一方面，提供了用于产生本文所述组合物的试剂盒。应当理解，组合物的稠度使得其可例如通过铺展或通过将组合物直接粘附到出血部位上来施用。因此，该组合物不需要进一步铺展到或施用于固体表面、物体或其他固体介质，诸如带或膜上，以便呈施用于出血部位上的适当形式。然而，可使用合适的施用装置诸如注射器，以便将组合物施用、铺展或粘附到出血部位上，从而易于触及和处理。

在另一方面和/或实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包括：a)容纳如上所述的本发明组合物的容器，b)用于将组合物施用于组织的施用装置，以及c)任选地使用说明书。

在另一实施方案中，本发明进一步提供了一种止血试剂盒，该试剂盒包括容纳在其一个实施方案中的本文所公开的组合物的容器。

根据一些实施方案，提供了一种用于制备组合物的试剂盒，该试剂盒包含(i)包含氧化纤维素、纤维蛋白原和凝血酶的粉末，该粉末中的氧化纤维素与纤维蛋白原的重量比分别在1:5至2:1范围内；以及任选地(ii)包含甘油和任选地水性溶液的分散剂，该组合物在室温下呈糊状悬浮液的形式。(i)和(ii)各自可存在于单独的容器中。

全文所公开的组合物的任何方面和实施方案都可以并入试剂盒的方面和实施方案中，包括组合物、分散剂和/或粉末的实施方案。

任选地，纤维蛋白原和凝血酶各自单独包装(例如，以干燥形式或在溶液中)在试剂盒中。因此，除了整个试剂盒的包装材料之外，两种成分中的每一种成分都包装在单独的包装材料中。

另选地，将纤维蛋白原、凝血酶和氧化纤维素一起包装(例如，作为干粉)在同一包装材料中的试剂盒中，并且任选地在另外的容器中提供分散剂。在一些实施方案中，试剂盒还包含关于如何组合试剂盒的成分和/或如何组合试剂盒的成分与另外的成分(例如，分散剂)以产生期望的组合物的说明书。

任选地，试剂盒还包含分散剂。分散剂(诸如甘油)可以是纯的形式或与另一种液体(例如，水、盐水或水性缓冲液)的溶液形式。任选地，分散剂与粉末分开单独包装。另选地，分散剂与粉末组合包装，例如作为本文所述的即用型组合物。在此类实施方案中，试剂盒可以另外含有测量装置，例如量筒，以测量分散剂或其组分的体积。

附加地或另选地，止血试剂盒可包括含有共混物、混合物或粉末的注射器和含有分散剂的另一注射器。例如，双注射器混合装置可通过组合最初分离的液体和粉末，并且然后经由互连的出口在两个连接的注射器之间来回传递共混的内容物，产生基本上均匀的糊剂混合物。因此，用于从注射器分配糊剂的低压出力可能是优选的，以便于混合并且最终用于部署所得糊剂。期望的压出力可以小于1.51lbf。

在一些实施方案中，试剂盒中的至少一个容器是预填充的注射器。在一些实施方案中，除了试剂盒的容器之外还提供了注射器。在一些实施方案中，容器为特定类型，诸如小瓶或施用装置，诸如注射器。

在一些实施方案中，试剂盒中的至少一个容器是预填充的注射器。在一些实施方案中，除了试剂盒的容器之外还提供了注射器。术语“容器”可指可含有糊剂的任何通用结构，诸如器皿或小瓶。

可使用施用装置来施用试剂盒，该施用装置可用于施用组合物的若干和连续注射。在一个实施方案中，施用装置在移动该装置时实现了固定剂量的混合组分在组织的2-D表面上的多次注射。在一个实施方案中，施用装置具有注射器，该注射器配有注射针，在完成注射之后该注射针任选地自动从患者的皮肤回缩而不必施用人员从注射表面向上提起该装置。在一个实施方案中，试剂盒可用于施用密封剂。

本发明的止血试剂盒可为用于减少、防止或停止例如开放性伤口中的血流的试剂盒，并且其可用于在手术期间诸如在外科手术诸如例如腹腔镜外科手术、神经外科手术、腹部外科手术、心血管外科手术、胸外科手术、头颈外科手术、盆腔外科手术及皮肤和皮下组织手术期间、之前或之后减少、防止或停止血流。该试剂盒可用于减少或防止来自皮肤或内部器官中的血流。

在一个实施方案中，这个试剂盒可在室温，诸如在8℃到40℃范围内的温度或在较低温度下储存。

在本文所公开的试剂盒或组合物的任何方面的一些实施方案中，粉末或共混物可以包含添加剂，例如钙盐和/或一种或多种赋形剂，该一种或多种赋形剂例如选自但不限于一种或多种氨基酸、白蛋白、糖和/或糖衍生物。

术语“添加剂”意图被理解为可以添加到组合物中的任何物质，并且还可以包括如下文所描述的活性添加剂，诸如钙盐。

如本文所用，术语“赋形剂”表示被添加到药物组合物中以例如提供所希望的稠度或稳定作用的非活性剂或非治疗剂。

钙是凝血级联反应中的重要元素，并且因子XIII活化为因子XIIIa需要钙，该因子XIIIa交联并稳定纤维蛋白以生成不溶凝块。

因此，在所公开的试剂盒和/或组合物的任何方面的一些实施方案中，共混物、混合物或粉末还包含添加剂，诸如但不限于钙。与本发明一起使用的钙可呈盐(例如，氯化钙盐)的形式。另选地，可使用附加盐，诸如乙酸钙和/或柠檬酸钙。在试剂盒中，可在包含粉末的组合物中提供钙盐。另选地，可在试剂盒中的单独容器中提供赋形剂和/或钙盐，或可在试剂盒中的含有共混物/混合物/粉末组分的相同容器中提供赋形剂和/或钙盐。

在试剂盒或组合物的一些实施方案中，按粉末的重量计，钙盐(例如，CaCl₂)以0.5％至约4％、或2％至4％、或2.5％至3.5％的浓度存在。在一些实施方案中，按共混物的重量计，钙盐(例如，氯化钙)以0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％或4％(包括其间的任何值和范围)的浓度存在。

已知OC是酸性的，并且这种酸性导致血浆蛋白(诸如凝血酶和纤维蛋白原)立即变性；因此，氧化纤维素和凝血酶和/或纤维蛋白原的共同施用可能导致血浆蛋白无效。

在一些实施方案中，将缓冲剂添加到组合物中以用于pH调节。

在一些这样的实施方案中，将缓冲剂，例如Tris或三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液或溶素以粉末形式添加到纤维蛋白原、凝血酶和ORC共混物/混合物/粉末中以用于pH调节(例如，至约7的pH)。在一些实施方案中，按共混物/混合物/粉末的重量计，缓冲剂，例如Tris或赖氨酸以0％至25％、4％至8％或5％至7％的浓度存在。在一些实施方案中，缓冲剂，例如Tris或赖氨酸以1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％或约25重量％的浓度存在，包括它们之间的任何值和范围。

在试剂盒和/或组合物的任何方面的一些实施方案中，粉末还包含选自氨基酸(例如，赖氨酸)的赋形剂。在试剂盒和/或组合物的任何方面的一些实施方案中，共混物或粉末包含OC和赖氨酸。

在一些实施方案中，按粉末的重量计，纤维蛋白原以20％至80％、60％至95％或70％至90％的浓度存在。在一些实施方案中，按粉末的重量计，纤维蛋白原以20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(包括它们之间的任何值和范围)的浓度存在。

在示例性实施方案中，按粉末的总重量计，共混物或粉末包含20重量％至80重量％的纤维蛋白原粉末；2000IU至4000IU凝血酶/剂量粉末；按粉末的总重量计，10％至50％ ORC粉末；按粉末的总重量计，2％至4％CaCl₂粉末；按粉末的总重量计，0％至25％赖氨酸粉末。本文中“剂量”是指约1.2g。

在试剂盒和/或组合物的任何方面的一些实施方案中，所公开组合物可与背衬、垫、绷带、纱布、海绵、支架或基质结合使用以提供机械强度以覆盖伤口表面。在这种情况下，该实例基质被支撑在衬垫上，以便于施用或填塞。

在试剂盒和/或组合物的任何方面的一些实施方案中，组合物是无菌的。尤其是在处理血液制品时，无菌问题至关重要，特别是病毒灭活的问题。一般来讲，病毒灭活可通过任意种方法来执行，包括溶剂洗涤剂、热灭活、辐照和纳米过滤。通常，病毒灭活标准要求使用两种不同方法。另外，FDA的无菌性标准要求过滤。

如本文所用，术语“无菌的”意指具有低生物负荷，是有效无菌的，例如基本上或甚至绝对不含微生物(例如，细菌和病毒)。灭菌是将生物负荷降低到有效无菌水平的过程。无菌液体或糊剂通常被定义为已经历无菌过滤的液体或糊剂。

术语“包含”、“含”、“包括”、“含有”、“具有”及其变化形式是指“包括但不限于”。术语“由……组成”是指“包括并且限于”。术语“基本上由……组成”是指组合物、方法或结构可包含附加成分、步骤和/或部件，但前提条件是该附加成分、步骤和/或部件不在本质上改变受权利要求书保护的组合物、方法或结构的基本特征和新颖特征。

词语“示例性”在本文中用于指“用作示例、实例或例证”。被描述为“示例性”的任何实施方案不一定被理解为比其他实施方案优选或有利并且/或者不包括其他实施方案的特征。

词语“任选地”在本文中用于指“在一些实施方案中提供而在其他实施方案中不提供”。本发明的任何具体实施方案可包括多个“任选的”特征，除非此类特征有冲突。

如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物(包括它们的混合物)。

在整个本申请中，本发明的各种实施方案可以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被理解为是对本发明范围的固定限制。因此，范围的描述应被视为具有明确公开的所有可能子范围以及该范围内的各个数值。例如，范围诸如1至6的描述应被视为具有明确公开的子范围诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这均适用。

每当本文指示数值范围时，其是指包括位于所指示范围内的任何列举的数字(分数或整数)。短语“范围是在”第一指示数字和第二指示数字之间以及“范围是从”第一指示数字“到”第二指示数字在本文中可互换使用，并且是指包括第一指示数字和第二指示数字以及其间的所有分数和整数。

如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或易于从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。

如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展、基本上改善病症的临床或美学症状、或基本上阻止病症的临床或美学症状的出现。

在其中使用类似于“A、B和C中的至少一者等”的惯例的那些情况下，一般而言，此类结构意在具有本领域的技术人员将理解所述惯例的意义(例如，“具有A、B和C中的至少一者的组合物”将包括但不限于具有仅A、仅B、仅C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、和/或A、B和C一起等的组合物)。本领域的技术人员还应当理解，实际上，无论在具体实施方式、权利要求还是附图中，呈现两个或更多个替代术语的转折性词语和/或短语应被理解为涵盖包括所述术语中的一者、所述术语中的任一个或这两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或者“A和B”的可能性。

应理解，为清晰起见，在独立实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征，也可在单个实施方案中组合提供。相反地，为简明起见，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种结构也可单独地或以任何合适的子组合形式提供，或如其所适当地提供于本发明的任何其他所述实施方案中。在各种实施方案的上下文中所述的某些特征不应视为那些实施方案的基本特征，除非实施方案在没有那些要素的情况下不起作用。

如本文所用，术语“约”意指也旨在包括高于或低于所指示值的10％的值。除非另外指明，否则所有数字诸如表示例如比率、重量、摩尔/摩尔、量、粘度、温度等的那些在所有情况下均应理解为被术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则在本说明书和所附权利要求中列出的数值参数均为近似值，这些近似值可根据本发明寻求获得的期望特性而变化多达±10％。

如上文所述以及如下文的权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中得到实验支持。

实施例

现在参考以下实施例，这些实施例连同以上描述以非限制性方式示出了本发明的一些实施方案。

实施例1：ORC、凝血酶和纤维蛋白原粉末的制备工艺

材料和方法：

纤维蛋白原和凝血酶的来源是猪血浆，其被分馏以获得纤维蛋白原和凝血酶，并由位于中国广州的倍绣生物技术有限公司(Bioseal Biotech CO.LTD)提供；

牛血清白蛋白(BSA)-SIGMA VETEC，V900933；

L-赖氨酸-ALADDIN，L103479-500g；

氧化再生纤维素(ORC)：ORC特征：粒度<70μm，纤维形式。ORC粉末可通过处理原始织物而获得。简言之，在以下步骤中通过处理/>原始织物获得ORC粉末：1)将织物分裂并切割成约2"×8"的片；2)使用已知的研磨方法将织物研磨成粉末粒度(通常但非排他性的，D50小于94微米)；将约100克织物放入500ml氧化锆广口瓶中，然后将12个至13个20mm氧化锆球(玛瑙)放入同一广口瓶中，盖上并将该广口瓶固定在Retsch行星式球磨机(型号PM100)上，以450rpm的转速研磨织物20分钟，将研磨后的粉末转移到具有8"直径和300微米开孔的筛上，通过轻微摇动分离出玛瑙和粉末，并且最终收集粉末。

在示例性程序中，通过使用尤其是喷雾干燥方法如下制备本发明的止血组合物。按纤维蛋白原的重量计，将一份ORC纤维与1份或2份或5份或0.5份纤维蛋白原或纤维蛋白密封剂(纤维蛋白原和凝血酶的共混物)粉末组合。因此，作为一个示例，将10g ORC粉末与5g纤维蛋白原在纤维蛋白密封剂混合粉末中组合。

喷雾干燥是用于由溶液、悬浮液或乳液形成粉末的干燥方法，该溶液、悬浮液或乳液在热气流中通过喷雾嘴雾化并且立即干燥。喷雾干燥工艺通过若干工艺参数来控制，其中一些参数是：柱空气流量和温度、喷嘴尺寸和雾化空气流速、材料流速等。

在示例性程序中，使用(每一种单独)喷雾干燥方法(喷雾干燥器：使用4M8-TriX喷雾干燥器(ProCepT NV,Zelzate,Belgium))如下产生凝血酶和纤维蛋白原粉末。

将所制备的凝血酶和纤维蛋白原猪纤维蛋白原溶液以不同量抽取到注射器中并放置在喷雾干燥器的注射器泵内。将注射器泵设置为期望的流速并且关闭进料阀。在关闭注射器泵进料阀的同时，启动喷雾干燥器并且设置期望的雾化气体流速、干燥气体流速、干燥气体温度、冷却气体流速和旋流气体流速。

选择冷却气体流速和温度，诸如不破坏干燥塔中的层流，但是将气体流温度降低到组合物的玻璃化转变温度以下，以便防止粉末粘着到玻璃部件。

允许喷雾干燥器运行直到达到稳定状态，其中参数的实际测量值达到设定水平并保持稳定。然后打开进料阀，从而允许凝血酶/纤维蛋白原溶液流动穿过进料口，进入喷雾嘴以被雾化气体流雾化为小液滴，这些小液滴然后在干燥塔中被干燥。形成喷雾干燥的粉末，并且随后将这些粉末收集在喷雾干燥器的旋流器的粉末出口中。

将从旋流器回收的喷雾干燥的粉末在相对湿度低于30％的脱湿器中称重，并且分成介于100mg至200mg之间的样品。将每个样品单独密封在具有塞子的试管中，并用密封(Bemis,Oshkosh,Wisconsin,USA)直至进行评估。

喷雾参数：风扇压力0.3巴；雾化压力：3巴；流速：130ml/min；液体压力：16kpa；喷嘴直径：0.7mm；搅拌速度：90rpm/min。

在示例性程序中，使用高剪切工艺将粉末进一步制粒。

设备细节：天平：SS1000；高剪切混合器：Mini-CG 1L；注射器泵：LSP01-1C；真空干燥：Vacucell 111；振动筛：Fritsch analysette 3。

环境：22℃-26℃；相对湿度：50％-70％。

在示例性程序中，在具有150rpm至500rpm高速混合叶片和150rpm至1000rpm切割刀片的高剪切混合/剪切反应器中形成粒状粉末。具体地，在预混合步骤中，称取总重量为100g的材料。将材料放入高剪切混合器的1L碗中。将切碎机速度设置为100rpm，叶轮速度设置为200rpm，混合5分钟。接下来，在制粒步骤中，将切碎机速度设置为300rpm，将叶轮速度设置为1000rpm，并且将密封压力设置为0.05MPa。使用注射器泵，以4mL/min的流速和0.4mm的喷嘴尺寸将8ml至16mL甘油溶液喷射到碗中以结合粒子。雾化压力为0.05MPa。制粒时间：2分钟至4分钟。

接下来，在后制粒步骤中，将切碎机速度调节至300rpm，并且将叶轮速度调节至1000rpm。然后继续制粒40秒至120秒。要注意的是，由于在该过程中使用甘油-水作为粘合剂，因此看不到液体。

接下来，施用第一真空干燥：将所获得的组合物转移到托盘并放入真空干燥箱中。将真空压力设置为大约0Pa，保持0.5小时至1小时。接下来，筛分粉末：将粉末转移到振荡筛网托盘中，筛网尺寸依次为500微米/355微米。将振幅设置为1.5mm，筛分时间：10分钟。接下来，施用第二真空干燥：将粉末转移到真空干燥箱中，保持干燥达3小时，其中真空压力为约0Pa。最后，收集产物。

制剂中的材料：20％至80％纤维蛋白原粉末；2000IU/剂量至4000IU/剂量凝血酶粉末；10％至50％ ORC粉末；2％至4％ CaCl₂粉末；0重量％至25重量％的赖氨酸粉末。

在示例性的预备程序中，将1.2g至1.5g的测试粉末样品与4ml至5ml的分散剂组合，该分散剂包括一定比率(v/v)的盐水和甘油：15％甘油、30％甘油、40％甘油、50％甘油以及70％甘油。作为对比样品，进一步测试以下样品：1:1ORC与纤维蛋白原，不具有凝血酶；2:1ORC与BSA，不具有凝血酶(比率按重量计)。测试样品的详细信息提供于以下实施例2中。

实施例2：所选样品的流动性特性的表征-初步测试

在示例性程序中，进行实验以测试各种样品的糊状稠度。

初步试验：在示例性程序中，将1.2g量的测试粉末样品分散在4ml包含盐水和50％甘油(v/v)的分散剂中。测试样品是：(i)ORC与纤维蛋白原重量比为2:1的上述粉末(凝血酶为3300IU/1.2g)；(ii)ORC与纤维蛋白原的重量比为2:1但不具有凝血酶的上述粉末；(iii)包含ORC和BSA以及凝血酶的粉末，其中ORC与BSA的重量比为2:1；(iv)ORC；以及(v)包含ORC和凝血酶的粉末(不具有纤维蛋白原)。

结果在图1A中示出(图片是在将共混物掺入分散剂后不久拍摄的)。结果显示，只有样品(i)在分散于上述分散剂中时提供糊状组合物。其他样品表现出更高的流动性，导致组合物不能停留在伤口部位，并且胶凝速率更慢。

测定分散剂的量：在示例性程序中，选择包含盐水和50％甘油(v/v)的分散剂，并且粉末具有1:1和2:1的ORC与纤维蛋白原重量比(具有或不具有凝血酶；每剂量3300IU，即每1.2g)。样品还包含钙和赖氨酸，如上文实施例1中详述。评价样品的流动性，目的是提供一方面不太稠(难以推出)，另一方面不太稀的可流动的组合物。测试样品汇总于下表1中。

表1用于测定粉末与分散剂比率(w/v)的测试样品

可以看出，3ml分散剂提供了太稠的组合物，而对于5ml，组合物变得非常稀。结果见于图2中。鉴于这些结果，以下实施例的测试样品包含分散在4ml分散剂中的1.2g粉末。

具有1:2至1:5比率和70％至80％甘油的测试样品的流动性和凝结时间：对于2:1、1:1、1:2和1:5的ORC与纤维蛋白原重量比，进行另外的示例性测试。在示例性程序中，将1.2g测试样品分散在4ml包含盐水和70％或80％甘油(v/v)的分散剂中。样品还包含凝血酶、钙和赖氨酸，如上文实施例1中详述。

体外猪血凝结时间的结果显示在图3中(照片是在将共混物掺入分散剂后不久拍摄的)。结果表明，含70％甘油的分散剂样品在分散于上述分散剂中时提供了糊状组合物，而80％甘油样品表现出更高的流动性(主要对于2:1至1:2样品)，导致组合物不太能够停留在伤口部位，并且还导致更慢的凝结速率(对于1:5样品高于180秒)；对于70％甘油样品(1:2和1:5比率)，凝血时间为70秒)。可以得出结论，约70％甘油是本文公开的组合物的浓度上限。

实施例3：流变特性

在示例性程序中，测试样品的粘度。

将1.2g量的测试粉末样品分散在4ml分散剂中，该分散剂包含盐水和50％甘油(v/v)，ORC与纤维蛋白原重量比为1:5至2:1。样品还包含凝血酶(3300IU/1.2g钙和赖氨酸，如上文实施例1中详述)。

粘度：将混合的样品夹在25mm平行板与Peltier板表面之间。对于所有测量，将两个板之间的间隙设定为1.00mm。将剪切速率设定为0.5 1/s且温度为25℃的旋转模式测试用于所有测量。

通过剪切应力与剪切速率的比率测定粘度。结果呈现于图4中，显示在ORC与纤维蛋白原重量比在1:5至2:1范围内的情况下，粘度大于约400Pa·s且小于约3000Pa·s。

振幅扫描测试：在一组示例性实验中，经由剪切流变仪评估样品的剪切损耗模量(G')和剪切储能模量(G”)。使用Anton Paar模块化紧凑型流变仪MCR102进行测量。所有测试均在25℃的温度下进行。在应变扫描测试中，固定测试的频率并且递增地增加振幅。进行应变扫描测试以确定样品的线性粘弹性方案。然后在0.01％至100％的剪切应变(振荡)范围和最高10rad/sec范围内的角频率下进行扫描测试。振幅是振荡运动的最大值。为了进行分析，绘制储能模量G'和损耗模量G”相对于变形的曲线图。如果G'>G”，则样品显示出凝胶状或固体结构并且可以被称为粘弹性材料。也首先确定线性粘弹性区域的界限。在线性粘弹性区域中，G'和G”的函数显示出恒定的平稳值，表明其中可以进行测试而不破坏样品结构的范围。G'和G"的相交点是屈服点(τ)。τ＝F/A，其中剪切应力为τ(tau)，剪切力为F(以N为单位)并且剪切面积为A(以m²为单位)。

图5中呈现的结果显示线性粘弹性区域，其中储能模量(G')和损耗模量(G”)保持不变，这意味着ORC与纤维蛋白原重量比为1:5至2:1的样品具有强稳定性。结果还显示2:1样品的τ值具有最高的屈服点，具有较长的线性粘弹区域，并且1:5样品具有最短的线性粘弹区域，这意味着1:5的ORC与纤维蛋白原比率可能是较不优选的。

实施例4：凝结和稳定性测试

猪血的离体凝血：如下测试几种本发明组合物和比较组合物的离体血液凝结。将1.2g量的每种样品溶解在4ml盐水+甘油(v/v)持续中20分钟至40分钟，形成糊状物。将2ml量的血液放入青霉素瓶中，添加1ml(约0.24g粉末或0.5g 明胶基质)样品，然后用涡旋计(IKA VORTEX 3)温和振荡三次。观察并记录凝结时间以及各样品在不同时间点的状态。通过随时间倾斜小瓶来评估凝结形成的时间。在样品制备(复原，然后将粉末与分散剂来回混合几次以形成糊状物)后，在0.5h、2h和20h时测试样品。通过目视观察血液流过倒置样品瓶来确定凝结时间。在凝结时间的终点，血液凝块不会从小瓶中脱落。结果汇总于下表2中。

表2各种样品的凝血时间

结果显示，对于2:1至1:1的ORC与纤维蛋白原重量比，分散剂中甘油的优选浓度(不损害酶活性，如下文所述)为大于15体积％至小于50体积％，从而为每个时间点提供小于60秒的凝结时间。

pH和甘油浓度对稳定性的影响：进行另外的实验以测试在各种pH值下重构后的各种样品的稳定性，使用L-赖氨酸调节pH。所测试的样品：(1)ORC:纤维蛋白原2:1，盐水+50％甘油，pH 4.48(“2:1，50％，4.48”)；并且因此：(2)2:1，50％，5.38；(3)2:1，50％，6.53；(4)2:1，40％，4.44；(5)2:1，30％，4.44；(6)2:1，15％，4.33；(7)1:1，50％，5.03；(8)1:1，50％，5.46；(9)1:1，40％，5.05；(10)1:1，30％，4.81；(11)1:1，15％，4.82；(12)+凝血酶。样品还包含凝血酶、钙和赖氨酸，如上文实施例1中所详述。图6中呈现的结果显示了20小时后15％甘油样品的液相分离。

pH对凝结时间的影响：在示例性程序中，用2:1和1:1制剂(50％甘油(v/v)，盐水溶液)进一步测试pH对凝结时间的影响。上文详述测试凝血酶活性的方案，并且在室温下进行。结果呈现于下表3和图7中。

表3在各种pH值下的凝血时间

结果进一步证实，优选的pH范围为约4.5至6.5，因为在该范围内，在至少两个测试时间下，凝血时间不高于50秒。

实施例5：随时间变化的活性测试

2:1至1:1比率的测试样品：测试样品中的凝血酶活性由以IU/mg报告的比活性表示。将测试样品在碱性碳酸盐中水合以限制凝血酶活性并使纤维蛋白形成最小化。溶解在碳酸盐溶液中的少量样品用大量缓冲的纤维蛋白原溶液中和，以允许凝结反应。在示例性程序中，将1.2g测试样品分散在4ml分散剂中，该分散剂在盐溶液中含有不同浓度的甘油(％v/v)和pH值。表4呈现了根据以下方案在0.5h、1.5h、2.5h、4.5h、20h后具有某些ORC与纤维蛋白原重量比(2:1或1:1)和关于凝血酶(酶)活性(IU/1.2g)的甘油浓度(％v/v)的每个测试样品的结果。

结果进一步示于图8中。

表4在不同甘油浓度下的凝血酶活性(样品还包含凝血酶、钙和赖氨酸，如上文实 施例1中详述)

pH随时间对凝血酶稳定性的影响：在示例性程序中，用2:1和1:1制剂(50％甘油(v/v)，盐水溶液)测试pH随时间对凝血酶稳定性的影响。使用L-赖氨酸粉末调节pH，并且使用具有表面电极的pH计(METTLER TOLEDO)测量pH。用于测试凝血酶活性的方案在上文详述并且在室温下进行。结果呈现于下表5和图9中。

表5 pH对凝血酶稳定性的影响(样品还包含凝血酶、钙和赖氨酸，如上文实施例1 中详述)

总之，结果显示在不同制剂和pH条件下，凝血酶的活性在20小时内没有显著降低，因此制剂在20小时内显示良好的稳定性。然而，优选的pH范围为约4.5至6.5，因为在该范围内，凝血酶活性在20小时内没有明显降低并且保持稳定。

实施例6：对厚度的影响

在示例性程序中，取一定量的各种样品并堆叠在厚度测试仪(CDK)的测试平台上。使样品的厚度自然下降，同时压缩样品。然后记录样品的厚度，观察样品的厚度随时间的变化。测试具有某些ORC与纤维蛋白原重量比(2:1或1:1)和甘油浓度(％v/v；4ml/1.2g)的各种样品，并且结果呈现于表6中。样品还包含凝血酶、钙和赖氨酸，如上文实施例1中详述。

表6不同制剂随时间对厚度的影响

可以得出结论，当ORC与纤维蛋白原比率低于2:1(1:1、1:2和1:5)时，重构的糊剂变得更硬，具有更高的厚度，其中1:5比率变得太硬。图10呈现代表性测试样品的结果进一步说明此特征。

实施例7：在猪肝和脾模型中的体内评价

在示例性程序中，在肝素化条件下使用猪穿孔出血模型(在脾和肝切片检查穿孔出血模型上)测试所选样品以评价可流动的止血组合物的止血功效。

在示例性程序中，测试表8中呈现的样品(在50％v/v甘油/盐水中)。

在示例性程序中，使用6mm穿孔器在脾或肝的表面上打一个5mm的孔。在测试制品施用之前，用纱布或通过使用抽吸将过量的血液从目标出血部位吸干/去除，使得止血糊剂可以直接施用于具有出血表面的出血部位。将足够量的糊剂施用于部位以用多层覆盖整个出血区域。

最初保持填塞3分钟，然后将纱布从该部位提起并观察该部位长达60秒。当在观察期间的任何时间观察到自由流动的血液时，再次将填塞物施加在纱布上并再保持1分钟。止血成功或失败是在施用后3分钟、5分钟和10分钟按压样品时确定的。中止试验并将结果记录在原始数据中超过10分钟。一旦停止出血，用10mL盐水冲洗掉过量的样品。

验收标准：使用0-5等级量表(表7和图11)测量出血，通过在施用后1分钟、2分钟、3分钟和4分钟停止自由流动出血来测定止血功效。

如果在制品施用后实现“无出血0”或“渗出1”，则认为止血成功。

表7出血分数-标准

结果汇总于表8中。

表8所选样品的止血效力。样品还包含凝血酶、钙和赖氨酸，如上文实施例1中所详 述。

附加的结果呈现在图12中。

在另一组体内实验中，用不同制剂(n＝5)以与在肝中类似的方案进行犬穿孔模型测试。犬接受100IU/kg至300IU/kg肝素钠的初始负荷静脉推注。在注射后约十分钟测量活化凝血时间(ACT)。当ACT>x3基线读数时，认为该动物是肝素化的。结果汇总于图13中。

总之，上述结果说明了所测试样品的高止血成功率(高于60％)，其中1:1比率在某种程度上是优异的。

尽管本发明已结合其具体实施方案进行了描述，但显然许多替代、修改和变型对于本领域中那些技术人员而言是显而易见的。因此，本文旨在涵盖落入所附权利要求书的实质和广义范围内的所有此类另选形式、修改和变型。

Claims (30)

1.一种双组分可流动的组合物，所述双组分可流动的组合物包含：(i)包含氧化纤维素、纤维蛋白原和凝血酶的粉末，所述粉末中的氧化纤维素与纤维蛋白原的重量比分别在约1:5至约2:1范围内；以及(ii)包含甘油和水性溶液的分散剂，所述组合物在室温下呈糊状悬浮液的形式。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中OC与纤维蛋白原的所述重量比在1:2至2:1范围内。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述OC包含氧化再生纤维素(ORC)。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述粉末的至少一部分呈聚集形式。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述甘油按所述分散剂的体积计以高于约15％的浓度存在。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述甘油按所述分散剂的体积计以高于约40％的浓度存在。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述甘油按所述分散剂的体积计以最高约70％的浓度存在。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述分散剂以分别在3:1至4:1(v/w；ml/g)范围内的分散剂与粉末比率存在。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述OC呈研磨形式。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，所述组合物还包含纤维蛋白。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述纤维蛋白是至少部分交联的。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述凝血酶以每1克粉末约2000IU至约4000IU的量存在。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，所述组合物还包含钙盐。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，所述组合物还包含缓冲剂。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述缓冲剂呈粉末的形式。

16.根据权利要求14或15所述的组合物，其中所述缓冲剂选自Tris、赖氨酸或它们的组合。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中至少90％的所述粉末的粒度在10μm至2,000μm范围内。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述粒度在约200μm至约900μm范围内。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的组合物，所述组合物在室温下在4至6.5的pH下稳定至少约20小时。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述水性溶液包含盐水。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的组合物，其中所述粉末是喷雾干燥的和/或高剪切混合的。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中按所述粉末的重量计，所述纤维蛋白原以60％至95％或70％至90％的浓度范围存在。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的组合物，所述组合物用作组织的出血部位的止血剂。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的组合物在用于治疗出血组织的方法中的用途，所述方法包括将所述组合物施用到所述出血组织。

25.根据权利要求24所述的用途，其中所述方法包括微创手术，例如腹腔镜手术。

26.一种制备根据权利要求1至23中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括将OC纤维与纤维蛋白原粉末和凝血酶粉末在允许形成所述OC纤维、纤维蛋白原和凝血酶的聚集形式的条件下组合，并且将所述聚集物与包含甘油和水性溶液的分散剂组合。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述条件允许纤维蛋白原至少部分转化为纤维蛋白。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述条件允许所述纤维蛋白的至少部分交联。

29.根据权利要求26至权利要求28中任一项所述的方法，其中所述条件选自(i)至(iii)中的一种或多种条件：(i)温度在0℃至30℃范围内，(ii)所述分散剂的pH在4.5至6.5范围内，以及(iii)分散剂的分散剂与粉末的比率分别在3:1至4:1(v/w；ml/g)范围内。

30.一种试剂盒，包括：

(a)容纳包含氧化纤维素、纤维蛋白原和凝血酶的粉末的容器，所述粉末中的氧化纤维素与纤维蛋白原的重量比分别在约1:5至约2:1范围内；以及

(b)容纳包含甘油和任选的水性溶液的分散剂的容器，以及任选地

(c)使用说明书。