CN109661234A - 包含交联的透明质酸衍生物基质的止血组合物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种止血组合物及其制备方法，更具体地涉及一种包含适用于止血的交联的透明质酸衍生物基质的止血组合物，以及一种制备这种组合物的方法。

Description

包含交联的透明质酸衍生物基质的止血组合物
技术领域
本发明涉及一种止血组合物及其制备方法，具体地涉及一种包含适用于止血的交联的透明质酸衍生物基质的止血组合物，以及这种组合物的制备方法。
背景技术
在外科手术的许多区域中，可以诱导通过结扎或一般程序不能有效控制或不可控制的出血。为了阻止这种严重出血，可以将止血组合物应用于伤口，并且作为这样的止血组合物，当应用于诸如伤口的人体组织时，需要提供具有强粘附力和足够溶胀的材料。
作为包含生物相容且可生物降解的干燥稳定颗粒材料的止血组合物的实例，存在并且这是一种由粒状明胶基质组成的多用途止血剂，其在含凝血酶的溶液中溶胀以形成可流动的糊剂。
然而，即使上述产品具有与止血效果相关的良好粘附力和溶胀，它也是由源自牛源的交联的干燥明胶组成，因此在应用人体手术时可能存在安全性问题。
透明质酸是人体成分之一，并且用于诸如饮料、美容、药品等各种用途。特别是，已知它有促进组织再生的可能性，并且它对人体无害，因此，它已被开发并用作抗粘附剂的成分。根据最近的文献，已经提出了透明质酸通过与其他止血剂组合可能作为止血基质的成分。然而，根据发明人的测试结果显示，透明质酸由于在水合过程中局部凝胶化而难以与止血成分混合，并且水合后的粘度和吸湿性低；并且当将混合的组合物施用到伤口区域上时，它由于其过高的粘附力而伤害伤口区域，因此，难以使用天然透明质酸作为止血剂的组合物。
在这些情况下，作为发明人的深入研究以克服现有技术的上述问题的结果，他们通过使透明质酸交联来制备具有适当组织粘附力和抗粘附能力的透明质酸衍生物基质，并且已将其均质化至适当尺寸，并且它们已经开发出透明质酸衍生物，其可以容易地与其他止血成分混合并且具有适当的用于治疗伤口的粘附力，因此他们通过证实包含这种衍生物的止血组合物表现出优异的止血效果来完成本发明。
发明内容
技术问题
为了解决上述问题，本发明的主要目的是提供一种包含交联的透明质酸衍生物基质的止血组合物。
此外，本发明的另一个目的是提供一种用于包含交联的透明质酸衍生物基质的止血组合物的制备方法。
有益效果
根据本发明的包含交联的透明质酸衍生物基质的止血组合物具有高吸水能力和适当的用于止血目的的粘附力。此外，当施用于身体时，它形成有效的屏障，该屏障可以阻止血管的泄漏。具体而言，止血组合物中包含的交联的透明质酸衍生物的溶胀性质可以增加对出血区域的粘附力并且形成有效的防止间质粘附的机械防护罩。
本发明的止血组合物具有与常规凝血酶溶液相比对组织更好的粘附力，并且可以在一段时间后在体内完全降解和吸收。此外，如上所述，通过使用具有与天然透明质酸钠溶液相比适当的粘附力的无害透明质酸衍生物，这种新的止血组合物排除了由使用由外源材料制成的止血组合物引起的副作用的风险。
附图说明
图1示出了含有根据本发明的制备方法制备的透明质酸衍生物的止血组合物的外观。
图2示出了在0.1Hz～1Hz的频率范围内测量复数粘度和tanδ结果值的结果，以研究如实施例1a至3a和比较例1a、2a和比较例3a制备的透明质酸衍生物的流变学特征。
图3示出了如实施例1a至3a制备的透明质酸衍生物的吸收能力的结果。
图4示出了证实如实施例1b至3b制备的含有透明质酸衍生物的止血组合物和如比较例4b制备的含有非交联的透明质酸的止血组合物的液体吸收性的结果。
图5a示出了分析如实施例2b制得的含有透明质酸衍生物的止血组合物的粒径的结果。
图5b示出了分析如比较例5制得的含有透明质酸衍生物的止血组合物的粒径的结果。
图6a和图6b是示出了如实施例1a至3a和比较例1a、2a和4a制得的透明质酸衍生物的粘附力的图。
图7a是示出了在平的玻璃板上如止血实施例2b和比较例2b和4b制得的止血组合物的外观的照片。
图7b是示出了在止血实施例2b和比较例2b和4b中制得的止血组合物的粘附力关于样品移动的距离的对比试验的结果的图。
图8示出了比较在止血组合物的制备中使用的含凝血酶的稀释剂和如实施例1b至3b制备的止血组合物的凝血酶活性的结果。
图9示出了透明质酸含量和凝血酶滴度根据混合时间的变化。
图10示出了证实实施例3b在SD大鼠肝脏损伤中的止血能力的结果。
图11a是证实如实施例3b制得的止血组合物在兔脾损伤中的止血作用的测试结果的照片。
图11b是示出了实施例1～3中制得的止血组合物在兔脾损伤中关于出血程度的止血作用的照片。
图12示出了比较本发明的止血组合物的止血作用与非交联的透明质酸钠的止血作用的示意图。下部图示出了根据本发明的止血组合物的实际照片。
具体实施方式
作为实现上述目的的一个方面，本发明涉及一种包含交联的透明质酸衍生物基质的止血组合物。
本发明的止血组合物是止血用成分，并且包含具有适当的吸湿性和粘度的交联的透明质酸衍生物基质。作为具体的一个方面，交联的透明质酸衍生物可以通过使用具有两个或更多个环氧基团的环氧化物交联剂来以交联的透明质酸(HA)或其盐形式进行获得。交联的透明质酸可以保持透明质酸的天然吸湿性，并且通过透明质酸之间的交联来形成基质，并且附加溶液的吸湿性和粘度增加，同时粘附力降低，因此这些特征能够用包含止血成分的溶液使混合顺利。
透明质酸是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡糖胺的交替残基组成的天然杂多糖，并且透明质酸衍生物基质可以通过与环氧化物试剂交联进行制备。在本发明中，除了透明质酸之外，还可以使用其盐形式。
环氧化物交联剂，具体而言可以是：1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDGE)、1,6-己二醇二缩水甘油醚、丙二醇二缩水甘油醚、聚(丙二醇)二缩水甘油醚、聚(四亚甲撑二醇)二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、聚甘油聚缩水甘油醚、二甘油聚缩水甘油醚、甘油聚缩水甘油醚、三羟甲基丙烷聚缩水甘油醚、1,2-(双(2,3-环氧丙氧基)乙烯、季戊四醇聚缩水甘油醚或山梨糖醇聚缩水甘油醚，并且更具体而言可以是1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。
本发明的交联的透明质酸衍生物基质的复数粘度在1Hz(25℃)下为10～500,000Pa·s(旋转流变仪(TA instrument Ltd.,DHR-1)，温度：25℃)。
此外，交联的透明质酸衍生物基质具有与天然透明质酸相比更高的吸水能力(图3)和更大的溶胀度的优点。具体而言，凝胶状态的交联的透明质酸衍生物基质的溶胀度为300％～1,500％，并且，在干燥粉末(105℃，6小时)的情况下，溶胀度为300％～75,000％。
此外，交联的透明质酸衍生物基质根据本发明的独特合成条件进行交联，因此透明质酸之间的分子结合增加并且粘弹性增加(图2)并且它对活组织具有适当的粘附力。此外，由于交联部分不会被内部透明质酸酶降解，因此它具有增强体内稳定性并同时几乎没有毒性风险的性质。另外，在完成止血作用后的一定时间，它可以在其应用区域上形成物理屏障。
由于上述特征，根据本发明的组合物特别适用于为包括手术出血区域、外伤损伤出血区域等的出血区域提供止血效果，因此可以容易且方便地用于医疗应用，具体而言，在发生各种出血时(如外科手术等)的止血。
作为另一方面，本发明涉及一种包含交联的透明质酸衍生物基质的止血组合物的制备方法。具体地，该制备方法可以包括：i)使透明质酸和环氧化物交联剂反应的步骤，其中将透明质酸和环氧化物交联剂溶解在碱性水溶液中以制备交联的透明质酸衍生物；和ii)使交联的透明质酸衍生物均质化的步骤，以将它制备成适当的尺寸。
优选地，在根据本发明的透明质酸衍生物的制备方法中，通过使由包含两个或更多个环氧基团的环氧化物交联剂与透明质酸(HA)反应所获得的产物均质化所制得的透明质酸衍生物。
在本发明的制备方法中，可以使用透明质酸(HA)或其盐形式，并且盐形式至少包括选自由透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌、透明质酸钴和透明质酸四丁基铵所组成的组中的一种或多种。
在该制备方法中，在步骤i)中，可以使用NaOH、KOH、氨水溶液等作为用于透明质酸的交联反应的电离的碱性水溶液。此外，溶解在碱性水溶液中的透明质酸的浓度优选为50～200mg/mL，并且环氧化物交联剂(例如BDDE)的交联比根据碱性水溶液中溶解的透明质酸的浓度而变化。作为一个实例，当碱性水溶液中溶解的透明质酸的浓度为20mg/mL时，BDDE作为环氧化物交联剂的加入量为2％～50％(环氧化物交联剂的体积与溶解透明质酸的碱性水溶液的重量之比(v/w))；并且，当碱性水溶液中溶解的透明质酸的浓度为200mg/mL时，BDDE的加入量为0.01％～5％(环氧化物交联剂的体积与溶解透明质酸的碱性水溶液的重量之比(v/w))。另外，在步骤i)中，反应温度为4～80摄氏度，反应时间为12小时～48小时，并且反应压力为0.5atm～2atm，优选为大气压。
步骤i)的环氧化物交联剂可以选自：1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(EGDGE)、1,6-己二醇二缩水甘油醚、丙二醇二缩水甘油醚、聚(丙二醇)二缩水甘油醚、聚(四亚甲基二醇)二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、聚甘油聚缩水甘油醚、二甘油聚缩水甘油醚、甘油聚缩水甘油醚、三羟甲基丙烷聚缩水甘油醚、1,2-(双(2,3-环氧丙氧基)乙烯、季戊四醇聚缩水甘油醚或山梨糖醇聚缩水甘油醚，并且更具体而言可以使用1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)。
作为另外的一个方面，在步骤i)中制得的透明质酸衍生物可以在步骤ii)中加工之前用生理盐水溶液等进行洗涤。除了洗涤步骤之外，步骤i)中制得的透明质酸衍生物可以通过本领域已知的方法进行分离和/或纯化，例如，蒸馏(在大气压或减压下)、重结晶、柱色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱、薄层色谱、相分离、溶剂萃取或透析。
此外，步骤ii)是使步骤i)中制得的交联的透明质酸衍生物均质化的步骤，以将它制备成凝胶形式。均质化方法可以通过常规的均质化方法来进行，例如，叶片均质化或压缩均质化方法，并且它可以对于均匀颗粒进行至少3次，但不限于此。
特别地，对透明质酸衍生物的尺寸和形状没有特别限定，并且其尺寸和形状可根据医学应用范围而变化，并且步骤ii)中研磨的水凝胶的尺寸优选为10～2000μm，更具体而言为200μm～800μm，但是如果需要，它可被研磨成其他尺寸并使用。
通过步骤i)和步骤ii)制备的透明质酸衍生物可以用于在高温和高压下灭菌。因此，作为另外的一个方面，根据本发明的制备方法可以进一步包括对步骤ii)中制得的透明质酸衍生物进行灭菌的步骤。
根据本发明的透明质酸衍生物的制备方法制备的水凝胶的复数粘度在1Hz(25℃)下为10～500,000Pa·s，并且溶胀度为200％～1,500％。另外，在透明质酸衍生物为粉末形式的情况下，溶胀度达到75,000％。
作为另一方面，本发明涉及一种包含根据本发明的止血组合物和药学上可接受的稀释剂的止血用试剂盒。
具体而言，根据本发明的止血用试剂盒可以包含稀释剂，该稀释剂含有凝血诱导剂以及包含透明质酸衍生物的止血组合物。优选地，在止血用试剂盒中，包含透明质酸衍生物的止血组合物：含有凝血诱导剂的稀释剂的重量比可以为2：8至9：1。
用于根据本发明的试剂盒的稀释剂中包含的凝血诱导剂是诱导凝血的材料，并且例如，它可以是选自由凝血酶、任何蛇毒成分、血小板活化剂、凝血酶受体激活肽、纤维蛋白原沉淀剂、抑肽酶和因子VIII所组成的组中的一种或多种，但不限于此。优选地，它是凝血酶。凝血酶可以由适用于人的任何凝血酶试剂诱导(即，药学上可接受的)。适当的凝血酶来源包括人和牛的血液、血浆或血清(当预计不会发生免疫排斥时，可以应用其他动物来源的凝血酶)，并且重组来源的凝血酶(例如人重组凝血酶)和自体人凝血酶对于某些应用可能是优选的，并且这同样适用于其他凝血诱导剂。
药学上可接受的稀释剂以通过其即用组合物来达到优选的最终浓度的量进行使用。除了上述凝血诱导剂之外，这种含有凝血诱导剂的稀释剂可以含有其他有用的成分，例如离子、缓冲溶液、赋形剂、稳定剂等。优选的盐是NaCl和/或CaCl2，并且优选的稳定剂是甘氨酸，并且它们全部以一般的量和浓度使用，应用于包含凝血酶的凝血诱导剂(例如，0.5～1.5％NaCl(例如，0.9％)和/或20～80mM CaCl2(例如，40mM))。在另外的实施方式中，稀释剂还可以包含缓冲溶液或缓冲系统，以缓冲至重构的干燥组合物的pH，优选为3.0～10.0的pH，更优选为6.5～8.5的pH。例如，稀释剂可以包含可注射级别的水，以及彼此独立的100～10,000IU/小瓶凝血酶(优选1,000至5,000IU/小瓶)、50～200mM NaCl(优选100～200mM)、10～80mM CaCl2(优选30～50mM)和5～100mg/mL甘氨酸(优选5～20mg/mL)。作为具体的一个方面，由于水溶液和选自由凝血诱导剂、NaCl、CaCl2、白蛋白和甘氨酸所组成的组中的材料(例如，小瓶中包含的形式为冻干的)被单独分离，含有凝血诱导剂的稀释剂可被包含在试剂盒中，并且当使用试剂盒时，可以将选自由凝血诱导剂、NaCl、CaCl2、白蛋白和甘氨酸所组成的组中的材料溶解在该水溶液中。
在其他实施方式中，含有凝血诱导剂的稀释剂可以含有少量的乙酸钠，特别是1～50mM的乙酸钠，优选10～30mM的乙酸钠。此外，含有凝血诱导剂的稀释剂可以含有小于100g/l、优选小于50g/l的甘露醇，并且可以含有小于200g/l、优选小于100g/l的乳糖。优选地，含有凝血诱导剂的稀释剂可以不必含有乙酸钠、甘露醇和乳糖。具体而言，通过将甘氨酸包含在上述范围内，甘氨酸单独可以保持包含凝血酶的凝血诱导剂的冻干饼形式，并且还可以使凝血诱导剂的滴度稳定，而不需要乙酸钠、甘露醇或乳糖。
根据优选的实施方式，当稀释剂包含凝血酶作为凝血诱导剂时，它优选包含10～10,000I.U.凝血酶/ml，特别是250～5,000I.U.凝血酶/ml。优选地，这种即用形式的止血用试剂盒含有10～100,000国际单位(I.U.)凝血酶，更优选500至20,000I.U.凝血酶，特别是1,000至10,000I.U.凝血酶。在优选的一个方面，根据本发明的止血用试剂盒可以是预充式注射器的形式。术语“预充式注射器”是通过将一定量的注射制剂原样填充到注射器中而制备的预充式注射器，并且意味着可即用，即，它可以立即使用而不需要在使用中称量药物并填充注射器等。
在具体的一个实施方式中，根据本发明的止血用试剂盒可以通过以下方式进行制备：将填充有根据本发明的包含透明质酸衍生物的止血组合物的预充式注射器连接到连接器，并且将填充有含有凝血诱导剂的稀释剂的注射器连接到连接器的另一末端来注射它，从而使包含交联的透明质酸衍生物基质的止血组合物水合。为了获得均匀的产品，可以在透明质酸衍生物注射器与含有凝血诱导剂的稀释剂注射器之间重复相互注射，并且它们可以通过优选地往复5次或更多次，更优选约10次进行制备。
根据本发明的这种止血用试剂盒包含止血组合物，其包含组合的透明质酸衍生物与含有凝血酶作为凝血诱导剂的稀释剂，从而表现出与单独的凝血酶相比优异的止血效果(参见图10等)。
发明实施例
下面，将参考下面实施例对本发明进行更详细的描述。然而，以下实施例的描述仅用于说明本发明的具体实施方式，而不是将本发明的范围限制或限制性地解释为其中描述的内容。
实施例1-3.止血组合物的透明质酸衍生物的制备
A.交联的透明质酸衍生物基质的制备
在于3个反应器中的每一个中制备1g的透明质酸钠后，使用0.25N NaOH溶液将它添加至最终重量10.0g(实施例1a)、8.3g(实施例2a)和7.1g(实施例3a)。向完全溶解的溶液中加入70μL(实施例1a)、60μL(实施例2a)和50μL(实施例3a)的1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，然后将它们混合。将混合的溶液置于恒温水浴中并在30℃下反应18小时，然后用缓冲溶液洗涤以去除未反应的物质。通过压缩法将制备的凝胶均质化3次或更多次以控制粒径，然后将其在121℃下灭菌15分钟。在5ml注射器中无菌称重3.0g的制备的透明质酸衍生物，然后在127℃最终灭菌2分钟以制备透明质酸衍生物预充式注射器(实施例1a、2a、3a)。
B.稀释剂的制备
每1小瓶加入凝血酶5,000IU、甘氨酸、氯化钠、氯化钙原料，然后通过加入适量的注射用水进行溶解。将溶解的溶液无菌过滤并装入小瓶中，然后冻干。在用于出血区域之前，冻干粉末用0.9％生理盐水注射液完全溶解并使用。
C.包含交联的透明质酸衍生物基质的止血组合物的制备
将填充有透明质酸衍生物(实施例1a、2a、3a)的预充式注射器连接到连接器，并且通过使用包含凝血酶的稀释剂来使透明质酸衍生物水合。为了获得均匀的产品，使圆筒在透明质酸衍生物注射器与含有凝血酶的稀释剂注射器之间反复运动，然后进行至少10次反复运动混合以制备止血组合物(实施例1b、2b、3b)。制得的含有透明质酸衍生物的止血组合物的外观如图1所示。
实施例4.透明质酸衍生物的流变特性
为了研究如实施例1a～3a制备的透明质酸衍生物以及市场上可得且含有透明质酸的B公司的抗粘附剂(比较例1a)和G公司的交联的透明质酸填充剂(比较例2a)和L公司的交联的透明质酸填充剂(比较例3a)的流变特性，进行旋转流变仪测试。在0.1Hz～1Hz的频率范围内的复数粘度和tanδ结果值示于图2。
通过图2和表1，实施例1a至3a示出了与比较例1a至3a相比更高的复数粘度值。由此可以看出，本发明的透明质酸衍生物(实施例1a至3a)具有与比较例1a至3a相比更高的粘度，并且它们形成具有高结构稳定性的结构。
表1
频率(1Hz)
复数粘度(Pa·s)
实施例1a 4,313
实施例2a 28,460
实施例3a 670
比较例1a 0.543
比较例2a 91
比较例3a 66
实施例5.透明质酸衍生物的溶胀度
在将100ml的生理盐水溶液添加到3.0mL的实施例1a至3a制备的透明质酸衍生物中后，将它们搅拌10分钟。在将它们在37℃保持1小时后，去除未吸收的生理盐水溶液，然后证实吸收到透明质酸衍生物的溶液的体积。
图3是如实施例1a至3a制备的透明质酸衍生物的溶胀度的结果，并且，实施例1a的溶胀度为706％，实施例2a的溶胀度为607％，并且实施例3a的溶胀度为409％。本发明的透明质酸衍生物(实施例1a至3a)表现出吸收其体积的4～7倍或更多的水分的吸收能力。
实施例6：含有透明质酸衍生物的止血组合物与含有非交联的透明质酸的止血组 合物的吸收能力的比较
比较例4：在将1000mg的透明质酸钠溶解在浓度为20重量％的缓冲溶液中后，该溶液在5ml注射器中进行称量，并在127℃下最终灭菌2分钟(比较例4a)。以与实施例1b至3b相同的方式进行使用稀释剂的止血组合物的制备过程，以制备最终组合物(比较例4b)。
图4是证实如实施例1b至3b制备的含有透明质酸衍生物的止血组合物与比较例4b中制得的组合物的液体吸收性的结果。为了证实吸收性，将5.0g的测试制品施加到培养皿上，然后将1.0mL的具有蓝色染料的生理盐水溶液倒在测试制品上以观察液体的吸收。
通过图4示出了：与比较例4b相比，在实施例1b至3b的包含透明质酸衍生物的止血组合物中液体在颗粒之间被更快吸收的现象。
实施例7.包含透明质酸衍生物的止血组合物的粒径的分析
为了测量包含实施例2b的透明质酸衍生物的止血组合物的粒径和分布，用15mL蒸馏水稀释3g各个样品，并使用Beckman Coulter Ls粒径分析仪对0.375μm～2000μm的颗粒进行计数。结果如图5a所示。图5b是分析止血剂(比较例5)的颗粒形式的粒径的结果。
通过图5a和图5b证实了，实施例2b的平均粒径为638.5μm，并且比较例5的平均粒径为462.8μm，并且与比较例5相比，实施例2b的止血组合物显示出均匀的颗粒分布。
实施例8.透明质酸衍生物的粘附力的证实测试
为了测量粘性值，将比较例1a、比较例2a、比较例4a和实施例1a至3a的每个样品装载在流变仪的板上，然后以0.1的剪切速率旋转10秒，并且测量几何体以0.1mm/s的速率分离时的法向力值。
图6a和图6b示出了根据每个样品的GAP(mm)的法向力(N)值并且比较该图中所示的最大法向力(N)，本发明的实施例1a至3a表现出与比较例1a(B公司的抗粘附剂)、比较例2a(G公司的交联的透明质酸填充剂)和比较例4a(非交联的透明质酸溶液)相比更高的法向力值。换句话说，本发明的实施例表现出与比较例相比更高的粘附力。
实施例9.透明质酸衍生物的粘附力的比较
为了测量止血组合物的粘附力，通过使用与实施例2b相同的稀释剂制备比较例2的3g样品(比较例2b)。
将约0.5mL的比较例4b、比较例2b和实施例2b样品滴在平的玻璃板上，并且进行30度倾斜玻璃镀覆并在环境条件下保持5分钟，然后测量每个样品的移动长度。由30度倾斜玻璃板上的样品长度与平的玻璃板上的样品长度之间的差异来计算每个样品的移动距离。
图7a和图7b示出了装载在平的玻璃板上的比较例4b、比较例2b和实施例2b样品的外观，并且实施例2b表现出与比较例2b和比较例4b相比更高的粘附力。
实施例10.透明质酸衍生物对凝血酶活性的影响
凝血酶活性根据韩国药典第11版的凝血酶定量方法进行测试。详细的操作方法如下。
在25摄氏度下将凝血酶标准制剂溶解于注射用生理盐水中，以制备4种含有4.0、5.0、6.2和7.5单位的1mL标准溶液，然后向试管中各自加入0.10mL。在相同温度下使用微量移液管将预热的0.90mL纤维蛋白原溶液添加到具有凝血酶标准溶液的试管中，并且同时启动计时器并轻轻摇动，直到测得第一次纤维蛋白凝固发生的时间。用4种标准溶液分别测量5次，并且计算出它们的平均值。
在与上述相同的温度下，通过相同的方法进行测试制品的测量。将测试制品溶解于注射用生理盐水中，并且制成含有5单位的1mL溶液，并且使用其0.10mL来重复上述操作5次，以测定凝血时间并且算出平均值。通过对数-对数图的横轴上的单位和纵轴上的凝血时间，利用图中的4种标准溶液的凝血时间的平均值来制备校准曲线。通过在上述校准曲线上应用测试溶液的凝血时间的平均值来计算单位数U-。
图8是比较仅在稀释剂中稀释的凝血酶溶液与如实施例1b至3b制备的止血组合物的凝血酶活性的结果。没有透明质酸衍生物的稀释剂的凝血酶滴度和包含透明质酸衍生物的止血组合物的凝血酶滴度是相似的。结果证实了，透明质酸衍生物不影响凝血酶的活性。
实施例11.透明质酸衍生物对凝血酶活性的影响
为了检查制备止血组合物的过程中混合时间对透明质酸含量和凝血酶滴度的改变，将3.0g的实施例2a中制得的透明质酸衍生物填充到预充式注射器中，然后通过使用包含1,000IU/mL凝血酶的稀释剂使透明质酸衍生物水合。图9示出了样品中凝血酶滴度和透明质酸含量的测试结果，其中水合过程分别通过反复运动5次、7次、10次和20次来进行。
通过图9证实了，透明质酸衍生物与稀释剂之间的混合必须进行至少10次或更多次，以获得均匀的止血组合物。
实施例12.大鼠模型的止血作用测试
对于SD大鼠肝脏损伤的止血作用，对实施例2b的制剂进行测试。对于动物模型，进行大鼠的中线剖腹术，然后通过使用手术刀将核心组织去除约1cm的宽度、1cm的长度和0.2cm的深度。对于出血伤口，通过使用施用装置尖端将约1.0mL的指定测试制品局部施用于损伤。在施用测试制品后2分钟内，去除施用的测试制品并在其去除1、2、5和10分钟后观察出血程度。结果如图10所示。
图10是证实实施例2b在SD大鼠肝脏损伤中的止血作用的结果。观察到如实施例2b制备的止血组合物随着时间流逝而吸收血液。在2分钟后，当用湿纱布去除止血剂时，观察到伤口组织中的止血。
实施例13.兔模型的止血作用测试
为了证实兔子的脾脏损伤中的止血作用，通过在兔子的脾脏中穿刺4mm来诱导出血。将大约1.0mL的指定测试制品局部施用于伤口，然后用手指通过湿纱布对其按压5秒，以帮助测试制品接近应用区域。在2分钟后去除湿纱布，并且用生理盐水溶液洗涤测试制品。在洗涤后每2、5和10分钟观察出血程度，并且结果如图11a和图11b所示。
通过图11a和图11b证实了如实施例2b制备的止血组合物的优异的组织粘附力和血液吸收能力。在去除2分钟后，在实施例2b中观察到来自出血组织的血液饱和，并且在没有产品泄漏的情况下实现止血。另外，即使在使用生理盐水溶液去除止血剂后，也没有再出血，并且观察到凝结的血液。

Claims (16)

1.一种止血组合物，包含交联的透明质酸衍生物基质。
2.根据权利要求1所述的止血组合物，其中，所述透明质酸衍生物的粒径为10～2000μm。
3.根据权利要求1所述的止血组合物，其中，所述交联的透明质酸衍生物基质的复数粘度在1Hz(25℃)下为10Pa·s至500,000Pa·s。
4.根据权利要求1所述的止血组合物，其中，所述交联的透明质酸衍生物基质通过使透明质酸和环氧化物交联剂在碱性水溶液中反应来制备。
5.根据权利要求1所述的止血组合物，所述止血组合物用于治疗选自由伤口、出血、受损组织、出血组织和/或骨缺损所组成的组的损伤。
6.一种根据权利要求1至5中任一项所述的止血组合物的制备方法，包括：
i)使透明质酸和环氧化物交联剂反应的步骤，其中，将透明质酸和环氧化物交联剂溶解在碱性水溶液中以制备交联的透明质酸衍生物；和
ii)使交联的透明质酸衍生物均质化的步骤。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，溶解在所述碱性水溶液中的透明质酸的浓度为20～200mg/mL。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其中，溶解在所述碱性水溶液中的透明质酸的浓度为20～200mg/mL，并且所述环氧化物交联剂的加入量为0.01～50％(v/w)。
9.根据权利要求6所述的制备方法，所述制备方法还包括对步骤ii)中制得的透明质酸衍生物进行灭菌的步骤。
10.一种止血用试剂盒，其特征在于，包含根据权利要求1～5中任一项所述的止血组合物和含有凝血诱导剂的稀释剂。
11.根据权利要求10所述的止血用试剂盒，其中，所述凝血诱导剂是选自由凝血酶、蛇毒成分、血小板活化剂、凝血酶受体激活肽、纤维蛋白原沉淀剂、抑肽酶和因子VIII所组成的组中的一种或多种。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其中，所述含有凝血诱导剂的稀释剂包含10～10,000I.U./ml的凝血酶。
13.根据权利要求10所述的试剂盒，其中，所述含有凝血诱导剂的稀释剂还包含选自由NaCl、CaCl2和甘氨酸所组成的组中的物质。
14.根据权利要求10所述的试剂盒，其中，所述含有凝血诱导剂的稀释剂包含pH为3.0～10.0的缓冲溶液或缓冲系统。
15.根据权利要求10所述的试剂盒，其中，所述试剂盒是预充式注射器的形式。
16.一种根据权利要求13至18中任一项所述的止血用试剂盒的制备方法，包括：
将根据权利要求1至5中任一项所述的透明质酸衍生物填充到第一注射器中并将含有凝血诱导剂的稀释剂填充到第二注射器中，然后通过连接器将所述第一注射器和所述第二注射器彼此连接的步骤；
通过连接器将所述第二注射器的含有凝血诱导剂的稀释剂注射到所述第一注射器中以混合所述透明质酸衍生物和所述稀释剂的步骤；
通过将所述混合物从所述第一注射器注射到所述第二注射器来重新混合的步骤；和
通过往复运动5次～20次来混合的步骤。
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