WO2018048199A1 - 가교화 히알루론산 유도체 매트릭스가 포함된 지혈 조성물 - Google Patents

가교화 히알루론산 유도체 매트릭스가 포함된 지혈 조성물 Download PDF

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acid derivative
hemostatic
hemostatic composition
kit
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김민경
우구
백영준
민경우
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(주)한국비엠아이
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Definitions

  • the present invention relates to a hemostatic composition and a method for preparing the same, and more particularly, to a hemostatic composition comprising a cross-linked hyaluronic acid derivative matrix suitable for use in hemostasis and to a method for producing such a composition.
  • ligature or general procedures can result in bleeding that is not controlled or uncontrolled effectively.
  • a blood donor composition can be applied to a wound, and as such a hemostatic composition, it is required to provide a material having strong adhesion and proper swelling power when applied to human tissues such as a wound.
  • a hemostatic composition comprising a biocompatible biodegradable dry stable granular material
  • Floseal® a multipurpose hemostatic agent consisting of a granular gelatin matrix that swells in a thrombin-containing solution to form a flowable paste.
  • Hyaluronic acid is a component of the human body is used in a variety of applications, such as beverages, cosmetics, medicines.
  • the possibility of hemostatic composition has been suggested through the combination with the hemostatic component, but the inventors' test results indicate that it is difficult to be mixed with the hemostatic component due to the local gelling property during the hydration process. This low, due to the excessively high adhesion at the time of the mixed treatment on the wound appeared to damage the wound site, it is difficult to use the natural hyaluronic acid as a composition of the hemostatic agent.
  • the hyaluronic acid derivative matrix was formed by crosslinking of the hyaluronic acid, which was crushed to an appropriate size, and the hyaluronic acid derivative was developed to be easily mixed with the hemostatic agent and to have an appropriate adhesive property when mixed with the wound. It was confirmed that the hemostatic composition containing an excellent hemostatic effect was completed the present invention.
  • a basic object of the present invention is to provide a hemostatic composition comprising a cross-linked hyaluronic acid derivative matrix.
  • the "A further object of the present invention to provide a method for producing a hemostatic composition containing the cross-linked hyaluronic acid derivative matrix.
  • the hemostatic composition comprising the crosslinked hyaluronic acid derivative matrix according to the present invention has high water absorption capacity and easy adhesion to use.
  • initially forms an efficient barrier to form a shield against blood flow.
  • the swelling properties of the crosslinked hyaluronic acid derivatives contained in the hemostatic composition can increase the adhesion of tissue to the bleeding site, and can make an effective mechanical shield against tissue adhesion.
  • the hemostatic composition of the present invention has excellent adhesion to biological tissues, and can be completely degraded and absorbed in vivo after a certain period of time.
  • a hyaluronic acid derivative that is harmless to the human body, which has proper adhesion compared to natural sodium hyaluronate solution, it eliminates the risk of side effects of the hemostatic composition using an externally derived substance that has been pointed out as a conventional problem.
  • FIG. 1 is a view showing a state of a hemostatic composition containing a hyaluronic acid derivative prepared according to the production method of the present invention.
  • Figure 2 is a complex viscosity (Complex Vi scosi ty) in the frequency range of 0.1 Hz to 1 Hz to characterize the rheological properties of the hyaluronic acid derivatives prepared in Examples la to 3a and Comparative Examples la, 2a and Comparative Example 3a The result of measuring tanS is shown.
  • 3 is a view showing the results of absorption of the hyaluronic acid derivatives prepared in Examples la to 3a.
  • FIG. 4 is a view showing the results of confirming the liquid absorption of the hyaluronic acid derivative-containing hemostatic composition prepared in Examples lb to 3b and the non-crosslinked hyaluronic acid-containing hemostatic composition prepared in Comparative Example 4b.
  • Figure 5a is a diagram showing the particle size analysis results of the hyaluronic acid derivative-containing hemostatic composition prepared in Example 2b.
  • Figure 5b is a particle size analysis of the hyaluronic acid derivative-containing hemostatic composition of Comparative Example 5. It is a figure which shows a result.
  • Figures 6a and b is a view confirming the adhesion of the hyaluronic acid derivatives prepared in hemostatic comparative examples la, 2a and 4a, Examples la to 3a.
  • Figure 7a is a photograph showing the results of the adhesion test of the hemostatic composition prepared in hemostatic examples 2b, Comparative Examples 2b and 4b.
  • 7B is a graph showing the results of adhesion comparison tests of the hemostatic compositions prepared in hemostatic examples 2b, comparative examples 2b, and 4b as a moving distance of the sample.
  • FIG. 8 is a view showing the result of comparing the thrombin activity of the hemostatic composition prepared in Examples lb to 3b and the diluent used in the preparation of the hemostatic composition.
  • 9 is a view confirming the change in hyaluronic acid content and thrombin titer according to the number of mixing.
  • Example 10 is a view showing the result of confirming the hemostatic ability of Example 3b in the liver lesion of SD rat.
  • Figure 11a is a photograph of the test results confirming the hemostatic efficacy in rabbit spleen lesions of the hemostatic composition prepared in Example 3b.
  • Lib is a graph showing the hemostatic efficacy in rabbit spleen lesions of the hemostatic composition prepared in Example 3b bleeding.
  • FIG. 12 is a comparison of the hemostatic effect of the hemostatic composition according to the present invention and the non-crosslinked sodium hyaluronate, and shows an actual photograph of the hemostatic composition according to the present invention.
  • the present invention relates to a hemostatic composition
  • a hemostatic composition comprising a crosslinked hyaluronic acid derivative matrix.
  • the hemostatic composition of the present invention is suitable as a component for hemostasis hygroscopic, Crosslinked hyaluronic acid derivative matrices with viscosity.
  • the crosslinked hyaluronic acid derivative may be a cross-linked hyaluronic acid (HA) or a salt thereof using an epoxide crosslinking agent having two or more epoxide groups.
  • HA cross-linked hyaluronic acid
  • the crosslinked hyaluronic acid forms a matrix through crosslinking between hyaluronic acids while maintaining the hygroscopic nature of hyaluronic acid, and the absorption and viscosity of the additional solution are improved, and the adhesion is inhibited. This becomes possible.
  • the hyaluronic acid is a natural heteropolysaccharide composed of alternating residues of D-glucuronic acid and N-acetyl-D-glucosamine, and an epoxide crosslinking agent. To form a hyaluronic acid derivative matrix.
  • salts thereof may also be used in addition to hyaluronic acid.
  • the epoxide crosslinking agent specifically, 1, 4-butanedi to diglycidyl ether (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE), ethylene glycol diglycidyl ether (ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 1, 6-nucleodiol diglycidyl ether (1,6-hexanediol diglycidyl ether), propylene glycol diglycidyl ether, polypropylene glycol diglycidyl ether, Poly (tetramethylene glycol) diglycidyl ether, neopentyl glycol diglycidyl ether, polyglycerol polyglycidyl ether, diglycerol Glycerol polyglycidyl ether, glycerol polyglycidyl ether, trimethylpropane polyglycidyl ether glycidyl ether), 1, 2- (bis (2, 3-epoxyprop
  • the composite viscosity of the crosslinked hyaluronic acid derivative matrix of the present invention is 1 Hz
  • the crosslinked hyaluronic acid derivative matrix has the advantage that the water absorption capacity is higher than that of the natural hyaluronic acid (Fig. 3) has a greater swelling degree.
  • the swelling degree of the crosslinked hyaluronic acid derivative matrix in the gel state is 30OT to 1,500%, and in the case of dry powder (105 ° C, 6 hours), the swelling degree is 300% to 75, 000%.
  • the crosslinked hyaluronic acid derivative matrix is crosslinked according to the synthetic conditions peculiar to the present invention, thereby increasing molecular bonds between hyaluronic acids and increasing viscoelasticity (FIG. 2), and having appropriate adhesion to biological tissues.
  • the oxidized part is not cleaved by the hyaluronic acid degrading enzyme in the body, and thus has improved stability in the body, and has little risk for toxicity.
  • after completing the hemostatic action may form a physical barrier in the affected area for a period of time.
  • the composition according to the present invention is particularly useful for providing a hemostatic effect on bleeding sites, including surgical bleeding sites, traumatic bleeding sites, and the like. If bleeding occurs, it can be used easily and conveniently as a bleeding ⁇ . '
  • the present invention relates to a method for producing a hemostatic composition comprising the crosslinked haaluronic acid derivative matrix.
  • the preparation method includes the steps of: i) reacting hyaluronic acid and an epoxide crosslinking agent dissolved in a basic aqueous solution to prepare a crosslinked hyaluronic acid derivative; And ⁇ ) pulverizing the crosslinked hyaluronic acid derivative to prepare it in an appropriate size.
  • hyaluronic acid derivative prepared by pulverizing the reaction product obtained by reacting the epoxide crosslinking agent containing two or more epoxy groups in hyaluronic acid (HA) Manufacture.
  • hyaluronic acid (HA) or a salt thereof may be used, and the salt may be sodium hyaluronate, potassium hyaluronic acid, calcium hyaluronate, magnesium hyaluronate, zinc hyaluronate, cobalt hyaluronic acid and tetra hyaluronic acid tetra. At least one selected from the group consisting of butylammonium.
  • the basic aqueous solution used for ionization for crosslinking reaction of hyaluronic acid in step i) may be used NaOH, K0H, ammonia aqueous solution and the like.
  • the concentration of hyaluronic acid dissolved in the basic aqueous solution is preferably 50-200 mg / mL, and the crosslinking ratio of the epoxide crosslinking agent (eg BDDE) varies depending on the concentration of hyaluronic acid dissolved in the basic aqueous solution.
  • the crosslinking ratio of the epoxide crosslinking agent eg BDDE
  • the BDDE dosage as the epoxide crosslinking agent is 2% to 50% (the volume ratio of the epoxide crosslinking agent to the weight of the basic aqueous solution in which the hyaluronic acid is dissolved ( v / w)) and, when the concentration of the hyaluronic acid dissolved in a basic aqueous solution of 200 mg / mL, BDDE amount is a volume ratio of epoxide cross-linking agent for i in the 0.01% to 5% (this hyaluronic acid dissolved in an aqueous basic solution weight (v / w)).
  • the reaction temperature of step i) is 4 to 80
  • the reaction time is 12 to 48 hours
  • the reaction pressure is 0.5 atm to 2 atm, preferably at atmospheric pressure.
  • the epoxide crosslinking agent of step i) is 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE), ethylene glycol diglycidyl ether (ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 1,6 1,6-hexanediol diglycidyl ether, propylene glycol diglycidyl ether, poly (propylene glycol) diglycidyl ether, Poly (tetramethylene glycol) diglycidyl ether, neopentyl glycol diglycidyl ether, polyglycerol polyglycidyl ether, diglycerol Glycerol polyglycidyl ether, glycerol polyglycidyl ether; Trimethylpropane polyglycidyl ether, 1, 2- (bis (2, 3-epoxypropoxy) ethylene (1, 2- (bi s (2, 3-epoxypropoxy) ethylene), pentaeryeri May be selected from pen
  • the hyaluronic acid derivative prepared in step i) may be washed using physiological saline or the like before being introduced into step ii). remind
  • the hyaluronic acid derivatives prepared in step i) can be prepared in addition to washing methods, including methods known in the art, such as distillation (at atmospheric or reduced pressure), recrystallization, column chromatography, ion exchange chromatography, gel chromatography, affinity chromatography. It may be separated and / or purified by chromatography, thin layer chromatography, phase separation, solvent extraction or dialysis.
  • step ⁇ ) is a step of preparing a gel form by grinding the crosslinked hyaluronic acid derivative prepared in step i).
  • the grinding method may be pulverized by a conventional grinding method, for example, a blade grinding or a compression grinding method, and is performed at least three times for homogeneous particles, but is not limited thereto.
  • the size and shape of the hyaluronic acid derivative is not particularly limited, and may vary in size and shape according to the medically applied range
  • the size of the hydrogel pulverized in step ii) is 10 to 2000 ⁇ ⁇ ⁇ More specifically, 200 ⁇ to 800 ⁇ are preferable, but may be pulverized to other sizes as necessary.
  • Hyaluronic acid derivatives prepared through the steps i) and i i) may be sterilized under high temperature and high pressure.
  • the preparation method according to the invention may further comprise the step of sterilizing the hyaluronic acid derivative prepared in step ⁇ ).
  • the complex viscosity of the hydrogel prepared according to the method for preparing the hyaluronic acid derivative of the present invention is 10 to 500, 000 Pa. At 1 Hz (25 ° C). s, swelling is 200%
  • the present invention relates to a hemostatic kit comprising the hemostatic composition according to the present invention and a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the hemostatic kit according to the present invention may include a diluent including a male-derived agent together with the hemostatic composition including the hyaluronic acid derivative.
  • the hemostatic kit may include a hemostatic composition comprising the hyaluronic acid derivative: a diluent including an ointment agent in a weight ratio of 2: 8 to 9: 1.
  • the ointment-inducing agent included in the diluent used in the kit according to the present invention is a substance that induces the nodule of blood, for example, thrombin, snake venom, platelet activator, thrombin receptor activating peptide, fibrinogen precipitant, aprotinin and It may be one or more selected from the group consisting of the eighth factor, but is not limited thereto.
  • thrombin thrombin.
  • Thrombin can be derived from any thrombin formulation suitable for use in humans (ie, pharmaceutically acceptable).
  • Suitable sources of thrombin include human and cattle, plasma or serum (thrombin from other animal sources may be applied if no immune rejection reaction is expected), thrombin of recombinant origin (eg human recombinant thrombin) and autologous Tissue human thrombin may be preferred for some applications, as is the case for other male derivatives.
  • diluents are used in amounts which will achieve the desired final concentration in the use-prepared composition. Such .
  • the diluent, including the ointment-inducing agent may contain other useful ingredients in addition to the above-mentioned ointment-inducing agent, such as ions, complete fluids, excipients, stabilizers and the like.
  • Preferred salts are NaCl and / or CaCl 2
  • preferred stabilizers are glycine, all of which are used in the usual amounts and concentrations applied for the high inducers, including thrombin (e.g. 0.5-1.5% NaCl (e.g.
  • the diluent may also comprise a complete solution or complete layer, system to buffer at a pH of the reconstituted dry composition, preferably at a pH of 3.0 to 10.0, more preferably at a pH of 6.5 to 8.5.
  • the diluent may be water for injection, and-independently of each other-from 100 to 10, 000 IU / vial trumbin (preferably between 1,000 and 5,000 IU / vial), and 50 to 200 mM NaCl (preferably 100 to 200 mM), 10 to 80 mM CaCl 2 (preferably 30 to 50 mM) and 5 to 100 mg / mL glycine (preferably 5 to 20 mg / mL).
  • the diluent including the coagulant inducing agent is separated from the aqueous solution and the material selected from the group consisting of male inducer, NaCl, CaCl 2 , albumin and ' glycine (for example, lyophilized and contained in the vial Form) kit, and may be used by dissolving a substance selected from the group consisting of coagulant, NaCl, CaCl 2) albumin and glycine in aqueous solution.
  • the diluent comprising a male derivative may contain small amounts of sodium acetate, specifically 1 to 50 mM, preferably 10 to 30 mM.
  • the diluent containing the above-mentioned high inducers may contain less than 100 g / 1 manny, preferably less than 50 g / 1, less than 200 g / 1 lactose, preferably less than 100 g / 1 It may contain.
  • the Diluents comprising an ointment agent may be essentially free of sodium acetate, manny and lactose.
  • the glycine alone can also stabilize the titer of the coagulant inducer, while including the thrombin can maintain the form of lyophilized cake without containing sodium acetate, manny and lactose have.
  • the diluent comprises thrombin as a highly inducer it is preferably 10 to 10,000 I.U. Thrombin / ml, especially 250 to 5,000 I.U. Contains thrombin / ml.
  • the hemostatic kit in this ready-to-use form has a thrombin of 10 to 100,000 international units (I.U.), more preferably 500 to 20,000 I.U. And especially 1,000 to 10,000 LIL.
  • the hemostatic kit according to the invention may be in the form of a prefilled syringe.
  • pre-filled syringe is prepared by injecting a certain amount of layered injection into a syringe (syringe) as it is, and means that it is ready for use, that is, it is possible to use it immediately without requiring weighing of the drug and intralayer injection.
  • the hemostatic kit according to the present invention is not limited thereto, but the prefilled syringe filled with the hemostatic composition comprising the hyaluronic acid derivative according to the present invention is connected to a connector, and a male-derived agent is included. It can be prepared by hydrating a hemostatic composition comprising a cross-linked hyaluronic acid derivative matrix by injecting a diluent-filled syringe into the other end of the connector and injecting it.
  • the reciprocal injection may be repeated between the hyaluronic acid derivatives and the diluent syringes containing the high inducer ' , and may be prepared by reciprocating at least 5 times, more preferably about 10 times.
  • the hemostatic kit according to the present invention includes a combination of a hemostatic composition including the hyaluronic acid derivative and a diluent including a thrombin as a male-derived agent, so as to use a thrombin alone, or to add a conventional swelling property and adhesion. Shows a superior hemostatic effect compared to flossil or the like using a gelatin matrix with a thrombin-containing solution for this purpose (see FIG. 10, etc.).
  • Example la After preparing 1 g of sodium hyaluronate in each of three reaction vessels, the final weight was 10.0 g (Example la), 8.3 g (Example 2a), 7.1 g (Example 3a) using 0.25 N NaOH solution.
  • Example la 70 uL (Example la), 60 uL (Example 2a) and 50 uL (Example 3a) were added to 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) in the completely dissolved solution. And then mixed. The mixture was mixed in an anti-silver bath and reacted at 30 0 C for 18 hours, followed by washing with a complete solution to remove unreacted material.
  • BDDE 1,4-butanediol diglycidyl ether
  • the prepared gel was pulverized three times or more by compression to adjust the particle size, and then sterilized for 15 minutes at 121 0 C.
  • the hyaluronic acid derivative 3.0.g prepared aseptically weighed in a 5 ml syringe, and then sterilized at 127 ° C. for 2 minutes to prepare a hyaluronic acid derivative pre-filled syringe (Example la, 2a, 3a).
  • 5,000 IU of thrombin, glycine, sodium chloride, and calcium chloride were added per vial, followed by dissolving with an appropriate amount of water for injection. After dissolving the dissolved Yongsek was filled into the vial, lyophilization was performed. Lyophilized powder is completely dissolved in 0.9% physiological saline immediately before use at the bleeding site.
  • Prefilled syringes layered with hyaluronic acid derivatives (Examples la, 2a, 3a) were connected with connectors, and the hyaluronic acid derivatives were hydrated using a diluent containing thrombin.
  • the hemostatic composition was prepared by at least 10 round trips of mixing between the hyaluronic acid derivative-thrombin containing diluent syringes and reciprocating the cylinder to obtain a homogeneous product (Example lb, 2b, 3b).
  • the state of the hemostatic composition containing the prepared hyaluronic acid derivative is shown in FIG.
  • Example 4 Rheological Properties of Hyaluronic Acid Derivatives
  • Examples la to 3a shows a higher composite viscosity value than Comparative Examples la to 3a.
  • the hyaluronic acid derivatives (Examples la to 3a) of the present invention have a viscosity higher than that of Comparative Examples la to 3a and are formed in a structurally high stability structure.
  • Example 3 is a result of the swelling degree of the hyaluronic acid derivatives prepared in Examples la to 3a, the swelling degree of Example la is 706%, the swelling degree of Example 2a is 607%, Example
  • Hyaluronic acid derivatives of the present invention showed an absorbing ability to absorb water up to 4 to 7 times its volume.
  • Example 6 Comparison of Absorption Capability of Hyaluronic Acid-Containing Hemostatic Composition and Non-crosslinked Hyaluronic Acid-Containing Hemostatic Composition Comparative Example 4: l, was dissolved in a 20% by weight of hyaluronic acid sodium of 000 mg to wancheung solution, this solution 3.0 g was 127 ° C (2 bungan post-sterilization were weighed on a 5 ml syringe (Comparative Example 4a).
  • FIG. 4 is a hyaluronic acid derivative-containing hemostatic composition prepared in Examples lb to 3b and Comparative Example This is the result of checking the liquid absorbency of the composition prepared in 4b, in order to confirm the absorbency, 5.0 g of the test article was applied to the di sh, and then 1.0. ML of pigmented physiological saline was added to the test article to absorb the liquid. Observed.
  • Examples lb to 3b which are hemostatic compositions containing hyaluronic acid derivatives, depict a phenomenon in which a liquid is rapidly absorbed between particles compared to Comparative Example 4b.
  • Example 7 Particle Size Analysis of Hemostatic Compositions Containing Hyaluronic Acid Derivatives
  • FIG. 5a is a particle size analysis of the flow chamber ® (Floseal ®) (Comparative Example 5) of hemostatic granular form.
  • Example 8 Adhesion test of hyaluronic acid derivative
  • each sample of Comparative Example la, Comparative Example 2a, Comparative Example 4a, and Examples la to 3a was loaded on the plate of the rheometer, and then sheared at 0.1 for 10 seconds. Rotation was performed at the shear rate, and the normal force value was measured when the geometry was separated at the speed of 0.1 ⁇ / 3.
  • Figure 6a and b shows the vertical drag (N) value according to each sample GAP ( ⁇ ), when comparing the maximum vertical drag (N) shown in this figure
  • Examples la to 3a of the present invention is a comparative example la (B-adhesion inhibitor), Comparative Example 2a (G company The vertical drag value was higher than that of the cross-linked hyaluronic acid filler product) and Comparative Example 4a (non-crosslinked hyaluronic acid solution). That is, the Example of this invention showed the adhesiveness higher than a comparative example.
  • Example 9 Adhesion test of hyaluronic acid derivative
  • the test for the determination of thrombin activity was carried out according to the test method for the determination of thrombin in the 11 Korean Pharmacopoeia.
  • the detailed operation method is as follows.
  • Dissolve the Trvin standard in physiological saline solution to make four standard solutions containing 4.0, 5.0, 6.2, and 7.5 units of 1 mL of this solution, and add 10 mL of each to the test tube.
  • Pipette 0.90 mL of the fibrinogen solution previously maintained at the same temperature using a pipette and simultaneously measure the time until the fibrin unevenness occurs while gently shaking and mixing. Five measurements were made with four standard solutions, and the average value was obtained. Measurements on the test article are made in the same manner at the same temperature as before.
  • Dissolve the test article in physiological saline and prepare a solution containing 5 units of 1 mL. Repeat the above procedure 5 times using 10.10 mL of the solution and measure the average time.
  • a calibration curve is prepared by taking the average value of the uneven time by four standard solutions on the horizontal axis and the uneven time on the vertical axis. Using this calibration curve, the number of units U is read from the mean value of the nominal time of the calibration liquid.
  • Example 8 is a diluent used in the preparation of the hemostatic composition in Examples lb to 3b This is a result of comparing the thrombin activity of the prepared hemostatic composition.
  • the thrombin titer of the diluent without the hyaluronic acid derivative was similar to the thrombin titer of the hemostatic composition including the hyaluronic acid derivative. As a result, it was confirmed that the hyaluronic acid derivatives did not affect the activity of the thrombin.
  • Example 11 Effect of Hyaluronic Acid Derivatives on Thrombin Activity
  • Example 2b The formulation of Example 2b was tested for hemostatic efficacy in liver lesions of SD rats.
  • the animal model performs a centerline lap of the rat and then removes the core tissue approximately 1 cm wide, 1 cm long and 0.2 cm deep using a scalpel on the exposed liver.
  • Approximately 1.0 mL of the allocated test article to the bleeding wound is applied topically to the lesion using the applicator tip.
  • the applied test article was removed 2 minutes after application of the test article and the degree of bleeding was observed at 1, 2, 5 and 10 minutes. The results are depicted in FIG.
  • Example 10 is a result of confirming the hemostatic ability of Example 2b in the liver lesion of SD rat. It is observed that the hemostatic composition prepared in Example 2b absorbs blood over time. After 2 minutes, hemostasis was observed in the wound tissue when the hemostatic agent was removed with wet gauze. Example 13. Confirmation of Hemostatic Effect in Rabbits
  • Example 2b saturated with blood of bleeding tissue was observed and hemostasis without bleeding out of the product. In addition, there was no rebleeding after removing the hemostatic agent using physiological saline, and clot formation was observed.

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Abstract

본 발명은 지혈용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 지혈에 사용하기 적합한 가교화 히알루론산 유도체 매트릭스를 포함하는 지혈 조성물 및 이러한 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
가교화 히알루론산 유도체 매트릭스가 포함된 지혈 조성물
【기술분야】
본 발명은 지혈용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로， 보다 상세하게는 지혈에 사용하기 적합한 가교화 히알루론산 유도체 매트릭스를 포함하는 지혈 조성물 및 이러한조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
【배경기술】
여러 영역의 외과적 수술 시， 결찰 ( l igature) 또는 일반적인 절차로 효과적으로 조절되지 않거나 조절이 불가능한 출혈이 유발될 수 있다. 이러한 출혈을 억제하기 위해 자혈 조성물을 상처에 적용할 수 있으며， 이러한 지혈 조성물로서， 상처와 같은 인체 조직에 적용할 때 강한 부착성 및 적절한 팽윤력을 가진 물질을 제공하는 것이 요구된다.
생체적합성의 생분해성 건조 안정한 과립 물질을 포함하는 지혈 조성물의 예로는 플로실 (Floseal )®이 있는데， 이는 트름빈 -함유 용액 중에 팽윤되어 유동성 페이스트를 형성하는 과립 젤라틴 매트릭스로 구성된 다용도 지혈제이다.
그러나 이러한 제품은 지혈의 효능과 관련된 부착 및 팽윤력은 좋으나， 소에서 유래된 젤라틴의 가교 및 건조시킨 물질을 포함하기 때문에 인간의 수술 적용 시 안전성에 대한우려가 있다.
히알루론산 (Hyaluroni c acid)은 인체 구성 요소의 하나로서 음료， 미용， 의약품 등의 다양한 용도로 활용되고 있다. 특히， 조직의 재생에 도움이 될 수 있는 것으로 알려져 있으며， 인체에 무해하여 유착 방지제의 성분으로 개발되어 활용되고 있다. 최근 문헌에 따르면 지혈제 성분과의 조합을 통해， 지혈 조성물의 가능성이 제시되었으나， 발명민의 시험 결과， 수화되는 과정에서 국부적으로 겔 화되는 성질로 인하여 지혈 성분과의 흔합이 어려우며， 수화후 점도와흡습성이 낮고， 상처 부위에 흔합 처리 시 지나치게 높은 부착성으로 인하여 상처 부위에 해를 가할 수 있는 것으로 드러나 자연상태의 히알루론산을 지혈제의 조성물로 용하기에는 어려움이 있다.
이러한 배경 하에서， 본 발명자들은 전술한 종래 기술의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구한 결과, 적절한 조직 부착성과 유착방지 능력이 있는 히알루론산의 가교화을 통한 히알루론산 유도체 매트릭스를 이루게 하였고, 이를 적정 크기로 분쇄하여， 지혈제 성분과 흔합이 용이하면서도, 상처부위에 흔합처리 시 적절한 접착성을 가진 히알루론산 유도체를 개발하여， 이러한 유도체가 포함된 지혈 조성물이 탁월한 지혈 효과를 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이러한 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한， 본 발명의 기본적인 목적은 가교화 히알루론산 유도체 매트릭스를 포함하는 지혈 조성물을 제공하는 것이다.
나아가，'본 발명의 또 다른 목적은 상기 가교화 히알루론산 유도체 매트릭스를 포함하는 지혈 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 【유리한 효과]
본 발명에 따른 가교화 히알루론산 유도체 매트릭스를 포함하는 지혈 조성물은 높은 수분 흡수 능력과 활용에 용이한 접착력을 갖는다. 또한， 생체에 적용했을 때， 초기에는 혈액 유동에 대한 차폐물을 형성할 수 있는 효율적인 장벽을 형성한다. . 구체적으로， 지혈 조성물에 포함된 가교화 히알루론산 유도체의 팽윤 성질은 출혈 부위에 대한 조직 부착력을 높여주고, 조직 간유착에 대한 효과적인 기계적 차폐물을 만들 수 있다. 본 발명의 지혈 조성물은 종래의 트롬빈 액제와는 달리， 생체 조직에 대한 부착력이 뛰어나고， 일정 기간 후 완전한 분해 및 생체 내 흡수될 수 있다. 또한자연 히알루론산나트륨 액에 비해 적절한부착성을 가진， 인체에 무해한 히알루론산 유도체를 사용함으로써 종래 문제점으로 지목되었던 외부 유래 물질을 이용한 지혈조성물의 부작용에 대한 위험성을 제거하였다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 히알루론산 유도체를 함유한 지혈 조성물의 모습을 나타낸 도면이다.
도 2는 실시예 la 내지 3a에서 제조한 히알루론산 유도체와 비교예 la , 2a 및 비교예 3a의 유변학적 특성을규명하기 위해 0.1 Hz 내지 1 Hz의 진동수 범위에서 복합점도 (Complex Vi scosi ty) 및 tanS 결과값을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 3은 실시예 la 내지 3a에서 제조한 히알루론산 유도체의 흡수능 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예 lb 내지 3b에서 제조한 히알루론산 유도체 함유 지혈 조성물과 비교예 4b에서 제조한 비가교 히알루론산 함유 지혈 조성물의 액체 흡수성을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5a는 실시예 2b에서 제조된 히알루론산 유도체 함유 지혈 조성물의 입도분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 5b는 비교예 5의 히알루론산 유도체 함유 지혈 조성물의 입도분석. 결과를 나타내는 도면이다.
도 6a 및 b은 지혈 비교예 la , 2a 및 4a, 실시예 la 내지 3a에서 제조한 히알루론산유도체의 부착성을 확인한 도면이다.
도 7a은 지혈 실시예 2b , 비교예 2b 및 4b에서 제조한 지혈 조성물의 접착성 비교시험 결과를 나타낸 사진이다.
도 7b는 지혈 실시예 2b, 비교예 2b 및 4b에서 제조한 지혈 조성물의 접착성 비교시험 결과를 시료의 이동거리로 나타낸 그래프이다.
도 8은 지혈 조성물 제조 시 사용된 희석제와 실시예 lb 내지 3b에서 제조한지혈 조성물의 트롬빈 활성을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9은 흔합 횟수별 히알루론산 함량과 트롬빈 역가의 변화를 확인한 도면이다.
도 10은 SD rat 간 병변에서 실시예 3b의 지혈능을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11a는 실시예 3b에서 제조한 지혈 조성물의 토끼 비장 병변에서의 지혈 효능을 확인한 시험 결과사진이다.
도 lib는 실시예 3b에서 제조한 지혈 조성물의 토끼 비장 병변에서의 지혈 효능을 출혈도로 나타낸 그래프이다.
도 12은 본 발명에 의한 지혈 조성물과 비가교 히알루론산나트륨의 지혈 작용 모식도를 비교한 것이며， 본 발명에 따른 지혈 조성물의 실제 사진을 나타낸다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서， 본 발명은 가교화 히알루론산 유도체 매트릭스를 포함하는 지혈 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 지혈 조성물은 지혈을 위한 성분으로서 적절한 흡습성， 점도를 가진 가교화 히알루론산 유도체 매트릭스를 포함한다. 구체적인 일 양태로서，상기 가교화된 히알루론산 유도체는,히알루론산 (hyaluronic acid; HA) 또는 이의 염을 2개 이상의 에폭사이드기를 갖는 에폭사이드 가교제를 사용하여 가교화시킨 것일 수 있다. 가교화된 히알루론산은 히알루론산 본연의 흡습성을 유지하면서도 히알루론산 간의 가교화를 통한 매트릭스를 이루게 되어， 추가적인 용액에 대한 흡수성과 점도가 향상되며， 부착성은 저해되어 지혈성분을 포함한 용액과의 원활한흔합이 가능하게 된다.
상기 히알루론산은 D-글루쿠론산 (D-glucuronic acid)과 N-아세틸 -D-글루코스아민 (N-acetyl-D-glucosamine)의 교대 잔기로 이루어진 천연의 이종다당류 (heteropolysaccharide)이고， 에폭사이드 가교제에 의해 히알루론산 유도체 매트릭스를 형성하게 된다. 본 발명에서는 히알루론산 외에 이의 염 또한사용 될 수 있다.
상기 에폭사이드 가교제는， 구체적으로， 1， 4-부탄디을 디글리시딜 에테르 (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE) , 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE) , 1，6-핵산디올 디글리시딜 에테르 (1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글라콜 디글리시딜 에테르 (polypropylene glycol) diglycidyl ether), 폴리테드라메틸렌글리콜 디글리시딜 에테르 (poly(tetramethylene glycol) diglycidyl ether) , 네오펜틸 글리콜 디글리시딜 에테르 (neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세를 폴리글리시딜 에테르 (polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세를 폴리글리시딜 에테르 (diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤 폴리글리시딜 에테르 (glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판 폴리글리시딜 에테르 (trimethylpropane polyglycidyl ether) , 1， 2- (비스 (2， 3-에폭시프로폭시；)에틸렌 ( 1 , 2-(bi s (2， 3-epoxypropoxy) ethylene )， 펜타에리스리를 폴리글리시딜 에테르 (pentaerythritol polyglycidyl ether) 또는 소르비를 폴리글리시딜 에테르 (sorbitol polyglycidyl ether)일 수 있고， 더욱 구체적으로， 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE)일 수 있다.
본 발명의 가교화된 히알루론산 유도체 매트릭스의 복합점도는 1 Hz
(25°C)에서 10 내지 500,000 Pa. s이다 (Rotational Rheometer (TA instrument
Ltd. , DHR-1), Temperature: 25°C). 또한 상기 가교화된 히알루론산 유도체 매트릭스는 자연상태의 히알루론산보다수분 흡수능력이 높고 (도 3) 팽윤도가크다는 장점을 갖는다. 구체적으로， 겔 상태의 가교 히알루론산 유도체 매트릭스의 팽윤도가 30OT 내지 1 , 500%이고， 건조 분말 (105 °C , 6시간)의 경우에는 팽윤도가 300%내지 75 , 000%이다.
더욱이， 상기 가교화 히알루론산 유도체 매트릭스는 본 발명 특유의 합성 조건에 따라 가교화함으로 인해 히알루론산 간의 분자결합이 늘어나 점탄성이 커지며 (도 2)， 생체 조직에 대한 적절한 부착성을 가지고 있다， 또한 가교화된 부분은 체내의 히알루론산 분해 효소에 의해 절단되지 않으므로 체내에서 향상된 안정성을 갖추고 있으면서도， 독성에 대한 위험도가 거의 없다는 특징을 갖는다. 또한 지혈 작용을 완료하고 난 이후에는 환부에 일정시간 동안 물리적인 장벽을 형성할 수 있다.
상기와 같은 특징으로 인해， 본 발명에 따른 조성물은 수술출혈 부위， 외상 출혈 부위 등을 포함하여 출혈 부위에 지혈 효과를 제공하기 위해 특히 유용하여 , 의료 용도， 구체적으로는 외과용 수술 시 등과 같이 다양한 출혈이 발생하는 경우 이를 지혈하는 용 ^로 쉽고 편리하게 사용될 수 있다. '
또 다른 하나의 양태로서， 본 발명은 상기 가교화 하알루론산 유도체 매트릭스를 포함하는 지혈 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로， 상기 제조방법은 i ) 염기성 수용액에 용해된 히알루론산과 에폭사이드 가교제를 반웅시켜 가교화 히알루론산 유도체를 제조하는 단계 ; 및 Π ) 상기 가교화 히알루론산 유도체를 분쇄하여 적절한 크기로 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
바람직하게， 본 발명에 따른 상기 히알루론산 유도체 제조 방법에 있어서， 히알루론산 (hyaluronic acid; HA)에 2 개 이상의 에폭시기를 포함하는 에폭사이드 가교제를 반웅시켜 얻어진 반웅물을 분쇄하여 제조된 히알루론산유도체를 제조한다.
본 발명의 제조방법에는, 히알루론산 (HA) 또는 이의 염을 사용할 수 있으며， 상기 염은 히알루론산 나트륨， 히알루론산 칼륨， 히알루론산 칼슘， 히알루론산 마그네슘， 히알루론산 아연， 히알루론산 코발트 및 히알루론산 테트라부틸암모늄으로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 하나 이상을 포함한다. 상기 제조방법에서, i) 단계에서 히알루론산의 가교반웅을 위한 이온화를 위하여 사용되는 염기성 수용액은 NaOH, K0H, 암모니아 수용액 등이 사용될 수 있다. 또한， 염기성 수용액에 용해된 히알루론산의 농도는 50 -내지 200 mg/mL이 바람직하며， 이러한 염기성수용액에 용해된 히알루론산의 농도에 따라 에폭사이드 가교제 (예를 들어 BDDE)의 가교비율이 달라진다. 일예로， 염기성 수용액에 용해된 히알루론산의 농도가 20 mg/mL인 경우， 에폭사이드 가교제로서 BDDE 투입량은 2 % 내지 50 % (히알루론산이 용해된 염기성 수용액 무게에 대한 에폭사이드 가교제의 부피 비율 (v/w))이며， 염기성 수용액에 용해된 히알루론산의 농도가 200 mg/mL인 경우, BDDE 투입량은 0.01 % 내지 5 % (히알루론산이 용해된 염기성 수용액 무게에ᅵ 대한 에폭사이드 가교제의 부피 비율 (v/w))이다. 또한， i) 단계의 반응 온도는 4 내지 80, 반웅 시간은 12 시간 내지 48 시간, 그리고 반웅 압력은 0.5 기압 내자 2 기압， 바람직하게는 상압이다.
상기 i) 단계의 에폭사이드 가교제는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 1，6-핵산디올디글리시딜 에테르 (1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜 디글리시딜 에테르 (poly (propylene glycol) diglycidyl ether), 폴리테드라메틸렌글리콜 디글리시딜 에테르 (poly(tetramethylene glycol) diglycidyl ether) , 네오펜틸 글리콜 디글리시딜 에테르 (neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세를 폴라글리시딜 에테르 (polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤 폴리글리시딜 에테르 (diglycerol polyglycidyl ether), 글리세를 폴리글리시딜 에테르 (glycerol polyglycidyl ether); 트리메틸프로판 폴리글리시딜 에테르 (trimethylpropane polyglycidyl ether) , 1， 2- (비스 (2， 3-에폭시프로폭시)에틸렌 ( 1， 2-(bi s (2， 3-epoxypropoxy)ethylene ), 펜타에리스리를 폴리글리시딜 에테르 (pentaerythritol polyglycidyl ether) 또는 소르비를 폴리글리시딜 에테르 (sorbitol polyglycidyl ether)로부터 선택될 수 있으며， 더욱 구체적으로는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE)를 사용할 수 있다.
추가적인 일 양태로서，상기 i)단계에서 제조된 히알루론산 유도체는 ii) 단계로 도입되기 전에 생리식염수 등을사용하여 세척될 수 있다. 상기 i ) 단계에서 제조된 히알루론산 유도체는 세척 방법 외에도， 당업계에 공지된 방법， 예를 들면 증류 (대기압 또는 감압 하)， 재결정， 컬럼 크로마토그래피， 이온교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피， 친화성 크로마토그래피， 박층 크로마토그래피， 상 분리， 용매 추출 또는 투석에 의하여 분리 및 /또는 정제될 수 있다.
나아가， 상기 Π ) 단계는 i ) 단계에서 제조된 가교된 히알루론산 유도체를 분쇄하여 겔 형태로 제조하는 단계이다. 분쇄 방법은 통상의 분쇄법， 예를 들어 칼날분쇄 또는 압축분쇄 방법에 의해 분쇄될 수 있으며 , 균질한 입자를 위해 최소 3회 이상 진행하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 특히, 상기 히알루론산 유도체의 크기 및 형태는 특별히 제한되지 아니하며， 의학적으로 적용되는 범위에 따라 그 크기 및 형태를 다양화할 수 있는데， 상기 i i ) 단계에서 분쇄된 하이드로겔의 크기는 10 내지 2000μηι, 더욱 구체적으로는 200 μπι 내지 800 μπι이 바람직하지만， 필요에 따라 다른 크기로 분쇄하여 사용할 수도 있다.
상기 i ) 및 i i ) 단계를ᅳ거쳐 제조된 히알루론산 유도체는 고온 고압 조건에서 멸균하여 사용할 수 있다. 따라서， 추가적인 일 양태로서, 본 발명에 따른 상기 제조방법은 Π ) 단계에서 제조된 히알루론산 유도체를 멸균하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 히알루론산 유도체 제조 방법에 따라 제조된 하이드로겔의 복합점도는 1 Hz (25°C)에서 10 내지 500 , 000 Pa. s이며 , 팽윤도는 200%내지
1 , 500%이다. 또한상기 히알루론산 유도체가 분말 상태인 경우에는 팽윤도가 75 , 000%에 이른다.
또 다른 양태로서， 본 발명은 상기 본 발명에 따른 지혈용 조성물 및 약학적으로 허용되는 희석제를 포함하는 지혈용 키트에 관한 것이다.
구체적으로， 본 발명에 따른 지혈용 키트는 상기 히알루론산 유도체를 포함하는 지혈용 조성물과 함께 웅고유도제를 포함하는 희석제를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 지혈용 키트에는 상기 히알루론산 유도체를 포함하는 지혈용 조성물 ： 웅고유도제를 포함하는 희석제가 2 : 8 내지 9 : 1의 중량 비율로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 키트에 사용되는 희석제에 포함되는 웅고유도제는 혈액의 웅고를 유도하는 물질로서， 예를 들어， 트름빈， 뱀독， 혈소판 활성화제， 트롬빈 수용체 활성화 펩티드， 피브리노겐 침전제， 아프로티닌 및 제 8인자로 이루어진 군에서부터 선택되는 하나 이상의 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 트롬빈이다. 트름빈은 인간에 사용하기 적합한 (즉， 제약상 허용되는) 임의의 트롬빈 제제로부터 유도될 수 있다. 트롬빈의 적합한공급원은 인간 및 소 피， 혈장또는 혈청 (면역 거부 반웅이 예상되지. 않는 경우 다른 동물 공급원의 트롬빈이 적용될 수 있다)을 포함하며， 재조합 기원의 트롬빈 (예컨대， 인간 재조합 트롬빈) 및 자가조직 인간 트름빈이 몇몇 적용에 바람직할 수 있으며， 이는 다른 웅고유도제의 경우에도 마찬가지로 적용된다.
제약상 허용되는 회석제는 사용-준비된 조성물에서 바람직한 최종-농도를 성취할 수 있는 양으로 사용된다. 이러한. 웅고유도제를 포함하는 회석제는 상기 한 웅고유도제 외에도 기타 유용한 성분， 예컨대 이온， 완층액， 부형제， 안정화제 등을 함유할 수 있다. 바람직한 염은 NaCl 및 /또는 CaCl2이며, 바람직한 안정화제는 글리신이며, 모두 트롬빈을 비롯한 웅고유도제를 위해 적용되는 일반적인 양 및 농도로 사용된다 (예컨대， 0.5 내지 1.5 % NaCl (예컨대， 0.9 %)및 /또는 20내지 80 mM CaCl2(예컨대， 40 mM) ) . 추가 실시태양에서， 희석제는 또한 재구성된 건조 조성물의 pH , 바람직하게는 3.0 내지 10.0의 pH에서， 보다 바람직하게는 6.5 내지 8.5의 pH에서 완충하도록 완층액 또는 완층, 시스템을 포함할 수 있다. 예컨대， 상기 희석제는 주사용수， 및 -서로 독립적으로 - 100내지 10 , 000 IU/바이알 트름빈 (바람직하게는 1 , 000 내지 5 , 000 IU/바이알)， 50 내지 200 mM의 NaCl (바람직하게는 100내지 200 mM) , 10내지 80 mM CaCl2 (바람직하게는 30내지 50 mM) 및 5내지 100 mg/mL글리신 (바람직하게는 5내지 20 mg/mL)을 포함할 수 있다. 구체적인 일 양태로서， 상기 응고유도제를 포함하는 희석제는 수용액과 웅고유도제, NaCl , CaCl2 , 알부민 및' 글리신으로 구성된 군에서 선택된 물질이 별도로 분리되어 (예를 들어 동결건조되어 바이알에 포함된 형태) 키트에 포함될 수 있으며， 사용시에 수용액으로 응고유도제, NaCl , CaCl2 ) 알부민 및 글리신으로 구성된 군에서 선택된 물질을 용해시켜 사용할 수 있다.
또 다른 실시태양에서 웅고유도제를 포함하는 회석제는 아세트산 나트륨을 소량, 구체적으로 1 내지 50 mM, 바람직하게는 10 내지 30 mM을 함유할수 있다. 또한 상기 웅고유도제를 포함하는 희석제는 100 g/1 미만의 만니를, 바람직하게는 50 g/1미만을 함유할 수 있으며， 200 g/ 1미만의 유당， 바람직하게는 100 g/1 미만을 함유할 수 있다. 바람직하게， 상기 웅고유도제를 포함하는 희석제는 아세트산나트륨， 만니를 및 유당을 필수적으로 함유하지 않을 수 있다. 구체적으로， 상기와 같은 범위의 글리신을 포함함으로써， 글리신만으로도 아세트산 나트륨， 만니를 및 유당을 포함하지 않으면서도 트롬빈을 비롯한 웅고유도제가 동결건조케이크 형태를 유지할 수 있으면서 응고유도제의 역가또한 안정화될 수 있다.
바람직한 실시양태에 따르면， 상기 희석제가 웅고유도제로서 트롬빈을 포함하는 경우 바람직하게는 10 내지 10 ,000 I .U. 트름빈 /ml , 특히 250 내지 5,000 I .U. 트롬빈 /ml을 포함한다. 바람직하게는， 이러한 사용 준비된 형태의 지혈용 키트는 10 내지 100,000 국제 단위 (I .U. )의 트롬빈, 보다 바람직하게는 500 내지 20,000 I .U. , 특히 1 ,000 내지 10 ,000 LIL를 함유한다. 바람직한 일 양태에서, 본 발명에 따른 지혈용 키트는 프리필드 시린지 형태일 수 있다. 상기 용어 "프리필드 시린지 "란 주사용 제제를 그대로 시린지 (주사기 )에 일정량 층전하여 제조된 것으로， 사용준비， 즉 사용시 약물의 칭량 및 주사기 내 층전 등이 필요하지 않고 바로 사용가능한 것을 의미한다.
구체적인 일 실시양태에서, 본 발명에 따른 지혈용 키트는 이에 제한되는 것은 아니나， 본 발명에 따른 히알루론산 유도체를 포함하는 지혈 조성물로 충전된 프리필드시린지를 커넥터로 연결하고， 웅고유도제가포함된 희석제가 충전된 주사기를 상기 커넥터의 다른 말단에 연결하여 이를 주입함으로써 가교 히알루론산 유도체 매트릭스를 포함하는 지혈 조성물을 수화시켜 제조될 수 있다. 균질한 생성물 수득을 위해 히알루론산 유도체 -웅고유도제 함유 희석제 주사기 '간에 서로 왕복 주입을 반복할 수 있고， 바람직하게는 5회 이상， 더욱 바람직하게는 10회 정도 왕복하여 제조할 수 있다.
이러한 본 발명에 따른 지혈용 키트는 상기 히알루론산 유도체를 포함하는 지혈 조성물과 웅고유도제로서 트롬빈를 포함하는 희석제를 함께 조합하여 포함함으로써, 트름빈을 단독으로 사용하거나， 종래 팽윤성 및 부착성을 부가하기 위해 젤라틴 매트릭스를 트롬빈—함유 용액과 함께 사용한 플로실 등에 비해 탁월한 지혈 효과를 나타낸다 (도 10 등 참조) .
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 다음의 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나다음의 실시예에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며， 본 발명의 권리범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석하고자 의도하는 것은 아니다. 실시예 1-3. 지혈 조성물을 위한 히알루론산유도체의 제조
A. 가교 히알루론산유도체 매트릭스의 제조
1 g의 히알루론산나트륨을 각각 3개의 반웅기에 준비 한 후， 0.25 N NaOH용액을 이용하여 최종 무게가 10.0 g (실시예 la), 8.3 g (실시예 2a)， 7.1 g (실시예 3a)이 되도록 투입하였다. 완전히 용해된 상기 용액에 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (butanediol diglycidyl ether, BDDE)를 70 uL (실시예 la), 60. uL (실시예 2a)， 50 uL (실시예 3a)를 투입한 후, 흔합하였다. 흔합액을 항은수조에 넣고 30 0C에서 18시간 동안 반웅시킨 후， 완층용액으로 세척하여 미 반응물을 제거해 주었다. 제조된 겔을 압축방식으로 3회 이상 분쇄하여 입자크기를 조절한후, 121 0C에서 15분간 멸균하였다. 제조된 히알루론산 유도체 3.0.g을 5 ml 주사기에 무균 칭량한 후， 127 °C, 2분간 사후 멸균하여 히알루론산 유도체 프리필드시린지를 제조하였다 (실시예 la, 2a, 3a).
B. 희석제의 제조
1 바이알 당 트롬빈 5,000 IU, 글리신， 염화나트륨， 염화칼슘 원료를 투입한후, 적량의 주사용수를 넣어 용해시켰다. 녹인 용섹을 무균 필터하여 바이알에 충진한 후， 동결건조를 진행하였다. 동결건조분말은 출혈 부위에 사용하기 직전 0.9% 생리식염주사액으로 완전히 용해하여 사용한다.
C. 가교 히알루론산 유도체 매트릭스가 포함된 지혈 조성물의 제조
히알루론산 유도체로 층전된 프리필드시린지 (실시예 la, 2a, 3a)를 커넥터로 연결하고， 트롬빈이 포함된 희석제를 이용하여 히알루론산 유도체를 수화시켰다. 균질한 생성물 수득을 위해 히알루론산 유도체-트롬빈 함유 희석제 주사기 간에 실린더를 왕복하면서 적어도 왕복 10 회 흔합을 하여 지혈 조성물을 제조하였다 (실시예 lb, 2b, 3b). 조제된 히알루론산 유도체를 함유한 지혈 조성물의 모습은 도 1에 나타난다. 실시예 4. 히알루론산유도체의 유변학적 특성
실시예 la 내지 3a에서 제조한 히알루론산 유도체와 시판되고 있는 히알루론산 함유 B사의 유착방지제 (비교예 la) , 그리고 G사의 가교히알루론산 필러 (비교예 2a) 및 L사의 가교히알루론산 필러 (비교예 3a)의 유변학적 특성을 규명하기 위해 회전형 레오미터 (Rotat ional rheometer )를 실시하였다. 0. 1 Hz 내지 1 Hz의 진동수 범위에서 복합점도 (Complex Vi scos i ty) 및 tan5 결과값을 도 2에 나타내었다.
도 2및 표 1을 통해， 실시예 la내지 3a은 비교예 la내지 3a에 비해 높은 복합점도 값을 보인다. 이를 통해 본 발명의 히알루론산 유도체 (실시예 la 내지 3a)이 비교예 la 내지 3a보다 우수한 점도를 지니며, 구조적으로 안정성이 높은 구조로 형성되어 있음을 알 수 있다.
【표 1】
Figure imgf000013_0001
실시예 5. 히알루론산유도체의 팽윤도
실시예 la 내지 3a에서 제조한 히알루론산 유도체 3.0 mL에 생리식염수를 100 ml을 첨가한 후， 10분간 교반시켰다. 37°C에서 1시간 방치한 후， 흡수되지 않은 생리식염수를 제거한 후， 히알루론산 유도체에 흡수된 용액의 부피를 확인하였다.
도 3는 실시예 la 내지 3a에서 제조한 히알루론산 유도체의 팽윤도 결과로서， 실시예 la의 팽윤도는 706 %， 실시예 2a의 팽윤도는 607 %, 실시예
3a의 팽윤도는 409 ¾이다. 본 발명의 히알루론산 유도체 (실시예 la 내지 3a)는 자신의 부피의 4 내지 7배 이상에 달하는 수분을 흡수하는 흡수능을 보였다. 실시예 6. 히알루론산유도체 함유지혈 조성물과 비가교 히알루론산 함유 지혈 조성물의 흡수능 비교 비교예 4: l , 000 mg의 히알루론산나트륨을 완층용액에 20중량 %농도로 용해한 후， 이 액 3.0 g을 5 ml 주사기에 칭량하여 127 °C ( 2분간 사후 멸균하였다 (비교예 4a) . 희석제를 이용한 지혈 조성물의 제조과정은 실시예 lb 내지 3b와 동일하게 실시하여 최종 조성물을 제조하였다 (비교예 4b) . 도 4는 실시예 lb 내지 3b에서 제조한 히알루론산 유도체 함유 지혈 조성물과 비교예 4b에서 제조한 조성물의 액체 흡수성을 확인한 결과이다. 흡수성을 확인하기 위해 시험물품 5.0 g을 di sh에 도포한후， 색소가 첨가된 생리식염수를 시험물품 위에 1.0. mL 뿌려 액체가 흡수되는 모습을 관찰하였다.
도 4를 통해， 히알루론산 유도체가 포함된 지혈 조성물인 실시예 lb 내지 3b는 비교예 4b에 비해 액체가 입자 사이로 빠르게 흡수되는 현상이 묘사된다. 실시예 7. 히알루론산유도체가포함된 지혈 조성물의 입도 분석
실시예 2b의 히알루론산 유도체가 포함된 지혈 조성물의 입자크기와 분포도를 확인하기 위해 각 시료 3g을 증류수 15mL로 회석하여 Beckman Coul ter LS Part i cle Si ze Analyzer를 이용하여 0.375 urn에서' 2000 urn사이의 입자를 계수하였다. 그 결과를 도 5a에 나타내었다. 도 5b는 과립 형태의 지혈제인 플로실 ®(Floseal®) (비교예 5)의 입도분석 결과이다.
도 5a 및 b를 통해， 실시예 2b의 평균 입자크기는 638.5um, 비교예
5의 평균 입자크기는 462.8 urn이었으며， 실시예 2b의 지혈 조성물은 비교예 5와 비교하였을 때， 입자분포도가 고르게 나타남을 확인하였다. 실시예 8. 히알루론산유도체의 부착성확인시험
택크 (tack) 값을 측정하기 위하여 비교예 la , 비교예 2a , 비교예 4a, 실시예 la 내지 3a의 각 시료를 레오미터의 Plate에 로딩 ( loading)한 후， 10초 동안 0. 1의 전단속도 (Shear rate)로 회전을 시키고 0. 1腿/3의 속도로 Geometry가 분리될 때의 수직항력 (Normal Force) 값을 측정하였다. 도 6 a 및 b는 각 시료별 GAP (隱)에 따른 수직항력 (N)값을 나타낸 것으로， 이 도면에 나타난 최대 수직항력 (N)을 비교하면 본 발명의 실시예 la 내지 3a가 비교예 la(B사의 유착방지제)， 비교예 2a(G사의 가교히알루론산 필러제품) 및 비교예 4a (비가교히알루론산 액)보다 높은 수직항력 값을 보였다. 즉， 본 발명의 실시예가 비교예보다 높은 부착성을 나타냈다. 실시예 9. 히알루론산유도체의 접착성확인시험
지혈 조성물의 접착성을 확인하기 위하여 비교예 2의 시료 3g을 실시예 2b와동일하게 희석제를 이용하여 조제하였다 (비교예 2b) .
편평한 유리판과 30도 경사의 유리판을 준비한 뒤， 각각의 유리판 위에 비교예 4b , 비교예 2b 및 실시예 2b 시료 약 0.5 mL를 떨어뜨려 5분간 방치한 후， 각 시료의 길이를 측정하였다. 각 시료의 이동거리는 30도 경사 유리판 위의 시료 길이와 편팜한 유리판 위의 시료 길이 차이로 구하였다. 도 7a및 b은 비교예 4b ,비교예 2b및 실시예 2b시료를 편광한유리판 위에 로딩한 모습을 묘사하며， 실시예 2b는 비교예 2b와 비교예 4b에 비해 높은 접착성을 보였다. 실시예 10. 히알루론산유도체가트롬빈 활성에 미치는 영향
트름빈 활성 측정시험은 대한민국 약전 11개정의 트름빈 정량법에 따라 시험하였다. 자세한조작법은 하기와 같다.
트름빈 표준품을 생리식염주사액에 녹여 이 액 l mL중 4.0， 5.0， 6.2 및 7.5단위를 함유하는 4가지 표준액을 만든 후， 각각 0. 10 mL를 시험관에 넣는다. 미리 같은 온도로 유지한 피브리노겐 용액 0.90 mL를 피펫을 써서 넣고 동시에 타이머를 작동시켜 가만히 흔들어 섞으면서 맨 처음 피브린의 웅고가 일어날 때까지의 시간을 측정한다. 4 가지 표준액을 가지고 각각 5회씩 측정하고 그 평균값을 구하였다. 시험물품에 대한 측정은 앞에서와 같은 온도에서 동일한 방법으로 수행한다. 시험물품을 생리식염주사액에 녹이고 1 mL 중 5 단위를 함유하는 용액을 만들어 그 0. 10 mL를 써서 앞의 조작을 5 회 반복하여 웅고시간을 측정하고 평균값을 구한다. 양대수 그래프의 가로축에 단위， 세로축에 웅고시간으로 하여 4 가지 표준액에 의한 웅고시간의 평균값을 그래프 위에 취하여 검량선을 작성한다. 이 검량선을 써서 검액의 웅고시간의 평균값에서 단위수 U를 읽는다.
도 8는 지혈 조성물 제조 시 사용된 희석제와실시예 lb 내지 3b에서 제조한 지혈 조성물의 트롬빈 활성을 비교한 결과이다. 히알루론산 유도체가 포함되지 않은 희석제의 트롬빈 역가와 히알루론산 유도체가 포함된 지혈 조성물의 트롬빈 역가가 유사하였다. 이 결과로 보아， 히알루론산 유도체가 트름빈의 활성에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 실시예 11. 히알루론산유도체가트롬빈 활성에 미치는 영향
지혈 조성물을 제조하는 과정에서 흔합 횟수별 히알루론산 함량과 트름빈 역가 변화를 확인하기 위해 실시예 2a에서 제조한 히알루론산 유도체를 프리필드 시린지에 3.0 g층전한 후， 1 , 000 IU/mL트름빈이 포함된 희석제를 이용하여 히알루론산 유도체를 수화시켰다. 수화과정을 각각 편도 5회， 7회， 10회， 20회 진행한 시료의 트롬빈 역가와 히알루론산 함량 시험 결과는 도 9에 나타난다.
도 9를 통해， 히알루론산 유도체와 희석제 사이의 흔합은 적어도 10회 이상 진행되어야균질한 지혈 조성물을 수득할 수 있음을 확인하였다. 실시예 12. 래트에서의 지혈 효력 확인
SD rat의 간 병변에서의 지혈 효능에 대하여 실시예 2b의 제제를 시험하였다. 동물 모델은 Rat의 중심선 개복을 수행한 후 노출된 간에 메스를 이용하껴 대략 가로 1 cm , 세로 1 cm , 깊이 0.2 cm로 코어 조직을 제거한다. 적용장치 팁을 이용하여 출혈 상처에 대략 1.0 mL의 할당된 시험 물품이 병변에 국소적으로 적용된다. 시험 물품흘 적용한 후 2분에 도포한 시험 물품을 제거하고 1， 2， 5 및 10분에서 출혈 정도를 관찰하였다. 결과는 도 10에 묘사된다.
도 10은 SD rat 간 병변에서 실시예 2b의 지혈능을 확인한 결과이다. 실시예 2b에서 제조한 지혈 조성물이 시간 경과에 따라 혈액을 흡수함이 관찰된다. 2분 경과 후，지혈제를 습윤 거즈로 제거하였을 때，상처 조직에서 지혈된 모습이 관찰된다. 실시예 13. 토끼에서의 지혈 효력 확인
토끼의 비장 병변에서의 지혈 효능을 확인하기 위하여 토끼의 비장에
4 mm 천공을 하여 출혈을 유도한다. 상처에 대략 1.0 mL의 할당된 시험 물품을 병변에 국소 적용한 후， 시험 물품이 적용 부위로의 근접을 돕기 위해 습윤 거즈로 5 초간 손가락 압박을 한다. 습윤 거즈는 2분 후에 제거하고， 시험물품은 5분에 생리식염수를 이용하여 세척하였다. 출혈 정도는 2， 5 및 10분마다 관찰하였고, 그 결과는 도 11a 및 b에 도시된다. 도 11a.및 b를 통해， 실시예 2b에서 제조한 지혈 조성물의 우수한 조직 부착력과 혈액 흡수력을 확인하였다. 2분 경과시 출혈 조직의 혈액으로 포화된 실시예 2b가 관찰되며， 제품 밖으로 출혈이 없이 지혈되었다. 또한 생리식염수를 이용하여 지혈제를 제거한 후에도 재출혈이 없었으며， 혈괴가 형성된 모습이 관찰된다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
가교화된 히알루론산유도체의 매트릭스를 포함하는 지혈 조성물.
【청구항 2]
제 1항에 있어서, 상기 히알루론산 유도체가 10 내지 2000 크기의 입도를 갖는, 지혈 조성물.
【청구항 3】
제 1항에 있어서, 상기 가교화된 히알루론산 유도체의 매트릭스의 복합점도는 1 Hz (250C)에서 10 Pa . s 내지 500 , 000 Pa . s인， 지혈 조성물.
【청구항 4】
게 1항에 있어서， 상기 가교화된 히알루론산 유도체의 매트릭스는 염기성 수용액 내에서 히알루론산과 에폭사이드 가교제를 반웅시켜 제조된 것인， 지혈 조성물.
【청구항 5】
제 1항에 있어서， 상처， 출혈， 손상된 조직, 출혈 조직 및 /또는 골 결손으로 구성된 군에서 선택되는 상해의 치료에 사용하기 위한 것인， 지혈 조성물.
【청구항 6】
i ) 염기성 수용액에 용해된 히알루론산과 에폭사이드 가교제를 반웅시켜 가교화 히알루론산 유도체를 제조하는 단계; 및
i i ) 상기 가교화 히알루론산 유도체를 분쇄하는 단계
를 포함하는， 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 지혈 조성물의 제조방법.
【청구항 7】
제 6항에 있어서, 상기 염기성 수용액에 용해된 히알루론산의 농도는
20 내지 200 mg/mL인， 제조방법 .
【청구항 8】
제 6항에 있어서, 상기 염기성 수용액에 용해된 히알루론산의 농도는 20내지 200 mg/mL이고， 상기 에폭사이드가교제의 투입량이 0.01내지 50%인 제조방법 .
【청구항 9】
제 6항에 있어서， 상기 i i ) 단계에서 제조된 히알루론산 유도체를 멸균하는 단계를 더 포함하는， 제조방법 .
【청구항 10】
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 지혈 조성물 및 웅고유도제를 포함하는 회석제를 포함하는 것을 특징으로 하는 지혈용 키트.
【청구항 11】
제 10항에 있어서， 상기 웅고유도제는 트롬빈， 뱀독， 혈소판 활성화제， 트롬빈 수용체 활성화 펩티드， 피브리노겐 침전제， 아프로티닌 및 제 8인자로 이루어진 군에서부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 지혈용 키트.
【청구항 12】
제 10항에 있어서， 상기 응고유도제를 포함하는 희석제는 10 내지 10 , 000 I .U. /ml의 트롬빈을 포함하는 것인, 키트.
【청구항 13】
제 10항에 있어서， 상기 응고유도제를 포함하는 희석게가 NaCl , CaCl2 및 글리신으로 구성된 군에서 선택되는 물질을 더 함유하는 것인， 키트.
【청구항 14】
제 10항에 있어서， 상기 웅고유도제를 포함하는 희석제가 3.0 내지 10.0의 pH에서 완층액 또는 완층 시스템을 포함하는 키트.
【청구항 15】
제 10항에 있어서, 상기 키트가프리필드 시린지 형태인 키트.
【청구항 16】
거 U 주사기에 게 1항 내지 게 5항 중 어느 한 항에 따른 히알루론산 유도체를 층전하고， 제 2 주사기에 웅고유도제를 포함하는 회석제를 층전한 후， 제 1 및 제 2주사기를서로 커넥터에 의해 연결하는 단계;
게 2 주사기의 웅고유도제를 포함하는 희석제를 커넥터에 의해 제 1 주사기 내로 주입하여 히알루론산유도체와 희석제를 흔합하는 단계;
거 U 주사기 내의 흔합물을 제 2주사기로 재주입하는 단계; 및 상기 재주입 단계를 5회 내지 20회 반복하는 단계를 포함하는， 제 13항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 따른 지혈용 키트의 제조 방법 .
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