KR20210046699A

KR20210046699A - 안정한 액체 트롬빈 조성물

Info

Publication number: KR20210046699A
Application number: KR1020217007474A
Authority: KR
Inventors: 에레즈 일란; 오므리 파인골드; 시반 도론
Original assignee: 옴릭스 바이오파머슈티컬스 리미티드
Priority date: 2018-08-16
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2021-04-28
Also published as: EP3836896A2; CA3108744A1; IL261190A; US20200054720A1; WO2020035848A2; MX2021001827A; US11911448B2; BR112021002705A2; AU2019321775A1; JP2021534171A; JP7387715B2; WO2020035848A3; US20240173388A1; IL280625A; CN112566624A

Abstract

본 발명은 글리세롤로 구성된 안정한 멸균 액체 트롬빈 조성물의 대규모 제조를 위한 방법; 안정한 액체 트롬빈 조성물; 및 지혈 조성물 및 키트를 제공한다. 본 발명은 액체 트롬빈, 글리세롤 및 젤라틴으로 구성된 지혈 조성물을 추가로 제공한다. 글리세롤로 구성된 멸균 액체 트롬빈 조성물의 대규모 생산을 위한 방법이 본 명세서에서 추가로 제공된다.

Description

안정한 액체 트롬빈 조성물

특히, 본 발명은 글리세롤을 포함하는 안정한 액체 트롬빈 조성물, 그의 제조, 및 이를 포함하는 지혈 키트에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 글리세롤을 포함하는 멸균 액체 트롬빈 조성물에 관한 것이다.

출혈의 제어는, 혈액 손실을 최소화하고, 수술후 합병증을 감소시키고, 수술실에서 수술 지속시간을 단축시키기 위해, 특히 외과적 시술에서 본질적이며 중요하다. 트롬빈을 포함하는 지혈 제제가 이용가능하지만, 트롬빈은 트롬빈을 불안정하게 만드는 그의 자가촉매 기능으로 인해 동결되거나 분말 형태로 제공된다. 액체 트롬빈의 몇몇 제제가 현재 알려져 있으며, 예를 들어:

유럽 특허 EP0277096호는 특정 pH에서 안정화 양의 폴리올 및 완충제를 사용하여 실온에서 안정하게 된 트롬빈 제형을 개시한다.

미국 특허 제4696812호는 변성을 방지하기 위해 낮은 수준의 염수 및 글리세롤과 조합된 안정화 양의 항-자가분해 완충제를 사용하여 저장 안정하게 된 트롬빈 용액을 개시한다.

미국 특허 제4965203호는 특정 pH에서 안정화 양의 폴리올 및 완충제를 사용하여 실온에서 안정한 개선된 트롬빈 제형을 개시한다.

미국 특허 출원 공개 제20060270015호는 높은 순도와 높은 비활성(specific activity)을 갖는 트롬빈을 함유하는 안정화된 액체 제형, 및 그러한 제형의 제조 및 사용 방법을 개시한다.

미국 특허 출원 공개 제20140120078호는 가교결합된 하이드로겔, 및 이를 포함하며 가소제(예를 들어, 글리세롤), 및 생활성제, 예를 들어, 트롬빈을 추가로 포함할 수 있는 키트를 개시한다.

액체 트롬빈 제제는 사용 시점에 용해시킨 후에 사용하는 동결건조된 의료 제제로 제조될 수 있다.

액체 형태의 트롬빈을 안정화하기 위한 현재 알려진 조성물 및 방법은 불만족스러우며, 예를 들어 다음을 포함한다: 다양한 비특이적 성분(예를 들어, 알부민과 같은 벌크 담체 단백질, 상이한 안정화 당, 일반적인 프로테아제 억제제 등)의 함유물(inclusion); 트롬빈 활성의 억제제를 갖는 트롬빈의 제형(이는 효율적일 수 있지만 또한 트롬빈을 불활성화하거나 억제하여, 그의 유효성을 감소시킴); 및 저 트롬빈 농도 용액의 제형(이는 더 많은 양의 제형의 투여를 필요로 함).

본 발명은 사용 전에 용매에 용해시키는 추가 단계 없이 안정한 액체 트롬빈 조성물을 용이하게 투여하는 데 대한 충족되지 않은 요구를 충족시킨다는 점에서 동결건조된 제제와 비교하여 유리한 액체 제제를 제공한다. 또한, 본 발명은 저장 안정성 액체 트롬빈 조성물을 용이하고 신속하게 투여하는 데 대한 충족되지 않은 요구를 충족시킨다는 점에서 트롬빈을 포함하는 약학적 동결건조된 조성물과 비교하여 유리한, 액체 트롬빈을 포함하는 즉시 사용가능한 약학적 액체 조성물을 제공한다. 용어 "약학적 액체"는 치료적 또는 의료적 가치가 있는 물질을 포함하는 임의의 액체를 말한다.

소정 태양에서, 본 발명은

a. 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 액체 트롬빈 조성물을 수용하는 용기; 및

b. 젤라틴을 수용하는 용기를 포함하는 지혈 키트를 제공한다.

지혈 키트의 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 약 60 내지 약 100% v/v의 글리세롤, 또는 80% 내지 약 100% v/v의 글리세롤을 포함한다.

지혈 키트의 일부 실시 형태에서, 트롬빈 용액은 약 60 내지 약 100% v/v의 글리세롤, 또는 80% 내지 약 100% v/v의 글리세롤을 포함한다. 지혈 키트의 일 실시 형태에서, 트롬빈 용액은 60% v/v 초과, 65% v/v 초과, 70% v/v 초과, 또는 75% v/v 초과, 예를 들어, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%(이들 사이의 임의의 값 및 범위를 포함함)의 글리세롤을 포함한다.

지혈 키트의 일부 실시 형태에서, 키트는 칼슘을 추가로 포함한다. 지혈 키트의 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 염화나트륨, 만니톨, 알부민 및 아세트산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 지혈 키트의 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 1 내지 약 5,000 IU/ml의 트롬빈을 포함한다. 지혈 키트의 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 약 1 내지 약 2,000, 또는 100 내지 약 2,000 IU/ml의 트롬빈을 포함한다.

지혈 키트의 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 50℃의 온도에서 약 20시간 후에 활성이 적어도 70%이다. 지혈 키트의 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 100℃의 온도에서 약 2분 후에 활성이 적어도 70%이다. 키트는 사용 설명서(instruction for use)를 추가로 포함할 수 있다.

다른 태양에 따르면, 본 발명은 트롬빈, 젤라틴, 및 글리세롤을 포함하는 지혈 조성물을 제공하며, 글리세롤은 중량 기준으로 고형물의 30% 초과의 비이다.

지혈 조성물의 일부 실시 형태에서, 조성물은 칼슘을 추가로 포함한다. 지혈 조성물의 일부 실시 형태에서, 조성물은 염화나트륨, 만니톨, 알부민 및 아세트산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다. 지혈 조성물의 일부 실시 형태에서, 조성물은 1 내지 약 2,500 IU/ml의 트롬빈, 또는 약 100 내지 약 2,000 IU/ml의 트롬빈을 포함한다. 지혈 조성물의 일부 실시 형태에서, 조성물은 지혈을 돕기 위한 국소 사용을 위한 것이다.

추가의 태양에 따르면, 본 발명은 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 멸균 액체 트롬빈 조성물의 대규모 생산을 위한 방법("대규모 생산 방법")을 제공하며, 상기 방법은

a. 트롬빈을 글리세롤 용액과 혼합하여 트롬빈 용액을 제조하여 50% v/v 초과의 글리세롤을 갖는 용액을 수득하는 단계;

b. 수득된 트롬빈 용액을 적어도 약 40℃로 가열하는 단계; 및

c. 트롬빈 용액을, 기공 크기가 약 0.22 μm 이하인 적어도 하나의 필터에 통과시켜 멸균하는 단계를 포함하고,

이로써 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 멸균 액체 트롬빈 조성물을 수득한다.

대규모 생산 방법의 일부 실시 형태에서, 본 방법은 열 불활성화에 의해 수행되는 바이러스 불활성화의 단계를 추가로 포함한다. 대규모 생산 방법의 일부 실시 형태에서, 트롬빈 용액은 약 60 내지 약 100% v/v의 글리세롤, 또는 80% 내지 약 100% v/v의 글리세롤을 포함한다. 본 방법의 일 실시 형태에서, 트롬빈 용액은 60% v/v 초과, 65% v/v 초과, 70% v/v 초과, 또는 75% v/v 초과의 글리세롤, 예를 들어, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 약 100% v/v(이들 사이의 임의의 값 및 범위를 포함함)의 글리세롤을 포함한다.

대규모 생산 방법의 일부 실시 형태에서, 트롬빈 용액은 칼슘을 추가로 포함한다. 대규모 생산 방법의 일부 실시 형태에서, 트롬빈 용액은 염화나트륨, 만니톨, 알부민 및 아세트산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함한다.

대규모 생산 방법의 일부 실시 형태에서, 트롬빈 용액은 트롬빈의 1 내지 약 2,500 IU/ml의 트롬빈, 또는 약 100 내지 약 2,000 IU/ml의 트롬빈을 포함한다. 대규모 생산 방법의 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 50℃의 온도에서 약 20시간 후에 활성이 적어도 70%이다. 대규모 생산 방법의 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 100℃의 온도에서 약 2분 후에 활성이 적어도 70%이다.

또 다른 태양에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득되는, 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 멸균 액체 트롬빈 조성물을 제공한다.

추가 태양에 따르면, 본 발명은 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 멸균 액체 트롬빈 조성물을 제공한다.

멸균 액체 트롬빈 조성물의 일부 실시 형태에서, 조성물은 약 60 내지 약 100% v/v의 글리세롤을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 멸균 액체 트롬빈 조성물은 약 60 내지 약 100% v/v의 글리세롤 또는 80 내지 약 100% v/v의 글리세롤을 포함한다. 멸균 액체 트롬빈 조성물의 일 실시 형태에서, 트롬빈 용액은 60% v/v 초과, 65% v/v 초과, 70% v/v 초과, 또는 75% v/v 초과의 글리세롤, 예를 들어, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% v/v(이들 사이의 임의의 값 및 범위를 포함함)의 글리세롤을 포함한다.

멸균 액체 트롬빈 조성물의 일부 실시 형태에서, 조성물은 칼슘을 추가로 포함한다. 멸균 액체 트롬빈 조성물의 일부 실시 형태에서, 조성물은 염화나트륨, 만니톨, 알부민 및 아세트산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 포함한다. 멸균 액체 트롬빈 조성물의 일부 실시 형태에서, 조성물은 1 내지 약 2,500 IU/ml의 트롬빈, 또는 약 100 내지 약 2,000 IU/ml의 트롬빈을 포함한다. 멸균 액체 트롬빈 조성물의 일부 실시 형태에서, 트롬빈은 약 50℃의 온도에서 약 20시간 후에 활성이 적어도 70%이다. 멸균 액체 트롬빈 조성물의 일부 실시 형태에서, 트롬빈은 약 100℃의 온도에서 약 2분 후에 활성이 적어도 70%이다. 멸균 액체 트롬빈 조성물의 일부 실시 형태에서, 조성물은 젤라틴을 추가로 포함한다.

또 다른 태양에 따르면, 본 발명은 트롬빈, 젤라틴, 및 중량 기준으로 고형물의 30% 초과의 농도 범위의 글리세롤을 포함하는 지혈 조성물을 제공한다.

또 다른 태양에 따르면, 본 발명은 트롬빈 및 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 실란트 제형(sealant formulation)을 제공한다. 실란트 제형의 일부 실시 형태에서, 제형은 약 60 내지 약 100% v/v의 글리세롤 또는 80 내지 약 100% v/v의 글리세롤을 포함한다. 실란트 제형의 일 실시 형태에서, 제형은 60% v/v 초과, 65% v/v 초과, 70% v/v 초과, 또는 75% v/v 초과, 예를 들어, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%(이들 사이의 임의의 값 및 범위를 포함함)의 글리세롤을 포함한다.

실란트 제형의 일부 실시 형태에서, 제형은 약 60 내지 약 100% v/v의 글리세롤 또는 80 내지 약 100% v/v의 글리세롤을 포함한다. 실란트 제형의 일부 실시 형태에서, 제형은 칼슘을 추가로 포함한다. 실란트 제형의 일부 실시 형태에서, 제형은 1 내지 약 2,500 IU/ml의 트롬빈, 또는 약 100 내지 약 2,000 IU/ml의 트롬빈을 포함한다.

또 다른 태양에 따르면, 본 발명은 트롬빈, 젤라틴, 및 중량 기준으로 고형물의 30% 초과의 농도 범위의 글리세롤을 포함하는 멸균 지혈 조성물을 제공한다. 멸균 지혈 조성물의 일 실시 형태에서, 조성물은 60% v/v 초과, 65% v/v 초과, 70% v/v 초과, 또는 75% v/v 초과의 글리세롤, 예를 들어, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% v/v(이들 사이의 임의의 값 및 범위를 포함함)의 글리세롤을 포함한다.

또 다른 태양에 따르면, 본 발명은 트롬빈 및 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 멸균 실란트 제형을 제공한다.

멸균 실란트 제형의 일부 실시 형태에서, 제형은 65 내지 약 100%, 65 내지 약 100% v/v의 글리세롤, 또는 80 내지 약 100% v/v의 글리세롤을 포함한다. 멸균 실란트 제형의 일 실시 형태에서, 제형은 60% v/v 초과, 65% v/v 초과, 70% v/v 초과, 또는 75% v/v 초과의 글리세롤, 예를 들어, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 약 100% v/v의 글리세롤(이들 사이의 임의의 값 및 범위를 포함함)을 포함한다.

실란트 제형의 일부 실시 형태에서, 제형은 칼슘을 추가로 포함한다. 실란트 제형의 일부 실시 형태에서, 제형은 1 내지 약 2,500 IU/ml의 트롬빈, 또는 약 100 내지 약 2,000 IU/ml의 트롬빈을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 실란트 제형은 피브리노겐 성분을 포함한다.

본 명세서에 제공된 키트, 조성물, 제형 및 방법의 임의의 태양에서의 일부 실시 형태에서, 키트, 조성물, 및/또는 제형은 각각 적어도 2성분 키트, 2성분 조성물, 및 2성분 제형이다. 2성분 조성물 및 2성분 제형의 임의의 태양의 일부 실시 형태에서, 성분들 중 하나는 피브리노겐을 포함한다.

예를 들어, 키트는 어플리케이터 장치를 사용하여 적용될 수 있으며, 적어도 2성분 물질(예를 들어, 에비셀(EVICEL)과 같은 피브린 실란트)의 수 회의 순차적 분사를 투여하는 데 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 어플리케이터 장치는 장치를 이동시키면서 조직의 2D 표면 상에 혼합된 성분들의 고정 용량을 다수회 분사하는 것을 가능하게 한다. 일 실시 형태에서, 어플리케이터는 분사 바늘을 가지며, 선택적으로 분사 바늘은 투여하는 사람이 분사 표면으로부터 장치를 위로 들어올릴 필요 없이, 분사가 완료된 후에 환자의 피부로부터 자동으로 후퇴된다. 일 실시 형태에서, 키트는 이의 임의의 태양의 임의의 실시 형태에서 피브리노겐 성분 및 트롬빈 성분을 갖는 피브린 실란트의 투여에 사용될 수 있다.

본 명세서 및 당업계에서 사용되는 바와 같이, 용어 "피브리노겐"은 혈전 매트릭스의 전구체 단백질을 지칭한다. 피브리노겐은 분자량이 약 340,000 달톤이고, 이황화결합에 의해 함께 연결된 3쌍의 동일하지 않은 폴리펩티드 사슬, Aα, Bβ 및 γ로 이루어진다. 전형적으로, 피브리노겐은 3결절형(trinodular) 구조: 초나선형(supercoiled) α-나선에 의해 연결된 중심 E 구형 도메인과 2개의 동일한 D 말단 구형 도메인을 갖는다.

일부 실시 형태에서, 피브리노겐은 피브리노겐 농축물이거나 그로부터 기원한다. 일부 실시 형태에서, 피브리노겐은 혈액 유래 피브리노겐 농축물이다.

본 명세서 전반에 걸쳐, 용어 "~로부터 기원한다", 또는 "~로부터 유래된"은 상호 교환적으로 사용되며, 자연 발생 분자, 재조합 분자, 가공된 분자, 정제되지 않은 분자 또는 정제된 분자(예를 들어, 관련 단백질)를 포함할 수 있는, 관련 성분의 기원 또는 공급원을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 피브리노겐 농축물은 동결침전된 피브리노겐을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 피브리노겐은 동결침전된 피브리노겐으로부터 기원한다. 일부 실시 형태에서, 피브리노겐 용액 성분 및 트롬빈 용액은 1:2 내지 2:1, 예를 들어, 약 1:1의 비(v/v)로 조합된다.

일부 실시 형태에서, 동결침전된 피브리노겐은 혈장의 생물학적 활성 성분(BAC)으로 간주된다. 일부 실시 형태에서, BAC는 바이러스 불활성화된다. 일부 실시 형태에서, BAC는 트라넥삼산과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 항피브린용해제를 포함하는 생물학적 활성 성분이다. 트라넥삼산을 포함하는 비제한적인 예시적인 BAC는 "퀵실"(Quixil)(이스라엘 소재의 옴릭스(Omrix))이라는 명칭의 제품이다. 이는 제2 세대 BAC로 간주되며 당업계에서 "BAC2"로 지칭된다. BAC2 제조 동안, 플라스미노겐(피브리노겐 및 피브린을 분해하는 플라스민의 효소 전구체)이 제거된다. BAC의 비제한적인 제조 경로는 미국 특허 제6,121,232호 및/또는 국제특허 공개 WO 1998033533호에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 참고로 포함된다. 일부 실시 형태에서, BAC 조성물은 하나 이상의 항피브린용해제(예를 들어, 트라넥삼산) 및 아르기닌 하이드로클로라이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, BAC 내의 트라넥삼산과 같은 항피브린용해제의 농도는 약 80 내지 약 110 mg/ml의 범위이다. 일부 실시 형태에서, BAC2는 그 내용이 본 명세서에 참고로 포함된 유럽 특허 제534178호의 개시 내용에 따라 제조된다. 예를 들어, BAC2는 농축된 동결침전물로부터 제조될 수 있으며, 이는 그 후에 예를 들어 용매 세제 처리 및 저온멸균(pasteurization)에 의한 바이러스 불활성화를 겪는다. 동결침전물로부터 플라스민/플라스미노겐의 제거를 고려하여, 트라넥삼산, 아프로티닌 등과 같은 항피브린용해제를 첨가할 필요가 없다. 따라서, 일부 실시 형태에서, BAC2는 트라넥삼산을 포함하지 않는다.

서지셀(SURGICEL)(등록상표)과 같은 몇몇 지혈 재료가 개시된 키트 및/또는 트롬빈 제형과 조합하여 효과적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 개시된 트롬빈 용액을 사용 전에 젤라틴, 예를 들어 유동성 젤라틴 매트릭스에 첨가할 수 있다. 일단 젤라틴이 트롬빈 제형과 혼합되면, 출혈 부위 또는 조직으로 제품을 전달하기 위해, 또는 모세혈관 및 소정맥으로부터 혈액 삼출 및 경미한 출혈이 생길 때마다 지혈 및 출혈 제어에 대한 보조구(aid)로서 주사기에 적절한 어플리케이터 팁을 부착할 수 있다.

용어 "조직"은 특정 기능을 수행하는 데 있어서 통합된 세포들 및/또는 세포 구성요소들의 연합을 지칭한다. 조직 내의 세포들은 모두 하나의 유형일 수 있거나 또는 하나 초과의 유형일 수 있다. 조직은 살아있는 유기체의 조직과 유사한 방식으로 기능하도록 세포가 성장되는 인공 조직일 수 있다. 조직은 인체 조직 또는 동물 조직일 수 있다.

2성분 조성물은 2가지 성분을 (예를 들어, 혼합 시) 조합함으로써 조성물을 수득하고, 동시에 또는 그 후에, 수득된 조성물을 출혈 감소 또는 방지가 필요한 부위에 직접 적용함으로써 제공될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조성물의 적용은 처리될 영역 상에 조성물을 분무 또는 적하함으로써 보조된다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어 및/또는 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 형태의 수행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 재료가 하기에 기재되어 있다. 상충되는 경우, 정의를 비롯한 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 반드시 제한하고자 하는 것은 아니다.

도 1은 50℃에서 24시간(h) 동안 트롬빈 활성에 대한 다양한 글리세롤 농도의 영향을 나타내는 그래프를 도시한다. 트롬빈을 재증류수(DDW) 중 몇몇 상이한 농도의 글리세롤 중에 현탁시키고 50℃에 24시간 동안 두었다. 1, 4.5, 8 및 24시간에 활성을 측정하였다. 점이 있는 회색 실선: 0% 글리세롤; 흑색 실선: 50% v/v 글리세롤; 회색 점선: 60% v/v 글리세롤; 점선: 80% v/v 글리세롤; n=4.
도 2a 및 도 2b는 25℃ 및 4℃에서 트롬빈 활성에 대한 다양한 글리세롤 농도의 영향을 나타내는 막대 그래프를 도시한다. 트롬빈을 DDW 중 몇몇 상이한 농도의 글리세롤 중에 현탁시키고, 25℃에서 6개월 동안 그리고 4℃에 12개월 동안 두었다. 도 2a는 25℃에서 3개월 및 6개월에 측정된 활성을 나타낸다. 도 2b는 4℃에서 12개월에 측정된 활성을 나타낸다. 여기서 그리고 하기에 제시된 막대 그래프에서 상단의 바는 표준 편차를 나타낸다.
도 3은 100℃에서 (2분 후 측정된) 트롬빈 활성에 대한 다양한 글리세롤 농도의 영향을 나타내는 그래프를 도시한다. 트롬빈을 DDW 중 몇몇 상이한 농도의 글리세롤 중에 현탁시키고, 100℃에 두었다. 2분 후에 활성을 측정하였다. 점이 있는 흑색 실선: 50% v/v 글리세롤; 회색 실선: 60% v/v 글리세롤; 점선: 80% v/v 글리세롤; n=2.
도 4는 돼지 펀치 생검 모델(porcine punch biopsy model)에서 생체 내 트롬빈 활성에 대한 다양한 글리세롤 농도의 영향을 나타내는 막대 그래프를 도시한다. 트롬빈을 DDW 중 지시된 농도의 글리세롤 중에 현탁시키고, 젤라틴 키트에서 재구성된 트롬빈 대신에 사용하여, 다양한 글리세롤 농도에서 트롬빈을 포함하는 젤라틴 페이스트를 제조하였다. 출혈을 정지시키는 데 필요한 탐포네이드(tamponade)의 수에 따라 트롬빈 활성을 측정하였으며; 왼쪽에서부터, 0% v/v의 글리세롤 중 트롬빈을 갖는 젤라틴 페이스트; 50% v/v의 글리세롤 중 트롬빈을 갖는 젤라틴 페이스트; 60% v/v의 글리세롤 중 트롬빈을 갖는 젤라틴 페이스트; 및 100% v/v의 글리세롤 중 트롬빈을 갖는 젤라틴 페이스트; n=5.

트롬빈은 출혈을 제어하기 위해 지혈 재료로서 널리 사용되지만; 자가촉매 효소이며 따라서 그의 액체 형태에서는 불안정하다. 트롬빈 농도가 증가함에 따라 그리고/또는 온도가 상승함에 따라 액체 트롬빈 안정성의 지속기간이 감소된다. 그 결과, 트롬빈의 시판 제제는 분말 또는 냉동 액체로 존재한다. 이는, 분말 트롬빈은 재구성해야만 하고 냉동 트롬빈은 해동해야만 하기 때문에 준비 시간이 비교적 긴 것; 저온에서 운송해야 하기 때문에 운송이 제한되는 것뿐만 아니라; 준비하는 데 분말 트롬빈의 재구성이 필요로 한 경우 멸균성이 잠재적으로 손상되는 것을 포함하는 일부 단점을 갖는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "분말"은 전형적으로 0.1 내지 1000 마이크로미터 범위 내의 작은 크기를 특징으로 하는 복수의 고체 입자를 지칭한다.

용어 "고체"는 실온(예를 들어, 25℃) 및 대기압(760 mmHg)에서의 화합물 또는 조성물의 상태, 즉, 저장 동안 그의 형태를 유지하는 높은 주도(consistency)의 화합물 또는 조성물의 상태를 특징으로 한다. 본 출원에서 이러한 용어는 또한 비-유체 입자, 또는 용해된 물질에 관한 것이다. "액체" 화합물 및 조성물과는 대조적으로, 고체는 자체 중량 하에서는 유동하지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "트롬빈"은 프로트롬빈(인자 II)의 단백질 분해 절단에 의해 생성되는 활성화된 효소를 나타낸다. 트롬빈은 당업계에 공지된 다양한 제조 방법에 의해 생성될 수 있으며, 재조합 트롬빈 및 혈장 유래 트롬빈을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 인간 트롬빈은 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 295개의 아미노산의 단백질이다. 인간 및 비-인간(예를 들어, 소) 트롬빈 둘 모두가 본 발명의 범주 내에서 사용될 수 있다.

본 발명에 사용되는 트롬빈은 재조합 세균 및/또는 세포(문헌[Vu et al., 2016, J. Viet. Env. 8(1):21-25), 전혈(몇몇 공여물로부터 풀링되거나 그렇지 않음) 및/또는 혈액 분획(몇몇 공여물, 예를 들어 혈장으로부터 풀링될 수 있음)을 포함하지만 이로 한정되지 않는 하나 또는 수 개의 공급원으로부터의 것일 수 있다. 트롬빈은 존슨 앤드 존슨(Johnson and Johnson), 박스터(Baxter) 및 시에스엘 베링(CSL Behring)과 같은 제조업체에 의해 독립형 제품, 예를 들어 에비트롬(EVITHROM)(등록상표)으로서, 또는 제품, 예를 들어 에비셀(등록상표), 티셀(TISEEL)(등록상표), 베리플라스트(Beriplast)(등록상표) 등의 구성요소로서 입수가능하다.

본 발명자들은 놀랍게도 트롬빈 용액 중 50% v/v 초과의 높은 농도의 글리세롤이, 예를 들어, 승온에서, 트롬빈 효소의 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라 생체 내에서 트롬빈 활성을 향상시킨다는 것을 알아내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 글리세롤 없이 제조된 트롬빈은 50℃에서 24시간 후에 약 90%의 활성을 상실하지만, 50% 이상의 글리세롤을 갖는 트롬빈의 활성은 완전히 유지된다. 부가적으로, 도 3은, 보통은 효소 활성을 완전히 감소시키는 100℃에서의 2분 후에, 50% 글리세롤의 경우 75%의 활성이 유지되고 60% 또는 80% 글리세롤의 경우 적어도 90%의 활성이 유지됨을 보여준다. 승온에서의 이러한 증가된 안정성으로 인해, 냉장(refrigeration)이 필요 없이 액체 상태로 운송, 취급, 및 보관하는 것과 같이, 이전에는 가능하지 않았던 방식으로 액체 트롬빈을 사용할 수 있다. 또한, 하기 실시예 3은, 일반적으로 필터 멸균에는 너무 점성인 것으로 여겨지는 글리세롤이 40℃ 및 50℃의 온도에서 효과적으로 여과될 수 있음을 입증한다. 상기 결과들을 조합하면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 여과의 온도를 상승시킴으로써 높은 글리세롤 농도(예를 들어, 60 중량% 초과)를 함유하는 용액에서 액체 트롬빈의 여과에 의한 멸균이 가능하다.

용어 "필터" 및 이의 임의의 문법적 어형 변화(inflection)는 유체, 예를 들어 액체 스트림 내의 입자의 통과를 가로막거나, 저지하거나, 지연시키거나, 또는 방해하는 것을 의미한다.

그러나, 잠재적인 문제는 글리세롤과 같은 점성 매질이 트롬빈과 그의 목표 분자의 상호작용을 방해할 수 있고, 따라서 형성된 혈전의 형성, 동역학 또는 질에 영향을 미칠 수 있다는 점이다. 이에 기초하여, 당업자는 트롬빈을 높은 글리세롤 농도와 조합하는 것을 고려하지 않을 것이다.

그럼에도 불구하고, 본 발명자들에 의해 놀랍게도 밝혀진 바와 같이, 생체 내에서는 상황이 상이하다. 도 3은 글리세롤을 포함하는 액체 트롬빈 용액으로 제조된 젤라틴의 생체 내 활성을 나타낸다. 젤라틴 키트(서지플로(Surgiflo)(등록상표))는 젤라틴 및 트롬빈 분말을 포함하는데, 이들은 출혈 부위 내에/상에 적용하기 직전에 함께 혼합된다. 트롬빈은 분말 상태로 제공되기 때문에, 의료인에 의한 재구성을 필요로 한다.

상기에 논의된 점도 문제와는 대조적으로, 글리세롤로 재구성된 트롬빈에서의 증가된 글리세롤 농도는 도 4에 도시된 바와 같이 출혈을 감소시키는 제형의 향상된 능력에 상응하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 본 발명의 액체 트롬빈 제형의 중요한 이점은 재구성 단계를 피함으로써, 의료인에게 번거로움을 방지하고 시간을 절약할 뿐만 아니라 오염 위험성을 최소화한다는 것이다.

용어 "액체 트롬빈 조성물", "액체 트롬빈 용액", "트롬빈 용액" 및 "액체 트롬빈 제형"은 본 명세서 전반에 걸쳐 상호 교환적으로 사용되며, 트롬빈을 포함하는 액체 조성물을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, "액체 트롬빈 조성물"은 수용액이며, 즉 1 내지 50% 미만의 물(% v/v)을 포함한다.

용어 "액체"는, 유동할 수 있으며 고정된 형상을 갖지 않고 고체 또는 기체가 아닌 물질을 지칭한다.

결과적으로, 본 발명의 안정한 액체 트롬빈 조성물은 지혈 재료로서의 분말형 또는 냉동 트롬빈을 대체하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 액체 트롬빈은 독립형 트롬빈 용액, 예를 들어 안정한 멸균 독립형 트롬빈 용액으로서 제공될 수 있거나, 또는 키트의 일부로서, 예컨대, 서피글로(Surfiglo)(등록상표) 키트 또는 피브린 실란트 키트에서 이들 키트 내의 트롬빈 구성요소 대신에 제공될 수 있다.

따라서, 본 발명은 일 태양에서, 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 액체 트롬빈 조성물을 수용하는 용기; 및 젤라틴을 수용하는 용기를 포함하는 지혈 키트를 제공한다. 본 발명은 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 저장 안정성 멸균 액체 트롬빈 조성물을 수용하는 용기; 및 젤라틴을 수용하는 용기를 포함하는 지혈 키트를 또한 제공한다.

용어 "저장 안정성"은 사전-선택된 저장 온도, 제형의 사전-선택된 물리적 상태(예를 들어, 유체/액체)를 포함하는 사전-선택된 저장 조건(이하 참조) 하에서 안정한, 선택적으로 용기, 예를 들어 바이알 내에 존재하는, 제형, 조성물을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 안정성은 사전-선택된 저장 조건 하에서, 예를 들어 제형이 액체 형태일 때, 예를 들어 제형 내의 가시적 응집 및/또는 피브린 혈전의 부재를 시험함으로써, 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 안정한 실란트 제형을 언급할 때, 이는 사용 시에 제형의 저장 조건과 무관하게 효과적인 응고 시간을 가지며, 예를 들어, 실란트 제형은 실온(예를 들어 8 내지 40 ℃)에서 저장되었든 더 낮은 온도(예를 들어 8 ℃ 미만)에서 저장되었든 관계없이 본질적으로 동일한 기간에 응고되는 것으로 이해되어야 한다.

일부 실시 형태에서, 사전-선택된 저장 조건은 실온(예를 들어, 10 내지 30℃)에서의 저장을 포함하고 실란트 제형은 5분 이상 동안, 때때로 15분 이상 동안, 또는 1시간 이상 동안, 1일 이상, 2, 3, 4, 5, 6 또는 심지어 7일 이상 동안, 때때로 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 심지어 24개월(이들 사이의 임의의 값 및 범위를 포함함) 이상 동안 안정하다.

일부 실시 형태에서, 사전-선택된 저장 조건은 저온(예를 들어, 2 내지 10℃)에서의 저장을 포함하고 실란트 제형은 5분 이상 동안, 때때로 15분 이상 동안, 또는 1시간 이상 동안, 1일 이상, 2, 3, 4, 5, 6 또는 심지어 7일 이상 동안, 때때로 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 심지어 24개월(이들 사이의 임의의 값 및 범위를 포함함) 이상 동안 안정하다.

용어 "용기"는 예를 들어 액체를 수용할 수 있는, 통 또는 바이알과 같은 임의의 일반적인 구조체를 지칭할 수 있다.

일 실시 형태에서, 이러한 키트는 실온에서, 예를 들어 8 내지 40℃ 범위의 온도에서 저장된다.

다른 태양에서, 본 발명은, 10% v/v 초과, 15% v/v 초과, 20% v/v 초과, 25% v/v 초과, 30% v/v 초과, 35% v/v 초과, 40% v/v 초과, 45% v/v 초과, 50% v/v 초과, 55% v/v 초과, 60% v/v 초과, 65% v/v 초과, 70% v/v 초과, 75% v/v 초과, 80% v/v 초과, 85% v/v 초과, 또는 90% v/v 초과의 글리세롤, 예를 들어 60% 내지 100%, 또는 80% 내지 100% v/v의 글리세롤을 포함하는 액체 트롬빈 조성물을 수용하는 용기; 및 젤라틴을 수용하는 용기를 포함하는, 2 내지 8 ℃에서 저장하기 위한 지혈 키트를 제공한다.

본 발명의 지혈 키트는, 예를 들어 개방 상처에서 혈류를 감소, 방지 또는 정지시키는 데 사용하기 위한 키트일 수 있으며, 이는 시술 동안, 예를 들어 복강경 수술, 신경외과 수술, 복부 수술, 심혈관 수술, 흉부외과 수술, 두경부 수술, 골반 수술, 및 피부 및 피하 조직 시술과 같은 외과적 시술 동안 혈류를 감소, 방지 또는 정지시키기 위해 사용될 수 있다. 키트는 피부로부터 또는 내부 기관에서 혈류를 감소시키거나 방지하는 데 사용될 수 있다.

용어 "액체 용액"은 또한 점성 용액을 포함한다. 용어 "점성 용액"은, 증가된 유동 저항성을 갖지만 유동할 수 있으며 전형적으로 그러나 비배타적으로 점도가 약 1 센티푸아즈 단위 초과 약 10,000 센티푸아즈 단위 미만일 수 있는 용액을 지칭한다.

키트를 위한 액체 트롬빈 조성물은 멸균 상태일 수 있으며,

b. 수득된 트롬빈 용액을 적어도 40℃로 가열하는 단계; 및

c. 상기 트롬빈 용액을, 기공 크기가 0.22 μm 이하인 적어도 하나의 필터에 통과시켜 멸균하는 단계를 포함하고,

이로써 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 액체 멸균 트롬빈 용액을 수득하는 대규모 생산 방법에 의해 수득될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대규모"는, 전형적으로 약 400 IU 이상의 트롬빈을 포함하는 1 리터 이상의 용액이 생성되는 공정에 관한 것이다.

본 발명을 위한 젤라틴 공급원은 합성 젤라틴(예를 들어, 재조합 젤라틴)일 수 있거나, 또는 돼지와 같은 동물로부터 유래될 수 있다. 젤라틴 공급원은 멸균 상태일 수 있고, 페이스트, 분말 또는 스펀지와 같은 상이한 형태로 제공될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "페이스트"는 실온 주위의 하나 이상의 온도에서의 조성물의 주도와 관련되며, 고체 입자의 유체 혼합물을 지칭할 수 있다.

본 발명에 사용되는 젤라틴은 그의 사용 전에 가교결합될 수 있다. 젤라틴의 가교결합은 당업계에 개시된 임의의 수의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 젤라틴은 3시간 동안 150℃로 가열함으로써 가교결합될 수 있다(문헌[Nagura et al., 2002, Polymer Journal 34: 761-766]).

일부 실시 형태에서, 젤라틴은 용매에 용해되어 젤라틴 페이스트를 형성한다. 일부 실시 형태에서, 젤라틴 페이스트는 글리세롤을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 젤라틴 페이스트는 중량 기준으로 고형물의 30% 초과의 글리세롤을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 멸균 상태이다.

일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 약 55% v/v 이상, 약 60% v/v 이상, 약 65% v/v 이상, 약 70% v/v 이상, 약 75% v/v 이상, 약 80% v/v 이상, 약 85% v/v 이상, 약 90% v/v 이상, 또는 약 95% v/v 이상(이들 사이의 임의의 값 및 범위를 포함함)의 글리세롤을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 100% v/v의 글리세롤을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 약 50% 내지 약 80% v/v의 글리세롤을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 약 60% 내지 약 80% v/v의 글리세롤을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 약 60% 내지 약 100% v/v의 글리세롤을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 약 70% 내지 약 100% v/v의 글리세롤을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 약 80% 내지 약 100% v/v의 글리세롤을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 (용매 부피 기준으로) 65% v/v 초과, 67% v/v 초과, 또는 70% v/v 초과, 및 약 100% v/v 이하의 글리세롤을 포함한다.

달리 언급되지 않는 한, 글리세롤과 관련하여 "% v/v", 또는 "%"로서의 글리세롤 농도의 정의는 액체 트롬빈 조성물 내의 용매(예를 들어, 물)의 총 부피 중 글리세롤 부피의 백분율에 관련된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "용매"는 그의 물리적 상태를 변화시키지 않으면서 다른 물질을 용해시키거나 분산시키는 재료를 지칭한다.

칼슘은 응고 캐스케이드(clotting cascade)에서 중요한 요소이다. 칼슘은 인자 XIII를 인자 XIIIa로 활성화하는 데 필요하며, 이러한 활성화는 피브린을 가교결합하고 안정화하여 불용성 혈전을 생성한다.

따라서, 일부 실시 형태에서, 개시된 키트 및/또는 이의 실시 형태에서의 조성물은 칼슘을 추가로 포함한다. 본 발명과 함께 사용되는 칼슘은 염, 예를 들어 염화칼슘 염의 형태일 수 있다. 대안적으로, 아세트산칼슘 및/또는 시트르산칼슘과 같은 추가적인 염이 사용될 수 있다. 키트에서, 칼슘 염은 액체 트롬빈 조성물에 제공될 수 있다. 대안적으로, 칼슘 염은 키트에서 별도의 용기에 제공될 수 있거나, 또는 칼슘 염은 키트에서 젤라틴 성분을 수용하는 것과 동일한 용기에 제공될 수 있다.

본 명세서에 개시된 임의의 태양에서 액체 트롬빈 조성물은 하기 부형제들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 칼슘, 알부민, 당류, 당류 유도체, 폴리올(들), 아세테이트, 시트레이트, 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜, 염화나트륨, 및 물. 칼슘 공급원은 염화칼슘일 수 있으며 2 내지 60 mM의 농도 범위일 수 있다. 알부민은 0.05 내지 1%(w/v)의 농도 범위 또는 0.5 내지 1%(w/w)의 범위일 수 있다. 당류 공급원은 사카로오스(saccharose)일 수 있으며 5 g/l 농도로 존재할 수 있다. 당류 유도체 공급원은 글루콘산일 수 있다. 폴리올(들) 공급원은 만니톨일 수 있으며 2%(w/w) 농도로 존재할 수 있다. 아세테이트 공급원은 아세트산나트륨일 수 있으며 10 mM 농도로 존재할 수 있다. 시트레이트 공급원은 시트르산나트륨일 수 있다. 아미노산은 히스티딘일 수 있으며 10 mM 농도로 존재할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 공급원은 PEG-3350일 수 있으며 예를 들어, 0.03% 농도일 수 있다. 염화나트륨은 50 내지 175 mM의 범위일 수 있다.

트롬빈 용액은 약 5.0 내지 8.5의 pH 범위일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "부형제"는, 예를 들어, 원하는 주도 또는 안정화 효과를 제공하기 위하여 약학적 조성물에 첨가되는 비-치료제를 나타낸다.

트롬빈 용액의 예는, 제한 없이, pH 6.8 내지 7.2에서, 800 내지 1200 IU의 트롬빈/ml, 20 mM 아세트산나트륨, 40 mM CaCl₂, 110 mM NaCl, 0.5% w/w 인간 알부민, 및 2% w/w 만니톨; 염화칼슘(40 μmol/ml), 알부민(인간), 염화나트륨, 주사용수; 500 IU/ml의 단백질 트롬빈, 1% 알부민, 10 mM 아세트산나트륨, 및 75 mM 염화나트륨; 500 IU/ml의 트롬빈, 2%의 만니톨, 10 mM의 히스티딘, 0.03%의 PEG-3350, 및 175 mM의 염화나트륨; 5.0 내지 8.5의 pH에서, 0.1% 내지 1%(w/v)의 농도의 인간 알부민 1 ml당 500 IU의 트롬빈 및 0.05 M 농도의 염화나트륨을 포함한다.

알부민은 예를 들어, 인간 알부민이다. 그러나, 알부민은 또한 비-인간 공급원 또는 재조합 알부민으로부터의 것일 수 있다. 본 명세서에 개시된 임의의 태양의 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 주사용수를 포함한다.

따라서, 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 염화나트륨, 만니톨, 알부민 및 아세트산나트륨으로부터 선택되지만 이로 한정되지 않는 부형제를 추가로 포함한다.

액체 형태의 농축된 정제된 트롬빈은, 주로 자가촉매 절단의 결과로서, 장기간 보관 동안 활성 감소를 나타낸다. 예를 들어, 1000 국제 단위(IU)/ml의 농도의 수성 액체 트롬빈은 실온에서 자가촉매 절단을 거쳐 트롬빈 활성의 상당한 손실을 야기할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 트롬빈 용액 또는 조성물은 1 내지 10,000, 또는 100 내지 10,000 IU 트롬빈/ml, 예를 들어 100 내지 4000, 또는 100 내지 2500 IU 트롬빈/ml 을 포함한다. 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 "IU"는 "국제 단위"를 나타내며, 예를 들어 트롬빈에 대한 세계 보건 기구(WHO) 제2 국제 표준, 01/580(World Health Organization (WHO) Second International Standard for Thrombin, 01/580)에 대해 보정된 역가 농도 측정을 위한 내부 기준 표준에 대한 응고 분석에 의해 결정될 수 있다. 단위(U)는 국제 단위(IU)와 등가이다.

상업적 제조에서, 트롬빈은 전형적으로 약 400 내지 1,200 IU/ml로 사용된다.

따라서, 일부 실시 형태에서, 본 발명의 액체 트롬빈 조성물은 1 내지 2,500 IU/ml의 트롬빈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 100 내지 2,000 IU/ml의 트롬빈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 400 내지 1,200 IU/ml의 트롬빈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 800 내지 1,200 IU/ml의 트롬빈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 400 내지 800 IU/ml의 트롬빈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 400 내지 600 IU/ml의 트롬빈을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 트롬빈의 농도는 약 1 내지 약 20 μM이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈의 농도는 약 5 내지 약 15 μM이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈의 농도는 약 5 내지 약 10 μM이다.

상기에 논의된 바와 같이, 트롬빈은 자가촉매 효소이며, 따라서 액체 형태에서 불안정하다. 안정성은 트롬빈 농도 또는 온도가 증가함에 따라 감소한다. 놀랍게도, 50% 초과의 글리세롤을 포함하는 본 발명의 액체 트롬빈 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같이 매우 높은 온도에서 안정하며, 이는 멸균, 가열에 의한 불활성화, 수송, 저장, 및 냉장 없는 액체 트롬빈의 취급을 용이하게 한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "안정성" 또는 "안정한"은 소정 온도에 대한 노출 후의 트롬빈 효소의 활성에 관련된다. 일반적으로, 액체 트롬빈 조성물은 트롬빈이 활성이 적어도 70%이라면 소정 온도에서 소정 지속시간 후에 안정한 것으로 정의된다.

따라서, 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 50℃의 온도에서 24시간 후에 활성이 적어도 70%이다. 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 50℃의 온도에서 24시간 후에 활성이 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%이다.

일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 50% 초과의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 50℃의 온도에서 24시간 후에 활성이 적어도 70%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 60% 초과의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 50℃의 온도에서 24시간 후에 활성이 적어도 70%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 80% 초과의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 50℃의 온도에서 24시간 후에 활성이 적어도 70%이다.

일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 50% 초과의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 50℃의 온도에서 24시간 후에 활성이 적어도 80%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 60% 이상의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 50℃의 온도에서 24시간 후에 활성이 적어도 80%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 80% 이상의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 50℃의 온도에서 24시간 후에 활성이 적어도 80%이다.

일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 50% 초과의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 50℃의 온도에서 24시간 후에 활성이 적어도 90%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 60% 이상의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 50℃의 온도에서 24시간 후에 활성이 적어도 90%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 80% 이상의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 50℃의 온도에서 24시간 후에 활성이 적어도 90%이다.

다양한 온도에서 트롬빈 활성에 대한 다양한 글리세롤 농도의 효과를 나타내는 도 2a 및 도 2b를 이제 참조한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 25℃의 온도에서 6개월 이상 후에 활성이 적어도 70%이다. 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 25℃의 온도에서 6개월 이상 후에 활성이 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%이다.

"6개월 이상"이란, 예를 들어, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월 또는 그 이상(이들 사이의 임의의 값 및 범위를 포함함)을 지칭하고자 하는 것이다.

"적어도 50%"이란, 예를 들어 50%, 55%, 60%, 65%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%(이들 사이의 임의의 값 및 범위를 포함함)를 지칭하고자 하는 것이다.

일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 50% 초과의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 25℃의 온도에서 6개월 이상 활성이 적어도 70%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 60% 초과의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 25℃의 온도에서 6개월 이상 후에 활성이 적어도 70%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 80% 초과의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 25℃의 온도에서 6개월 이상 후에 활성이 적어도 70%이다.

일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 50% 초과의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 25℃의 온도에서 6개월 이상 후에 활성이 적어도 80%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 60% 이상의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 25℃의 온도에서 6개월 이상 후에 활성이 적어도 80%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 80% 이상의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 25℃의 온도에서 6개월 이상 후에 활성이 적어도 80%이다.

일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 0℃의 온도에서 6개월 이상 후에 활성이 적어도 70%이다. 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 0℃의 온도에서 6개월 이상 후에 활성이 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%이다.

일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 50% 초과의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 0℃의 온도에서 6개월 이상 활성이 적어도 70%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 60% 초과의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 0℃의 온도에서 6개월 이상 후에 활성이 적어도 70%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 80% 초과의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 0℃의 온도에서 6개월 이상 후에 활성이 적어도 70%이다.

일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 50% 초과의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 0℃의 온도에서 6개월 이상 후에 활성이 적어도 80%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 60% 이상의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 0℃의 온도에서 6개월 이상 후에 활성이 적어도 80%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 80% 이상의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 0℃의 온도에서 6개월 이상 후에 활성이 적어도 80%이다.

일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 100℃의 온도에서 2분 후에 활성이 적어도 70%이다. 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 100℃의 온도에서 2분 후에 활성이 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%이다. 일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 50% 초과의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 100℃의 온도에서 2분 후에 활성이 적어도 70%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 60% 이상의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 100℃의 온도에서 2분 후에 활성이 적어도 70%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 80% 이상의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 100℃의 온도에서 2분 후에 활성이 적어도 70%이다.

일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 60% 이상의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 100℃의 온도에서 2분 후에 활성이 적어도 80%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 80% 이상의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 100℃의 온도에서 2분 후에 활성이 적어도 80%이다.

일부 실시 형태에서, 액체 트롬빈 조성물은 60% 이상의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 100℃의 온도에서 2분 후에 활성이 적어도 90%이다. 일부 실시 형태에서, 트롬빈 조성물은 80% 이상의 글리세롤을 포함하고 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 약 100℃의 온도에서 2분 후에 활성이 적어도 90%이다.

일부 실시 형태에서, 개시된 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 실온(예를 들어, 약 25℃)에서 24개월 후에 활성이 적어도 70%이다. 일부 실시 형태에서, 개시된 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 실온에서 24개월 후에 활성이 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 2 내지 8℃의 온도에서 24개월 후에 활성이 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%이다. 일부 실시 형태에서, 개시된 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 2 내지 8℃의 온도에서 24개월 후에 활성이 적어도 70%이다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 -20℃에서 2년 후에 활성이 적어도 70%이다.

일부 실시 형태에서, 본 발명의 액체 트롬빈 조성물 내의 트롬빈은 -20℃에서 3년 후에 활성이 적어도 70%이다.

일부 실시 형태에서, 지혈 키트는 액체 트롬빈 조성물을 수용하는 주사기 및 젤라틴을 수용하는 주사기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트 내의 용기 중 적어도 하나는 사전-충전된 주사기이다. 일부 실시 형태에서, 키트의 용기에 더하여 주사기가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 용기는 바이알 또는 어플리케이터와 같은 특정 유형의 것이다.

상기에 기재된 키트는 트롬빈 성분 및 젤라틴 성분을 포함할 수 있으며, 이들은 적용 전에 함께 혼합된다. 예를 들어, 성분들은, 예를 들어 수술 동안 출혈을 감소시켜야 할 필요가 있을 때 외과 의사 또는 다른 의사에 의해 혼합된다. 키트의 성분들의 혼합은 지혈 조성물을 형성한다.

따라서, 추가의 태양에서, 본 발명은 트롬빈, 젤라틴, 및 글리세롤을 중량 기준으로 지혈 조성물 중 고형물의 30% 초과의 범위로 포함하는 지혈 조성물을 제공한다.

일부 실시 형태에서, 지혈 조성물은 중량 기준으로 고형물의 31% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과의, 또는 100%에 가까운 글리세롤을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 지혈 조성물 내의 두드러진 고체는 젤라틴이다.

추가의 태양에서, 본 발명은 지혈을 돕기 위한 국소 사용을 위한 본 발명의 지혈 조성물을 제공한다.

지혈은 상처 치유의 첫 번째 단계이다. 이는 출혈이 멈추게 하는 과정이다. "지혈 보조"는 출혈을 감소 또는 중지시키는 것을 돕는 것을 의미한다.

추가의 태양에서, 본 발명은 트롬빈과 젤라틴, 중량 기준으로 고형물의 30 중량% 초과의 글리세롤, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

예를 들어 약학적 조성물을 위한 부형제가 본 명세서에서 상기에 기재되어 있으며, 임의의 약학적으로 적합한 부형제, 예를 들어 염화칼슘, 인간 알부민, 만니톨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 시트르산나트륨 이수화물, 글루코네이트 완충제, 사카로오스, 글리신, 아세트산나트륨, 히스티딘 및 PEG를 추가로 포함할 수 있다.

치료 용도의 모든 제제는 멸균 상태이어야 한다. 특히 혈액 제품을 취급할 때, 멸균성 문제, 구체적으로는 바이러스 불활성화의 문제가 중요하다. 일반적으로, 바이러스 불활성화는, 예를 들어, 용매 세제, 열 불활성화, 조사(irradiation), 및 나노여과, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 전형적으로, 바이러스 불활성화에 대한 표준은 2가지 상이한 방법을 사용하는 것을 필요로 한다. 추가로, 멸균성에 대한 미국 식품의약국(FDA) 표준은 여과를 필요로 한다.

그러나, 액체 트롬빈은 특히 고온에서 불안정하기 때문에, 열 불활성화 또는 조사를 사용한 액체 트롬빈의 멸균은 트롬빈 활성에 대한 그의 부정적인 영향으로 인해 비실용적이다. 다른 한편, 높은 농도의 글리세롤을 포함하여 더 안정한 트롬빈 제제는 실온에서 여과에 의해 멸균하기에는 너무 점성이다. 글리세롤을 포함하는 트롬빈 제제는 고온에서 안정할 뿐만 아니라, 글리세롤을 포함하지 않는 제제와 비교하여 생체 내에서 향상된 활성을 갖는다는 본 발명의 놀라운 발견은 글리세롤이 덜 점성인 고온에서 여과에 의한 멸균을 용이하게 한다. 이는 글리세롤을 포함하는 안정한 멸균 액체 트롬빈 조성물의 대규모 생산을 가능하게 한다. 부가적으로, 승온에서의 글리세롤-함유 액체 트롬빈의 안정성으로 인해 열처리에 의한 바이러스 불활성화가 또한 가능하다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "멸균"은 낮은 바이오버든(bioburden)을 갖고, 유효하게 무균 상태이며, 예를 들어 미생물, 예를 들어 세균 및 바이러스가 없음을 의미한다. 멸균은 바이오버든을 유효 무균 수준으로 감소시키는 공정이다. 멸균 액체는 일반적으로 멸균 여과를 거친 액체로서 정의된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 멸균 트롬빈 용액 또는 멸균 액체 트롬빈 조성물은, 예를 들어, 0.22 μm 이하의 필터를 통과함으로써, 멸균 여과에 의해 멸균된 트롬빈 용액 또는 액체 트롬빈 조성물이다.

상기에 논의된 바와 같이, 안정한 멸균 액체 트롬빈 조성물의 대규모 제조를 위한 방법이 현재는 존재하지 않는다. 이는 한편으로는 (특히 고온에서의) 트롬빈의 안정성 결여, 및 한편으로는 필요한 여과 단계를 어렵고 시간 소모적으로 만들 수 있는 글리세롤의 높은 점도 때문이다. 글리세롤을 포함하는 액체 트롬빈 제형이 고온에서 안정할 뿐만 아니라, 향상된 출혈 감소 능력을 나타낸다는 놀라운 발견은, 글리세롤이 덜 점성인 승온에서의 여과를 포함하는, 멸균 액체 트롬빈 조성물의 대규모 제조에 대한 길을 열어준다.

용어 "제제"는 치료 용도에 적합한 생리학적으로 허용가능한 것을 지칭한다.

일부 태양에서, 트롬빈 및 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 실란트 제형이 제공된다.

본 발명과 관련하여, 용어 "실란트 제형"은 단일/하나의 성분의 접착제/글루/지혈제로서 이해되어야 하며, 이 제형은 조직 및/또는 예를 들어 조직과 근접해 있는 혈액과 접촉 시에 반응하여 후속적으로 혈전을 형성하는 성분들을 가지며, 조직 접착제로서 작용하여, 출혈을 방지, 감소 또는 정지시키고/시키거나, 구조체들을 결합하고/하거나, 예를 들어 뇌척수액(CSF), 림프액, 담즙, 위장(GI) 내용물, 폐로부터의 공기 누출 등의 생리학적 누출을 밀봉한다. 일부 실시 형태에서, 실란트 제형은 또한 치료제를 포함하여, 체내에서 형성된 혈전의 자연적 분해 시에 치료제가 방출되도록 한다. 치료제는 항생제, 진통제, 항염증 약물, 항암 약물 등과 같은 약물, 예를 들어, 인간 또는 다른 기원의 임의의 유형의 줄기 세포, 예를 들어, 배아 줄기(ES) 세포, 성체 줄기 세포, 만능 줄기 세포(iPSC) 등을 포함하는 세포일 수 있지만, 이로 한정되지 않는다.

피브린 실란트는 Ca, 인자 VIII, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 폰 빌레브란트 인자(vWF)와 같은 혈전의 형성을 촉진하는 성분을 또한 포함할 수 있으며, 이들은 별도의 성분으로서 제공될 수 있거나 액체 성분들과 함께 제형화될 수 있다.

때때로, 실란트 제형은 "트롬빈계 실란트"로 지칭되며, 본 명세서에 개시된 맥락에서, 이는 피브린 글루, 피브린 실란트, 피브린 접착제, 피브린 필름, 피브린 네트워크, 피브린 격자, 피브린 메시, 피브린 그리드(greed) 및 피브린 겔을 형성하거나 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

임의의 태양에서 개시된 제형, 예를 들어 액체 실란트 제형은, 에어 스프레이를 사용하거나 사용하지 않고서, 예를 들어 적하에 의해, 조직 또는 다른 기재(substrate) 또는 작업 표면 상에 직접 실란트를 방출하는 디스펜서를 사용하여 조직 상에 적용될 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 실란트는 15 PSI의 공기압으로 분무된다. 조직 실란트 디스펜서의 예는 미국 특허 제4,631,055호, 제4,846,405호, 제5,116,315호, 제5,582,596호, 제5,665,067호, 제5,989,215호, 제6,461,361호 및 제6,585,696호, 제6,620,125호 및 제6,802,822호, 그리고 국제특허 공개 WO 96/39212호, WO 2007/059801호, 및 WO 2010/095128호에 나타나 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 명세서에서 상기에 기재된 액체 트롬빈 조성물 및 멸균 액체 트롬빈 조성물의 실시 형태가 개시된 실란트 제형의 태양에 포함된다.

따라서, 일부 실시 형태에서, 실란트 제형은 트롬빈 및 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 실란트 제형은 약 60 내지 약 100% v/v의 글리세롤을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 실란트 제형은 칼슘을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 실란트 제형은 약 1 내지 약 5,000 IU/ml, 약 1 내지 약 2,000 IU/ml, 또는 약 100 내지 약 2,000 IU/ml의 트롬빈을 포함한다.

따라서, 추가의 태양에서, 본 발명은 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 멸균 액체 트롬빈 조성물의 대규모 생산을 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은

b. 수득된 트롬빈 용액을 적어도 40℃로 가열하는 단계; 및

이로써 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 액체 멸균 트롬빈 용액을 수득한다.

일부 실시 형태에서, 용액은 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상, 60℃ 이상, 65℃ 이상, 70℃ 이상, 75℃ 이상, 80℃ 이상, 85℃ 이상, 90℃ 이상, 95℃ 이상, 또는 약 100℃로 가열된다.

일부 실시 형태에서, 필터는 소수성 필터일 수 있다.

일부 실시 형태에서, 하나 초과의 필터가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 2개 이상의 필터가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 3개 이상의 필터가 사용된다.

전형적으로, 여과는 멸균 여과이며, 이는 유효 여과 면적 1 cm²당 10⁷개 이상의 유기체로 시험할 때 미생물 통과를 허용하지 않는 여과 공정으로서 정의된다. 그러한 필터는 보통 등급 기공 크기가 0.22 μm 이하이다(문헌[2004 FDA Guidance for Industry Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing - Current Good Manufacturing Practice]참조).

트롬빈 용액 및/또는 여과 요소, 예컨대 필터는 여과 공정 전에 및/또는 여과 공정 동안에 온도 제어될 수 있다. 온도 제어는 순환식 온도 제어 배스(controlled circulated temperature bath)와 같은 다양한 수단에 의해 수행될 수 있다.

더 큰 용량(예를 들어, 수 킬로그램의 여과액)으로 업스케일링하기 위해, 막 필터 카트리지(예를 들어, 팔 코포레이션(Pall corporation)(등록상표)의 수포르 이엑스 그레이드(Supor EX Grade) ECV, 5" 크기의 부품 번호 AB05UECV2PH4, 10'' AB1UECV7PH4, 20'' AB2UECV2PH4 또는 30'' AB3UECV2PH4)가 사용될 수 있다. 예시적인 실시 형태에서, 하기 실시예 3에 언급된 미니 클린팩(Mini kleenpak)™ 캡슐(표면적 0.023 m²)이 사용되는데, 그 이유는 여과액과 필터 표면적 사이의 비가 알려져 있으며, 이는 전술한 바와 같은 필터 카트리지를 사용함으로써 더 큰 크기로 반복될(duplicated) 수 있기 때문이다.

높은 글리세롤 함량을 포함하는 액체 트롬빈 제형은 또한 증가된 압력에서 더 안정한 것으로 인식된다. 이러한 특징은, 보통 트롬빈 활성의 손실을 초래하는, 시스템에서의 무작위 압력 증가 시점에, 또는 가공 시간을 줄이기 위해 승압이 필요할 때 도움이 될 수 있다.

여과되고 있는 용액을 포함하는 용기는 필터를 통해 액체를 밀어낼 수 있는 에너지원에 연결될 수 있다. 에너지원은 압축 공기일 수 있다. 용기는 에너지 출력을 모니터링 및/또는 제어하는 하나 이상의 요소를 통해 에너지원에 연결될 수 있다. 그러한 요소(들)는 압력 밸브 및 압력 게이지일 수 있다. 트롬빈 용액에 적용되도록 허용되는 에너지의 양은 제한될 수 있다. 제한은 트롬빈 용액에 대한 1 바(bar) 이하의 압력일 수 있다.

따라서, 일부 실시 형태에서, 여과는 약 1 바의 압력 하에서 수행된다. 일부 실시 형태에서, 여과는 1 바 초과의 압력 하에서 수행된다. 일부 실시 형태에서, 여과는 1.5 바 초과, 2 바 초과, 2.5 바 초과, 3 바 초과, 3.5 바 초과, 4 바 초과, 4.5 바 초과, 또는 5 바 초과의 압력 하에서 수행된다.

일부 실시 형태에서, 여과 속도는 용액 1 ㎏당 1시간 미만이다. 일부 실시 형태에서, 여과 속도는 용액 1 ㎏당 30분 미만이다. 일부 실시 형태에서, 여과 속도는 용액 1 ㎏당 약 20 내지 약 30분이다.

바이러스 안전성은 인간 유래 제품의 위험과 관련하여 중요한 문제이다. 인간 유래 제품의 공정에서는 바이러스가 전파될 수 있기 때문에, 이러한 제품은 그의 안전성을 보장하기 위해 바이러스 불활성화 단계를 거쳐야 한다. 전통적으로, 잠재적인 바이러스 부하(viral potential load)의 효과적인 감소를 보장하기 위해 2가지 바이러스 불활성화 방법이 독립적으로 사용된다. 사용되는 바이러스 불활성화 방법에 대한 일부 예가 하기에 기재되어 있다:

나노여과에 의한 바이러스 불활성화 - 이 방법은 크기 배제를 이용하여, 피막 바이러스 및 비피막 바이러스 둘 모두를 여과할 수 있다. 사용되는 필터는 전형적으로 플라노바(Planova) 20N, 플라노바 35N, 바이레솔브(Viresolve) 70, 바이레솔브 180과 같이 70 nm 미만의 기공 크기를 갖는다.

용매 세제(S/D)에 의한 바이러스 불활성화 - 이 방법은 세제 및/또는 용매를 이용하여, 피막 바이러스 또는 지질-코팅된 바이러스에서 발견되는 지질을 제거할 수 있다. 사용되는 세제 및/또는 용매, 예를 들어 트리톤(Triton) X-45, 트리톤 X-100 또는 폴리소르베이트 80, 트라이(n-부틸)포스페이트(TnBP), 다이- 또는 트라이알킬포스페이트는 피막 바이러스 또는 지질-코팅된 바이러스를 불활성 상태로 만든다. 전통적으로, 10 내지 100 mg/ml의 용매 세제를 2 내지 37℃ 범위의 온도에서 30분 내지 24시간 동안 5 내지 8 범위의 pH에서 사용한다. 제품을 S/D로 처리한 후에, 보통 S/D를 제품으로부터 제거한다. 사용되는 세제 및 용매의 조합 및 농도는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 0.1% 초과의 TnBP와 0.1% 초과의 트리톤 X-100의 조합이 사용될 수 있다. 다른 예에서, 1% 트리톤 X-100과 0.3% TnBP의 조합이 사용될 수 있다.

열 불활성화에 의한 바이러스 불활성화 - 저온멸균으로도 알려져 있는 열 불활성화는 피막 바이러스 및 비피막 바이러스를 포함하는 몇몇 유형의 병원체를 해칠 수 있는 고온을 이용한다. 저온멸균은 보통 노출 시간에 대해 온도 수준을 트레이딩(trade)하는 몇몇 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 온도는 10시간의 지속시간 동안 60℃일 수 있다. 다른 예에서, 더 높은 열의 더 단시간(Higher Heat Shorter Time) 기법, 예컨대 2초 미만의 지속시간 동안 100℃가 사용된다.

그러나, 적어도 열에 의한 바이러스 불활성화에 대해, 그러한 선택 사항은 액체 트롬빈의 안정성 결여로 인해 액체 트롬빈에 대해서는 이용가능하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 본 명세서에 기재된 발견을 고려하면, 높은 함량의 글리세롤을 함유하는 개시된 액체 트롬빈 조성물은 열 불활성화를 거칠 수 있다.

따라서, 일부 실시 형태에서, 본 발명의 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 멸균 액체 트롬빈 조성물의 대규모 생산을 위한 방법은 열 불활성화에 의한 바이러스 불활성화의 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시 형태에서, 열 불활성화는 약 60 내지 100℃에서 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 열 불활성화는 약 60℃에서 약 10시간 동안 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 열 불활성화는 약 100℃에서 2초 미만 동안 수행될 수 있다.

추가의 태양에서, 본 발명은 상기에 기재된 방법에 의해 수득되는, 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 멸균 액체 트롬빈 조성물을 제공한다.

또 다른 태양에서, 본 발명은 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 멸균 액체 트롬빈 조성물을 제공한다.

본 발명의 액체 트롬빈 조성물은 출혈을 감소시키거나 정지시키기 위해 독립형으로서 사용될 수 있다. 이는 또한 냉동 또는 분말형 트롬빈을 대체하기 위해 키트의 일부로서, 또는 다른 지혈제에 더하여 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 태양에서, 액체 조성물을 그의 임의의 태양 및 실시 형태에서 치료를 필요로 하는 대상의 상처 상에 및/또는 내에 적용하는(예를 들어, 접촉시키는) 단계를 포함하는, 상처를 치료하는 방법이 제공된다.

"상처를 치료하는"은, 예를 들어 수술을 받는 환자에서, 조직의 출혈 부위에서의 혈액 손실을 감소시키는 것을 포함함을 또한 의미한다.

따라서, 일부 실시 형태에서, 본 방법은, 예를 들어 수술을 받는 환자에서, 조직의 출혈 부위에서의 혈액 손실을 감소시키기 위한 것이며, 개시된 조성물 또는 제형을 그 실시 형태에서 출혈 부위와 접촉시키는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 조직의 출혈 부위에서의 혈액 손실을 감소시키기 위해 사용되는 조성물 또는 제형은 트롬빈 및 50% 이상의 글리세롤, 예를 들어 약 60% 내지 약 100%, 또는 약 80% 내지 약 100% v/v의 글리세롤을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조성물 또는 제형은, 예를 들어, 보충량으로 젤라틴 및/또는 물을 추가로 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상"은 인간, 마우스, 래트, 토끼, 비인간 영장류, 또는 임의의 다른 포유동물을 제한 없이 포함하는 임의의 동물을 의미할 것이다. 일부 실시 형태에서, 대상은 인간, 예를 들어 인간 환자이다. 대상은 남성 또는 여성일 수 있다.

적어도 % 글리세롤, 칼슘 및 부형제, 트롬빈 공급원 및 농도뿐만 아니라 상기에 언급된 트롬빈 안정성과 관련된 실시 형태가 본 출원의 모든 태양에 포함되는 것으로 의도된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 표시된 값보다 10% 더 크거나 더 작은 값이 또한 포함되도록 의도됨을 의미한다. 일반적으로, 본 출원에서의 모든 값은 용어 "약"을 포함하도록 의도된다.

용어 "포함한다", "포함하는", "갖는다", "갖는", "함유한다", "함유하는", 및 이들의 동근어(conjugate)는 "포함하지만 이로 한정되지 않는"을 의미한다. 용어 "~로 이루어진"은 "~를 포함하며 이로 한정되는"을 의미한다. 용어 "~로 본질적으로 이루어진"은 조성물, 방법 또는 구조체가 추가적인 성분, 단계 및/또는 부품을 포함할 수 있지만, 추가적인 성분, 단계 및/또는 부품이 청구된 조성물, 방법 또는 구조체의 기본적이고 신규한 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 경우에만 그러함을 의미한다.

단어 "예시적인"은 본 명세서에서 "예, 사례, 또는 실례로서의 역할을 하는"을 의미하도록 사용된다. "예시적인"으로 기술되는 임의의 실시 형태는 반드시 다른 실시 형태에 비해 바람직하거나 유리한 것으로 및/또는 다른 실시 형태로부터의 특징의 포함을 배제하는 것으로 해석되어야 하는 것은 아니다.

단어 "선택적으로"는 "일부 실시 형태에서 제공되며 다른 실시 형태에서는 제공되지 않음"을 의미하는 것으로 본 명세서에서 사용된다. 본 발명의 임의의 특정 실시 형태는 복수의 "선택적인" 특징을 그러한 특징들이 상충하지 않는 한 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형("a," "an," 및 "the")은 문맥상 명백히 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "하나 이상의 화합물"은 복수의 화합물(이들의 혼합물을 포함함)을 포함할 수 있다.

본 출원 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 실시 형태가 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결함을 위한 것이며 본 발명의 범주에 대한 유연성 없는 제한으로서 해석되어서는 안 된다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위범위뿐만 아니라 그 범위 내의 개별적인 수치를 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 구체적으로 개시된 하위범위뿐만 아니라 그 범위 내의 개별적인 수, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.

수 범위가 본 명세서에 지시될 때마다, 이는 지시된 범위 내의 임의의 인용된 수(분수 또는 정수)를 포함하는 것을 의미한다. 첫 번째 표시 수(indicate number)와 두 번째 표시 수 "사이에 걸친/그 사이의 범위" 및 첫 번째 표시 수"로부터" 두 번째 표시 수"까지에 걸친/그까지의 범위"라는 어구는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되며, 첫 번째 표시 수와 두 번째 표시 수 및 그들 사이의 모든 분수 및 정수를 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "방법"은 화학, 약리학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 실무자에게 알려져 있거나 이들에 의해 공지된 방식, 수단, 기술 및 절차로부터 용이하게 개발되는 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함하지만 이로 한정되지 않는 주어진 과제를 달성하기 위한 방식, 수단, 기술 및 절차를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 의학적 치료와 관련하여 용어 "치료하는"은 병태의 진행을 철폐하거나 실질적으로 억제하거나 늦추거나 역전시키는 것, 병태의 임상적 또는 심미적 증상을 실질적으로 개선하는 것, 또는 병태의 임상적 또는 심미적 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "출혈"은 순환계의 임의의 구성요소로부터의 혈액의 혈관외 유출을 지칭한다. 따라서, "출혈"은 수술, 외상, 또는 다른 형태의 조직 손상과 관련하여 원치 않고, 제어되지 않고, 종종 과도한 출혈뿐만 아니라 출혈 장애를 갖는 환자에서의 원치 않는 출혈을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 출혈과 관련하여 상호 교환적으로 사용될 수 있는 용어 "제어하는", "방지하는", 또는 "감소시키는"(이들의 임의의 문법적 어형 변화를 포함함)은 혈관외 유출되는 혈액의 비율이 본질적으로 0으로 되거나, 출혈 부위 내에서/상에서의 개시된 조성물의 접촉이 결여된 상황과 비교하여 초기 출혈 비율의 10%, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 심지어 100%만큼 감소됨을 나타낸다. 출혈의 출현 수준을 결정하는 방법이 당업계에 공지되어 있다.

게다가, 일부 실시 형태에서, 출혈과 관련하여 용어 "제어하는", "방지하는" 또는 "감소시키는"은 또한, 예를 들어 연조직에서 출혈 부위의 혈관을 적어도 부분적으로 밀봉하는 것을 포함하는 것을 의미한다.

"A, B, 및 C 중 하나 이상 등"과 유사한 관례가 사용되는 그러한 경우에, 일반적으로 그러한 구성은 당업자가 그 관례를 이해할 의미로 의도된다(예컨대, "A, B 및 C 중 하나 이상을 갖는 시스템"은 A만을, B만을, C만을, A와 B를 함께, A와 C를 함께, B와 C를 함께, 그리고/또는 A, B 및 C를 함께 등을 갖는 시스템을 포함할 것이지만 이로 제한되지 않는다). 명세서에서든, 청구범위에서든, 또는 도면에서든, 2개 이상의 대안적인 용어를 제공하는 사실상 임의의 분리 단어 및/또는 문구는, 용어들 중 하나, 용어들 중 어느 하나, 또는 둘 모두의 용어를 포함할 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 한다는 것이 또한 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 문구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.

명확성을 위해서 개별 실시 형태와 관련하여 설명된 본 발명의 소정의 특징부는 또한 단일 실시 형태와 조합하여 제공될 수 있다는 것이 인지된다. 반대로, 간결성을 위해서 단일 실시 형태와 관련하여 설명된 본 발명의 다양한 특징부는 또한 본 발명의 임의의 다른 기재된 실시 형태와 별개로 또는 임의의 적합한 하위조합으로 또는 적합하게 제공될 수 있다. 다양한 실시 형태와 관련하여 기재된 소정의 특징부는, 실시 형태가 이들 부재 없이 사용될 수 있는 한, 이들 실시 형태의 본질적인 특징부가 아니다.

상기에 기술된 바와 같은 그리고 하기 청구범위 섹션에서 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 실시 형태 및 태양은 하기 실시예에서 실험적으로 뒷받침된다.

실시예

이제 하기의 실시예를 참조하며, 이는 상기 설명과 함께 본 발명의 일부 실시 형태를 비제한적인 방식으로 예시한다.

재료 및 방법

다양한 글리세롤 농도의 준비: 각각의 글리세롤 농도에 대해, 일정 부피의 DDW를 5 ml 주사기(요엘 나임(Yoel Naim) 5 ml 주사기 로트: 20130815) 내로 흡인하고 바이알에 첨가하였다. 일정 부피의 글리세롤(제이.티 베이커(J.T Baker) 500 ml 무수 글리세롤 배치: 0000136697)을 5 ml 주사기 내로 흡인하고 동일한 바이알에 첨가하였다. 이어서, DDW 및/또는 글리세롤이 담긴 각각의 바이알을 주위 온도에서 30초 동안 와류(vortex)(사이언티픽 인더스트리즈(Scientific industries), 볼텍스-지니(Vortex-genie) 2 모델 G560E. 속도 설정 5)에 의해 혼합하였다.

트롬빈 재구성: 각각의 글리세롤 농도에 대해, 상이한 글리세롤 농도를 함유하는 2 ml의 액체를 5 ml 주사기 내로 흡인하였다. 약 2000 IU가 담긴 동결건조 트롬빈 바이알에 상기 2 ml의 액체를 주입하고, 주위 온도에서 재구성을 위해 24 내지 72시간(h) 동안 롤러(스튜어트(Stuart), 롤러 믹서 모델 SRT6) 상에 두었다.

간단히 말해, 4 내지 10 국제 단위(IU)/ml 사이에서 트롬빈 표준 곡선을 생성하였다. 이어서, 40 ml의 트롬빈 또는 희석된 샘플을 시험 큐벳 내의 160 ml의 0.1% 피브리노겐 용액에 첨가하였다. 자동화된 응고 기계(Stat4, 스타고 다이아그노스티카(Stago Diagnostica))에서 응고 시간을 분석하였다. 이 기계는 진동 전자기장을 생성하는데, 이는 큐벳 내부에서 작은 금속 볼을 움직이게 한다. 볼 움직임이 정지된 것으로 탐지될 때 응고가 발생한 것으로 결정된다. 시험 샘플 내의 트롬빈 농도를 표준 곡선에 대해 응고 시간으로부터 외삽한다.

실시예 1 : 액체 트롬빈 안정성

50℃에서 24시간 안정성: 다양한 글리세롤 농도를 갖는 트롬빈 용액의 제조를 나타내는 하기 표 1에 따라 상기에 기재된 바와 같이 몇몇 글리세롤 농도를 준비하였다.

[표 1]

트롬빈을 상기에 기재된 바와 같이 재구성하고, 시점 0(0시간)으로서의 향후 분석을 위해, 1 ml 주사기(테루모(Terumo) 1 ml 주사기 로트: 1001015)를 사용하여 300 μl 샘플을 에펜도르프 튜브(사르스테트(Sarstedt), 1.5 마이크로 튜브 72.690.001)에 넣고 냉동하였다(-20℃). 나머지 재구성된 트롬빈이 담긴 바이알을 표시된 시간(예를 들어, 24시간) 동안 표시된 온도, 예를 들어 50℃를 위해 필요한 대로 오븐(벤티셀(venticell) 222, SN: B020251) 내에 두었다. 1, 4.5, 8 및 24시간인 각각의 시점에; 1 ml 주사기를 사용하여 300 μl 샘플을 에펜도르프 튜브에 넣고, 각각의 시점에 대한 향후 분석을 위해 냉동하였다. 상기에 기재된 바와 같이, 표준 곡선에 기초하여 시험 샘플의 트롬빈 활성을 평가하였다.

50℃에서의 24시간 안정성 연구에서 상이한 글리세롤 농도에 대한 트롬빈 활성의 4회 반복 시험의 평균 결과가 도 1에 제시되어 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 50%, 60%, 및 80%의 글리세롤 농도에서, 트롬빈 활성은 50℃에서 25시간 동안 완전히 유지되었다.

장기 안정성: 다양한 온도(℃)에서의 트롬빈 활성에 대한 다양한 글리세롤 농도의 영향을 추가로 시험하였다. 트롬빈을 DDW 중 몇몇 상이한 농도의 글리세롤 중에 현탁시키고, 25℃에서 6개월 동안 그리고 4℃에서 12개월 동안 두었으며, 도 2a는 25℃에서 3개월 및 6개월에 측정한 활성을 나타낸다. 도 2b는 4℃에서 12개월에 측정된 활성을 나타낸다. 결과는 각각의 표시된 시간 동안 활성의 약 90% 내지 약 100%가 유지되었으므로, 시험된 글리세롤 샘플의 장기간 안정성을 나타내었다.

실시예 2: 100℃에서의 액체 트롬빈의 2분 안정성

상기 표 1에 따라 상기에 기재된 바와 같이 몇몇 글리세롤 농도(50%, 60%, 및 80%)를 준비하였다.

트롬빈을 상기에 기재된 바와 같이 재구성하고, 시점 0(0분)으로서의 향후 분석을 위해, 1 ml 주사기(테루모 1 ml 주사기 로트: 1001015)를 사용하여 300 μl 샘플을 에펜도르프 튜브(사르스테트, 1.5 마이크로 튜브 72.690.001)에 넣었다. 나머지 재구성된 트롬빈이 담긴 바이알을 2분 동안 100℃로 설정된 오븐(벤티셀 222, SN: B020251) 내에 두었다. 2분 후에, 1 ml 주사기를 사용하여 각각의 농도로부터 에펜도르프 튜브 내로 300 μl 샘플을 취하였다. 시험 샘플의 트롬빈 활성을 상기에 기재된 바와 같이 표준 곡선에 기초하여 평가하고, 시점 0에서의 0% 글리세롤에 대한 결과에 의해 정규화하였다.

100℃에서의 2분 안정성 연구에서 상이한 글리세롤 농도에 대한 트롬빈 활성의 2회 반복 시험의 평균 결과가 도 3에 제시되어 있다. 도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 100℃에서 2분 후에, 50% 글리세롤의 경우 트롬빈 활성의 75% 미만이 유지된 반면, 60% 및 80% 글리세롤의 용액에서는, 트롬빈 활성의 90%가 유지되었다.

실시예 3: 다양한 온도에서의 무수 글리세롤의 여과 속도

여과를 사용하여 멸균 액체를 생성하기 위해서, 액체는 공극 크기가 0.22 μM 이하인 필터를 통과해야 한다(문헌[2004 FDA Guidance for Industry Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing - Current Good Manufacturing Practice]). 그러나, 글리세롤과 같은 점성 액체는 그러한 필터를 통과하기가 어려워서 절차가 매우 오래 걸리므로 기껏해야 비효과적인 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 여과의 온도를 상승시키는 것이 글리세롤을 덜 점성으로 만들고 여과를 더욱 효과적이게 만들 수 있는지를 시험하였다. 그러나, 이는 트롬빈 활성이 상기 공정에 영향을 받지 않는 경우에만 수행될 수 있다. 실시예 1에서 상기에 나타나 있는 바와 같이, 본 발명자들은 50% 초과의 글리세롤 중의 트롬빈이 50℃에서 24시간 동안 안정하다는 것을 이제 확립하였다. 부가적으로, 실시예 2에 나타나 있는 바와 같이, 본 발명자들은 50% 초과의 글리세롤의 용액 중 트롬빈이 100℃에서 2분 동안 안정하다는 것을 또한 확립하였다. 그 결과, 더 높은 온도가 또한 여과 공정에 사용될 수 있다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 글리세롤의 여과 속도에 대한 온도의 영향을 조사하였다.

예시적인 절차에서, 글리세롤(제이.티. 베이커 무수 글리세롤 배치: 0000136697)을 압력 용기(사르토리우스 스테딤(Sartorius Stedim) 모델 17530)에 넣고, 공정 동안 0.9 내지 1 바의 압력을 유지하도록 압력 게이지(최대 1 바)에 연결된 압축 공기(CA) 시스템 및 실리콘 튜빙을 사용하여 0.2 μM 미니 클린팩™ 캡슐 필터(팔 코포레이션(등록상표) REF KA02ECV2FT, 로트 IB2616)를 통해 여과하였다. 글리세롤 및 필터를 갖는 압력 용기를, 순환식 온도 제어 배스 내에서 여과 공정 전에 그리고 여과 공정 동안에 45분 동안 인큐베이션하였다. 여과 속도에 대한 온도의 영향을 평가하기 위하여, 순환식 온도 제어 배스를 각각의 시험에 대해 하나씩 3가지 상이한 온도 중 하나로 설정하였다. 조사된 온도는 25℃, 40℃, 및 50℃였다.

시간 경과에 따라 여과물을 칭량함으로써 여과 속도를 측정하였다. 결과가 하기 표 2에 나타나 있으며, 이는 여과 속도에 대한 여과 온도의 영향을 입증한다.

[표 2]

표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 25℃에서의 글리세롤의 여과 유량은 비교적 낮았으며, 즉 시간당 0.5 ㎏ 미만이었으며, 이로 인해 비효율적이었다. 그러나, 40℃ 및 50℃에서의 글리세롤의 여과 유량은, 실온에서의 공정에 비하여, 각각 약 2.5배 및 약 5배 더 빨랐으며, 이로 인해 고온에서 수행될 때 공정이 훨씬 더 효과적이었다. 따라서, 대규모 제조에 필요한 대략 1 ㎏의 글리세롤의 여과가 25℃에서의 대략 2.5시간과 비교하여 50℃에서는 30분 안에 달성될 수 있다.

실시예 4: 안정한 멸균 액체 트롬빈 용액의 대규모 제조

고온에서의 트롬빈 안정성을 나타내는 실시예 1 및 실시예 2 및 승온에서의 글리세롤의 더 높은 여과 속도를 나타내는 실시예 3에서의 종합된 발견에 기초하여, 용액 온도를 상승시키고 공극 크기가 0.22 μM 이하인 필터에 통과시킴으로써, 50% 초과의 글리세롤을 포함하는 액체 트롬빈 용액을 멸균 여과할 수 있다.

예시적인 절차에서, 트롬빈을 글리세롤(제이.티. 베이커 무수 글리세롤) 및 DDW와 혼합하여, 80% 글리세롤 v/v 중 1000 IU/ml의 트롬빈을 함유하는 2 리터의 최종 부피의 트롬빈 용액을 수득한다. 압력 게이지 및 밸브를 통해 압축 공기(CA) 시스템 및 0.2 μM 미니 클린팩™ 캡슐 필터(팔 코포레이션(등록상표) REF KA02ECV2FT, 로트 IB2616)에 연결된, 사르토리우스 스테딤 모델 17530 내에 트롬빈 용액을 넣는다. 트롬빈 용액 및 여과 요소가 담긴 압력 용기를 50℃로 설정된 순환식 온도 제어 배스 내에 넣는다. 트롬빈 용액 및 여과 요소가 50℃에 도달한 후에, 압력 밸브 및 압력 게이지에 의해 압축 공기 유동을 제어함으로써 압력을 0.9 내지 1 바로 조정한다. 1 ㎏의 여과액, 멸균 트롬빈 용액을 2시간 미만 내에 생성하는, 시간당 0.5 ㎏ 초과의 유량이 예상된다. 실제로, 실시예 3에서의 실험에 기초하면, 1 ㎏의 여과액, 멸균 트롬빈 용액을 30분 미만 내에 생성하는, 시간당 대략 2 ㎏의 유량이 예상될 수 있다. 온도를 더 상승시키는 것이 훨씬 더 높은 여과 속도를 야기할 것으로 예상되는 것으로 인식된다.

실시예 5: 젤라틴과 조합된 액체 트롬빈의 생체 내 시험

표 1에 나타낸 것과 유사하게, 표 3에 따라 상기에 기재된 바와 같이 몇몇 글리세롤 농도를 준비하였다:

[표 3]

각각의 글리세롤 농도에 대해, (키트에 따라 물로 재구성된 트롬빈 대신) 2 ml의 다양한 글리세롤 농도로 재구성된 1,600 내지 2,400 IU의 트롬빈을 사용하여 (서지플로(등록상표) 키트로부터의) 8 ml의 젤라틴 페이스트를 제조하였다. 시험한 모든 지혈 조성물은 트롬빈, 젤라틴, 및 글리세롤을 포함하였으며, 여기서 글리세롤은 중량 기준으로 고형물의 30% 초과의 농도였다.

트롬빈 재구성에 사용한 글리세롤 농도를 각각의 준비된 주사기에 표지하였다. 하기에 기재된 바와 같이 생체 내 돼지 펀치 생검 모델을 사용하여 트롬빈 활성을 시험하였다.

사용한 동물 절차는 문헌[MacDonald et al. 2017, Medical Devices: Evidence and Research 10: 273-279]에서 이전에 보고된 절차와 유사하였으나 다음의 변경이 있었다:

- 4 mm로 설정된 정지부를 갖는 8 mm의 일회용 생검 펀치를 사용하였고;

- 시험 물품 적용 후 10초 동안 탐포네이드를 적용하고, 자유-유동 혈액의 존재를 2분 동안 모니터링하고;

- 자유-유동 혈액이 없도록 하는 데 필요한 탐포네이드의 수를 기록하였다.

간단히 말해, 복측 정중선 복부 절개를 수행하였고, 정중선 절개부의 머리쪽 부분을 연장시켜 간의 노출을 개선하였다. 시험 표면 가용성을 최대화하도록 필요한 대로 간을 위치시켰다. 절차 전반에 걸쳐 염수 및 염수 침지된 개복술용 스펀지로 복부 기관을 촉촉하게 유지하였다. 깊이 정지부가 4 mm로 설정된 일회용 8 mm 생검 펀치를 사용하여 좌측, 우측, 및 네모엽의 접근가능한 영역의 횡격막 표면 상에 간실질 결함을 생성하였다. 생검의 코어 부분을 파지하고 기저 표면으로부터 자유로이 예리하게 해부하여 경한 정도 내지 중간 정도의 출혈(mild to moderate hemorrhage)을 야기하였다.

얻어지는 출혈의 특성화를 가능하게 하기 위해 제품 적용 전에 결함 부위를 수 초 동안 출혈되게 두었다. 각 결함 부위에서의 출혈을 상처 생성 시점에 그리고 치료 전에 0 내지 5의 범위로 분류하였다. 1 이하로 분류된 결함은 제외하였고, 그에 대해서는 시험을 수행하지 않았다. 시험 부위를 거즈로 닦아내고, 이어서 시험 물품 중 하나를 적용하였다. 본 연구의 목적상, 유효 지혈은 자유 유동 출혈의 중단으로서 정의되었다. 나타났지만 성장하지 않은 소량 또는 점상 출혈은 자유 유동 출혈인 것으로 간주되지 않았다. 시험 물품을 서지플로(등록상표) 어플리케이터에 의해 결함(출혈 부위) 상에 분배하였다. 초기 탐포네이드를 손가락 압력을 이용하여 거즈 상에 대략 10초 동안 적용하였다. 초기 10초의 탐포네이드 후에, 드레싱을 제거하였다. 120초 후에 지혈이 달성되지 않았다면, 탐포네이드를 재적용하고 추가 10초 동안 유지하였고, 이어서 다른 관찰 기간이 뒤따랐다. 효과적인 지혈이 달성될 때까지 이 과정을 반복하였고, 필요한 탐포네이드의 수를 기록하였다.

돼지 펀치 생검 생체 내 모델에서 젤라틴과 조합된 글리세롤로 재구성된 트롬빈의 효능 결과의 5회 반복 시험의 평균이 도 4에 제시되어 있다.

도 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 트롬빈 용액 내의% 글리세롤이 결과에 직접 영향을 미쳤는데, 50% 글리세롤은 평균적으로 약 2.8개의 탐포네이드 반복을 초래하였고, 60% 글리세롤은 평균적으로 약 1.8개의 탐포네이드 반복을 초래하였고, 100% 글리세롤은 평균적으로 1.5개 미만의 탐포네이드 반복을 초래하였다.

비교를 위해, 서지셀(등록상표)(흡수성 지혈 분말)은 유사한 모델에서 AR(아리스타(Arista)™ AH 흡수성 지혈 입자) 및 PC(퍼클롯(PerClot)(등록상표) 폴리사카라이드 지혈 시스템)보다 우수한 것으로 이전에 보고되었다(상기에 언급된 문헌[MacDonald et al. 2017]). 그 모델에서, 아리스타™ 및 퍼클롯(등록상표) 둘 모두는 지혈 시간(time-to-hemostasis)이 4.75분 이상이었다. 각각의 탐포네이드 후의 각각의 관찰은 최대 2분이기 때문에, 아리스타 및 퍼클롯(등록상표)의 결과는 2.3개 이상의 탐포네이드와 동등하다.

따라서, 본 연구의 결과는 글리세롤 없이 물에 재구성된 기존의 트롬빈 제품과 비교하여 60% 이상의 글리세롤에 재구성된 트롬빈의 효능이 증가하였음을 입증한다.

본 발명은 이의 구체적인 실시 형태와 관련하여 설명되었지만, 다수의 대안, 수정 및 변형이 당업자에게 자명함이 분명하다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위의 사상 및 넓은 범주 내에 있는 모든 이러한 대안, 수정 및 변형을 포함하는 것으로 의도된다.

Claims

a. 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 액체 트롬빈 조성물을 수용하는 용기; 및
b. 젤라틴을 수용하는 용기를 포함하는, 지혈 키트.
제1항에 있어서, 상기 액체 트롬빈 조성물은 약 60 내지 약 100% v/v의 글리세롤, 선택적으로 약 80% 내지 약 100% v/v의 글리세롤을 포함하는, 지혈 키트.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 키트는 칼슘을 추가로 포함하는, 지혈 키트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 트롬빈 조성물은 염화나트륨, 만니톨, 알부민 및 아세트산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는, 지혈 키트.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 트롬빈 조성물은 약 100 내지 약 2,000 IU/ml의 트롬빈을 포함하는, 지혈 키트.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 트롬빈 조성물 내의 상기 트롬빈은 약 50℃의 온도에서 약 20시간 후에 활성이 적어도 70%인, 지혈 키트.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 트롬빈 조성물 내의 상기 트롬빈은 약 100℃의 온도에서 약 2분 후에 활성이 적어도 70%인, 지혈 키트.
트롬빈, 젤라틴, 및 중량 기준으로 고형물의 30% 초과의 농도 범위의 글리세롤을 포함하는, 지혈 조성물.
제8항에 있어서, 칼슘을 추가로 포함하는, 지혈 조성물.
제8항 또는 제9항에 있어서, 염화나트륨, 만니톨, 알부민 및 아세트산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는, 지혈 조성물.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약 100 내지 약 2,000 IU/ml의 트롬빈을 포함하는, 지혈 조성물.
제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 지혈을 돕기 위한 국소 사용을 위한, 지혈 조성물.
50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 멸균 액체 트롬빈 조성물의 대규모 생산을 위한 방법으로서, 상기 방법은
a. 트롬빈을 글리세롤 용액과 혼합하여 트롬빈 용액을 제조하여 50% v/v 초과의 글리세롤을 갖는 용액을 수득하는 단계;
b. 수득된 트롬빈 용액을 적어도 약 40℃로 가열하는 단계; 및
c. 상기 트롬빈 용액을, 기공 크기가 약 0.22 μm 이하인 적어도 하나의 필터에 통과시켜 멸균하는 단계를 포함하고,
이로써 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 멸균 액체 트롬빈 조성물을 수득하는, 방법.
제13항에 있어서, 열 불활성화에 의해 수행되는 바이러스 불활성화의 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 트롬빈 용액은 약 60 내지 약 100% v/v의 글리세롤, 선택적으로 약 80% 내지 약 100% v/v의 글리세롤을 포함하는, 방법.
제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트롬빈 용액은 칼슘을 추가로 포함하는, 방법.
제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트롬빈 용액은 염화나트륨, 만니톨, 알부민 및 아세트산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는, 방법.
제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트롬빈 용액은 약 100 내지 약 2,000 IU/ml의 트롬빈을 포함하는, 방법.
제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 트롬빈 조성물 내의 상기 트롬빈은 약 50℃의 온도에서 약 20시간 후에 활성이 적어도 70%인, 방법.
제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 트롬빈 조성물 내의 상기 트롬빈은 약 100℃의 온도에서 약 2분 후에 활성이 적어도 70%인, 방법.
제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 수득되는, 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 멸균 액체 트롬빈 조성물.
50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는, 멸균 액체 트롬빈 조성물.
제22항에 있어서, 약 60 내지 약 100% v/v의 글리세롤, 선택적으로 약 80% 내지 약 100% v/v의 글리세롤을 포함하는, 멸균 액체 트롬빈 조성물.
제22항 또는 제23항에 있어서, 칼슘을 추가로 포함하는, 멸균 액체 트롬빈 조성물.
제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 염화나트륨, 만니톨, 알부민 및 아세트산나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함하는, 멸균 액체 트롬빈 조성물.
제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 약 100 내지 약 2,000 IU/ml의 트롬빈을 포함하는, 멸균 액체 트롬빈 조성물.
제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트롬빈은 약 50℃의 온도에서 약 20시간 후에 활성이 적어도 70%인, 멸균 액체 트롬빈 조성물.
제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트롬빈은 약 100℃의 온도에서 약 2분 후에 활성이 적어도 70%인, 멸균 액체 트롬빈 조성물.
제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 젤라틴을 추가로 포함하는, 멸균 액체 트롬빈 조성물.
트롬빈 및 50% v/v 초과의 글리세롤을 포함하는 실란트 제형(sealant formulation).
제30항에 있어서, 약 60 내지 약 100% v/v의 글리세롤, 선택적으로 약 80% 내지 약 100% v/v의 글리세롤을 포함하는, 실란트 제형.
제30항 또는 제31항에 있어서, 칼슘을 추가로 포함하는, 실란트 제형.
제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 약 100 내지 약 2,000 IU/ml의 트롬빈을 포함하는, 실란트 제형.
제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 피브리노겐 성분을 포함하는, 실란트 제형.