CN1877303A - 一种具有抑制蛋白酶作用的药物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有抑制蛋白酶作用的药物的制备方法及检测方法，该方法包括步骤：将含有α1－蛋白酶抑制物的水溶液经病毒灭活处理；离子交换树脂吸附、洗脱；同时应用丝氨酸蛋白酶与α1－蛋白酶抑制物反应而引起相应波长的光吸收变化，从而定量测定α1－蛋白酶抑制物的活性。本发明的制备方法有效地实现高收率，保证产品的高纯度和高活性，同时简化工艺，降低成本；检测方法简单易行、灵敏度高。
Description
本发明申请是申请文件“一种具有抑制蛋白酶作用的药物的制备方法及检测方法”的分案申请，原申请的申请号为2004100310574，申请日为2004年4月12日。
【技术领域】
本发明属于蛋白检测领域，具体涉及一种具有抑制蛋白酶作用的药物的检测方法。
【背景技术】
α1-蛋白酶抑制物(又名α1-抗胰蛋白酶，alpha-1 Antitrypsin，简称α1-PI)是分子量约为53,000道尔顿的糖蛋白，每升血浆平均含有1.5克。该蛋白在机体中主要是抑制弹性蛋白酶和其它丝氨酸蛋白酶的分解作用。当机体中有活性的α1-PI浓度显著低于丝氨酸蛋白酶的浓度时，正如发生在具有α1-PI遗传缺陷的人群中，肺组织就会遭到丝氨酸蛋白酶的破坏而引起慢性病变，如肺气肿。这种肺气肿的病人可应用α1-PI作长期的替代治疗，然而市场上的α1-PI产品供不应求，因此，开发能工业化生产高质量α1-PI的工艺才能满足市场的需求。
以往有多种已发表的可用于工业化生产具有抑制蛋白酶作用的药物的方法。Glaser等人(Anal.Biochem.1982，124：364-371)应用硫酸铵沉淀法从人血浆的Cohn氏组分IV-1中一步得到纯度约为70％的α1-PI，然后再经阴离子交换层析法(DEAE-cellulose)精制，但收率偏低，只有40％左右。
Coan等人(美国专利US 4,379,087；Vox Sang.1985，48：333-342)使用聚乙二醇沉淀法和阴离子交换层析法从人血浆的Cohn氏组分IV-1中纯化α1-PI，收率约为50％，纯度只有60％左右。此方法是美国拜尔公司(Bayer Corporation)1988年批准上市的α1-PI产品Prolastin的原型，该制剂中有活性的α1-PI仅占总蛋白的≥35％(见其产品说明书，14-7601-001(Rev.Jan.2002))。
Burnouf等人(Vox Sang.1987，52：291-297)采用阴离子交换(DEAE Sepharose CL6B FF)和凝胶过滤(Sephacryl S-200)层析法从人血浆上清A(相当于Cohn氏组分II+III)中分离得到纯度80-90％的α1-PI，收率为65-75％。
上述这些提纯α1-PI的方法都未能在取得高收率的同时，保证产品的高纯度和高活性。而且，上述方法工艺比较繁，成本比较高。实际操作上，分子大小及等电点都与α1-PI接近的蛋白，如血浆中含量最多的白蛋白，令分离高纯度α1-PI的工作相当困难；而将没有活性的α1-PI与有活性的α1-PI分开则是更大的挑战。对离子交换层析条件的多番尝试之后，本发明将简单的两步层析法整合成为可用作治疗药物之高纯度和高活性的α1-PI的制备方法。
现有的α1-PI检测技术通常应用特异性的抗体来定量测定α1-PI，包括放射性免疫扩散法，火箭免疫电泳法和ELISA法。可是，现有的应用特异抗体的技术无法将有活性的α1-PI与无活性的α1-PI区分开来，而且现有的这些技术成本相对比较高。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
为了实现高收率，保证产品的高纯度和高活性，同时简化工艺及降低成本，本发明提供一种具有抑制蛋白酶作用的药物的制备方法；同时针对现有检测技术操作繁琐、检测灵敏度低的情况，本发明提供一种简单易行、检测灵敏度高的具有抑制蛋白酶作用的药物的检测方法。
[技术方案]
为了实现高收率，保证产品的高纯度和高活性，同时简化工艺及降低成本，本发明提供一种具有抑制蛋白酶作用的药物的制备方法，该方法含有如下步骤：病毒灭活处理含有α1-PI的水溶液，离子交换树脂吸附、洗脱。
将含有α1-PI的水溶液经病毒灭活处理，首先通过阴离子交换树脂吸附α1-PI，并从阴离子交换树脂上有选择性地洗脱有活性的α1-PI；然后经过阳离子交换树脂，得到具有抑制蛋白酶作用的药物。含有α1-PI的水溶液包括：人的血浆或血浆组分、含有基因重组α1-PI的微生物或细胞培养液以及含有α1-PI转基因的动物体液包括乳汁和血浆。正常的人血浆，每升含有0.83-4.0克的α1-PI，其中相当大部分在血浆蛋白的工业化生产过程中富集于某些血浆组分。Wright等人的研究发现，在转基因绵羊的乳汁中，α1-PI的含量可高达每升60克(Biotechnology，1991，9：830-834)。在微生物如大肠杆菌(Casolaroet al，1987，J.Appl.Physiol.，63：2015-2023)和酵母(Hubbard et al，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.，86：680-684)中，应用基因重组技术可产生大量的α1-PI。优选的含有α1-PI的材料是人血浆的Cohn氏组分IV，因其是应用低温乙醇沉淀法(Cohn氏法)的常规工业化血浆蛋白纯化过程中的废弃物。为了增加α1-PI制品的安全性，在阴离子交换层析法处理以前，溶解的Cohn氏组分IV可经由一种或多种方法联合去除/灭活病毒。病毒去除/灭活方法包括：巴斯德(巴氏)消毒法，干热法，低pH孵放法，有机溶剂/去污剂(S/D)处理法，辛酸或辛酸盐处理法，超滤病毒去除法，纳米过滤法，等等。
人血浆中的α1-PI有超过100种不同的分子变异体(variants)，含量高的几个变异体的等电点在4.3-4.6之间。当溶液的pH高于其等电点时，α1-PI带负电，能结合到阴离子交换树脂上。溶液的pH比其等电点高的越多，α1-PI与阴离子交换树脂的结合力越大。溶液中的阴离子与α1-PI竞争阴离子交换树脂上的结合位点，因此，低的离子强度有利于α1-PI被吸附到阴离子交换层析柱。调节经病毒去除/灭活处理过的含有α1-PI的水溶液的pH至≥4.8，且≤12.0，并调节其离子强度至≥0.1mS/cm，且≤10.0mS/cm，使其流过阴离子交换层析柱。可用的阴离子交换树脂包括强阴离子交换树脂和弱阴离子交换树脂，例如，安玛西亚(Amersham)公司的Q Sepharose Fast Flow和DEAESepharose Fast Flow。目标蛋白α1-PI结合到阴离子交换树脂上，部分杂蛋白不被吸附而得以除去。增加层析柱洗液的盐浓度或调节洗液的pH，进一步洗脱部分杂蛋白，继续增加洗液的盐浓度或调节洗液的pH就把吸附的α1-PI有选择性的洗脱下来。含α1-PI的阴离子交换层析柱洗脱液随后用阳离子交换层析法精制。调节经透析处理的含α1-PI的阴离子交换层析柱洗脱液的pH至≥4.8，且≤13.0，并调节其离子强度至≥0.1mS/cm，且≤10.0mS/cm，使其流过阳离子交换层析柱。可用的阳离子交换树脂包括强阳离子交换树脂和弱阳离子交换树脂，例如，安玛西亚公司的SP Sepharose Fast Flow和CM SepharoseFast Flow。目标蛋白α1-PI流过阳离子交换树脂，剩余的绝大部分杂蛋白被吸附而得以除去。收集阳离子交换层析柱流出液，通过超滤或透析处理，经配方后除菌过滤，然后装瓶冻干及密封保存，作为纯化的具有抑制蛋白酶作用的药物。
同一构思的上述方法可以进行如下的改变：具有抑制蛋白酶作用之药物的制备方法，其特征在于：将含有α1-PI的水溶液经病毒灭活处理后，首先使α1-PI流过阳离子交换树脂，随后被阴离子交换树脂所吸附，并令有活性的α1-PI从阴离子交换树脂上有选择性地洗脱下来，得到具有抑制蛋白酶作用的药物。上述两种方法效果基本相同。
含有α1-PI的水溶液的病毒灭活处理通过加入具有病毒灭活作用的化学试剂进行孵放来完成的。具有病毒灭活作用的化学试剂加入到含有α1-PI的水溶液，在摄氏0度与摄氏50度之间孵放一个小时以上。病毒灭活处理前可加入相应稳定剂。
具有病毒灭活作用的化学试剂是有机溶剂和去污剂(S/D)。其中所用的去污剂是非离子化的。具有病毒灭活作用的化学试剂还包括：辛酸以及辛酸盐，等等。病毒灭活处理过程中常用的稳定剂是2％-50％的蔗糖和0.001M-0.50M的柠檬酸钠。
最常用的有机溶剂是磷酸三丁酯，最常用的去污剂是TritonX-100。另外，吐温80(Tween 80)也是常用的去污剂。所加入的磷酸三丁酯的终浓度在0.01％与10.0％之间，同时加入的Triton X-100的终浓度在0.01％与10.0％之间。
具有抑制蛋白酶作用的药物的检测方法是应用丝氨酸蛋白酶与α1-PI反应而引起相应波长的光吸收变化，从而定量测定α1-PI的活性。丝氨酸蛋白酶与底物反应引起相应波长的光吸收变化，α1-PI通过抑制丝氨酸蛋白酶而改变该波长的光吸收变化，具体方法包括如下步骤：1)利用丝氨酸蛋白酶与α1-蛋白酶抑制物反应；2)测定引起相应波长的光吸收变化；3)依据光吸收变化测得定量的α1-蛋白酶抑制物的活性。
所加入的丝氨酸蛋白酶的终浓度在0.1ppm与100ppm之间，同时加入五倍于该酶重量的相应底物。量度一定时间内该波长的光吸收改变就可定量测定α1-PI的活性。应用丝氨酸蛋白酶检测α1-PI活性的方法称为，丝氨酸蛋白酶抑制力测定法。每个单位的丝氨酸蛋白酶抑制力定义为，与对照相比，在一分钟内，改变相应波长的光吸收1个单位的活性。
最常用的丝氨酸蛋白酶是胰蛋白酶或弹性蛋白酶。其它可用的丝氨酸蛋白酶包括：糜蛋白酶，凝血酶，纤维蛋白溶酶以及胶原酶，等等。高纯度的胰蛋白酶比较容易得到，因而最常用于α1-PI的活性测定。应用胰蛋白酶检测α1-PI活性的方法称为，胰蛋白酶抑制力测定法。在没有抑制物时，胰蛋白酶每分钟的降解产物会增加相应波长的光吸收。每个单位的胰蛋白酶抑制力定义为，与对照相比，在一分钟内，减少相应波长的光吸收1个单位的活性。胰蛋白酶的常用底物是苯甲酰精氨酸乙酯，胰蛋白酶抑制力测定的常用光波长是253nm。
[有益效果]
本发明提供的制备方法有效地实现高收率，保证产品的高纯度和高活性，同时简化工艺，降低成本；检测方法简单易行、灵敏度高。
应用本发明提供的方法与用阴离子交换(DEAE Sepharose CL6BFF)和凝胶过滤(Sephacryl S-200)提纯α1-PI，最后用常规的ELISA方法检测，结果表明本发明提供的方法有效地实现高收率，保证了产品的高纯度和高活性。
现有的α1-PI检测技术通常应用特异性的抗体来定量测定α1-PI，包括放射性免疫扩散法，火箭免疫电泳法和ELISA法。可是，现有的应用特异抗体的技术无法将有活性的α1-PI与无活性的α1-PI区分开来，而且现有的这些技术成本相对比较高。本发明提供的检测方法应用简单的丝氨酸蛋白酶与相应底物的反应定量测定有活性的具有抑制蛋白酶作用的药物，排除了无活性的α1-PI，提高了精确度；同时操作步骤简单，成本相应降低了。
【具体实施方式】
本发明共设计如下反应条件：
表1、反应条件
| 阴离子交换树脂 | 阳离子交换树脂 | |||||||||||
| pH | 5.0 | 6.5 | 8.0 | 9.5 | 11.0 | 12.0 | 4.8 | 5.4 | 7.0 | 9.6 | 11.0 | 12.6 |
| 离子强度(mS/cm) | 0.5 | 2.5 | 4.5 | 6.5 | 8.5 | 10.0 | 0.5 | 1.5 | 3.0 | 6.0 | 8.0 | 10.0 |
下面的实施例应该是对本发明的进一步说明，而不是将本发明限定为所列举的实施例。
实施例1
Cohn氏组分IV加二十倍重量的纯化水溶解后，加入37％蔗糖和0.38M柠檬酸钠作为病毒灭活处理的稳定剂。随后加入终浓度为0.3％的磷酸三丁酯和终浓度为1.0％的Triton X-100在30℃下孵放4个小时。经病毒灭活后，调节pH至6.5后，用水将离子强度降至2.5mS/cm，加到pH 6.5预平衡的DEAE Sepharose Fast Flow层析柱上。应用20mM磷酸二氢钠和100mM氯化钠溶液有选择性地洗脱目标蛋白α1-PI。加大氯化钠的浓度可把强力吸附的杂蛋白，包括铜蓝蛋白，从该离子交换层析柱洗脱下来。DEAE Sepharose Fast Flow树脂经0.5M氢氧化钠消毒后可重复使用。
含α1-PI的洗脱液通过10kD的超滤膜包(Pall Corporation)除去盐分。先用水将离子强度降至2.5mS/cm，再用5mM柠檬酸钠(pH5.4)进行溶液交换。经处理的含α1-PI的溶液加到pH 5.4预平衡的CM Sepharose Fast Flow层析柱上，有活性的α1-PI流过该离子交换树脂而得以纯化。本实施例从4.18克组分IV中纯化出45.3毫克，纯度95.8％的α1-PI。有活性α1-PI的收率高达63.4％。
本实施例应用胰蛋白酶定量测定α1-PI的活性。在没有抑制物时，33.3ppm的胰蛋白酶每分钟降解166.7ppm的苯甲酰精氨酸乙酯所产生的产物会增加253nm的光吸收0.1-0.2个单位。每个单位的胰蛋白酶抑制力定义为，与对照相比，在一分钟内，减少253nm的光吸收1个单位的活性。表2为本例的实验数据。
表2、α1-PI活性
| 总蛋白(mg) | α1-PI活性(收率) | |
| 组分IVDEAE层析CM层析 | 1695.2108.645.3 | 612.0U(100％)432.6U(70.7％)388.1U(63.4％) |
实施例2
溶解的Cohn氏组分IV，用1M盐酸调节pH至5.4，用水调节离子强度至1.5mS/cm，然后加到5mM柠檬酸钠(pH 5.4)预平衡的CM Sepharose Fast Flow层析柱上。收集该离子交换树脂的流出液，调节pH至6.5后，调节离子强度至2.5mS/cm，加到20mM磷酸二氢钠溶液(pH 6.5)预平衡的DEAE Sepharose Fast Flow层析柱上。应用20mM磷酸二氢钠和100mM氯化钠溶液有选择性地洗脱有活性的α1-PI。本实施例从5.34克组分IV中纯化出58.9毫克，纯度92.5％的α1-PI。有活性α1-PI的收率高达81.2％。表3为本例的实验数据。
表3、α1-PI活性
| 总蛋白(mg) | α1-PI活性(收率) | |
| 组分IVCM层析DEAE层析 | 1191.2255.358.9 | 448.7U(100％)408.8U(91.1％)364.5U(81.2％) |
其余的与实施例1相同。
Claims (2)
1、一种具有抑制蛋白酶作用的药物的检测方法，该方法包括步骤：1)利用丝氨酸蛋白酶与α1-蛋白酶抑制物反应；2)测定引起相应波长的光吸收变化；3)依据光吸收变化测得定量的α1-蛋白酶抑制物的活性。
2、根据权利要求1所述的检测方法，其中丝氨酸蛋白酶是胰蛋白酶、弹性蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶、纤维蛋白溶酶或胶原酶。
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