DE3018901A1 - Verfahren zur herstellung von immunoglobulinderivaten - Google Patents

Verfahren zur herstellung von immunoglobulinderivaten

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DE3018901A1 DE19803018901 DE3018901A DE3018901A1 DE 3018901 A1 DE3018901 A1 DE 3018901A1 DE 19803018901 DE19803018901 DE 19803018901 DE 3018901 A DE3018901 A DE 3018901A DE 3018901 A1 DE3018901 A1 DE 3018901A1
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Description

  • Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten
  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten. Insbesendere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten, die eine verringerte Aptikomplementaktivität besitzen und infolgedessen intravenös verabfolgt werden können.
  • Immunoglobuline sind von großer medizinischer Bedeutung als für die Humoralimmunität verantwortliche Mittel und besitzen eine Immunaktivität gegen verschiedene pathogene Mikroorganismen. Die Verabfolgung von Immunoglobulin kann deshalb zur Verhinderung und Behandlung von Virusinfektionen wie Masern und viraler Hepatitis und von durch gegenUber Antibiotika resistenten Bakterien wie Staphylococci bewirkten Infektionen führen. Die Verabfolgg von aus menschlichem Plasma fraktionierten Immunnoglobulinen ist auf die intramus'Kuläre Injektion beschränkt. Dies verursacht den Fehler, daß lediglich ein Teil des båtzierten Immunoglobulins in den Körper eindringt und das in dieser Weise injizierte Immunoglobulin nicht rasch wirkend ist und ferner nicht in großer Menge verabfolgt werden kann. Die intravenöse Injektion von Immunoglobulinen is+ zwar frei von derartigen Fehlern, stellt jedoch neue Probleme von Nebeneffkten wie heftige pyrogene udd kardiovasculine Reaktionen auf. Diese Neigung ist besonders ausgeprägt bei Patienten von Agammaglobulinämie. Diese Nebeneffekte aufgrund intravenöser Injektionen sind auf die bei der Immunoglobulinfraktionierung asgebildeten aggregierten Immunoglobuline zurückzuführen. Die aggregierten Immunoglobuline iiaben eine erhöhte Antikomplementaktivität, d.h. eine erhöhte Fähigkeit zur Eombinierung mit den Komplementen im Plasma. Diese Eombination verursacht die Ausbildung von anaphylaktischen Faktoren innerhalb des E7pers, wodurch wioderum die vorstehend abgehandelten Nebeneffekte eingeleitet werden. Ausgedehnte Untersuchungen wurden deshalb unternommer, um Immunoglobuline mit einer verringerten Antikomplement3ktivität, welche zur intravenösen Ionisierung fähig sind, zu erhalten.
  • Ein besonders gutes Verfahren unter diesen üblichen vorgeschlagenen Verfahren umfaßt die Umsetzung eines Immunoglobulins mit einem Sulfition in Gegenwart bestimmter Oxidationsmittel, um mindestens eine Interkettendisultidbindung des Immunoglobulins zu spalten. Das nach diesem Verfahren erhalteine Immunoglobulinderivat hat eine sehr niedrige Antikomplementaktivität und kann praktisch ohne wesentlichen Nebeneffekte intravenös injiziert werden. Ferner ist diees Immunoglobulinderivat durch eine langdauernde pharmakologische Wirkung und eine sehr hohe Sicherheit ausgszeichnet, da es zu dem ursprünglichen Immunoglobulin innerhalb des Körpers des Patienten wiederhergestellt wird.
  • Bisher wurden Alkalitetrathionate (japanische Patentveröffentlichung 121421/75) oder Jodosobenzoesäure, Alkalisalze hiervon, Kupfer-II-ionen und molekularer Sauerstoff (japanische Patentveröffentlichung 1630/76) als Oxidationsmittel zur Anwendung bei der Umsetzung zur Spaltung der Interkettendisulfidbindung von Immunoglobulinen vorgeschlagen.
  • Das Verfahren unter Anwendung von Kupfer-II-ionen ist zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten für die intravenöse Injektion ungünstig, da es äußerst schwierig ist, das hupfer-II-ion aus dem Reastionsprodukt zu entfernen,und die Antikörpeiak+ivität des Produktes verringert ist. In gleicher Weise ist das Verfahrcn der Anwendung von molekularem Sauerstoff ungünstig zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten für die intravenöse Injektion, da die in das Reaktionsgemisch eingeführten Luftblasen eine Oberflächendenaturierung de Immunoglobuline unter Bildung von agglutinierten Imm-noglobulinen verursachen, Andererselts ist das Verfahren unter Anwendung eines Alkalitetrathionats oder der Jodosobenzoesäure für die Herstellung von Immunoglobulinderivaten für die intravenöse Injektion zu bevorzugen. Die Tetrathionate sind jedoch unstabil und schwierig als hochreine Verbindungen durch übliche Verfahren zu erhalten. Ferner können sie nicht mit vernünftigen Kosten für die industrielle Anwendung erhalten Jodosobenzoesciure wird lediglich als Spezialreagenz hergestellt und ist technisch noch schwieriger zu erhalten als die Tetrathionate. Darüberhinaus ist dessen Preis hoch.
  • Infolgedessen leiden diese Verfahren an den Fehlern, die im wesentlichen den Oxidierverbindungen selbst zuzusc'reiben sindJund sie sind deshalb wirtschaftlich nachteilig.
  • Es wurde gezeigt, daß die Immunoglobulinein fünf Klassen eingeteilt werden könnsn, nämlidi IgG, IgA, IgM, IgD und IgE, wobei der Anteil an IgG mindestens 70 Gew.-% beträgt.
  • Die Immunoglobuline mit Ausnahme von IgM sind jeweils hauptsächlich aus vier Peptidketten aufgebaut, nd einige Disulfidbindungen sind an internen Ketten und an ZwJschenkettenstellen vorhanden. Beispielsweise kann das typischste Immunoglobulin IgG, wenn es mit Papain digeriert wird, in zwei Fragmente ("Fab") mit Antigenbindungsaktivität und ein Fragment ("Fc") mit Komplement- und Gewebsbindurchsaktivität fraktioniert werden. Es wurde auch gefunden, daß IgG aus zwei schweren Ketten (II-Ketten) von Polypeptiden und zwei leichten Ketten (L-Ketten) von Polypeptiden aufgebaut ist, welche stark über Disulfidbindungen und richt-kovalente Bindungen zur Bildung eines Proteinnsleküls mit einem Nolekulargewicht von etwa 160 000 gebunden sind, und daß jedes Molekül etwa 4,5 Interkettendisulfidbindungen und etwa 12 Intrakettendisulfidbindun6en durchschnittlich enthält (B. Frangione & C. Nilstein: J. Mol. Biol. 33, S. 893 (1968)).
  • Im Hinblick auf die Tatsache, daß ein Immunoglobulin aus Polypeptiden mit solch hohem Molekulargewicht und komplizierter Struktur aufgebaut ist, ist es tatsächlich überraschend, daß die vorstehenden begrenzten Oxidationsmittel sowie Sulfitionen als Verbindungen aufgefunden wurden, welche die Disulfidbindungen zwischen den leichten Ketten und schweren Ketten des Immunoglobulins spalten, während sie die Gestalt ihrer Moleküle lediglich zu solchem Ausmaß beeinflussen, daß das erhaltene Immunoglobulin zu dem ursprünglichen Immunoglobulins innerhalb des Körpers des Patientens wiederhergestellt wird.
  • Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung führten nun zu der Feststellung von Verbindungen, die zur Erzeugung von Persulfationen in Wasser geeignet sind, als Oxidationsmittel, welche selektiv die Interkettendisulfidbindungen der Immunoglobuline mit Sulfitionen spalten und Iumunoglobuiinderivate ergeben, welche zur Wiederherstellung der ursprünglichen Immunoglobuline innerhalb des Körpers des Patienten fähig sind.
  • Es war bisher nicht bekannt, daß Peroxide als Oxidationsmittel mit einer derartigen Eign-rng verwendet werden können.
  • Eine Aufgabe der Erfindung besteht deshalb in einem neuen Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten, welches die selektive Spaltung der Interkettendisulfidbindungen eines Immunoglobulins umfaßt.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten mit wirtschaftlichen und industriellen Vorteilen, wobei die selektive Spaltung der Interkettendisulfidbindungen eines Immunoglobutin umfaßt wird.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem neuen Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten mit einer zu einem solchen Ausmaß verringerten Antikomplementaktivität, daß sie intravenös injiziert werden können, wobei das Verfahren die selektive Spaltung der Interkettendlsulfidbindungen eines Immunoglobulins durch Sulfitionen und Peroxidionen umfaßt.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem industriell vorteilhaften Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten mit einer in solchem Ausmaß verringerten Antikomplementaktivität, daß sie intravenös injiziert werden können, wobei dieses Verfahren nicht die Anwendung von solchen Verbindungen wie Tetrathionaten oder Jodosobenzoesäure mit den vorstehenden Fehlern und Problemeli umfaßt, sondern wobei dieses Verfahren die selektive Spaltung der Interkettendisulfidbindungen eines Immunoglobulins durch Anwendung von stabilen und billigen Peroxiden, die frei von den vorvtehenden Mängeln und Problemen sind, unter den gleichen milden Reaktionsbe-Bedingungen wie im Fall der Anwendung der Tetrathionate umfaßt.
  • Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung ergeben sich auE der folgenden Beschreibung.
  • Die Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden mittels eines Verfahrens zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten mit einer verringerten Antikomplementaktivität erzielt, wobei ein natives Immunoglobulin mit einem Sulfition in Gegenwart von Oxidationsmitteln zur Spaltung mindestens eier lnterkettendisulfidbindung des nativen Immunoglobulins behandelt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß als Oxidationsmittel eine Verbindung, die zur Bildung eines Persulfations in Wasser fähig ist, verwendet wird.
  • Das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete native Immunoglobulin kann aus menschlichem Plasma beispielsweise nach dem Frakticnierverfahren von Col.m und Mitarbeitern (E.G. Cohn und Mitarbeiter: J. Am. Chem. Soc. 68, S. 459 (1946)) erhalten werden.
  • Cohn und Mitarbeiter fraktionierten eine große Menge von menschlichem Plasma durch Äthanolausfällung. Die Fraktion II besteht überwiegerd aus IgG und enthalt geringere Nengen an IgA und IgM und zeigt Antikörperaktivität gegen verschiedene Mikroorganismen, die Infektionslaankheiten verursachen.
  • Beim erfindungsgemäßen Verfahrer: wird die Fraktion II (Immunoglobulin mit einem Molekulargewicht von etwa 160 000, das überwiegend aus der 7S-I(omponente besteht), welches durch Niederternperaturäthanolfraktion gemäß Cohn und Mitarbeiter erhalten wurde, besonders bevorzug Das erfindungsgemäße Verfahren wird durchgeführt, indem das native Immunoglobulin mit einem Sulfition in Wasser in Gegenwart eines Oxidationsmittels behandelt wird.
  • Das Reaktionsmedium ist in keiner Weise auf Wasser beschränkt, und andere wäßrige Medien können verwendet werden, die die Reaktion beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht nachteilig beeinflussen.
  • Das charakteristischerweise im Rahmen der Erfindung verwendete Oxidationsmittel ist eine Verbindung, die zur Erzeugung eines Persulfations fähig ist. Ausgangsmaterialien für das Persulfation können sämtliche Verbindungen sein, die ein Persulfation in Wasser erzeugen. Geeignete Ausgangsmaterialien für das Persulfation sind Salze der Perschwefelsäure (Peroxodischwefelsäure) wie Natriumpersulfat (Na2S208), Kaliumpersulfat (K>S208) und Ammoniumpersulfat L(MI4)2S208 Die Untersuchungen im Rahmen der Erfindung zeigten, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bei Anwendung einer Verbindung, die zur Erzeugung von Persulfationen fähig ist, Immunoglobulinderivate mit Antikomplementaktivität, die praktisch zu dem gleichen Ausmaß wie bei Immunoglobulinderivaten verringert ist, welche durch das übliche Verfahren unter Anwendung eines Tetrathionats gewonnen wurde, erhalten werden und riß auch ein Imaunoglobulinderivat mit einer verringesten Antikomplementaktivität erhalten werden kann, welches weit besser ist als die bei Anwendung der üblichen Oxidationsmittel wie Wasserstoffperoxid, Eisen-III-ionen oder Mangandioxid erhaltenen Immunoglobulinderivate.
  • Bisher war kein Verfahren zur Spaltung der interkettendisulfidbindungen eines nativen Immunoglobulins durch Behandlung desselben mit einem Peroxid, wie einer Verbindung, welche Persulfationen erzeugt, bekannt. Deshalb ist es tatsächlich überraschend, Jaß mindestens einc Interkettendisulfidbindung eines nativen Immunoglobulins bei dem Verfahren gemäß der Erfindung unter Anwendung einer Verbindung, dfe zur Erzeugung von Persulfationen fähig iet, gespalten wird und ein Immunoglobulinderivat mit einer in solchem Ausmaß verrringerten Antikomplementaktivität ergibt, daß es intravenös injiziert werden kann.
  • Ein weiteres charakteristisches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Anwendung von Verbindungen, die zur Erzeugung von Persulfationen in Wasser fähig sind, liegt darin, daß die Persulfationen ergebenden Verbindungen leicht zu handhaben sind, weil sie relativ stabil sind, und daß, weil diese Verbindungen im Industriema,ßstab hergestellt werden und mit niedrigen Kosten erhältlich sind, das Verfahren wirtschaftlich besonders vorteilhaft ist.
  • Bei Anwendung der Verbindung, die zur Erzeugung von Sulfitionen n Wasser fähig ist, wird das Sulfition im erfindungsgemäßen Reaktionssystem ausgebildet.
  • Sämtliche Verbindungen, welche ein Sulfition in Wasser erzeugen können, können erfindungsgemäß eingesetzt werden.
  • Bevorzugt werden Verbindungen, die keine Toxizität in vivo zeigen, wie shwefelige Säure, Natriumsulfit, Natriumhydrogensulflt, Kaliumsulfit, Kaliumhydrogensulfit, Natriummetabisulfit und Kaliurnm"tabisulfit.
  • Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren ausgeführt, indem ein natives Immunoglobulin in Wasser, vorzu:3weise einer Pufferlösung mit einem darin gelösten Neutralsalz oder einer Lösung mit einem Stabilisatcr oder einem darin gelösten Auflösungshilfsmittel wie Glycin aufgelost wird und anschließend eine zur Erzeugung eines Sulfitions iähige Verbindung und eine zur Erzeugung eines Persulfations fähige Verbindung zu dem Reaktionssystem zugesetzt wird.
  • Die geeignete Menge der zur Erzeugung des Sulfitions fähigen Verbindung beträgt mindestens 2 Mol, vorzugsweise 20 bis 12u Mol, je Mol der zu spaltenden Interkettendisulfidbindung.
  • Die geeignete Menge der zur Erzeugung des Persulfations fähigen Verbindung beträgt mindestens 1 Pool, vorzugsweise 5 bis 30 Mol, je Mol der zu spaltenden Interkettendisulfidbindung.
  • Der pH-Wert des Reaktionssystems beträgt vorzugsweise 4 bis 10, insbesondere 6 bis 9. Bei einem pH-Wert von weniger als 4 zeigt sich eine Neigung zur Spaltung der Interkettendisulfidbindungen im Fc-Teil des nativen Inmiunoglobulins. Bei einem pH-Wert oberhalb 10 wird das das Glovalin bildende Protein denaturiert und es werden unerwünschte Ergebnisse wie gehemmte Verringerung der Antikomplementaktivität und Verringerung der Antigenbindungsaktilrität erzielt.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhafterweise bei Temperaturen von nicht mehr als 55 0C durchgeführt.
  • Ublicherweise werden Temperaturen von 10 bis 500C bevorzugt, obwohl auch niedrigere Temperaturen angewandt werden können. 55 oC überschreitende Temperaturen sollten allgemein vermieden werden, da bei diesen Temperaturen das native Immunoglobulin üblicherweise eine Denaturierung erleidet und eine Spaltung der Intrakettendisulfidbindungen stattzufinden beginnt.
  • Beim erfindungsgemäßen Verfahren sollte die Anwendung eines Prcteinperturbiermittels wie Harnstoff oder Guanidin möglichst vermieden werden.
  • Die Reaktionszeit ist abt'gängig von solchen Faktoren wie Art des Immunoglobulins, der Menge der Reagenzien, der Reaktionstemperatur und der Anwesenheit eines Proteinperturbiermittels. Allgemein beträgt die Zeit von 0,5 bis 24 Stunden.
  • Es besteht keine kritische Reihenfolge des Zusatzes der Reagenzien zum Reaktionssystem der Erfindung.
  • Das gewünschte Immunogiobulinderivat lcann durch Dialyse des Reaktionsgemisches nach der Reaktion in Salzlösung oder einer geeigneten Pufferlösung wie einer Salzlösung mit einem Gehalt von 0,01 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) und 2,5 % Glycin oder Ausfällung des Immunoglobulinderivates mit einem geeigneten Salz wie Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat unter Abtrennung desselben von den Reagenzien erhalten werden.
  • Eine gewisse Menge an aggregierten Immunoglobulinen, die während der Reaktion erzeugt sind, kann günstigerweise bei der Reinigung der erhaltenen Immunoglobulinderivate unter Anwendung eines üblichen Reinigungsverfahrens für Serumprotein wie Aussaizungs- und Chromatographierverfahren wie Säulenchromatographie auf einer Säule eines geeigneten Harzes wie Sephadex G-75 unter Anwendung eines Lösungsmittels wie 1 m-lOropionsäure entfernt werden.
  • Nach dem erfindungEgemäEen Verfahren ergibt sich somit ein Immunoglobulinderivat auf Grund der Spaltung mindestens einer Interkettendisulfidbindung eines nativen Immunoglobulins, vorzugsweise ein Immunoglobulinderivat auf Grund der Spaltung von 3 bis 4,5, insbesondere 4,5, Interkettendisulfidbindungen durchschnittlich des nativen Immunoglobulins.
  • Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung zeigten, daß das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Immunoglobulinderivat ein Immunoglobulinderivat ist, welches sich auf Grund der S-Sulfonierung (S-S03 ) eines nativen Immunoglobulins infolge der Spaltung der Interkettendisulfidbindungen des nativen Immunoglobulins ergibt und welches intravenös injiziert werden kann, da es eine solche Gestalt besitzt, daß es zum nativen Immunoglobulin innerhalb des Körpers des Patienten wiederhergestellt wird und da es weiterhin eine Fc-Aktivität und verschiedene Antikörperaktivitäten und eine sehr niedrige Antikomplementaktivität besitzt.
  • Die Anzahl der S-Sulfonatgruppen (-S-S03 ) in dem Immunoglobulinderivat gemäß der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise bei der Ausübung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Anwendung von radioaktivem Natriumsulfit und Bestimmung der mit 35 S markierten S-Sulfonatgruppen in dem erhaltenen Immunoglobulinderivat mittels eines Flüssigkeitsszintilationszählers bestimmt werden.
  • Die Hälfte der durchschnittlichen Anzahl der markierten S-Sulfonatgruppen je Molekül des in dieser Weise bestimmten Immunoglobulinerivats entspricht der durchschnittlichen Anzahl von gespaltenen Interkettendisulfidbindungen in dem nativen Ausgangsimmunoglobulin.
  • Ein Immunoglobulin mit dem Gehalt von etwa 9 S-Sulfonatgruppen je Molekül durchschnittlich, d.h. ein durch Spaltung von 4,5 Disulfidbindungen durchschnittlich des nativen Immunoglobulins und S-Sulfonierung der gebildeten Schweelatome gemäß der Erfindung gebildetes, kann in H-Ketten und L-Ketten unter Anwendung beispielsweise einer Sephadex G-75- oder G-200-Kolonne, vorzugsweise in Gegenwart eines kleinen Menge Harnstoff oder Guanidinaund Propionsäure als Lösungsmittel,wie vorstehend abgehandelt, fraktioniert werden.
  • Jeder Bedingungssatz kann deshalb beim erfindungsgemäßen Verfahren angewandt werden, sofern er die Herstellung von Immunoglobulinderivaten mit einem Gehalt von etwa 9 S-Sulfonatgruppen je Molekül durchschnittlich erlaubt, wobei diese Derivate weiterhin in 11-Ketten und L-Ketten durch die vorstehend abgehandelten säulenchromatographischen Verfahren fraktioniert werden können. Wenn diese Bedingungen einmal empirisch bestimmt wurden, kann die Anzahl an gespaltenen Disulfidbindungen im nativen Immunoglobulin in geeigneter Weise durch Einstellung der Reaktionszeit unter dem gewählten Satz von Bedingungen gesteuert werden.
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung im einzelnen, ohne sie hierauf zu begrenzen.
  • Das iri diesen Beispielen angewandte Ausgangsimmunoglobulin war das folgende: Menschliches natives Immllnoglobulin Eine Lösung von menschlichem Immunoglobulin (Fraktion II) in gepuffertcr Salzlösung (plI neutral) mit dem Gehalt von 2,25 50 Glycin als Produkt der Chemo-Sero-Therapeutic -Research Institute.
  • Antikörperaktivität und Antikomplementaktivität wurden in folgender Weise gemessen: Bestimmung des Antidiphtherieti+rs Reaktion: Es wurde die sensibilisierte passive ilämagglutinationsreaktion (Fußnote 1) angewandt.
  • Verfahren der Bestimmung: Mikroplattentechnik.
  • Blutzellen: Menschliche rot Blutzellen vom 0-Typ (Fußnott 2), die mit Formalin behandelt wurden, wurden mit Bis-diazobenzidin (BDB) behandelt (Fußnote 3) und mit Diphtherietoxoid sensibilisiert.
  • Kontrolle: Standardantitoxin für Diphtherie (NIH Japan) Fußnote 1) NIH-Japan-Verfahren: R. Murata, Nr. 21 Tokyo Veterinarian & Animal Husbandry (1975).
  • Fußnote 2) W.T. Butler: J.Immunol. Bd. 90, S. 663 (1963).
  • Fußnote 3) J. Dordon, B. Rose, A.H. Sehon: J. Exp. Med. Bd. 108, S. 37 (1958).
  • Bestimmung der Antikomplementaktivität: Das in Kabat & Mayer "Experimental Immunochemistry", S. 225 (1961) beschriebene Verfahren wurde angewandt. Eine 1 ziege Immunoglobulinlösung mit dem Gehalt von Meerschweinchenserum 20 CH50/ml auf 5 ml mit GVB++ eingestellt, wurde bei 37C während 1 sud. inkubiert und das verbrauchte Antikomplement wus-de nach dem vorstehenden Verfahren bestimmt.
  • Die Antikomplementaktivitätswerte sind durch den Prozentsatz des Verbrauches gegenüber 20 CH50/ml angegeben.
  • Beispiel 1 50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung (pH 7,6) mit dem Gehalt von 3,75 g gelösten Natriumdisulfid und 50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung (pH 7,6) mit 1,77 g gelöstem Natriumpersulfat (Na2S208) wurden aufeinanderfolgend zu 100 ml einer 2,25 zeigen Glycinlösung mit dem Gehalt von 50 g menschlichem nativen Immunoglobulin zugesetzt und das Gemisch wurde bei 430C während 4,5 Std. gehalten. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch mit physiologischsr Salzlösung dialysiert bis die Konzentration der Reagenzien 0,1 Millimol/Liter oder niedriger betrug. Dabei wurden 7.00 1 einer -äßrigen Lösung eines Immunoglobulinderivates gemäß der Erfindung mit einer Konzentration voa 7,5 % erhalten.
  • Die Antikomplementaktivität C1150 des Produktes als 5 ziege Lösung betrug 18 %. Die Antikomplementaktivität CH50 des menschlicnen nativen Ausgangsimmunoglobulins betrug 9C %.
  • Der Titer des Antidiphterietoxins des erhaltenen Immunoglobulinderivats als 5 %-ige Lösung betrug 9,5 I.U./ml, was demjenigen des nativen Ausgangsimmunoglobulins gleich ist.
  • Um die Anzahl der gespaltenen Interketten<iisulfidbindungen des erhaltenen Immunoglobulinderivates zu bestimmen, wurde das erhaltene Immunoglobulinderivat der Natriumdodecylsulfat-Scheibenelektrophor (SDS-disc electrophoresis) unterworfen. Die Bestimmung erfolgte nach dem Verfahren von Weber und Osborne in J. Biol. Chem.
  • Bd. 244, S. 4406 (1969). Das erhaltene Elektrophoresemuster ist in Fig. 1 gezeigt. In der Fig. 1 und den weiteren Zeichnungen bedeuten (a), (b), (c), (d), (e) und (f) jeweils die Wiede?gaben auf den als II2L2, H2L,H2,HL, H und L wiedergegebenen Peptidketten.
  • Es ist aus Fig. l ersichtlich, daß, obwohl das in diesem Beispiel erhaltene Immunoglobulinderivat einen gewissen Betrag «n Imumgesetzten Material (H2L2) enthielt, es hauptsächlich aus einem Gemisch von H2L-,H2-,IIL- II- und L-Ketten infolge der Spaltung der Interkettendisulfidbindungen aufgebaut war. slit H und L sind II- bzw. L-Ketten des Immunoglobulins bezeichnet. Beispielsweise ist ein Immunoglobulinderivat, welches auf Grund der Spaltung einer Disulfidbindung zwischen den H- und Ketten eines Immunoglobulins (H2L2),das aus -2 H-Ketten und 2 L-Ketten aufgebaut ist, erhalten wurde, ein Gemisch aus H2l-Ketten und L-Ketten.
  • Beispiel 2 20 ml einer physiologischen Salzlösung mit dem Gehalt von 2,5 g gelöstem Natriumsulfid und 20 ml einer physiologischen Salzlösung mit 1,6 g gelösten Ammoniumpersulfat [(MI4)2S2(}83 wurden aufeinanderfolgend zu 100 ml einer 2,25 %-igen Glycinlösung mit dem Gehalt von 10 g menschlichem nativen Immunoglobulin zugesetzt und das Gemisch wurde bei 40°C während 5 Std. gehalten. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch mit physiologischer Salzlösung zur Entfernung der Reagenzien dialysiert, und es wurden 140 ml einer wäßrigen Lösung des Immunoglobulinderivates mit eIner Konzentration von 7 % erhalten. Die Antikomplementaktivität CH5Q des Immunoglobulinderivats als 5 %-ige Lösung betrug 23 %. Das SDS-Scheibenelektrophoresemuster ist in Fig. 2 gezeigt, das praktisch gleich wie in Beispiel l ist, obwohl ein bestimmter Betrag an H2L2-Ketten verblieben ist.
  • Zu 60 ml einer wäßrigen Lösung dieses Produktes wurden 11 ml einer gesättigten wäßrigen Natriumsulfatlösung zugegeben und der erhaltene Niederschlag wurde abzentrifugiert und durch Aussalzen gereinigt. Das gereinigte Immunoglobulinderivat wurde in einer physiologischen Salzlösung, die Glycin in einer Konzentration von 2,25 fo enthielt, zur Herstellung einer 5 %-igen Lösung des lmmunoglobulinderivates gelöst. Die Lösung wurde aseptisch filtriert, in einer Menge von 5,0 ml jeweils in 10 ml-Ampullen gegossen und lyophilisiert. Die Antikomplementaktivität Cm150 des erhaltenen Immunoglobulinderivates bei einer Konzentration von 5 % betrug 15 %.
  • Das folgende Bezugsbeispiel 1 und die VergLeichsbeispiele 1 bis 3 zeigen die Anwendung von Natriumtetrathionat (Bezugsbeispiel 1), Wasserstoffperoxid (Vergleichsbeispiel 1), Mangandioxid (Vergleichsbeispiel 2) und von risen-III-ion£n (Vergleichsbeispiel 3) als Oxidationsmittel.
  • Bezgsbeispiel 1 50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung (pH 7,6) mit 3,75 g gelöstem Natriumsulfit und 50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung (pH 7,6) mit 2,jl g gelöstem Natriumtetrathionat wurden aufeinanderfolgend zu 100 ml einer 2,25 %-igen Glycinlösung mit dem Gehalt von 50 g nativem menschlichen Immunoglobulin zugesetzt und das Gemisch wurde bei 45 0C während 3 Std. gehalten. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch mit physiologischer Salzlösung dialysiert, bis die Konzentration der Resgenzien 0,1 mmol/l oder weniger betrug. Dadurch wurden 200 g einer wäßrigen Lösung eines Immunoglobulinderivates mit einer Konzentration von 7,5 % erhalten. Die Antikomplementaktivität CH5O des erhaltenen Immunoglobulinderivates als 5 %-ige Lösung betrug 18 %.
  • Das SDS-Scheibenelektrophoresemuster des Produktes ist in Fig. 3 gezeigt.
  • Vergleichsbeispiel 1 50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung (pH 7,6) mit 3,75 g gelöstem Natriumsulfit und 50 ml einer phosphatgepufferten physiclogischen Salzlösung mit einem Gehalt von 0,9 ml einer hiermit vermischten 30 %-igen wäßrigen Wasserstoffperoxidlösung wurden aufeinanderfolgend zu 100 ml einer 2,25 zeigen Glycinlösung mit dem Gehalt von 15 g nativem menschlichen Immunoglobulin zugesetzt und das Gemisch wurde bei 450C während 4 Std. gehalten. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch in der gleichen Weise wie in Bezugsbeispiel l dialysiert und es wurden 200 ml einer 7,5 zeigen wäßrigen Lösung eines Immunaglobulinderivats erhalten. Die Antikomplementaktivität CH50 dieses Produktes als 5 ziege Lösung betrug 52 %. Das SDS-Scheibenelektrophoresemuster dieses Produktes ist in Fig. 4 gezeigt.
  • Vergleichsbeispiel 2 Das Bezugsbeispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch 660 mg Mangandioxid anstelle des Natriumtetrathionats verwendet wurden. Dabei wurde ein Immunoglobulinderivat mit einer zueiner Antikomplementaktivität C1150 von 70 % erhalten Die SDS-Scheibenelektrophoreses dieses Produktes zeigte lediglich das Vorhandensein geringer Mengen an H2- und H2L-Ketten.
  • Vergleichsbeispiel 3 25 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung (pH 7,C) mtt 1,3 g gelöstem Natriumsulfit und 25 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung mit 1,0 g gelöstem Eisen-TII-sulfat wurden aufeinanderfolgend zu 50 ml einer 10 zeigten Lösung von menschlichem nativen Immunoglobulin mit dem Gehalt von 2,25 % Glycin zugesetzt und das Gemisch warde bei 45 0C gehalten. Im Verlauf der Umsetzung begann das Reaktionsgemisch trübe zu werden und es wurde keine Reaktion in einem homogenen System erhalten.
  • Der Niederschlag wurde en+fernt und die erhaltene Lösung wurde gründlich dialysiert, wobei 90 ail einer hellgelbbräunlichen Lösung eines Immunoglobulinderivates erhalten wurden. Die Antikompleentaktjvität CH50 dieses Produktes betrug 50 . Die SDS-Elektrophorese zeigte, daß einige H- und L-Ketten vorlagen, daß das Produkt jedoch hauptsächlich aus H2-, H2L- und H2L2-Ketten bestand. Die SDS-Scheibenelektrophoresemuster der Fig. 1 und 2 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zeigten eine gute tDereinstimmung mit demjneigen der Fig. 3 (Bezugsbeispiel 1). Es ist hieraus ersichtlich, daß das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Immunoglobulinderivat sich auf Grund der Spaltung von Interkettendisulfidbindungen eines nativen Immunoglobulins praktisch wie im Fall der Anwendung von Natriumtetrathiot als Oxidationsmittel ergibt.
  • Es ist bekannt, daß bei dem Versuch von Bezugsbeispiel 1 -(toter Anwendung eines Sulfitions und eines Tetrathionations) die gespaltenen Disulfidbindungen des Immunoglobulins S-sulfOniert sind (-S-S03 ) (siehe U5-Patentschrift 4 059 571).
  • Die nach dem erfindungsgemäEen Verfahren erhältlichen ImmunoglobulindeIivate zeigten praktisch das gleiche Muster bei der SDS-Scheibenelektrophorese wie es in Bezugsbeispiel 1 erhalten wird. DieseQatsache und die Art des eingesetzten Oxidationsmittels führen zu der theoretischen Annahme, daß die gespaltenen Disulfidbindungen S-suifoniert sind.
  • Es zeigt sich aus einem Vergleich der Fig. l und 2 mit der Fig. 4 (Vergleichsheispiel 1) und den Ergebnissen der Vergleichsbeispiele 2 und 3, daß, während das erfindungsgemäße Verfahren Immunoglobulinderivate infGlge der selektiven Spaltung der Interkettendisulfidbindungen eines nativen Immunoglobulins ergeben, bei Anwendung von Wasserstoffperoxid, Mangandioxid oder Eisen-III-ionen, die an sich bekannte Oxidationsmittel sind, lediglich Immunoglobulindcrivate mit einer hohen Antikomplementaktivität erhalten werden, die fur die intravenöse Injektion ungeeignet sind, da die Spaltung der Interkettendisulfidbindungen des nativen Immunoglobulins unzureichend ist.
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Claims (2)

  1. Patentansprüche 4) Verfahren zur Eerstellung von Immunoglobulinderivaten mit verringerter Antikomplementaktivität, wobei ein natives Immunoglobulin mit Sulfitionen in Gegenwart eines Oxidationsmittels zur Spaltung mindestens einer Interkettendisulfidbindung des nativen Immunoglobulins behandelt wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Oxidationsmittel eine Verbindung, die zu Erzeugung von Persulfationen in Wasser fähig ist, verwendet wird.
  2. 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindung, die zur Erzeugung von Persulfationen in Wasser fähig ist, Natriumpersulfat, Kaliumpersulfat oder Ammoniumpersulfat verwendet werden.
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