-
Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten
-
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten.
Insbesendere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten,
die eine verringerte Aptikomplementaktivität besitzen und infolgedessen intravenös
verabfolgt werden können.
-
Immunoglobuline sind von großer medizinischer Bedeutung als für die
Humoralimmunität verantwortliche Mittel und besitzen eine Immunaktivität gegen verschiedene
pathogene Mikroorganismen. Die Verabfolgung von Immunoglobulin kann deshalb zur
Verhinderung und Behandlung von Virusinfektionen wie Masern und viraler Hepatitis
und von durch gegenUber Antibiotika resistenten Bakterien wie Staphylococci bewirkten
Infektionen führen. Die Verabfolgg von aus menschlichem Plasma fraktionierten Immunnoglobulinen
ist auf die intramus'Kuläre Injektion beschränkt. Dies verursacht den Fehler, daß
lediglich ein Teil des båtzierten Immunoglobulins in den Körper eindringt und das
in dieser Weise injizierte Immunoglobulin nicht rasch wirkend ist und ferner nicht
in großer Menge verabfolgt werden kann. Die intravenöse Injektion von Immunoglobulinen
is+ zwar frei von derartigen Fehlern, stellt jedoch neue Probleme von Nebeneffkten
wie heftige pyrogene udd kardiovasculine Reaktionen auf. Diese Neigung ist besonders
ausgeprägt bei Patienten von Agammaglobulinämie. Diese Nebeneffekte aufgrund intravenöser
Injektionen sind auf die bei der Immunoglobulinfraktionierung asgebildeten aggregierten
Immunoglobuline zurückzuführen. Die aggregierten Immunoglobuline iiaben eine erhöhte
Antikomplementaktivität, d.h. eine erhöhte Fähigkeit zur Eombinierung mit den Komplementen
im Plasma. Diese Eombination verursacht die Ausbildung von anaphylaktischen Faktoren
innerhalb des E7pers, wodurch wioderum die vorstehend abgehandelten Nebeneffekte
eingeleitet werden. Ausgedehnte Untersuchungen wurden deshalb unternommer, um Immunoglobuline
mit einer verringerten Antikomplement3ktivität, welche zur intravenösen Ionisierung
fähig sind, zu erhalten.
-
Ein besonders gutes Verfahren unter diesen üblichen vorgeschlagenen
Verfahren umfaßt die Umsetzung eines Immunoglobulins mit einem Sulfition in Gegenwart
bestimmter Oxidationsmittel, um mindestens eine Interkettendisultidbindung des Immunoglobulins
zu spalten. Das nach diesem Verfahren erhalteine
Immunoglobulinderivat
hat eine sehr niedrige Antikomplementaktivität und kann praktisch ohne wesentlichen
Nebeneffekte intravenös injiziert werden. Ferner ist diees Immunoglobulinderivat
durch eine langdauernde pharmakologische Wirkung und eine sehr hohe Sicherheit ausgszeichnet,
da es zu dem ursprünglichen Immunoglobulin innerhalb des Körpers des Patienten wiederhergestellt
wird.
-
Bisher wurden Alkalitetrathionate (japanische Patentveröffentlichung
121421/75) oder Jodosobenzoesäure, Alkalisalze hiervon, Kupfer-II-ionen und molekularer
Sauerstoff (japanische Patentveröffentlichung 1630/76) als Oxidationsmittel zur
Anwendung bei der Umsetzung zur Spaltung der Interkettendisulfidbindung von Immunoglobulinen
vorgeschlagen.
-
Das Verfahren unter Anwendung von Kupfer-II-ionen ist zur Herstellung
von Immunoglobulinderivaten für die intravenöse Injektion ungünstig, da es äußerst
schwierig ist, das hupfer-II-ion aus dem Reastionsprodukt zu entfernen,und die Antikörpeiak+ivität
des Produktes verringert ist. In gleicher Weise ist das Verfahrcn der Anwendung
von molekularem Sauerstoff ungünstig zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten
für die intravenöse Injektion, da die in das Reaktionsgemisch eingeführten Luftblasen
eine Oberflächendenaturierung de Immunoglobuline unter Bildung von agglutinierten
Imm-noglobulinen verursachen, Andererselts ist das Verfahren unter Anwendung eines
Alkalitetrathionats oder der Jodosobenzoesäure für die Herstellung von Immunoglobulinderivaten
für die intravenöse Injektion zu bevorzugen. Die Tetrathionate sind jedoch unstabil
und schwierig als hochreine Verbindungen durch übliche Verfahren zu erhalten. Ferner
können sie nicht mit vernünftigen Kosten für die industrielle Anwendung erhalten
Jodosobenzoesciure
wird lediglich als Spezialreagenz hergestellt und ist technisch noch schwieriger
zu erhalten als die Tetrathionate. Darüberhinaus ist dessen Preis hoch.
-
Infolgedessen leiden diese Verfahren an den Fehlern, die im wesentlichen
den Oxidierverbindungen selbst zuzusc'reiben sindJund sie sind deshalb wirtschaftlich
nachteilig.
-
Es wurde gezeigt, daß die Immunoglobulinein fünf Klassen eingeteilt
werden könnsn, nämlidi IgG, IgA, IgM, IgD und IgE, wobei der Anteil an IgG mindestens
70 Gew.-% beträgt.
-
Die Immunoglobuline mit Ausnahme von IgM sind jeweils hauptsächlich
aus vier Peptidketten aufgebaut, nd einige Disulfidbindungen sind an internen Ketten
und an ZwJschenkettenstellen vorhanden. Beispielsweise kann das typischste Immunoglobulin
IgG, wenn es mit Papain digeriert wird, in zwei Fragmente ("Fab") mit Antigenbindungsaktivität
und ein Fragment ("Fc") mit Komplement- und Gewebsbindurchsaktivität fraktioniert
werden. Es wurde auch gefunden, daß IgG aus zwei schweren Ketten (II-Ketten) von
Polypeptiden und zwei leichten Ketten (L-Ketten) von Polypeptiden aufgebaut ist,
welche stark über Disulfidbindungen und richt-kovalente Bindungen zur Bildung eines
Proteinnsleküls mit einem Nolekulargewicht von etwa 160 000 gebunden sind, und daß
jedes Molekül etwa 4,5 Interkettendisulfidbindungen und etwa 12 Intrakettendisulfidbindun6en
durchschnittlich enthält (B. Frangione & C. Nilstein: J. Mol. Biol. 33, S. 893
(1968)).
-
Im Hinblick auf die Tatsache, daß ein Immunoglobulin aus Polypeptiden
mit solch hohem Molekulargewicht und komplizierter Struktur aufgebaut ist, ist es
tatsächlich überraschend, daß die vorstehenden begrenzten Oxidationsmittel sowie
Sulfitionen als Verbindungen aufgefunden wurden, welche die Disulfidbindungen zwischen
den leichten Ketten und schweren Ketten des Immunoglobulins spalten, während sie
die Gestalt ihrer Moleküle lediglich zu solchem Ausmaß beeinflussen, daß das erhaltene
Immunoglobulin zu dem ursprünglichen
Immunoglobulins innerhalb
des Körpers des Patientens wiederhergestellt wird.
-
Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung führten nun zu
der Feststellung von Verbindungen, die zur Erzeugung von Persulfationen in Wasser
geeignet sind, als Oxidationsmittel, welche selektiv die Interkettendisulfidbindungen
der Immunoglobuline mit Sulfitionen spalten und Iumunoglobuiinderivate ergeben,
welche zur Wiederherstellung der ursprünglichen Immunoglobuline innerhalb des Körpers
des Patienten fähig sind.
-
Es war bisher nicht bekannt, daß Peroxide als Oxidationsmittel mit
einer derartigen Eign-rng verwendet werden können.
-
Eine Aufgabe der Erfindung besteht deshalb in einem neuen Verfahren
zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten, welches die selektive Spaltung der
Interkettendisulfidbindungen eines Immunoglobulins umfaßt.
-
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem Verfahren zur
Herstellung von Immunoglobulinderivaten mit wirtschaftlichen und industriellen Vorteilen,
wobei die selektive Spaltung der Interkettendisulfidbindungen eines Immunoglobutin
umfaßt wird.
-
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem neuen Verfahren
zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten mit einer zu einem solchen Ausmaß verringerten
Antikomplementaktivität, daß sie intravenös injiziert werden können, wobei das Verfahren
die selektive Spaltung der Interkettendlsulfidbindungen eines Immunoglobulins durch
Sulfitionen und Peroxidionen umfaßt.
-
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem industriell vorteilhaften
Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten mit einer in solchem Ausmaß
verringerten
Antikomplementaktivität, daß sie intravenös injiziert
werden können, wobei dieses Verfahren nicht die Anwendung von solchen Verbindungen
wie Tetrathionaten oder Jodosobenzoesäure mit den vorstehenden Fehlern und Problemeli
umfaßt, sondern wobei dieses Verfahren die selektive Spaltung der Interkettendisulfidbindungen
eines Immunoglobulins durch Anwendung von stabilen und billigen Peroxiden, die frei
von den vorvtehenden Mängeln und Problemen sind, unter den gleichen milden Reaktionsbe-Bedingungen
wie im Fall der Anwendung der Tetrathionate umfaßt.
-
Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung ergeben sich auE der
folgenden Beschreibung.
-
Die Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden mittels eines Verfahrens
zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten mit einer verringerten Antikomplementaktivität
erzielt, wobei ein natives Immunoglobulin mit einem Sulfition in Gegenwart von Oxidationsmitteln
zur Spaltung mindestens eier lnterkettendisulfidbindung des nativen Immunoglobulins
behandelt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß als Oxidationsmittel eine Verbindung,
die zur Bildung eines Persulfations in Wasser fähig ist, verwendet wird.
-
Das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete native Immunoglobulin
kann aus menschlichem Plasma beispielsweise nach dem Frakticnierverfahren von Col.m
und Mitarbeitern (E.G. Cohn und Mitarbeiter: J. Am. Chem. Soc. 68, S. 459 (1946))
erhalten werden.
-
Cohn und Mitarbeiter fraktionierten eine große Menge von menschlichem
Plasma durch Äthanolausfällung. Die Fraktion II besteht überwiegerd aus IgG und
enthalt geringere Nengen an IgA und IgM und zeigt Antikörperaktivität gegen verschiedene
Mikroorganismen, die Infektionslaankheiten verursachen.
-
Beim erfindungsgemäßen Verfahrer: wird die Fraktion II (Immunoglobulin
mit einem Molekulargewicht von etwa 160 000, das überwiegend aus der 7S-I(omponente
besteht), welches durch Niederternperaturäthanolfraktion gemäß Cohn und Mitarbeiter
erhalten wurde, besonders bevorzug Das erfindungsgemäße Verfahren wird durchgeführt,
indem das native Immunoglobulin mit einem Sulfition in Wasser in Gegenwart eines
Oxidationsmittels behandelt wird.
-
Das Reaktionsmedium ist in keiner Weise auf Wasser beschränkt, und
andere wäßrige Medien können verwendet werden, die die Reaktion beim erfindungsgemäßen
Verfahren nicht nachteilig beeinflussen.
-
Das charakteristischerweise im Rahmen der Erfindung verwendete Oxidationsmittel
ist eine Verbindung, die zur Erzeugung eines Persulfations fähig ist. Ausgangsmaterialien
für das Persulfation können sämtliche Verbindungen sein, die ein Persulfation in
Wasser erzeugen. Geeignete Ausgangsmaterialien für das Persulfation sind Salze der
Perschwefelsäure (Peroxodischwefelsäure) wie Natriumpersulfat (Na2S208), Kaliumpersulfat
(K>S208) und Ammoniumpersulfat L(MI4)2S208 Die Untersuchungen im Rahmen der Erfindung
zeigten, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bei Anwendung einer Verbindung,
die zur Erzeugung von Persulfationen fähig ist, Immunoglobulinderivate mit Antikomplementaktivität,
die praktisch zu dem gleichen Ausmaß wie bei Immunoglobulinderivaten verringert
ist, welche durch das übliche Verfahren unter Anwendung eines Tetrathionats gewonnen
wurde, erhalten werden und riß auch ein Imaunoglobulinderivat mit einer verringesten
Antikomplementaktivität erhalten werden kann, welches weit besser ist als die bei
Anwendung der üblichen Oxidationsmittel wie Wasserstoffperoxid, Eisen-III-ionen
oder Mangandioxid erhaltenen Immunoglobulinderivate.
-
Bisher war kein Verfahren zur Spaltung der interkettendisulfidbindungen
eines nativen Immunoglobulins durch Behandlung desselben mit einem Peroxid, wie
einer Verbindung, welche Persulfationen erzeugt, bekannt. Deshalb ist es tatsächlich
überraschend, Jaß mindestens einc Interkettendisulfidbindung eines nativen Immunoglobulins
bei dem Verfahren gemäß der Erfindung unter Anwendung einer Verbindung, dfe zur
Erzeugung von Persulfationen fähig iet, gespalten wird und ein Immunoglobulinderivat
mit einer in solchem Ausmaß verrringerten Antikomplementaktivität ergibt, daß es
intravenös injiziert werden kann.
-
Ein weiteres charakteristisches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens
unter Anwendung von Verbindungen, die zur Erzeugung von Persulfationen in Wasser
fähig sind, liegt darin, daß die Persulfationen ergebenden Verbindungen leicht zu
handhaben sind, weil sie relativ stabil sind, und daß, weil diese Verbindungen im
Industriema,ßstab hergestellt werden und mit niedrigen Kosten erhältlich sind, das
Verfahren wirtschaftlich besonders vorteilhaft ist.
-
Bei Anwendung der Verbindung, die zur Erzeugung von Sulfitionen n
Wasser fähig ist, wird das Sulfition im erfindungsgemäßen Reaktionssystem ausgebildet.
-
Sämtliche Verbindungen, welche ein Sulfition in Wasser erzeugen können,
können erfindungsgemäß eingesetzt werden.
-
Bevorzugt werden Verbindungen, die keine Toxizität in vivo zeigen,
wie shwefelige Säure, Natriumsulfit, Natriumhydrogensulflt, Kaliumsulfit, Kaliumhydrogensulfit,
Natriummetabisulfit und Kaliurnm"tabisulfit.
-
Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren ausgeführt, indem ein
natives Immunoglobulin in Wasser, vorzu:3weise einer Pufferlösung mit einem darin
gelösten Neutralsalz oder einer Lösung mit einem Stabilisatcr oder einem darin gelösten
Auflösungshilfsmittel wie Glycin aufgelost
wird und anschließend
eine zur Erzeugung eines Sulfitions iähige Verbindung und eine zur Erzeugung eines
Persulfations fähige Verbindung zu dem Reaktionssystem zugesetzt wird.
-
Die geeignete Menge der zur Erzeugung des Sulfitions fähigen Verbindung
beträgt mindestens 2 Mol, vorzugsweise 20 bis 12u Mol, je Mol der zu spaltenden
Interkettendisulfidbindung.
-
Die geeignete Menge der zur Erzeugung des Persulfations fähigen Verbindung
beträgt mindestens 1 Pool, vorzugsweise 5 bis 30 Mol, je Mol der zu spaltenden Interkettendisulfidbindung.
-
Der pH-Wert des Reaktionssystems beträgt vorzugsweise 4 bis 10, insbesondere
6 bis 9. Bei einem pH-Wert von weniger als 4 zeigt sich eine Neigung zur Spaltung
der Interkettendisulfidbindungen im Fc-Teil des nativen Inmiunoglobulins. Bei einem
pH-Wert oberhalb 10 wird das das Glovalin bildende Protein denaturiert und es werden
unerwünschte Ergebnisse wie gehemmte Verringerung der Antikomplementaktivität und
Verringerung der Antigenbindungsaktilrität erzielt.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhafterweise bei Temperaturen
von nicht mehr als 55 0C durchgeführt.
-
Ublicherweise werden Temperaturen von 10 bis 500C bevorzugt, obwohl
auch niedrigere Temperaturen angewandt werden können. 55 oC überschreitende Temperaturen
sollten allgemein vermieden werden, da bei diesen Temperaturen das native Immunoglobulin
üblicherweise eine Denaturierung erleidet und eine Spaltung der Intrakettendisulfidbindungen
stattzufinden beginnt.
-
Beim erfindungsgemäßen Verfahren sollte die Anwendung eines Prcteinperturbiermittels
wie Harnstoff oder Guanidin möglichst vermieden werden.
-
Die Reaktionszeit ist abt'gängig von solchen Faktoren wie Art des
Immunoglobulins, der Menge der Reagenzien, der Reaktionstemperatur und der Anwesenheit
eines Proteinperturbiermittels. Allgemein beträgt die Zeit von 0,5 bis 24 Stunden.
-
Es besteht keine kritische Reihenfolge des Zusatzes der Reagenzien
zum Reaktionssystem der Erfindung.
-
Das gewünschte Immunogiobulinderivat lcann durch Dialyse des Reaktionsgemisches
nach der Reaktion in Salzlösung oder einer geeigneten Pufferlösung wie einer Salzlösung
mit einem Gehalt von 0,01 m-Phosphatpuffer (pH 7,4) und 2,5 % Glycin oder Ausfällung
des Immunoglobulinderivates mit einem geeigneten Salz wie Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat
unter Abtrennung desselben von den Reagenzien erhalten werden.
-
Eine gewisse Menge an aggregierten Immunoglobulinen, die während
der Reaktion erzeugt sind, kann günstigerweise bei der Reinigung der erhaltenen
Immunoglobulinderivate unter Anwendung eines üblichen Reinigungsverfahrens für Serumprotein
wie Aussaizungs- und Chromatographierverfahren wie Säulenchromatographie auf einer
Säule eines geeigneten Harzes wie Sephadex G-75 unter Anwendung eines Lösungsmittels
wie 1 m-lOropionsäure entfernt werden.
-
Nach dem erfindungEgemäEen Verfahren ergibt sich somit ein Immunoglobulinderivat
auf Grund der Spaltung mindestens einer Interkettendisulfidbindung eines nativen
Immunoglobulins, vorzugsweise ein Immunoglobulinderivat auf Grund der Spaltung von
3 bis 4,5, insbesondere 4,5, Interkettendisulfidbindungen durchschnittlich des nativen
Immunoglobulins.
-
Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung zeigten, daß
das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Immunoglobulinderivat ein Immunoglobulinderivat
ist, welches sich auf Grund der S-Sulfonierung (S-S03 ) eines nativen Immunoglobulins
infolge der Spaltung der Interkettendisulfidbindungen des nativen Immunoglobulins
ergibt und welches intravenös injiziert werden kann, da es eine solche Gestalt besitzt,
daß es zum nativen Immunoglobulin innerhalb des Körpers des Patienten wiederhergestellt
wird und da es weiterhin eine Fc-Aktivität und verschiedene Antikörperaktivitäten
und eine sehr niedrige Antikomplementaktivität besitzt.
-
Die Anzahl der S-Sulfonatgruppen (-S-S03 ) in dem Immunoglobulinderivat
gemäß der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise bei der Ausübung des erfindungsgemäßen
Verfahrens unter Anwendung von radioaktivem Natriumsulfit und Bestimmung der mit
35 S markierten S-Sulfonatgruppen in dem erhaltenen Immunoglobulinderivat mittels
eines Flüssigkeitsszintilationszählers bestimmt werden.
-
Die Hälfte der durchschnittlichen Anzahl der markierten S-Sulfonatgruppen
je Molekül des in dieser Weise bestimmten Immunoglobulinerivats entspricht der durchschnittlichen
Anzahl von gespaltenen Interkettendisulfidbindungen in dem nativen Ausgangsimmunoglobulin.
-
Ein Immunoglobulin mit dem Gehalt von etwa 9 S-Sulfonatgruppen je
Molekül durchschnittlich, d.h. ein durch Spaltung von 4,5 Disulfidbindungen durchschnittlich
des nativen Immunoglobulins und S-Sulfonierung der gebildeten Schweelatome gemäß
der Erfindung gebildetes, kann in H-Ketten und L-Ketten unter Anwendung beispielsweise
einer Sephadex G-75- oder G-200-Kolonne, vorzugsweise in Gegenwart eines kleinen
Menge Harnstoff oder Guanidinaund Propionsäure als Lösungsmittel,wie vorstehend
abgehandelt, fraktioniert werden.
-
Jeder Bedingungssatz kann deshalb beim erfindungsgemäßen Verfahren
angewandt werden, sofern er die Herstellung von Immunoglobulinderivaten mit einem
Gehalt von etwa 9 S-Sulfonatgruppen je Molekül durchschnittlich erlaubt, wobei diese
Derivate weiterhin in 11-Ketten und L-Ketten durch die vorstehend abgehandelten
säulenchromatographischen Verfahren fraktioniert werden können. Wenn diese Bedingungen
einmal empirisch bestimmt wurden, kann die Anzahl an gespaltenen Disulfidbindungen
im nativen Immunoglobulin in geeigneter Weise durch Einstellung der Reaktionszeit
unter dem gewählten Satz von Bedingungen gesteuert werden.
-
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung im einzelnen, ohne
sie hierauf zu begrenzen.
-
Das iri diesen Beispielen angewandte Ausgangsimmunoglobulin war das
folgende: Menschliches natives Immllnoglobulin Eine Lösung von menschlichem Immunoglobulin
(Fraktion II) in gepuffertcr Salzlösung (plI neutral) mit dem Gehalt von 2,25 50
Glycin als Produkt der Chemo-Sero-Therapeutic -Research Institute.
-
Antikörperaktivität und Antikomplementaktivität wurden in folgender
Weise gemessen: Bestimmung des Antidiphtherieti+rs Reaktion: Es wurde die sensibilisierte
passive ilämagglutinationsreaktion (Fußnote 1) angewandt.
-
Verfahren der Bestimmung: Mikroplattentechnik.
-
Blutzellen: Menschliche rot Blutzellen vom 0-Typ (Fußnott 2), die
mit Formalin behandelt wurden, wurden mit Bis-diazobenzidin (BDB) behandelt (Fußnote
3) und mit Diphtherietoxoid sensibilisiert.
-
Kontrolle: Standardantitoxin für Diphtherie (NIH Japan) Fußnote 1)
NIH-Japan-Verfahren: R. Murata, Nr. 21 Tokyo Veterinarian & Animal Husbandry
(1975).
-
Fußnote 2) W.T. Butler: J.Immunol. Bd. 90, S. 663 (1963).
-
Fußnote 3) J. Dordon, B. Rose, A.H. Sehon: J. Exp. Med. Bd. 108,
S. 37 (1958).
-
Bestimmung der Antikomplementaktivität: Das in Kabat & Mayer
"Experimental Immunochemistry", S. 225 (1961) beschriebene Verfahren wurde angewandt.
Eine 1 ziege Immunoglobulinlösung mit dem Gehalt von Meerschweinchenserum 20 CH50/ml
auf 5 ml mit GVB++ eingestellt, wurde bei 37C während 1 sud. inkubiert und das verbrauchte
Antikomplement wus-de nach dem vorstehenden Verfahren bestimmt.
-
Die Antikomplementaktivitätswerte sind durch den Prozentsatz des Verbrauches
gegenüber 20 CH50/ml angegeben.
-
Beispiel 1 50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung
(pH 7,6) mit dem Gehalt von 3,75 g gelösten Natriumdisulfid und 50 ml einer phosphatgepufferten
physiologischen Salzlösung (pH 7,6) mit 1,77 g gelöstem Natriumpersulfat (Na2S208)
wurden aufeinanderfolgend zu 100 ml einer 2,25 zeigen Glycinlösung mit dem Gehalt
von 50 g menschlichem nativen Immunoglobulin zugesetzt und das Gemisch wurde bei
430C während 4,5 Std. gehalten. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch mit
physiologischsr Salzlösung dialysiert bis die Konzentration der Reagenzien 0,1 Millimol/Liter
oder niedriger betrug. Dabei wurden 7.00 1 einer
-äßrigen Lösung
eines Immunoglobulinderivates gemäß der Erfindung mit einer Konzentration voa 7,5
% erhalten.
-
Die Antikomplementaktivität C1150 des Produktes als 5 ziege Lösung
betrug 18 %. Die Antikomplementaktivität CH50 des menschlicnen nativen Ausgangsimmunoglobulins
betrug 9C %.
-
Der Titer des Antidiphterietoxins des erhaltenen Immunoglobulinderivats
als 5 %-ige Lösung betrug 9,5 I.U./ml, was demjenigen des nativen Ausgangsimmunoglobulins
gleich ist.
-
Um die Anzahl der gespaltenen Interketten<iisulfidbindungen des
erhaltenen Immunoglobulinderivates zu bestimmen, wurde das erhaltene Immunoglobulinderivat
der Natriumdodecylsulfat-Scheibenelektrophor (SDS-disc electrophoresis) unterworfen.
Die Bestimmung erfolgte nach dem Verfahren von Weber und Osborne in J. Biol. Chem.
-
Bd. 244, S. 4406 (1969). Das erhaltene Elektrophoresemuster ist in
Fig. 1 gezeigt. In der Fig. 1 und den weiteren Zeichnungen bedeuten (a), (b), (c),
(d), (e) und (f) jeweils die Wiede?gaben auf den als II2L2, H2L,H2,HL, H und L wiedergegebenen
Peptidketten.
-
Es ist aus Fig. l ersichtlich, daß, obwohl das in diesem Beispiel
erhaltene Immunoglobulinderivat einen gewissen Betrag «n Imumgesetzten Material
(H2L2) enthielt, es hauptsächlich aus einem Gemisch von H2L-,H2-,IIL- II- und L-Ketten
infolge der Spaltung der Interkettendisulfidbindungen aufgebaut war. slit H und
L sind II- bzw. L-Ketten des Immunoglobulins bezeichnet. Beispielsweise ist ein
Immunoglobulinderivat, welches auf Grund der Spaltung einer Disulfidbindung zwischen
den H- und Ketten eines Immunoglobulins (H2L2),das aus -2 H-Ketten und 2 L-Ketten
aufgebaut ist, erhalten wurde, ein Gemisch aus H2l-Ketten und L-Ketten.
-
Beispiel 2 20 ml einer physiologischen Salzlösung mit dem Gehalt
von 2,5 g gelöstem Natriumsulfid und 20 ml einer physiologischen Salzlösung mit
1,6 g gelösten Ammoniumpersulfat [(MI4)2S2(}83 wurden aufeinanderfolgend zu 100
ml einer 2,25 %-igen Glycinlösung mit dem Gehalt von 10 g menschlichem nativen Immunoglobulin
zugesetzt und das Gemisch wurde bei 40°C während 5 Std. gehalten. Nach der Umsetzung
wurde das Reaktionsgemisch mit physiologischer Salzlösung zur Entfernung der Reagenzien
dialysiert, und es wurden 140 ml einer wäßrigen Lösung des Immunoglobulinderivates
mit eIner Konzentration von 7 % erhalten. Die Antikomplementaktivität CH5Q des Immunoglobulinderivats
als 5 %-ige Lösung betrug 23 %. Das SDS-Scheibenelektrophoresemuster ist in Fig.
2 gezeigt, das praktisch gleich wie in Beispiel l ist, obwohl ein bestimmter Betrag
an H2L2-Ketten verblieben ist.
-
Zu 60 ml einer wäßrigen Lösung dieses Produktes wurden 11 ml einer
gesättigten wäßrigen Natriumsulfatlösung zugegeben und der erhaltene Niederschlag
wurde abzentrifugiert und durch Aussalzen gereinigt. Das gereinigte Immunoglobulinderivat
wurde in einer physiologischen Salzlösung, die Glycin in einer Konzentration von
2,25 fo enthielt, zur Herstellung einer 5 %-igen Lösung des lmmunoglobulinderivates
gelöst. Die Lösung wurde aseptisch filtriert, in einer Menge von 5,0 ml jeweils
in 10 ml-Ampullen gegossen und lyophilisiert. Die Antikomplementaktivität Cm150
des erhaltenen Immunoglobulinderivates bei einer Konzentration von 5 % betrug 15
%.
-
Das folgende Bezugsbeispiel 1 und die VergLeichsbeispiele 1 bis 3
zeigen die Anwendung von Natriumtetrathionat (Bezugsbeispiel 1), Wasserstoffperoxid
(Vergleichsbeispiel 1), Mangandioxid (Vergleichsbeispiel 2) und von
risen-III-ion£n
(Vergleichsbeispiel 3) als Oxidationsmittel.
-
Bezgsbeispiel 1 50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung
(pH 7,6) mit 3,75 g gelöstem Natriumsulfit und 50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen
Salzlösung (pH 7,6) mit 2,jl g gelöstem Natriumtetrathionat wurden aufeinanderfolgend
zu 100 ml einer 2,25 %-igen Glycinlösung mit dem Gehalt von 50 g nativem menschlichen
Immunoglobulin zugesetzt und das Gemisch wurde bei 45 0C während 3 Std. gehalten.
Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch mit physiologischer Salzlösung dialysiert,
bis die Konzentration der Resgenzien 0,1 mmol/l oder weniger betrug. Dadurch wurden
200 g einer wäßrigen Lösung eines Immunoglobulinderivates mit einer Konzentration
von 7,5 % erhalten. Die Antikomplementaktivität CH5O des erhaltenen Immunoglobulinderivates
als 5 %-ige Lösung betrug 18 %.
-
Das SDS-Scheibenelektrophoresemuster des Produktes ist in Fig. 3 gezeigt.
-
Vergleichsbeispiel 1 50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen
Salzlösung (pH 7,6) mit 3,75 g gelöstem Natriumsulfit und 50 ml einer phosphatgepufferten
physiclogischen Salzlösung mit einem Gehalt von 0,9 ml einer hiermit vermischten
30 %-igen wäßrigen Wasserstoffperoxidlösung wurden aufeinanderfolgend zu 100 ml
einer 2,25 zeigen Glycinlösung mit dem Gehalt von 15 g nativem menschlichen Immunoglobulin
zugesetzt und das Gemisch wurde bei 450C während 4 Std. gehalten. Nach der Umsetzung
wurde das Reaktionsgemisch in der gleichen Weise wie in Bezugsbeispiel l dialysiert
und es wurden 200 ml einer 7,5 zeigen wäßrigen
Lösung eines Immunaglobulinderivats
erhalten. Die Antikomplementaktivität CH50 dieses Produktes als 5 ziege Lösung betrug
52 %. Das SDS-Scheibenelektrophoresemuster dieses Produktes ist in Fig. 4 gezeigt.
-
Vergleichsbeispiel 2 Das Bezugsbeispiel 1 wurde wiederholt, wobei
jedoch 660 mg Mangandioxid anstelle des Natriumtetrathionats verwendet wurden. Dabei
wurde ein Immunoglobulinderivat mit einer zueiner Antikomplementaktivität C1150
von 70 % erhalten Die SDS-Scheibenelektrophoreses dieses Produktes zeigte lediglich
das Vorhandensein geringer Mengen an H2- und H2L-Ketten.
-
Vergleichsbeispiel 3 25 ml einer phosphatgepufferten physiologischen
Salzlösung (pH 7,C) mtt 1,3 g gelöstem Natriumsulfit und 25 ml einer phosphatgepufferten
physiologischen Salzlösung mit 1,0 g gelöstem Eisen-TII-sulfat wurden aufeinanderfolgend
zu 50 ml einer 10 zeigten Lösung von menschlichem nativen Immunoglobulin mit dem
Gehalt von 2,25 % Glycin zugesetzt und das Gemisch warde bei 45 0C gehalten. Im
Verlauf der Umsetzung begann das Reaktionsgemisch trübe zu werden und es wurde keine
Reaktion in einem homogenen System erhalten.
-
Der Niederschlag wurde en+fernt und die erhaltene Lösung wurde gründlich
dialysiert, wobei 90 ail einer hellgelbbräunlichen Lösung eines Immunoglobulinderivates
erhalten wurden. Die Antikompleentaktjvität CH50 dieses Produktes betrug 50 . Die
SDS-Elektrophorese zeigte, daß einige H- und L-Ketten vorlagen, daß das Produkt
jedoch hauptsächlich aus H2-, H2L- und H2L2-Ketten bestand. Die SDS-Scheibenelektrophoresemuster
der Fig. 1 und 2 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zeigten eine gute tDereinstimmung
mit
demjneigen der Fig. 3 (Bezugsbeispiel 1). Es ist hieraus ersichtlich, daß das bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Immunoglobulinderivat sich auf Grund der
Spaltung von Interkettendisulfidbindungen eines nativen Immunoglobulins praktisch
wie im Fall der Anwendung von Natriumtetrathiot als Oxidationsmittel ergibt.
-
Es ist bekannt, daß bei dem Versuch von Bezugsbeispiel 1 -(toter
Anwendung eines Sulfitions und eines Tetrathionations) die gespaltenen Disulfidbindungen
des Immunoglobulins S-sulfOniert sind (-S-S03 ) (siehe U5-Patentschrift 4 059 571).
-
Die nach dem erfindungsgemäEen Verfahren erhältlichen ImmunoglobulindeIivate
zeigten praktisch das gleiche Muster bei der SDS-Scheibenelektrophorese wie es in
Bezugsbeispiel 1 erhalten wird. DieseQatsache und die Art des eingesetzten Oxidationsmittels
führen zu der theoretischen Annahme, daß die gespaltenen Disulfidbindungen S-suifoniert
sind.
-
Es zeigt sich aus einem Vergleich der Fig. l und 2 mit der Fig. 4
(Vergleichsheispiel 1) und den Ergebnissen der Vergleichsbeispiele 2 und 3, daß,
während das erfindungsgemäße Verfahren Immunoglobulinderivate infGlge der selektiven
Spaltung der Interkettendisulfidbindungen eines nativen Immunoglobulins ergeben,
bei Anwendung von Wasserstoffperoxid, Mangandioxid oder Eisen-III-ionen, die an
sich bekannte Oxidationsmittel sind, lediglich Immunoglobulindcrivate mit einer
hohen Antikomplementaktivität erhalten werden, die fur die intravenöse Injektion
ungeeignet sind, da die Spaltung der Interkettendisulfidbindungen des nativen Immunoglobulins
unzureichend ist.
-
Leerseite