CH644130A5 - Process for the preparation of immunoglobulin derivatives - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Immunoglobulin-Derivats mit reduzierter antikomplementärer Wirksamkeit, das intravenös verabreicht werden kann.

Immunoglobuline sind von grosser medizinischer Bedeutung als Mittel für humorale Immunität und zeigen Immunisierungswirkung gegen verschiedene pathogene Mikroorganismen. Verabreichung von Immunoglobulinen kann daher zu Verhinderung und Behandlung von Virusinfektionen, wie Masern und Virus-Hepatitis und von durch Antibiotika beständigen Bakterien, wie Staphylokokken, erzeugten Infektionen dienen. Verabreichung von aus Humanplasma fraktionierten Immunoglobulinen war auf intramuskuläre Injektion eingeschränkt. Dies führt zum Nachteil, dass nur ein Teil des eingespritzten Immunoglobulins in den Körper eindringt und das solcherart eingespritzte Immunoglobulin keine schnelle Wirkung zeigt und ausserdem nicht in grosser Menge verabreicht werden kann. Intravenöse Injektion von Immunoglobulinen zeigt sicherlich keinen derartigen Nachteil, stellt jedoch ein neues Problem von Nebenwirkungen, wie abrupten und hohen Anstieg der Körpertemperatur oder des Blutdrucks, dar. Diese Tendenz ist besonders ausgesprochen bei Patienten mit Agammaglobulinemia. Diese Nebenwirkungen intravenöser Injektion werden bei der Immunoglobulinfraktionierung gebildeten aggregierten Immunoglobulinen zugeschrieben. Aggregierte Immunoglobuline zeigen erhöhte antikomplementäre Wirksamkeit, d.h. erhöhte Fähigkeit zur Vereinigung mit Komplementärsubstanzen im Plasma. Diese Kombination führt zur Bildung von anaphylaktischen Faktoren im Körper, die ihrerseits die vorstehend genannten Nebenwirkungen einleiten. Demzufolge wurde ausgedehnte Forschung betrieben, um zu Immunoglobulinen reduzierter antikomplementärer Wirksamkeit, die intravenös injiziert werden können, zu gelangen.

Nach einer unter konventionell vorgeschlagenen Methoden besteht eine besonders gute Methode darin, ein Immunoglobulin mit einem Sulfition in Gegenwart eines bestimmten Oxidationsmittels zur Reaktion zu bringen, um mindestens eine Zwischenketten-Disulfidbindung des Immunoglobulins zu spalten. Das nach dieser Methode erhaltene Immunoglobulin-Derivat zeigt eine sehr geringe antikomplementäre Wirksamkeit und kann ohne wesentliche Nebenwirkung intravenös injiziert werden. Ausserdem zeigt dieses Immunoglobulin-Derivat eine lang anhaltende pharmakologische Wirkung und sehr hohe Sicherheit, da es innerhalb des Körpers des Patienten in das ursprüngliche Immunoglobulin rückgeführt wird.

Bisher wurden als Oxidationsmittel für die Reaktion zur Spaltung der Zwischenketten-Disulfidbindungen von Immunoglobulinen Alkalimetall-tetrathionate, wie in der JP-OS 121 421/75 beschrieben, oder Jodosobenzoesäure, Alkalimetallsalze davon, ein Kupfer (II) -Ion und molekularer Sauerstoff, wie in der JP-OS 1630/76 beschrieben, vorgeschlagen. Die Methode unter Verwendung eines Kupfer (Il)-Ions für die Herstellung von Immunoglobulin-Derivaten für intravenöse Injektion ist unerwünscht, da es äusserst schwierig ist, das Kupfer (Il)-Ion aus dem Reaktionsprodukt zu entfernen und die Antikörper-Wirksamkeit des Produktes vermindert ist. Gleichermassen ist die Methode unter Verwendung von molekularem Sauerstoff unerwünscht, da im Reaktionsgemisch gebildete Luftblasen zur Oberflächen-Denaturierung der Immunoglobuline unter Bildung von agglutinierten Immunoglobulinen führen.

Andererseits ist die Methode unter Verwendung eines Alkalimetall-tetrathionats oder von Jodosobenzoesäure für die Herstellung von Immunoglobulin-Derivaten für intravenöse Injektion überlegen. Die Tetrathionate sind jedoch unstabil und nach üblichen Methoden schwierig in Form von hochreinen Verbindungen erhältlich. Ausserdem können sie in industriellem Masstab nicht zu annehmbaren Preisen hergestellt werden. Jodosobenzoesäure wird nur als spezieller Reaktant hergestellt und ist industriell schwieriger herstellbar als Tetrathionate. Ausserdem ist sie sehr teuer. Demzufolge leidet diese Methode immer noch unter den Nachteilen, die im wesentlichen den Oxidationsverbindungen selbst zugeschrieben werden, und ist auch vom wirtschaftlichen Standpunkt aus unvorteilhaft.

Es wurde nachgewiesen, dass Immunoglobuline in fünf Klassen eingeteilt werden können, d.h. IgG, IgA, IgM, IgD und IgE, wobei der Mengenanteil der Klasse IgG mindestens 70% beträgt.

Immunoglobuline ohne Klasse IgM bestehen zur Hauptsache aus 4 Peptitketten, wobei an Inter- und Intraketten-stellen mehrere Disulfidbindungen vorhanden sind. Beispielsweise kann die Klasse IgG, das typischste Immunoglobulin, fraktioniert werden in zwei Fragmente «Fab» mit Antigen-Bindenwirkung und ein Fragment «Fe» mit Komplement- und Gewebe-Bindungswirkung. Es wurde auch gefunden, dass die Klasse IgG aus zwei schweren H-Ketten von Polypeptid und zwei leichten L-Ketten von Polypeptid aufgebaut ist, die über Disulfidbindungen und nicht-kova-lente Bindungen stark verbunden sind unter Bildung eines Proteinmoleküls mit einem Molekulargewicht von etwa 160 000, wobei jedes Molekül etwa 4,5 Interlcetten-Disulfid-bindungen und etwa 12 Intralcetten-Disulfidbindungen im Durchschnitt aufweist [B. Frangione & C. Milstein: J. Mol. Biol. 33, 893 (1968)].

Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass ein Immunoglobulin aus Polypeptiden mit derartig hohem Molekulargewicht und komplexer Struktur aufgebaut ist, ist es überraschend, dass die vorstehend genannte eingeschränkte Anzahl von Oxidationsmitteln wie auch Sulfitionen als Verbindungen befunden wurden, welche die Disulfidbindungen zwischen den leichten und schweren Ketten des Immunoglobulins spalten und die Konfiguration von dessen Molekülen nur in solchem Ausmass beeinflussen, dass das resultierende Immunoglobulin-Derivat im Körper eines Patienten in das ursprüngliche Immunoglobulin zurückgeführt wird.

Weitere Forschungen haben nun zu der Entdeckung von zur Erzeugung von Persulfationen in Wasser befähigten Verbindungen geführt, die als Oxidationsmittel die Zwischen-ketten-Disulfidbindungen von Immunoglobulinen mit Sulfitionen selektiv spalten und Immunoglobulin-Derivate ergeben, die dazu befähigt sind, im Körper eines Patienten in die ursprünglichen Immunoglobuline zurückgeführt zu werden.

Es wurde bisher nicht berichtet, dass als Oxidationsmittel mit derartiger Fähigkeit Peroxide verwendet werden können.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neu2

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artiges Verfahren für die Herstellung eines Immunoglobulin-Derivats zu schaffen, das die selektive Spaltung von Zwi-schenketten-Disulfidbindungen eines Immunoglobulins umfasst, in industriellem Masstab ökonomisch durchführbar ist, zu einem Immunoglobulin-Derivat führt, dessen antikomplementäre Wirksamkeit in solchem Ausmass reduziert ist, dass es intravenös injiziert werden kann, wobei die Zwi-schenketten-Disulfidbindungen des Immunoglobulins mittels einem Sulfit- und einem Peroxidon selektiv gespalten werden, das ohne die Verwendung von Verbindungen wie Tetrathionate oder Jodosobenzoesäure mit den vorstehend beschriebenen Nachteilen auskommt und trotzdem unter den gleichen milden Reaktionsbedingungen ausführbar ist, wie bei Verwendung von Tetrathionaten.

Alle diese Anforderungen werden durch das erfindungsge-mässe Verfahren erfüllt, das im Patentanspruch 1 definiert ist.

Das im erfindungsgemässen Verfahren als Ausgangsmaterial verwendete native Immunoglobulin ist aus Humanplasma erhältlich, beispielsweise nach der Fraktionierungs-methode von Cohn et al. in J. Am. Chem. Soc., 68 459 (1946).

Cohn et al. fraktionierten eine grosse Menge von Humanplasma durch Äthanolausfällung. Die Fraktion II besteht überwiegend aus dem Typ IgG mit geringen Mengenanteilen der Typen IgA und IgM und zeigt Antikörperwirksamkeit gegen verschiedene Mikroorganismen, die Infektionskrankheiten erzeugen.

Als Ausgangsmaterial im erfindungsgemässen Verfahren wird die nach der Äthanolfraktion bei niedriger Temperatur von Cohn et al. erhaltene Fraktion II, d. h. Immunoglobulin mit einem Molekulargewicht von etwa 160 000, bestehend zur Hauptsache aus der 7S-Komponente, besonders bevorzugt.

Das erfmdungsgemässe Verfahren kann durch Behandlung des nativen Immunoglobulins mit einem Sulfition in Wasser in Gegenwart eines Oxidationsmittels durchgeführt werden. Das Reaktionsmedium ist keinesfalls auf Wasser eingeschränkt, und es kann jedes beliebige andere wässrige Medium zum Einsatz gelangen, das die Reaktion im erfindungsgemässen Verfahren nicht nachteilig beeinflusst.

Das im erfindungsgemässen Verfahren verwendete Oxidationsmittel ist eine zur Erzeugung eines Persulfations in Wasser befähigte Verbindung. Quellen für das Persulfation können beliebige Verbindungen sein, die in Wasser ein Persulfation erzeugen können. Geeignete derartige Verbindungen sind beispielsweise Salze von Perschwefelsäure (Peroxodischwefelsäure), wie Natriumpersulfat (NaiSîOs), Kaliumpersulfat (KÄO») und Ammoniumpersulfat KNH4):S:08].

Untersuchungen haben gezeigt, dass nach dem erfindungsgemässen Verfahren unter Verwendung einer zur Erzeugung eines Persulfations befähigten Verbindung ein Immunoglobulin-Derivat erhalten wird, dessen antikomplementäre Wirksamkeit wesentlich und in gleichem Ausmass reduziert ist, wie ein Immunoglobulin-Derivat, das nach konventioneller Methode unter Verwendung eines Tetrathionats erhältlich ist, oder das viel besser ist als Immunoglobulin-Derivate, die unter Verwendung gewöhnlicher Oxidationsmittel, wie Wasserstoffperoxid, einem Eisen (Ill)-ion oder Mangandioxid, hergestellt werden.

Bisher war kein Verfahren zur Spaltung der Zwischen-ketten-Disulfidbindungen eines nativen Immunoglobulins durch Behandlung mit einem Peroxid, wie eine ein Persulfation erzeugende Verbindung, bekannt.

Es ist daher überraschend, dass nach dem erfindungsgemässen Verfahren unter Verwendung einer zur Erzeugung eines Persulfations in Wasser befähigten Verbindung mindestens eine Zwischenketten-Disulfidbindung eines nativen Immunoglobulins gespalten und ein Immunoglobulin-

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Derivat erhalten wird, dessen antikomplementäre Wirksamkeit in solchem Ausmass reduziert ist, dass es intravenös injiziert werden kann.

Ein anderer Vorteil der Verwendung von zur Erzeugung eines Persulfations in Wasser befähigten Verbindungen im erfindungsgemässen Verfahren besteht darin, dass die Per-sulfationen erzeugenden Verbindungen leicht handhabbar sind, da sie relativ stabil sind, und dass diese Verbindungen industriell hergestellt werden, verfügbar und billig sind, so dass das Verfahren wirtschaftliche Vorteile bietet.

Bei Verwendung einer zur Erzeugung eines Sulfitions in Wasser befähigten Verbindung wird das Sulfition im Reaktionssystem des erfindungsgemässen Verfahrens gebildet.

Im erfindungsgemässen Verfahren können beliebige zur Erzeugung eines Sulfitions in Wasser befähigte Verbindungen verwendet werden. Bevorzugt werden Verbindungen, die in vivo keine Toxizität aufweisen, wie schwefelige Säure, Natrium- und Kalium-sulfit, -hydrogensulfit und -metabi-sulfit.

Vorzugsweise wird das erfmdungsgemässe Verfahren ausgeführt durch Lösen eines nativen Immunoglobulins in einem wässrigen Medium, vorzugsweise einer Pufferlösung mit einem darin gelösten neutralen Salz oder einer Lösung mit einem darin gelösten Stabilisator oder Lösungsvermittler, wie Glycin, und danach Zusatz je einer zur Erzeugung eines Sulfitions und einer zur Erzeugung eines Persulfations befähigten Verbindung zum Reaktionssystem.

Ein zweckmässiger Mengenanteil der zur Erzeugung eines Sulfitions befähigten Verbindung beträgt mindestens 2 mol, vorzugsweise 20-120 mol, pro mol der zu spaltenden Zwi-schenketten-Disulfidbindungen.

Ein zweckmässiger Mengenanteil der zur Erzeugung eines Persulfations befähigten Verbindung beträgt mindestens 1 mol, vorzugsweise 5-30 mol, pro mol der zu spaltenden Zwischenketten-Disulfidbindung.

Der pH-Wert des Reaktionssystems liegt vorzugsweise im Bereich von 4-10, insbesondere von 6-9. Bei einem pH-Wert unterhalb 4 besteht Neigung zur Spaltung der Zwischen-ketten-Disulfitbindungen im Fc-Teil des nativen Immunoglobulins. Bei einem pH-Wert oberhalb 10 wird das das Globulin darstellende Protein mit unliebsamer Wirkung, wie Verminderung der antigen-bindenden Wirkung, denaturiert.

Vorzugsweise wird das erfmdungsgemässe Verfahren bei einer Temperatur von nicht mehr als 55°C ausgeführt. Üblicherweise wird ein Temperaturbereich von 10-50°C bevorzugt, obwohl auch niedrigere Temperaturen zum Einsatz gelangen können. Temperaturen oberhalb 55°C sollten im allgemeinen vermieden werden, da das native Immunoglobulin bei solchen Temperaturen normalerweise denaturiert wird.und Spaltung von Intraketten-Disulfidbindungen einzusetzen beginnt.

Im erfindungsgemässen Verfahren sollte die Anwesenheit eines proteinstörenden Mittels, wie Harnstoff oder Gua-nidin, zweckmässig vermieden werden.

Die Reaktionsdauer variiert in Abhängigkeit von Faktoren wie der Art des Immunoglobulins, dem Mengenanteil der Reaktanten, der Reaktionstemperatur und der allfälligen Gegenwart eines proteinstörenden Mittels, und liegt im allgemeinen im Bereich von 30 min. bis 24 h.

Im erfindungsgemässen Verfahren gibt es für die Zugabe der Reaktanten zum Reaktionssystem keine kritische Reihenfolge.

Das erwünschte Immunoglobulin-Derivat kann durch Dialyse des Reaktionsgemischs nach der Reaktion in einer Salz- oder zweckentsprechenden Pufferlösung, beispielsweise einer 0,01M Phosphatpuffer mit pH-Wert 7,4 und 2,5 Gew.% Glycin enthaltenden Salzlösung, oder durch Ausfällung des Immunoglobulin-Derivats mit einem Salz, wie Ammonium3

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oder Natriumsulfat, und Abtrennung von den Reaktanten, gewonnen werden.

Ein geringer Mengenanteil von allfällig während der Reaktion gebildeten aggregierten Immunoglobulinen kann zweckmässig entfernt werden durch Reinigung des erhaltenen Immunoglobulin-Derivats nach einer konventionellen Methode zur Reinigung von Serumprotein, beispielsweise durch Aussalzen oder Chromatographie, wie Säulenchromatographie auf einer mit einem zweckentsprechenden Harz, beispielsweise «Sephadex» G-75, gefüllten Säule unter Verwendung eines Lösungsmittels, wie IM Propionsäure.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird somit ein Immunoglobulin-Derivat durch Spaltung mindestens einer Zwischenketten-Disulfidbindung eines nativen Immunoglobulins erhalten, vorzugsweise ein Derivat aus der Spaltung von 3 bis 4,5 insbesondere 4,5 Zwischenketten-Disulfidbin-dungen im Durchschnitt des nativen Immunoglobulins.

Untersuchungen der vorliegenden Erfindung zeigen, dass das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene Immunoglobulin-Derivat aus der S-Sulfonierung eines nativen Immunoglobulins durch Spaltung der Zwischen-ketten-Disulfidbindungen des nativen Immunoglobulins ist und intravenös injiziert werden kann, da es eine solche Konfiguration aufweist, dass es im Körper des Patienten zum ursprünglichen nativen Immunoglobulin rückgeführt werden kann, und auch, da es Fe-Aktivität und verschiedene Antikörper-Aktivitäten und eine sehr geringe antikomplementäre Wirkung aufweist.

Die Anzahl von S-Sulfonat- (-S-SO3 ) -Gruppen in dem nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Immunoglobulin-Derivat kann beispielsweise bestimmt werden durch Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens unter Verwendung von radioaktivem Natriumsulfit und Bestimmung der im resultierenden Immunoglobulin-Derivat enthaltenen mit 35S markierten S-Sulfonatgruppen durch einen Flüssigkeits-Szintillationszähler.

Die Hälfte der durchschnittlichen Anzahl der so bestimmten markierten S-Sulfonatgruppen pro Molekül des Immunoglobulin-Derivats entspricht der durchschnittlichen Anzahl von gespaltenen Zwischenketten-Disulfidbindungen im als Ausgangsmaterial verwendeten nativen Immunoglobulin.

Ein im Durchschnitt etwa 9 S-Sulfonatgruppen pro Molekül enthaltendes Immunoglobulin-Derivat, das durch Spaltung von durchschnittlich 4,5 Disulfidbindungen im nativen Immunoglobulin und S-Sulfonierung der gebildeten Schwefelatome im erfindungsgemässen Verfahren gebildet wurde, kann in H- und L-Ketten fraktioniert werden, beispielsweise unter Verwendung einer mit «Sephadex» G-75 oder G-200 gefüllten Säule wie vorstehend angeführt, vorzugsweise in Gegenwart eines geringen Mengenanteils Harnstoff oder Guanidin und eines Propionsäure-Lösungsmittels.

Im erfindungsgemässen Verfahren kann jede beliebige Anordnung von Bedingungen unter der Voraussetzung zum Einsatz gelangen, dass die Herstellung von Immunoglobulin-Derivaten mit durchschnittlich etwa 9 S-Sulfonatgruppen pro Molekül ermöglicht wird, welche Derivate durch Säulenchromatographie wie vorstehend beschrieben weiterhin in H- und L-Ketten fraktioniert werden können. Nachdem diese Bedingungen einmal empirisch bestimmt sind, kann die Anzahl gespaltener Disulfidbindungen im nativen Immunoglobulin zweckmässig kontrolliert werden durch Anpassung der Reaktionsdauer an die übrigen gewählten.Bedingungen.

In den nachstehenden Beispielen wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen erläutert. In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1-4 Elektropherogramme der Elektropherographie mit Scheiben aus Natrium-dodecylsulfat als Trägermaterial. Die Banden (a)-(f) beziehen sich auf Peptid-Ketten, die mit H2L2, H2L, H2, HL, H und L bezeichnet sind.

Die nachstehenden prozentualen Konzentrationsangaben sind gewichtsmässig.

In allen Beispielen wurde als Ausgangsmaterial natives menschliches Immunoglobulin in Form einer Lösung von neutralem pH-Wert, enthaltend 2,25% Glycin, ein Produkt des Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute, verwendet.

Die nachstehend angeführte Wirkung wurden folgender-massen ermittelt:

Die Messung des Anti-Diphtherie-Titers erfolgte durch sensibilisierte passive Hemagglutinations-Reaktion(l).

Die Messung erfolgte nach der Mikroplattenmethode. Es wurden menschliche rote Blutkörperchen vom 0-Typ(2), die mit Formalin behandelt worden waren, verwendet und mit Bis-diazobenzidin (BDB)(3) behandelt und Diphtherietoxoid sensibilisiert.

Die Kontrolle erfolgte mittels Standard-Diphtherie-Antitoxin (NIH Japan).

Die Bestimmung der antikomplementären Wirksamkeit erfolgte nach der von Kabat & Mayer in «Expérimental Immunochemistry», S. 225 ('61) beschriebenen Methode. Eine Meerschweinchenserum enthaltende l%ige Immuno-globulinlösung mit 20 CHso/ml wurde mit GVB++ auf 5 ml gestellt, während 1 h bei 37°C inkubiert und dann die verbrauchte Antikomplementärsubstanz nach der genannten Methode bestimmt. Die Werte der antikomplementären Wirkung werden durch den prozentualen Verbrauch auf 20 CHso/ml ausgedrückt.

Beispiel 1

50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung mit pH-Wert 7,6, enthaltend 3,75 g gelöstes Natriumsulfit, und 50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung mit pH-Wert 7,6, enthaltend 1,77 g Natriumpersulfat (NasS^Os) wurden nacheinander zu 100 ml einer 2,25%igen Glycinlösung, enthaltend 15 g natives Immunoglobulin, gegeben und das Gemisch wuräe während 4,5 h bei 43°C gehalten. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit physiologischer Salzlösung dialysiert, bis die Konzentration der Reaktanten 0,1 mmol/1 oder weniger erreichte. Dabei wurden nach der Erfindung 200 ml einer wässrigen Lösung eines Immunoglobulin-Derivats einer Konzentration von 7,5% erhalten. Die antikomplementäre Wirkung CHso des als Ausgangsmaterial verwendeten nativen menschlichen Immunoglobulins betrug 90% und diejenige des wie beschrieben erhaltenen Produktes in 5%iger Lösung betrug 18%.

Der Titer des Anti-Diphtherie-Toxins des erhaltenen Immunoglobulin-Derivats in 5 gew.%iger Lösung betrug 9,5 IU/ml und war gleich wie derjenige des als Ausgangsmaterial verwendeten nativen Immunoglobulins.

Zur Bestimmung der Anzahl gespaltener Zwischenketten-Disulfidbindungen des erhaltenen Immunoglobulin-Derivats wurde dieses der Elektropherographie mit Scheiben aus Natrium-dodecylsulfat als Trägermaterial nach der von Weber und Osborne in J. Biol. Chem., 244, S. 4406 (1969) beschriebenen Methode unterzogen. Das erhaltene Elektro-pherogramm ist in Fig. 1 dargestellt.

Fussnoten:

(1) NIH Japan Methode: R. Murata, Nr. 21, Tokyo Veterinarian & Animal Husbandry ('75)

(2) W. T. Butler: J. Immunol. 90 663 ('63)

(3) J. Dordon, B. Rose, A.H. Sehon: J. Exp. Med. 108,37, ('58).

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Aus Fig. I geht hervor, dass, obwohl das erhaltene Immu-noglobulin-Derivat etwas unreagiertes Material (H2L2) enthält, dieses zur Hauptsache aus einem Gemisch von H2L-, H2-, HL-, H- und L-Ketten als Resultat der Spaltung der Zwi-schenketten-Disulfidbindungen bestand. Die Ketten eines Immunoglobulins sind mit H bzw. L bezeichnet. Beispielsweise ist ein durch Spaltung einer Disulfidbindung zwischen der H- und L-Kette eines Immunoglobulins (H2L2) erhaltenes Immunoglobulin-Derivat aus zwei H- und zwei L-Ketten aufgebaut und ein Gemisch von H2L- und L-Ketten.

Beispiel 2

20 ml einer physiologischen Salzlösung, enthaltend 2,5 g gelöstes Natriumsulfit und 20 ml einer physiologischen Salzlösung, enthaltend 1,6 g gelöstes Ammoniumpersulfat [(NH]4)2S20s] wurden nacheinander zu 100 ml einer 2,25%igen Glycinlösung, enthaltend 10 g natives Immunoglobulin, gegeben, und das Gemisch wurde während 5 h bei 40°C gehalten. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch rtiit physiologischer Salzlösung dialysiert, um die Reaktanten zu entfernen, wobei 140 ml einer wäss-rigen Lösung eines Immunoglobulin-Derivats in einer Konzentration von 7% erhalten wurden. Die antikomplementäre Wirksamkeit CH50 des erhaltenen Immunoglobulin-Derivats in 5%iger Lösung betrug 23%. Das Elektropherogramm des erhaltenen Produktes ist in Fig. 2 dargestellt und entspricht nahezu demjenigen von Fig. 1 aus Beispiel 1, obwohl ein Anteil H2L2-Ketten zurückblieb.

60 ml einer wässrigen Lösung des erhaltenen Produktes wurden mit 11 ml einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumsulfat zugesetzt, und die erhaltene Ausfällung wurde zentrifugiert und durch Aussalzen gereinigt. Das gereinigte Immunoglobulin-Derivat wurde in einer physiologischen, 2,25% Glycin enthaltenden Salzlösung auf eine Konzentration von 5% des Immunoglobulin-Derivats gelöst. Die Lösung wurde aseptisch filtriert, in Mengenanteilen von je 5 ml in Ampullen von 10 ml Volumen gefüllt und lyophilisiert. Die antikomplementäre Wirkung CHso des erhaltenen Immunoglobulin-Derivats in 5%iger Konzentration betrug 15%.

Im nachstehenden Bezugsbeispiel A wird die Verwendung von Natrium-tetrathionat und in den Vergleichsversuchen a-c die Verwendung von Wasserstoffperoxid (a), Mangandioxid (b) und einem Eisen (Ill)-ion (c) als Oxidationsmittel dargestellt.

Bezugsbeispiel A

50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung mit pH-Wert 7,6, enthaltend 3,75 g gelöstes Natriumsulfit, und 50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung mit pH-Wert 7,6, enthaltend 2,31 g gelöstes Natrium-tetrathionat, wurden nacheinander zu 100 ml einer 2,25%igen Glycinlösung, enthaltend 15 g natives Immunoglobulin, gegeben, und das Gemisch wurde während 3 h bei 45°C gehalten. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit physiologischer Salzlösung dialysiert, bis die Konzentration der Reaktanten 0,1 mmol 1/1 oder weniger betrug. Es wurden dabei 200 g einer wässrigen Lösung eines Immunoglobulin-Derivats einer Konzentration von 7,5% erhalten. Die antikomplementäre Wirksamkeit CHso des erhaltenen Immunoglobulin-Derivats in 5%iger Lösung betrug 18,0%. Das Elektropherogramm des erhaltenen Produktes ist in Fig. 3 dargestellt.

Vergleichsversuch a

50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlö644130

sung mit pH-Wert 7,6, enthaltend 3,75 g gelöstes Natriumsulfit, und 50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung, enthaltend 0,9 ml einer 30%igen wässrigen Lösung von Wasserstoffperoxid, wurden nacheinander zu 100 ml einer 2,25%igen Glycinlösung, enthaltend 15 g natives Immunoglobulin, gegeben, und das Gemisch wurde während 4 h bei 45°C gehalten. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch auf gleiche Art dialysiert, wie in Bezugsbeispiel A angegeben, wobei 200 ml einer 7,5%igen wässrigen Lösung eines Immunoglobulin-Derivats erhalten wurden. Die antikomplementäre Wirksamkeit CHso des erhaltenen Produktes in 5%iger Lösung betrug 52%. Das Elektropherogramm des erhaltenen Endproduktes ist in Fig. 4 dargestellt.

Vergleichsversuch b

Das Bezugsbeispiel A wurde mit der Ausnahme wiederholt, dass anstelle des Natrium-tetrathionats 660 mg Mangandioxid eingesetzt wurden. Es wurde ein Immunoglobulin-Derivat erhalten, dessen antikomplementäre Wirksamkeit CHso 70% betrug. Das Elektropherogramm des erhaltenen Endproduktes zeigte lediglich die Anwesenheit von H2- und H2L-Ketten.

Vergleichsversuch c

25 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung mit pH-Wert 7,6, enthaltend 1,3 g gelöstes Natriumsulfit, und 25 ml phosphatgepufferte physiologische Salzlösung, enthaltend 1,0 g gelöstes Eisen (Ill)-sulfat wurden nacheinander zu 50 ml einer 10%igen Lösung von nativem Immunoglobulin, enthaltend 2,25% Glycin, gegeben, und das Gemisch wurde bei 45°C gehalten. Im Verlaufe der Reaktion setzte Trübung des Reaktionsgemischs ein und die Reaktion in einem homogenen System versagte. Die Ausfällung wurde entfernt und die erhaltene Lösung gründlich dialysiert, wobei 90 ml einer leicht gelbbräunlichen Lösung eines Immunoglo-bulin-Derivats erhalten wurden. Die antikomplementäre Wirksamkeit CHso des erhaltenen Produktes betrug 50%. Das Elektropherogramm des erhaltenen Endproduktes zeigte, dass einige H- und L-Ketten vorhanden waren, das Produkt jedoch zur Hauptsache aus H2-, H2L- und HaLi-Ketten aufgebaut war.

Die Elektropherogramme von Fig. 1 und 2 der nach den Beispielen 1 und 2 erfindungsgemäss erhaltenen Endprodukte zeigten gute Übereinstimmung mit dem Elektropherogramm gemäss Fig. 3 des Endproduktes aus dem Bezugsbeispiel A. Hieraus geht hervor, dass das nach dem erfindungsgemässen Verfahren durch Spaltung der Zwischenketten-Disulfidbindungen eines nativen Immunoglobulins erhaltene Immunoglobulin-Derivat praktisch gleich ist wie ein unter Verwendung von Natrium-tetrathionat als Oxidationsmittel erhältliches Immunoglobulin-Derivats.

Es ist bekannt und in der US-PS 4 059 571 beschrieben,

dass die im Bezugsbeispiel A unter Verwendung eines Sulfit-und eines Tetrathionat-Ions gespaltenen Disulfidbindungen des Immunoglobulin-Derivats S-sulfoniert (-S-SO3-) sind.

Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene Immunoglobulin-Derivat zeigt praktisch das gleiche Elektropherogramm wie dasjenige gemäss Bezugsbeispiel A in Fig. 3. Diese Tatsache und die Art des verwendeten Oxidationsmittels führen zur theoretischen Annahme, dass die gespaltenen Disulfidbindungen S-sulfoniert sind.

Aus dem Vergleich der Elektropherogramme der Fig. 1 und 2 mit demjenigen der Fig. 4 des Vergleichsversuchs a und der Resultate der Vergleichsversuche b und c ist ersichtlich, dass das erfmdungsgemässe Verfahren ein Immunoglobulin-Derivat durch selektive Spaltung der Zwischenketten-Disulf-

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idbindungen eines nativen Immunoglobulins ergibt, während die Verwendung von Wasserstoffperoxid, Mangandioxid und einem Eisen (Ill)-ion, die als eigentliche Oxidationsmittel bekannt sind, nur zu einem Immunoglobulin-

Derivat führen kann, in welchem die Spaltung der Zwischenketten-Disulfidbindungen des nativen Immunoglobulins ungenügend ist, das eine hohe antikomplementäre Wirksamkeit aufweist und für intravenöse Injektion nicht geeignet ist.

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1 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

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1. Verfahren zur Herstellung eines Immunoglobulin-Deri-vats mit reduzierter antikomplementärer Wirksamkeit, wobei ein natives Immunoglobulin zur Spaltung mindestens einer Zwischenketten-Disulfidbindung des nativen Immunoglobulins in Gegenwart eines Oxidationsmittels mit einem Sulfition behandelt wird, dadurch gekennzeichnet, dass man als Oxidationsmittel eine zur Bildung eines Persulfations in Wasser befähigte Verbindung verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Oxidationsmittel Natrium-, Kalium- oder Ammonium-persulfat verwendet.