DE3018901C2

DE3018901C2 - Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten

Info

Publication number: DE3018901C2
Application number: DE19803018901
Authority: DE
Inventors: Yuji Kumamoto Fukumoto; Syoji Kodaira Tokyo Ono; Tsunemasa Hachioji Yoshida
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1979-05-17
Filing date: 1980-05-16
Publication date: 1982-04-22
Also published as: SE8003591L; JPS62886B2; CH644130A5; SE435787B; DE3018901A1; JPS55153724A

Description

De Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Immunoglob'ilinderivaten.die eine verringerte Antikomplementaktivität besitzen und infolgedessen intravenös verabfolgt werden können.

Immunoglobuline sind von großer medizinischer Bedeutung als für die Humoralimmunität verantwortliche Mittel und besitzen eine Immunaktivität gegen verschiedene pathogene Mikroorsanismen. Die Verabfolgung von Irnmunoglooulinen kann deshalb zur Verhinderung und Behandlung von Virusinfektionen wie Masern und viraler Hepatiiu und von durch gegenüber Antibiotika resistcnten Bakterien wie Staphylococci bewirkten Infektionen führen. Die Verabfolgung von aus menschlichem Plasma fraktionierten Immu loglobulinen ist auf die intramuskuläre Injektion beschränkt. Dies verursacht den fehler, daß lediglich ein Teil des injizierten Immunoglobulins in den Körper eindringt und das in dieser Weise injizierte Immunoglobulin richi rasch wirkend ist und ferner nicht in großer Mengt verabfolgt werden kann. Die intravenöse Injektion von Immunoglobulinen ist zwar frei von derartigen Fehlern, stellt jedoch neue Probleme von Neben'.'ffekten wie heftige pyrogene und kardiovasculiri'C Reaktionen auf. Diese Neigung ist besonders ausgeprägt bei Patienten von Agammaglobulinämie. Diese Nebeneffekte aufgrund intravenöser Injektionen sind auf die bei der Immunoglnbulinfraktionierung ausgebildeten aggregierten Immunoglobuline zurückzuführen. Die aggregierten Immunoglobuline haben eine erhöhte Antikomplementaktivität. d. h. eine erhöhte Fähigke ι /ur Kombinierung mit den Komplementen im Plasma Diese Kombination verursacht die Ausbildung von anaphylaktischeti Faktoren innerhalb des Körpers, wodurch wiederum die vorstehend abgehandelten Nebeneffekte eingeleitet werden. Ausgedehnte Untersuchungen wurden deshalb unternommen, um Immunoglobuline mit einer verringerten Antikomplemßnlaktivitüitj welche zur intravenösen Injizierung fähig sind, zu ei'halien.

Ein besonders gutes Verfahren unter diesen üblichen Vorgeschlagenen Verfahren umfaßt die Umsetzung eines Immunoglobulins mit einem Sulfition in Gegenwart bestimmter Oxidationsmittel, um mindestens eine [nterkettendisulfidbindung des Immunoglobulins zu spalten. Das nach diesem Verfahren erhaltene Immunoglobulinderivat hat eine sehr niedrige Antikomplementaktivität und kann praktisch ohne wesentliche Nebeneffekte intravenös injiziert werden. Ferner ist dieses Immunoglobulinderivat durch eine langdauernde pharmakologjsche Wirkung und eine sehr hohe Sicherheit ausgezeichnet, da es zu dem ursprünglichen Immunoglobulin innerhalb des Körpers des Patienten wiederhergestellt wird.

Bisher wurden Alkalitetrathionate (japanische Patentveröffentlichung 1 21 421/75) oder Jodosobenzoesäure, Alkalisalze hiervon, Kupfer-II-ionen und molekularer Sauerstoff (japanische Patentveröffentlichung 1 630/76) als Oxidationsmittel zur Anwendung bei der Umsetzung zur Spaltung der Interkettendisulfidbindung von Immunoglobulinen vorgeschlagen.

Das Verfahren unter Anwendung von Kupfer-II-ionen ist zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten für die intravenöse Injektion ungünstig, da es äußerst schwierig ist, das Kupfer-II-ion aus dem Reaktionsprodukt zu entfernen, und die Antikörperaktivität des Produktes verringert ist In gleicher Weise ist das Verfahren der Anwendung von molekularem Sauerstoff ungünstig zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten für die intravenöse Injektion, da die in das Reaktionsgemisch eingeführten Luftblasen eine Oberflächendenaturierung· der Immunoglobuline unter Bildung von agglutinierten Immunoglobulinen verursa-

jo chen.

Andererseits is' das Verfahren unter Anwendung eines Alkalitetrathionats oder der Jodosobenzoesäure für die Herstellung von Immunoglobulinderivaten für die intravenöse Injektion zu bevorzugen. Die Tetrathionate sind jedoch unstabil und schwierig als hochreine Verbindungen durch übliche Verfahren zu erhalten. Ferner können sie nicht mit vernünftigen Kosten für die industrielle Anwendung erhalten Jodosobenzoesäure wird lediglich als Spezialreager.z hergestellt und ist technisch noch schwieriger zu e-halten als die Tetraihionate. Darüberhinaus ist dessen Preis hoch. Infolgedessen leiden diese Verfahren an den Fehlern, die im wesentlichen den Oxidierverbindungen selbst zuzuschreiben sind, und sie sind deshalb wirtschaftlich nachteilig.

Fs wurde gezeigt, daß die Immunoglobuline in fünf Klassen eingeteilt werden können, nämlich IgG. IgA. IgM. IgD und IgE. wobei der Anteil an IgG mindestens 70 Gew. % beträgt.

Die Immunoglobuline mit Ausnahme von IgM sind jeweils hauptsächlich aus vier Peptidketten aufgebaut, und einige Disulfidbindungen sind an internen Ketten und an Zwischenkettenstellen vorhanden. Beispielsweise kann das typischste Immunoglobulin IgG, wenn es mit Papain digeriert wird, in zwei Fragmente (»Fab«) mit Antigenbindungsaktivität und ein Fragment (»Fc«) mit KompL-ment und Gewebsbindungsaktivität fraktioniert werden. Es wurde auch gefunden, daß IgG aus zwei schweren Ketten (H-Keucn) von Polypeptiden und zwei leichten Ketten (L-Ketten) von Polypeptiden aufgebaut ist. welche stark über Disulfidbindungen und nicht-kovalente Bindungen zur Bildung eines Proteinmoleküls mil einem Molekulargewicht von etwa 160 000 gebunden sind, und daß jedes Molekül etwa 4,5 IntefkeUendisulfidbindungen und etwa 12 Intrakettendisulfidbindungen durchschnittlich enthält (B. Frangione & C, Milstein: J. Mol. Biol. 33, S. 893 (1968)).
Im Hinblick auf die Talsache, daß ein ImmunoErlohnlin

aus Polypeptiden mit solch hohem Molekulargewicht und komplizierter Struktur aufgebaut ist, ist es tatsächlich überraschend, daß die vorstehenden begrenzten Oxidationsmittel sowie Sulfitionen als Verbindungen aufgefunden wurden, welche die Disulfidbindungen zwischen den leichten Ketten und schweren Ketten des Immunoglobulins spalten, während sie die Gestalt ihrer Moleküle lediglich zu solchem Ausmaß beeinflussen, daß das erhaltene immunoglobulin zu dem ursprünglichen Unmunoglobulin innerhalb des Körpers des Patientens wiederhergestellt wird.

Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung führten nun zu der Feststellung von Verbindungen, die zur Erzeugung von Persulfationen in Wasser geeignet sind, als Oxidationsmittel, welche selektiv die Interkettendisulfidbindungen der Immunoglobuline mit Sulfitionen spalten und Immunoglobulinderivate ergeben, welche zur Wiederherstellung der ursprünglichen Immunoglobuline innerhalb des Körpers des Patienten fähig sind.

Es war bisher nicht bekannt, daß Peroxide als Oxidationsmittel mit einer derartigen Eignung verwendet werden können.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht deshalb in einem neuen Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten, welches die selektive Spaltung der Interkettendisulfidbindungen eines Immunoglobulins umfaßt.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besieht in einem Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulnderivaten mit wirtschaftlichen und industriellen Vorteilen, wobei die selektive Spaltung der Interkettendisulfidbindungen eines Immunoglobulins umfaßt wird.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem neuen Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten mit einer zu einem solchen Ausmaß verringerten Antikomplementaktivität. daß sie intravenös injiziert werden können, wobei das Verfahren die selektive Spaltung der Interkettendisulfidbindungen eines Immunoglobulins durch Sulfitionen und Peroxidionen umfaßt.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem industriell vorteilhaften Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten mit einer in solchem Ausmaß verringerten Antikomplementaktivität, daß sie intravenös injiziert werden können, wobei dieses Verfahren nicht die Anwendung von solchen Verbindungen wie Tetrathionaten oder Jodosobenzoesäure mit den vorstehenden Fehlern und Problemen umfaßt, sor.dern wobei dieses Verfahren die selektive Spaltung der Interkettendisulfidbindungen eines Immunoglobulins durch Anwendung von stabilen und billigen Peroxiden, die frei von den vorstehenden Mängeln und Problemen sind, unter den gleichen milden Reaktionsbedingungen wie im Fall der Anwendung der Tetrathionate umfaßt.

Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.

Die Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden mittels eines Verfahrens zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten mit einer verringerten Antikomplementaktivität erzielt, wobei ein natives Immunoglobulin mit einem Sulfition in Gegenwart von Oxidationsmitteln zur Spaltung mindestens einer Interkettertdisulfidbin· dung des nativen Immunoglobulins behandelt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß als Oxidationsmittel eine Verb'ndung, die zur Bildung eines Persulfations in Wasser fähig ist, verwendet wird.

Da > beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete

nativs Immunoglobulin kann aus menschlichem Plasmn beispielsweise nach dem Fraktionierverfahren von Cohn und Mitarbeitern (E.G. Cohn und Mitarbeiter: I. Am. Chem. Soc. 68, S. 459 (1946)) erhalten werden.

Cohn und Mitarbeiter fraktionierten eine große Menge von menschlichem Plasma durch Äthanoiausfällung. Die Fraktion II besteht überwiegend aus IgG und enthält geringere Mengen an IgA und IgM und zeigt Antikörperaktivität gegen verschiedene Mikroorganismen, die Infektionskrankheiten verursachen.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird insbesondere die Fraktion II (Immunoglobulin mit einem Molekulargewicht von etwa 160 000, das überwiegend aus der 7S-Komponente besteht), welche durch Niedertemperaturäthanolfraktion gemäß Cohn und Mitarbeiter erhalten wurde, verwendet.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durchgeführt, indem das native Immunoglobulin mi. einem Sulfition in Wasser in Gegenwart eines Oxidationsmittels behandelt wird. Das Reaktionsmedium ist in keiner Weise auf Wasser beschränkt, und andere wäßr . e Medien können VCrWCriuCt WCrCCn, UiC uiC l\CHKtiüPi uuiiT CM inuüiigSgC-mäüen Verfahren nicht nachteilig beeinflussen.

Das charakteristischerweise im Rahmen der Erfindung verwendete Oxidationsmittel ist eine Verbindung, die zur Erzeugung eines Persulfations fähig ist. Ausgangsmaterialien für das Persulfation können sämtliche Verbindungen sein, die ein Persulfation ,n Wasser erzeugen. Geeignete Ausgangsmaterialien fur das Persulfation sind Salze der Pjrschwefelsäure (Peroxidschwefelsäure) wie Natriumpersulfai

(NaiSjOs), Kaliumpersulfat (K₂SjOi) und Ammontumpersulfat [(N H₄J₂S₂O₈].

Die Untersuchungen im Rahmen der Erf raung zeigten, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bei Anwendung einer Verbindung, die zur Erzeugung von Persulf'itionen fähig ist. Immunoglobulinderivate mit Antikomplementaktivität, die praktisch zu dem gleichen Ausmaß wie bei Immunoglohüinde; Waten verringert ist, welche durch das übliche Verfahren unter Anwendung eines Tetrathionats gewonnen wurde, erhalten werden und daß auch ein Immunoglobulinderivat mit einer verringerten Antikomplementaktivität erhalten werden kann, welches weit besser is·, als die bei Anwendung der üblichen Oxidationsmittel wie Wasserstoffperoxid, Eisen-III-ionen oder Mangandioxid erhaltenen Immunoglobulinderivate.

Bisher war kein Verfahren zur Spaltung der Interkettendisulfidbindungen eines nativen Immunoglobulins durch Behandlung desselben mit einem Peroxid, wie einer Verbindung, welche Persulfationen erzeugt, bekannt. Deshalb ist es tatsächlich überraschend, daß mindestens eine InterkeUendisulfidbindung eines nativen l'.inunoglobulins bei dem Verfahren gemäß der Erfindung unter Anwendung einer Verbindung, die zur Erzeugung von Pc;sulfationen fähig ist. gespilten wird und ein immunoglobulindenvat mit einer in solchem Ausmaß verringerten Antikomplementaktivität ergibt, daß es intravenös injiziert werden kann.

Ein weiteres charakteristisches Merkmal des erfindungsgemäDen Verfahrens unier Anwendung von Verbindungen, die zur Erzeugung von Persulfationen in Wasser fähig sind, liegt darin, daß die F-ersulfationen ergebenden Verbindungen leicht zu handhaben sind, weil sie relativ stabil sind, und daß, weil diese Verbindungen im Industriemaßslab hergestellt werden und mit niedrigen Kosten erhältlich sind, das Verfahren wirtschaftlich besonders vorteilhaft ist.

Bei Anwendung der Verbindung, die zur Erzeugung von Sulfitionen in Wasser fähig ist, wird das Sulfition im erfindungsgemäßen Reaktionssystem ausgebildet.

Sämtliche Verbindungen, weiche ein Sulfition in Wasser erzeugen können, können erfindungsgemäß eingesetzt werden. Bevorzugt werden Verbindungen, die keine Toxizität in vivo zeigen, wie schwefelige Säure, Natriumsulfit, Natriumhydrogensulfit, Kaliunisulfit, Kaliumhydrogensulfit, Natriummetabisulfit und Kaliummetabisulfit.

Zweckmäßig wird das erfinduhgsgemäße Verfahren ausgeführt, indem ein natives Immunoglobulin in Wasser, insbesondere einer Pufferlösung mit einem darin gelösten Neutralsal/ oder einer Lösung mit einem Stalv'isator oder einem darin gelösten Auflösungsmittel wie Glycin aufgelöst wird und anschließend eine zur Erzeugung eines Sulfitions fähige Verbindung und eine zur Erzeugung eines Persulfalions fähige Verbindung zu dem Reaktionssystem zugesetzt wird.

Die geeignete ivienge der zur Erzeugung des Siilfitions fähigen Verbindung beträgt mindestens 2 Mol. insbesondere 20 bis 120MoI. je Mol der zu spaltenden Interketiendisulfidbindung.

Die geeignete Menge der zur Erzeugung des Persulfations fähigen Verbindung beträgt mindestens i Mol. insbesondere 5 bis 30 Mol, je Mol der zu spaltenden Interkettendisulfidbindung.

Der pH-Wert des Reaktionssystems beträgt zweckmäßig 4 bis 10. insbesondere 6 bis 9. Bei einem pH-Wert von weniger als 4 zeigt sich eine Neigung zur Spaltung der Interkcttendisulfidbi^^gen im Fc-Tcil des nativen Immunoglobulins. Bei einem pH-Wert oberhalb 10 wird das das Globulin bildende Protein denaturiert und es werden unerwünschte Ergebnisse wie gehemmte Verringerung der Antikomplementaklivität und Verringerung der Antigenbindungsaktivität erzielt.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird zweckmäßig bei Temperaturen von nicht mehr als 55°C durchgeführt. Üblicherweise werden Temperaluren von 10 bis 50⁰C eingehalten, obwohl auch niedrigere Temperaturen angewandt werden können. 55°C überschreitende Temperaturen sollten allgemein vermieden werden, da bei diesen Temperaturen das native Immunoglobulin üblicherweise eine Denaturierung erleidet und eine Spaltung der Intrakettendisulfidbindungen stattzufindenbeginnt

Beim erfindungsgemäßen Verfahren sollte die Anwendung eines Proteinperturbiermittels wie Harnstoff oder Guanidin möglichst vermieden werden.

Die Reaktionszeit ist abhängig von solchen Faktoren wie Art des Immunoglobulins, der Menge der Reagenzien, der Reaktionstemperatur und der Anwesenheit eines Proteinperturbiermittels. Allgemein beträgt die Zeit von 0,5 bis 24 Stunden.

Es besteht keine kritische Reihenfolge des Zusatzes der Reagenzien zum Reaktionssystem der Erfindung.

Das gewünschte Immunoglobulinderivat kann durch Dialyse des Reaktionsgemisches nach der Reaktion in Salzlösung oder einer geeigneten Pufferlösung wie einer Salzlösung mit einem Gehalt von 0,01 m-Phosphatpuffer (pH 7.4) und 23% Clycin oder Ausfällung des Immunoglobulinderivates mit einem geeigneten Salz wie Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat unter Abtrennung desselben von den Reagenzien erhalten werden.

Eine gewisse Menge an aggregierten Immunoglobufinen. die während der Reaktion erzeugt sind, kann günstigerweise bei der Reinigung der erhaltenen Immunoglobulinderivate unter Anwendung eines üblichen Reinigungsverfahrens für Serumprotein wte Aussalzungs- und Chromatographlerverfahren wie Säulenchromatographie auf einer Säule eines geeigneten Harzes wie Sepltadcx® G-75 unter Anwendung ί eines Lösungsmittels wie 1 m-Propionsäure entfernt werden.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ergibt sich somit ein Immunoglobulinderivat auf Grund der Spaltung mindestens einer Interketlendisulfidbind;jng

to eines nativen Immunoglobulins, insbesondere ein Immunoglobulinderivat auf Grund der Spaltung von 3 bis 4.5. insbesondere 4,5. Interkcttendisulfidbindungen durchschnittlich des nativen Immunoglobulins.

Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Erfin· dung zeigten, daß das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche immunoglobulinderivat ein Immunoglobulinderivat ist. welches sich auf Grund der S-Sulfonierung (S-SOi ) eines naliven Immunoglobulins infolge der Spaltung der Interkettcndisulfidbindun-

λι gen des nativen immunoglobulins ergibt und welches intravenös injiziert werden kann, da es eine solche Gestalt besitzt, daß es zum nativen Immunoglobulin innerhalb des Körpers des Patienten wiederhergestellt wird und da es weiterhin eine Fc Aktivität und verschiedene Antikörperaktivitäten und eine sehr niedrige Antikomplementaktivität besitzt.

Die Anzahl der S-Sulfonatgruppen (-S-SOj-) in dem Immunoglobulinderivat gemäß der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise bei der Ausübung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Anwendung von radioaktivem Naiiiumsulfit und Bestimmung der mit 35 S markierten S Sulfonatgruppen in dem erhaltenen Immunoglobulinderivat mittels eines Flüssigkeitsszintilationszählers bestimmt werden.

Die Hälfte der durchschnittlichen Anzahl der markierten S-Sulfonatgruppen je Molekül des in dieser Weise bestimmten Immunoglobulinderivats entspricht der durchschnittlichen Anzahl von gespaltenen Interkettendisulfidbindungen in dem nativen Ausgangsimmunoglobulin.

Ein Immunoglobulin mit einem Gehalt von etwa 9 S-Sulfonatgruppen je Molekül durchschnittlich, d. h. ein durch Spaltung von 43 Disulfidbindungen durchschnittlich des nativen Immunoglobulins und S-Sulfonie-

■»5 rung der gebildeten Schwefelatome gemäß der Erfindung gebildetes, kann in //-Ketten und L-Ketten unter Anwendung beispielsweise einer Sephadex® G-75- oder G-200-Kolonne, insbesondere in Gegenwart einer kleinen Menge Harnstoff oder Guanidin, und Propionsäure als Lösungsmittel, wie vorstehend abgehandelt, fraktioniert werden.

Jeder Bedingungssatz kann deshalb beim erfindungsgemäßen Verfahren angewandt werden, sofern er die Herstellung von Immunoglobulinderivaten mit einem Gehalt von etwa 9 S-Sulfonatgruppen je Molekül durchschnittlich erlaubt, wobei diese Derivate weiterhin in W-Ketten und L-Ketten durch die vorstehend abgehandelten säulenchromatographischen Verfahren fraktioniert werden können. Wenn diese Bedingungen einmal empirisch bestimmt wurden, kann die Anzahl an gespaltenen Disulfidbindungen im nativen Immunoglobulin in geeigneter Weise durch Einstellung der Reaktionszeit unter dem gewählten Satz von Bedingungen gesteuert werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung im einzelnen, ohne sie hierauf zu begrenzen.

Das in diesen Beispielen angewandte Ausgangsimmunoglobulin war das folgende:

Menschliches natives Immunoglobulin

Eine Lösung von menschlichem Immunoglobulin (Fraktion II) in gepufferter Salzlösung (pH neutral) mit dem Gehalt von 2,25% Glycin als Produkt der Chemo-Sero-Thcrapeutic Research institute.

Antikörperaktivilät und Anlikomplemerilaktivität wurden in folgender Weise gemessen:

Bestimmung des Antidiphtherietitefs

Reaktion: Es wurde die sehsibilisiefle passive Hämagglutinationsreakliön (Fußnote 1) angewandt.

Verfahren der Bestimmung: Mikroplattentechnik.
Blutzellen: Menschliche rote Blutzellen vom O-Typ (Fußnote 2), die mit Formalin behandelt wurden, wurden mit Bis-diazobcnzidin (BDB) behandelt (Fußnote 3) und mit Diphtherictoxoidsensibilisiert. Konirolle: Standardantitoxin für Diphtherie (NIH japanj

Fußnote I) NIH-)apan-Verfahren: R. Murata, Nr. 21 Tokyo Veterinarian & Animal Husbandry (1975).

Fußnote 2) VV. T. Butler: J. Immunol. Bd. 90. S. 663 (1963).

Fußnote 3) J. Dordon. B. Rose. A. H. Sehon: J. Exp. med.Bd. 108. S. 37(1958).

Bestimmung der Antikomplementaktivität:

Das in Kabat & Mayer »Experimental Immunochemistry«. S. 225 (1961) beschriebene Verfahren wurde angewandt. Eine l°/oige Immunoglobulinlösung mit dem Gehalt von Meerschweinchenserum 20 CHw/ml auf 5 ml mit GVB* * eingestellt, wurde bei 37°C während 1 Std. inkubiert und das verbrauchte Antikomplement wurde nach dem vorstehenden Verfahren bestimmt. Die Anttkomplementaktivitätswerte sind durch den Prozentsatz des Verbrauches gegenüber 20CH5<>/ml angegeben.

Beispiel 1

50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung (pH 7,6) mit dem Gehalt von 3,75 g gelösten Natriumsulfit und 50 ml einer einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung (pH 7,6) mit 1,77 g gelöstem Natriumpersulfat (Na2S2Og) wurden aufeinanderfolgend zu 100 ml einer 2,25%igen Glycinlösung mit dem Gehalt von 50 g menschlichem nativen Immunoglobulin zugesetzt und das Gemisch wurde bei 43° C während 4,5 Std. gehalten. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch mit physiologischer Salzlösung dialysiert bis die Konzentration der Reagenzien 0,1 Millimol/Liter oder niedriger betrug. Dabei wurden 200 ml einer wäßrigen Lösung eines Immunoglobulinderivates gemäß der Erfindung mit einer Konzentration von 73% erhalten. Die Antikomplementaktivität CH50 des Produktes als 5%ige Lösung betrug 18%. Die Antikomplementaktivität CH50 des menschlichen nativen Ausgangsimmunoglobulins betrug 90%.

Der Titer des Antidiphtherietoxins des erhaltenen Immunoglobulinderivats als 5%ige Lösung betrug 93 I. U/ml, was demjenigen des nativen Ausgangsimmunoglobulins gleich ist

Um die Anzahl der gespaltenen Interkettendisulfidbindungen des erhaltenen Immunoglobulindenvates zu bestimmen, wurde das erhaltene Immunoglobulinderivat der Natriumdodecylsulfat-Scheibenelektrophorese (SDS-disc electrophoresis) unterworfen. Die Bestimmung erfolgte nach dem Verfahren von Webern und Osborne in J. Biol. Chem. Bd. 244, S. 4406 (1969). Das erhaltene Elektrophoresemuster ist in F i g. I gezeigt. In der F i g. I und den weiteren Zeichnungen bedeuten (a), (b), (c). (d), (e)üna β> jeweils die Wiedergaben auf den als H2L1. HiU //2, HL, H und L wiedergegebenen Peptidketten.

Es ist aus F i g. I ersichtlich, daß, obwohl das in diesem Beispiel erhaltene (mmunoglobulinderivat einen gewissen Betrag an unumgesetzleh Material (hhLi) enthielt, es hauptsächlich aus einem Gemisch von HtL-, Hiu HL·, H- und /.-Ketten infolge der Spaltung der Interkettefidisulfidbindungen aufgebaut war. Mil H und L sind H- bzw /.-Ketten des Immunoglobulins bezeichnet. Beispielsweise ist ein Immunoglobulinderivat. welches auf Grund der Spaltung einer Disulfidbindung zwischen den H und /.-Ketten eines Immunoglobulins (HiLt), das aus 2 Η-Ketten und 2 L-Ketten aufgebaut ist. erhalten wurde, ein Gemisrh aus W?/.-Ketten und /.-Ketten.

^iv Beispiel 2

20 ml einer physiologischen Salzlösung mit dem Gehalt von 2,5 g gelöstem Natriumsulfit und 20 ml einer physiologischen Salzlösung mit 1,6 g gelösten Amrnoniumpersulfat [(NH^SjOe] wurden aufeinanderfolgend zu 100 ml einer 2,25%igen Glycinlösung mit dem Gehalt von 10 g menschlichem nativen Immunoglobulin zugesetzt und das Gemisch wurde bei 40°C während 5 Std. gehalten. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch mit physiologischer Salzlösung zur Entfernung der Reagenzien dialysiert, und es wurden 140 ml einer wäßrigen Lösung des Immunoglobulindenvates mit einer Konzentration von 7% erhalten. Die Antikomplementaktivität CH50 des Immunoglobulinderivats als 5%ige Lösung betrug 23%. Das SDS-Scheibenelektrophoresemuster ist in F i g. 2 gezeigt, das praktisch gleich wie in Beispiel 1 ist, obwohl ein bestimmter Betrag an H2L2-Ketten verblieben ist

Zu 60 ml einer wäßrigen Lösung dieses Produktes

AO wurden 11 ml einer gesättigten wäßrigen Natriumsulfatlösung zugegeben und der erhaltene Niederschlag wurde abzentrifugiert und durch Aussalzen gereinigt Das gereinigte Immunoglobulinderivat wurde in einer physiologischen Salzlösung, die Glycin in einer Konzentration von 2,25% enthielt, zur Herstellung einer 5%igen Lösung des Immunoglobulindenvates gelöst Die Lösung wurde aseptisch filtriert in einer Menge von 5,0 ml jeweils in 10 ml-Ampullen gegossen und lyophilisiert Die Antikomplementaktivität CH50 des erhaltenen

so Immunoglobulindenvates bei einer Konzentration von 5% betrug 15%.

Das folgende Bezugsbeispiel 1 und die Vergleichsbeispiele 1 bis 3 zeigen die Anwendung von Natriumtetrathionat (Bezugsbeispiel 1), Wasserstoffperoxid (Vergleichsbeispiel 1), Mangandioxid (Vergleichsbeispiel 2) und von Eisen-III-ionen (Vergleichsbeispiel 3) als Oxidationsmittel.

Bezugsbeispiel 1

50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung (pH 7,6) mit 3,75 g gelöstem Natriumsulfat und 50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung (pH 7,6) mit 231 g gelöstem Natriumtetrathionat wurden aufeinanderfolgend zu 100 ml einer 225%igen Glycinlösung mit dem Gehalt von 50 g nativem menschlichen Immunoglobulin zugesetzt und das Gemisch wurde bei 45° C während 3 Std. gehalten. Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch mit

physiologischer Salzlösung dialysiert, bis die Konzentration der Resgcnzien 0,1 mmol/l oder weniger betrug. Dadurch wurden 200 g einer wäßrigen Lösung eines Immunöglöbulinderivates mit einer Konzentration von 73% erhalten. Die Anlikomplementaktivität CH50 des erhaltenen Immunöglöbulinderivates als 5%ige Lösung betrug 18%. Das SDS-Scheibenelektrophoresemuster des Produktes ist in F i g. 3 gezeigt

Vergleichsbeispiel 1

50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung (pH 7,6) mit 3.75 g gelöstem Natriumsulfil •nd 50 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung mit einem Gehalt von 0,9 ml einer hiermit »ermischten 30%igen wäßrigen Wasserstoffperoxidlöiung wurden aufeinanderfolgend zu 100 ml einer l,25%igen Glycinlösung mit dem Gehalt von 15 g nativcm menschlichen Immunoglobulih zugesetzt und das Gemisch wurde bei 45°C während 4 Std. gehalten. (U.ich rltfr Ilmsp.l7ima u/ijrrjp d2S PcaktionSgeniisch Li

ier gleichen Weise wie in Bezugsbeispiel 1 dialysiert •nd es wurden 200 ml einer 7,5%igen wäßrigen Lösung •ines Immunoglobulinderivats erhalten. Die Antikompiementaktivität CH₅₀ dieses Produktes als 5%ige Lösung betrug 52%. Das SDS-Scheibenelektrophoresetiuster dieses Produktes ist in F i g. 4 gezeigt.

Vergleichsbeispiel 2

Das Bezugsbeispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch •60 mg Mangandioxid anstelle des Natriumtetrathio-Mats verwendet wurden. Dabei wurde ein Immunoglobu-■nderivat mit einer Antikomplementaktivität CH50 von J0% erhalten. Die SDS-Scheibenelektrophoreses dieses Produktes zeigte lediglich das Vorhandensein geringer Mengen an H₂- und

Vergleichsbeispiel 3

25 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung (pH 7,6) mit U g gelöstem Natriumsulfit und J5 ml einer phosphatgepufferten physiologischen Salzlösung mit 1,0 g gelöstem Eisen-lll-sulfat wurden aufeinanderfolgend zu 50 ml einer 10%igen Lösung von menschlichem nativen immunoglobulin mit dem Gehalt •on 2^5% Glycin zugesetzt und das Gemisch wurde bei 45°C gehalten. Im Verlauf der Umsetzung begann das Reaktionsgemisch trübe zu werden und es wurde keine Reaktion in einem homogenen System erhalten. Der Niederschlag wurde entfernt und die erhaltene Lösung wurde gründlich dialysiert, wobei 90 ml einer hellgelbbräunlichen Lösung eines Immunöglöbulinderivates erhalten wurden. Die Antikomplementaktivität CH50 dieses Produktes betrug 50%. Die SDS-Elektrophorese zeigte, daß einige H- und L-Kellen vorlagen, daß das Produkt jedoch hauptsächlich aus H₂-, HiL- und H₂Li-K.&Ucn bestand. Die SDS-Scheibeneiektrophoresemuster der F i g. 1 und 2 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zeigten eine gute Übereinstimmung mit demjenigen der Fi g. 3 (Bezugsbeispiel 1). Es ist hieraus ersichtlich, daß das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Immunoglobulinderivat sich auf Grund der Spaltung von Interkettendisulfidbindungen eines nativen Immunoglobulins praktisch wie im Fal^f der Anwendung von Nalriumtetrathionat als Oxidationsmittel ergibt.

on Fs is! bekann·. daß be> de"¹ Versuch ^von Bezugsbeispiel 1 (unter Anwendung eines Sulfitions und eines Telrathionations) die gespaltenen Disulfidbindungen des Immunoglobulins S-sulfoniert sind ( —S—SO₃") (siehe US-Patentschrift 40 59 571).

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Immunoglobulinderivate zeigten praktisch das gleiche Muster bei der SDS-Scheibenelektrophorese wie es in Bezugsbeispiel I erhalten wird. Diese Tatsache und die Art des eingesetzten Oxidationsmittels führen zu der theoretischen Annahme, daß die gespaltenen Disulfidbindungen S-sulfoniert sind.

Es zeigt sich aus einem Vergleich der F i g. 1 und 2 mit der Fig.4 (Vergleichsbeispiel 1) und den Ergebnissen der Vergleichsbeispiele 2 und 3, daß, während das erfindungsgemäße Verfahren Immunoglobulinderivate infolge der selektiven Spaltung der Interkettendisulfidbindungen eines nativen Immunoglobulins ergeben, bei Anwendung von Wasserstoffperoxid, Mangandioxid oder Eisen-III-ionen, die an sich bekannte Oxidationsmittel sind, lediglich Immunoglobulinderivate mit einer hohen Antikomplementaktivität erhalten werden, die für die intravenöse Injektion ungeeignet sind, da die Spaltung der Interkettendisulfidbindungen des nativen Immunoglobulins unzureichend ist.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Immunoglobulinderivaten mit verringerter Antikompletnentaktivität, wobei ein natives Immunoglobulin mit Sulfitionen in Gegenwart eines Oxidationsmittels zur Spaltung mindestens einer Interkettendisulfidbindung des nativen Immunoglobulins behandelt wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Oxidationsmittel eine Verbindung, die zur Erzeugung von Persulfationen in Wasser fähig ist, verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindung, die zur Erzeugung von Persulfationen in Wasser fähig ist, Natriumpersulfat, Kaliumpersulfat oder Ammoniumpersulfat verwendet werden.