DE2637022C3 - Amidierte Immunglobuline und deren Verwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft amidierte Immunglobuline und deren Verwendung als Arzneimittel. Insbesondere betrifft sie amidierte Immunglobuline, die intravenös appliziert werden können.

Durch Fraktionierung aus Serum, insbesondere aus menschlichem Serum hergestellte Immunglobuline, haben die wesentliche Eigenschaft, als Antikörper gegen körperfremde Antigene wirksam zu sein.

Immunglobulin-Präparationen erwiesen sich bislang im wesentlichen nur für die intramuskuläre Anwendunggeeignet. Bei intravenöser Applikation reagieren die Empfänger mehr oder weniger mit anzphylaktoiden Erscheinungsformen.

Es wird angenommen, daß diese Nebenreaktionen auf der Bindung des Serum komplements durch das verabreichte Immunglobulin beruhen. Andererseits ist ein intravenöses Immunglobulin-Präparat erwünscht, da es im Organismus rascher zur Wirkung kommt.

Man hat bereits mehrfach versucht, die Immunglobuline derart zu verändern, daß ihre Antikörperaktivität erhalten bleibt, das Maß der Komplementbildung jedoch so weit verringert wird, daß die modifizierten Immunglobuline für eine intravenöse Applikation eingesetzt werden können. Beispielsweise lassen sich Immunglobulinmoleküle durch enzymaf ischen Abbau dahingehend verändern, daß die Bindungsstellen für das Komplement abgespalten werden, der Rest der Moleküle jedoch noch in der Lage bleibt, Antigene zu binden. Ein solches Präparat wird mit gutem Erfolg intravenös appliziert.

Auch die Umsetzung von Immunglobulinen mit al· kylierenden und acylierenden Mitteln führt zu einem zur intravenösen Anwendung geeigneten Immunglobulin. Die Verminderung der Komplementbindung von Immunglobulinen ist durch N-Alkylierung und Benzylierung ebenfalls zu erreichen.

Es ist weiter ein Verfahren bekannt, wonach Immunglobuline durch Reduktion von intramolekularen Disulfidbindungen teilweise gespalten und die gebildeten Sulfhydrilgruppen anschließend alkyliert werden. Bei diesem Verfahren bleibt die ursprüngliche Molekülgröße erhalten.

Diese Verfahren beruhen im wesentlichen auf der Veränderung der freien Aminogruppen bzw. Disulfidbindungen der Immunglobulinmoleküle, Obwohl diese Verfahren zu Produkten mit ziemlich zufriedenstellenden Eigenschaften führen, verbleiben Probleme, die in verbesserter Weise gelöst werden sollen, insbesondere weil die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Moleküle durch die beschriebenen Verfahren wesentlich verändert werden.

ίο Es wurde bereits zu der deutschen Patentanmeldung P 2442655 (Hoe 74/B 023 - Ma 199) vorgeschlagen, Immunglobuline so zu modifizieren, daß sie ihr Bindungsverhalten gegenüber Komplement wesentlich ändern, ohne ihre Wirksamkeit als Antikör- per zu verlieren. Derart modifizierte Immunglobuline, die wenig oder nicht nachweisbar Komplement zu binden vermögen, sind als Arzneimittel für die intravenöse Applikation geeignet.

Gegenstand der genannten Patentanmeldung sind

amidierte Immunglobuline und ferner ein Verfahren zur Herstellung solcher amidierter Immunglobuline, dadurch gekennzeichnet, daß Immunglobuline mit einem molaren Überschuß eines primären Monoamine und einem Carbodiimid in schwachsaurer bis neutraler wäßriger Lösung umgesetzt werden. Es ist danach zweckmäßig, daß das molare Verhältnis von Immunglobulinen zu Amin mindestens 1:50 und das von Immunglobulinen zu Carbodiimid mindestens 1:1 ist. Es wurde nun gefunden, daß dieses Verfahren be sonders vorteilhaft mit Immunglobulinen durchge führt werden kann, die zuvor mit einem Disulfid-Briicken spaltenden Reduktionsmittel behandelt werden, wobei mindestens eine Disulfid-Brücke in zwei Sulfhydrilgruppen überführt wird.

Gegenstand der Erfindung sind demgemäß amidierte Immunglobuline, erhältlich durch Umsetzung von Immunglobulinen mit

a) einem Reduktionsmittel bei schwach alkalischem pH-Wert mit einer Konzentration des Reduk tionsmittels von < 0,1 Mol/l und einem Molver hältnis von Reduktionsmittel zu Protein von 2,5 bis 50:1 und

b) einem primären Monoamin und einem Carbodiimid oder dessen Salz in wäßriger Lösung bei ei- nem pH-Wert von 3 bis 7 und einer Temperatur von 5 bis 50° C, wobei das molare Verhältnis von Immunglobulin zu Amin mindestens 1:50 und das von Immunglobulin zu Carbodiimid mindestens 1:1 ist.

so Nach dem Verfahren zur Herstellung von amidierten Immunglobulinen gemäß der Patentanmeldung P 2442655.9 werden Immunglobuline mit einem molarenüberschuG eines primären Monoamine und einem Carbodiimid oder dessen Salz in schwachsaurer bis neutraler wäßriger Lösung gemäß b) umgesetzt

Erfindungsgemäß werden solche Immunglobuline amidiert, bei denen mindestens eine Dtsulfidbindung mittels eines Reduktionsmittels in zwei Sulfhydrilgruppen gemäß a) übergeführt werden, co Die Reduktion von Disulfidbindungen kann nach einem bekannten Verfahren mit hierfür geeigneten Reduktionsmitteln durchgeführt werden. 2-Mercaptoäthanol oder Mercaptoäthylamin werden beispielsweise in relativ hohen Konzentrationen eingesetzt. Die von CIe I and beschriebenen Reduktionsmittel Dithioerythrit oder Dithiothreitol können besonders vorteilhaft für die Reduktion der Immunglobuline eingesetzt, da sie schon bei niedriger Konzentration

eine ausreichende Reduktionskapazität besitzen.

Die Reduktion des Immunglobulms kann erfolgen in wäßriger, schwach alkalischer Lösung, etwa bei pH-Werten zwischen 7 und 10, Die Konzentration des Reduktionsmittels im Umsetzungsgemiscb sollte zweckmäßig 0,0001 bis <Q,1 M/t und das Mol-Verhältnis Reduktionsmittel: Protein 2,5 bis 50; 1 betragen, wobei bei Verwendung von Cleland-Reagenzien die Konzentration des Reduktionsmittels zwischen 0,0001 und 0,01 und das Mol-Verhältnis etwa 2J5 bis 5:1 beträgt

AJs Ausgangsmaterial für die erfindungsgemäße Umsetzung dienen aus Seren, Plasma oder anderen Körperflüssigkeiten oder Organextrakten gewonnene Immunglobulin-Fraktionen. Insbesondere werden die bezüglich Immunglobulin G angereicherten Fraktionen eingesetzt. Eine vorteilhafte Methode zu deren Herstellung ist beispielsweise die nach Levy und Sober über Chromatographie an DEAE-Zellulose. Selbstverständlich können auch die reinen Immunglo- -o buline erfindungsgtmäß amidiert werden. In der Praxis spielen die lQ0%ig reinen Immunglobuline wegen der aufwendigen Reinigungsverfahren zur Zeit aber keine bedeutende Rolle.

Es hat sich gezeigt, daß die Komplementbindung der Immunglobuline besonders niedrige Werte ergibt, wenn das Verhältnis Immunglobuline zu Carbodiimid 1:5 bis 1:20 ist. Als Amine im Sinne der Erfindung eignen sich alle primären Monoamine, also Verbindungen der allgemeinen Formel A-NH₂, in der R einen Rest bedeutet, der nach bekannten Vorstellungen In der Immunologie kein markantes antigenes Motiv darstellt.

Beispiele geeigneter Amine sind k. erster Linie aliphatische Amine, MethySamin, A thylamin und höhere J5 aliphatische Amine, insbesondere sp>;he mit bis zu 10 C-Atomen. In den zur Anwendung gelangenden schwachsauren wäßrigen Lösungen liegen die Amine in der Regel als die entsprechenden Ammonium-Kationen vor. Bevorzugt im Sinne der Erfindung sind solehe Amine, die weitere funktioneile Gruppen, insbesondere hydrophile Gruppen, wie Hydroxyl oder Acetal tragen. Beispiele solcher Amine sind Äthanolamin, Trishydroxymethylaminomethan oder Glukosamin, die die Löslichkeit des Umsetzungsproduktes in einem physiologisch verträglichen wäßrigen Medium günstig beeinflussen.

Da das Verfahren im wäßrigen System unter Bedingungen, unter denen die Antikörperaktivität des Immunglobulins nicht geschädigt werden darf, durchgeführt wird, ist die Umsetzung in an sich bekannter Weise in Gegenwart eines Carbodiimids als Aktivator auszuführen. Als Carbodiimide eignen sich hier alle Vertreter dieser Verbindungsklasse, die in der Lage sind, bei der Bildung von Pep- tidbindungen aktivierend zu wirken. Beispiele für solche Carbodiimide sind das l-Äthyl-3-(3-dimethylarninopropyl)-carbodumid-Hydrochlorid (EDC) oder das l-Cyclohexyl-3-(2-morpiioIinäthyl) carbodiimid metho-p.toluolsulfonat (CMC), Ebenso wie die Amine werden auch die Carbodiimide in den zur Anwendung kommenden schwachsauren wäßrigen Lösungen als Salze vorliegen. In der Regel werden die Carbodiimide ohnehin als Salze zum Einsatz gebracht, weil sie in dieser Form beständiger und leichter zu handhaben sind. Prinzipiell können aber auch die freien Carbodiimide zur Anwendung kommen, die dann beim Auflösen in der wäßrigen Lösung in die Salzform übergehen.

Die Testung der Komplementbindung kann nach A. Nowotny, Basic Exercises in Immunochemistry, S. 160 ff. (1969) durchgeführt werden.

Die erfindungsgemäß hergestellten amidierten Immunglobuline mit einer hinreichenden Verringerung der Komplementbindung können intravenös appliziert werden. Sie lassen sich mit physiologisch verträglichen Lösungsmitteln zu entsprechenden Zubereitungen verarbeiten. Amidierte Immunglobuline enthaltende Arzneimittel können in flüssiger oder gefriergetrockneter Form zur Verfugung gestellt werden.

Demgemäß ist auch Gegenstand der Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäß amidierten Immunglobuline zur intravenösen Applikation.

Die Erfindung soll ·κη nachstehend angeführtem Beispiel näher erläutert werden.

Beispiel

Eine Lösung von 33 g Immunglobulin in 330 ml 0,15 M NaCI-Lösüng wird mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) auf pH 8,2 eingestellt. Der Immunglubolinlösung werden 15,3 mg Dithioerythrit (DTE) gelöst in 2 ml Wasser zugesetzt. Nach 60 Minuten wird der Immunglubolinlösung 20 ml einer 5 g Tris enthaltenden Tris-HCl-Lösung vom pH 1,0 unter Rühren zugesetzt. Der pH-Wert ^.sr Mischung wird mit HCl auf 5,0 eingestellt und in 2 Stunden bei Raumtemperatur nach Zugabe von 82,2 mg N-Äthyl-N'-P-dimethylaminopropylJ-carbodiimid-HCl amidiert.

Das mit Tris-Hydroxymethyl-aminomethan amidierte Immunglobulin wird danach über eine Sephadex G-25® enthaltende Säule geleitet, die vorher mit einer Lösung gespült worden ist, die 0,15 M NaCl und 0,3 M Glycin sowie einen pH-Wert von 7,3 hatte. Die optische Dichte des Säuleneluates wird bei 280 nm mit einem Durchflußphotometer gemessen. Der das amidierte Immunglobulin enthaltende Teil des Eluates wird vereinigt und mit einem Ultrafilter ankonzentriert bis zu einem Proteingehalt von 5%.

Die Reduktion der Immunglobuline kann statt mit Dithioerythrit mit Dithiotreitol (DTT) bei gleichen Versuchsbedingungen vorgenommen werden.

Claims (2)

1. Patentansprüche;

   1, Amidiene Immunglobuline, erhältlich durch Umsetzung von Immunglobulinen mit

   a) einem Reduktionsmittel bei schwach alkalischem pH-Wert mit einer Konzentration des Reduktionsmittels von <0,l Mol/l und einem Mol-Verhältnis von Reduktionsmittel zu Protein von 2,5 bis 50:1 und

   b) einem primären Monoamin und einem Carbodümid oder dessen Salz in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 3 bis 7 und einer Temperatur von 5 bis 50° C, wobei das molare Verhältnis von Immunglobulin zu Amin mindestens 1:50 und das von Immunglobulin zu Carbodiimid mindestens 1:1 ist.
2. 2. Verwendung von amidierten Immunglobulinen nach Anspruch 1 zur intravenösen Applikation.