DE1962795A1 - Chemisch modifiziertes Endotoxin-Immunisierungmittel - Google Patents
Chemisch modifiziertes Endotoxin-ImmunisierungmittelInfo
- Publication number
- DE1962795A1 DE1962795A1 DE19691962795 DE1962795A DE1962795A1 DE 1962795 A1 DE1962795 A1 DE 1962795A1 DE 19691962795 DE19691962795 DE 19691962795 DE 1962795 A DE1962795 A DE 1962795A DE 1962795 A1 DE1962795 A1 DE 1962795A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- lipopolysaccharide
- polysaccharide
- groups
- bacterial endotoxin
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0258—Escherichia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
Es vrurde gefunden, daß ein bakterielles Endotoxin-Iipopolysaccharid,
das kovalent an ein Protein-Antigen gebunden ist, erhöhte HilfsstoffWirkungen zeigt. Die Herstellung
der Bindung erfolgt durch Umsetzung mit Halogenacylhalogenid. Ein mit einem Anhydrid einer zweibasischen Säure
acyliertes Lipopolysaccharid ist detoxifiziert, es entwickelt
in.Kombination mit kovalent an Protein-Antigen gebundenem Endotoxin-Polyeaocharid eynergistieche immunogene
Wirkungen.
- 1 -009827/1897
2602 g, 1362795
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein verbessertes Immunisierungsmittel und ein Verfahren zu seiner Herstellung.
Sie betrifft insbesondere ein bakterielles Endotoxin-Lipopolysaccharid
(LPS), das zur Erhöhung seiner !Fähigkeit, Antikörper-Bildung in Warmblütern zu stimulieren, chemisch
modifiziert ist, und ein Verfahren zur Herstellung den modifizierten LPS.
Es ist bereits bekannt, daß Lipopolysaccharide aus gramnegativen Bakterien die Antikörper-Reaktion in warmblütigen Tieren gegenüber relativ reinen Protein-Antigenen erhöhen,
wenn das LPS und das Protein entweder zusammen oder innerhalb eines geeigneten Zeitintervalle injiziert
werden· Bei Kaninchen muß das LPS 0 bis 48 Stunden nach dem Antigen verabreicht werden, während das LPS bei BaIb-Mäusen
bis zu 7 Tage vor oder 8 Tage nach einem löslichen Antigen verabreicht werden kann und noch eine Steigerung
der Antikörper-Bildung zeigt. Ein derartiges Mittel, das die Antikörper-Bildung steigert, wenn es mit
einem Antigen verbunden ist, kann als ein "Hilfsstoff" bezeichnet werden, während das sich ergebende Phänomen
als eine "Hilfestoffwirkung" bezeichnet werden kann· Die
Verwendung von LPS als ein Hilfsstoff ist zwar sehr erwünscht, seine Anwendung ist jedoch durch die Toxizität
des LPS bei der Verabreichung in einer wirksamen Dosis.etwas begrenzt. Es ist erwünscht, daß die Steigerungsaktivität
beibehalten wird, während 'die loxizität herabgesetzt
wird, oder daß zumindest der Abstand zwischen der Steigerungsdosis und der toxischen Dosis erhöht werden kann«
.Ziel der vorliegenden Erfindung ist somit die Schaffung
einer LPS-Hilfsstoff-Zusammensetzung, die ein erhöhtes Haß
an Antikörper-Bildung bei herabgesetzter Toxizitätsreaktion
liefert« Sin weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung
009827/1091
2602
ist die Schaffung eines chemisch modifizierten LPS-Hilfs-.stoffes
mit herabgesetzter Toxizität, Ziel der vorliegenden Erfindung ist weiterhin die Schaffung einer Hilfsstoff-Zusammensetzung,
die eine synergistische Kombination von chemisch modifizierten Endotoxinderivaten mit hoher Aktivität
in Hinblick auf die Steigerung der Antikörper-Bildung und niedriger Toxizität enthält· Ein weiteres
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur chemischen Modifizierung von IPS und von
einer sich von LFS ableitenden Fraktion, um die Toxizität
zu vermindern oder zu beseitigen, während die Fähigkeit, Antikörper-Bildung zu steigern, beibehalten wird·
Es wurde nun gefunden, daß die Steigerung der Antikörper-Bildung durch chemische kovalente Bindung des Antigens an
das LFS stark verbessert wird« Es wurde weiterhin gefunden,
daß das LPS selbst chemisch modifiziert werden kann, um seine Toxizität stark herabzusetzen, während die Antikörper-Steigerungswirkung
unverändert bleibt oder nur gering vermindert wird· Ausserdem wurde gefunden, daß eine
Kombination von chemisch modifizierten LPS-Derivaten mehr
als zusätzliche HilfsstoffWirkungen, jedoch ohne zusätzliche
Toxizität verursacht, wodurch eine unerwartete Erhöhung des Verhältnisses von Steigerungsaktivität zu
Toxizität hervorgerufen wird«
Lipopolysaccharide sind noch nicht vollständig charakterisiert,
es wird jedoch angenommen, daß sie ein Gerüst aus Heptosedisaccharideinheiten, die durch Fhosphodiesterbrücken
miteinander verbunden sind, enthalten· Polysaccharide und vollständig acylierte kleine Aminohexosepolymerisate
sind mit denHeptosedisaooharideinheiten ver
knüpft· Das aus E. coil K-235 erhaltene LFS hat auch ge-
009827/1897
bundene Aminosäuren und Äthanolamin, die freie primäre
Aminogruppen liefern, die bei der kovalenten Verknüpfung des LPS mit Protein verwendet werden können« Sie meisten
Fettsäurereste liegen in Esterverknüpfungen vor, und können durch sehr milde alkalische Hydrolyse entfernt werden·
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die aktiven Aminogruppen und möglicherweise einige
Hydroxylgruppen mit einem Halogenacylhalogenid umgesetzt« Anschließend wird das Halogen der Halogenacylgruppe mit
aktiven Stellen auf einem Protein-Antigen umgesetzt, um ein durch eine Ester- oder Amidverknüpfung kovalent an
ein Antigen gebundenes LPS (LPS-A) zu liefern« Sie Umsetzungen finden bei etwa Raumtemperatur, d«h« bei etwa
20 bis etwa 5O0C, und in einem Medium mit einem pH ober
halb 7t vorzugsweise in einem bei einem pH von etwa 8,5
bis etwa 9,5 gehaltenem Medium statt«
Sie Aminogruppen werden insbesondere mit Bromacetylbromld
in wäßriger Lösung in der folgenden Weise umgesetzt:
0 Lipopolysaccharide NH2) χ+ (Br-Co-CHgBr ) Überschuß
pH 9
* 0 Lipopolysaccharid-(NH-C-
Sie Gruppe
0 -NH-C-CHgBr
009827/ 1897
2602
ist relativ stabil und das Lipopolysaccharidderivat kann durch Dialyse von Salzen und überschüssigem Reagens abgetrennt
werden. Jedes Bromatom dieses LPS-Derivats kann mit -SH und Imidazol bei etwa pH 7 oder mit -NHg-Gruppen von
Proteinen bei etwa pH 8 bis 10 reagieren, wobei folgende Gruppen gebildet werden:
0
EPS-NH-C-CH2-S-Protein
EPS-NH-C-CH2-S-Protein
CH = CH-Protein
ι ι
S S
NH - Protein
Ss kann demzufolge jedes Lipopolysaccharid mit freien
Aminogruppen an ein Protein oder ein anderes Makromolekül, einen Virus oder eine Zellfraktion gebunden werden, die
verfügbare -SH-, Imidazol- oder -HHg-Gruppen enthalten·
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein LPS-Derivat mit stark vermindertem Lipidgehalt
(PS) mit Halogenacylhalogenid und Protein-Antigen in der obigen Weise behandelt, um verbundenes PoIysaccharid-Antigen
(PS-A) mit niedriger Toxizität und niedriger Hilfsstoffwirkung zu liefern. Diesem wird ein
LPS zugesetzt, das durch Umsetzung mit dem Anhydrid einer zweibasischen Niedrigalkyleäure detoxifiziert worden ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Umsetzung unter Bedingungen durchgeführt, die ausreichen, um alle
freien Aminogruppen und etwa die Hälfte der freien Hydroxy 1-
009827/189 7
2602
gruppen zu acylieren. Das acyllerte Lipopolysaccharid (AcLPS) selbst hat eine gewisse Hilfsstoffwirkung und sehr
niedrige Toxizität, jedoch liefert die Kombination nach Mischen mit dem PS-A eine größere als additive Hilfsstoffreaktion
bei einer weit geringeren als additiven Toxizität.
Für diese Acylierung können Anhydride verwendet werden, die mit den Hydroxylgruppen des Lipopolysaccharidmoleküla
Halbester bilden, ohne eine wesentliche Anzahl der ursprünglich vorhandenen Fettsäurereste zu ersetzen« Zu geeigneten
Anhydriden gehören Verbindungen der allgemeinen Formel
H -CH
-C-H
11
L1 .. 2
worin η eine ganze Zahl von Null bis 1, R, R1 und R2 Wasserstoff,
Alkyl, substituiertes Alkyl, Alkenyl, substituiertes Alkenyl, Cycloalkyl und/oder Aryl bedeuten, wobei beliebige
zwei Gruppen R zusammengenommen einen gesättigten oder ungesättigten cyclischen Substituenten bilden können«
Bernsteinsäureanhydrid, G-lutarsäureanhydrid und 1,2-Cyclohexandicarbonsäureanhydrid
sind bevorzugt« Aromatische Anhydride, wie Phthalsäureanhydrid und seine Derivate,
können ebenfalls verwendet werden. Natürlich sind Bolohe Anhydride, die die Toxizität der LPS-Derivate relativ zu
ihrer Hilfeetoffwirkung unverhältnismäßig erhöhen, su ver-
' ■- 6 -
009827/ 1ÖÖ7
2602 .
meiden» Salze des acylierten Lipopolysaccharide können
ebenfalls hergestellt werden und die wasserlöslichen Salze, wie die Natrium-, Kalium-, Lithium- und Aminsalze, sind besonders
bevorzugt, wenngleich auch andere Salze brauchbar Bind·
Die Acylierungöreaktion wird bei etwa Raumtemperatur, erwünschtermaßen
unter etwa 500C und in jedem Pail unter der
Temperatur durchgeführt, bei der wesentliche Zersetzung stattfindet· Die Reaktionszeit ist abhängig von der
Temperatur und soll ausreichend lang sein, um' die Acylierung der Hydroxyalkoholgruppen zu erlauben· Dies kann etwa
12 bis etwa 30 Stunden in Anspruch nehmen und in einer oder mehr als einer Acylierungsstufe durchgeführt werden«
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter
erläutern, jedoch nicht beschränken·
Herstellung von Lipopolysaccharid (LFS) und Polysaccharid
(PS)
Gran-negative Bakterien, E. GoIi K-235, werden auf einem ■
belüfteten Medium gezüchtet, zentrifugiert und mit wäßrigem Phenol extrahiert· Die Polysaccharide-(PS)-Fraktion des
LPS wird durch Hydroxylaminolyse erhalten. Einzelheiten dieser Arbeitsweisen sind in Biochemistry, £, 2363 (1967)
beschrieben«
Das so erhaltene LPS und PS werden in der in den nachfolgenden Beispielen angegebenen Weise chemisch nodifiaiert.
009827/1897
2602
1 6 LPS wird in 250 ml 1/2-geBättigtera Natriumacetat in
einem Eisbad suspendiert und der pH wird mit Natriumhydroxyd auf 9 eingestellt· 200 /ul Bromacetylbroraid, gelöst in
10 ml trockenem Dioxan (Reagensqualität), werden tropfenweise zugegeben und gleichzeitig wird 1n NaOH in einer
Menge zugegeben, die ausreicht, um den pH zwischen 8,5 und 9,5 zu halten. Nach Zugabe des gesamten Bromacetylbromide
wird der pH mit 6 bis 12n HOl auf etwa 4,5 eingestellt.
Die Herstellungsmischung wird 5 bis 7 Tage lang bei 4-0C in einem mit Gewebe umhüllten Schlauch dialysiert.
Das bromacetylierte Produkt ist bei dem niedrigen pH stabil und kann entweder gefroren oder lyophilisiert gelagert werden.
Seine Hilfsstoffaktivität ist der des LPS-Ausgangsmaterials
etwa gleich. Das für die Bindungsbildung verfügbare Brom wird bestimmt, indem das Bromacetyl-Endotoxin
unter konstantem Rühren bei pH 9 bis 12 zwanzig Stunden lang bei Raumtemperatur mit einer gleichen Gewichtsmenge
N-(2,4-Dinitrophenyl)-ethylendiamin reagieren gelassen
wird. Die Lösung·wird auf pH 4 eingestellt und erschöpfend gegen 10"^n HCl dialysiert. Die gebundene Menge an N-(2,4-Dinitrophenyl)-ethylendiamin
wird durch die Absorption bei 340 m/u bestimmt. Das in der oben beschriebenen Weise bestimmte
für die Bindungsbildung verfügbare Brom beträgt gewöhnlich etwa O11 /uMol pro mg Endotoxin, wenngleich
die durch Elementaranalyse gefundene Menge gewöhnlich um ein Mehrfaches größer ist· Das meiste "für die Bindungsbildung nicht verfügbare" Brom kann durch Elektrodialyse
entfernt werden«
009827/1 897
Bromacetyliertes PS wird gemäß der gleichen Arbeitsweise
hergestellt, wobei jedoch das PS von Beispiel 1 für das oben erwähnte LPS eingesetzt wird. Die Menge an für die
Bindungsbildung verfügbarem Brom beträgt gewöhnlich etwa 0,04 /uMol pro mg Endbtoxin.
Das nachfolgende.Beispiel veranschaulicht die Bindung der
bromacetylierten Produkte an ein Protein-Antigen, von dem verschiedene Typen verwendet werden können«
Beispiel 3-A
100 mg Bromacetyl-Endotoxin in 25 ml H2O mit pH 4,5 werden
mit 100 mg Antigen in 20 ml gemischt und es werden 5 ml 1 molares K2HPO, zugegeben. Das Antigen ist ein kristallisiertes
Menschenserumalbumin-(HSA)-Präparat, das von Pentex Incorporated erhalten worden ist. Die lösung wird
auf 100 ml verdünnt, mit 2 bis 5n NaOH auf pH 10 eingestellt, 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und wieder
auf pH 7 eingestellt. Bei der Chromatographie über G-200 SephadexvS/ ergeben sich zwei proteinhaltige Peaks.
Der ausgeschlossene Peak (hohes Molekulargewicht) enthält LPS gebunden an HSA und vermutlich etwas freies LPS,
während der eingeschlossene Peak in hohem Maß aus unumgesetztem
HSA besteht. Das Ausmaß der kovalenten Bindung von HSA an LPS wird bestimmt, indem die Lösung mit Natriumchlorid
auf 0,15 molar eingestellt, dreimal bei 650C mit
einer gleichen Volummenge Phenol extrahiert, das Phenol
aus dtr wäßrigen Phase duroh drei Ä'therextraktionen ant-
0 Ö Π f J 2 7 / !897
2602
fernt und das Protein in der wäßrigen Phase gemessen wird.
Durch diese Arbeitsweise können gemischtes und nicht verbundenes LPS und HSA vollständig getrennt werden» Es wird
gefunden, daß mindestens 10 # und gewöhnlich 25 bis 30 $>
des HSA gemäß der Arbeitsweise des vorliegenden Beispiels an das LPS gebunden worden sind·
Beispiel 5-B
Die Arbeitsweise von Beispiel 3-A wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß das Bromacetyl-Endotoxin durch eine gleiche
Menge an Bromacetyl-Polysaccharid, hergestellt gemäß Beispiel
2, ersetzt wird· Hehr als etwa 10 $> des Antigene
werden an das Polysaocharid gebunden*
Das nachfolgende Beispiel veranschaulicht die Acylierung eines Lipopolysaccharide.
Beispiel 4
Herstellung von Succinyl-LPS
Herstellung von Succinyl-LPS
1 g LPS und 10 g Bernsteinsäureanhydrid werden in 50 ml
Formamid und 50 ml Pyridin gelöst, die vorher über Hatriumhydroxydplätzchen
getrocknet und redestilliert worden sind« Der Reaktionskolben wird mit einer doppelten Schicht aus
Parafilm© verschlossen, es wird bei Raumtemperatur 20 bis 22 Stunden lang gerührt und dann in 200 ml pyrogenfreies
Wasser gegossen« Die Lösung wird bei 40C
48 Stunden lang gegen 5 Ltr· dreifaoh destilliertes Wasser,
48 Stunden lang gtgen 0,1 molar·· Natriuobioarbonat
- 10 -
009827/1897
2602
Ii
und 48 Stunden lang gegen dreifach destilliertes Wasser dialysiert, wobei das Wasser alle 8 bis 16 Stunden gewechselt
und konstant gerührt wird. Zur Verhinderung einer Volumzunahme während der Dialyse wird der Schlauch in
einen Gewebemantel gebracht· Das Natriumsuccinyl-LPS wird
konzentriert und lyophilisiert. Dieses Produkt wird nochmals
5 bis 7 Stunden lang bei Raumtemperatur mit den · gleichen Reagentien und in den gleichen Mengen succinyliert.
Die Ausbeute an Endprodukt beträgt 1,85 bis 2 g. Durch Säure-Base-Titration wird festgestellt, daß zu 50 bis
55 Gew,-# Natriumsuccinyl (NaOOCCH2CHgCO-) vorliegt, was
etwa 8 /uMol pro mg LPS in dem Produkt äquivalent ist·
Die Hilfsstoffaktivität der Präparate von Beispiel 1 bis 4 wird an männlichen Ratten vom Stamm Sprague Dawley mit
einem Gewicht von etwa 200 g und an männlichen Neuseeland-Kaninchen-Albinos
mit einem Gewicht von etwa 2 kg bestimmt· Jede Ratte erhält 0,05 bis 0,5 mg Antigen in 0,25 ml
Salzlösung, den Kaninchen werden 0,04 bis 0,8 mg Antigen in 0,5 ml Salzlösung injiziert. Die Hilfsstoffwirkung des
LPS kann bei Verabreichung auf intraperitonealem, intramuskulärem oder subkutanem Weg gezeigt werden, wobei die
Injektion in den Fußballen nicht wirksamer ist als intramuskuläre (Bein) oder subkutane (Nacken) Injektion. Die
Antikörper-Bestimmung erfolgt durch passive Hämagglutination mit zweifacher Reihenverdünnung· Die Antikörper-Titer
werden als der reziproke Wert der Verdünnung ausgedrückt· Jeder Wert in den Tabellen stellt den geometrischen Mittelwert von Bestimmungen an 8 bis 12 Ratten dar·
Das nachfolgende Beispiel veranschaulicht die Bedeutung der kovalenten Bindung zwischen Antigen und LPS1 wenn beide
subkutan bei der Ratte injiziert werden·
- 11 -
0 09827/1897
2602
Antigen (MenBchenserum-Albumin) und LPS werden fast gleichzeitig
an etwa 2,5 cm auseinanderliegenden getrennten Stellen im Nacken in der Menge von 0|19 mg Antigen (A) an Stelle
1 und 0,31 mg IPS an Stelle 2 an Ratten injiziert. Andere Ratten erhalten gemäß der Arbeitsweise von Beispiel 3 verbundenes
LPS-A in einer Menge von 0,5 mg. Weiterhin wird mit LPS unmittelbar vor der Injektion gemischtes Antigen
in einer Menge von 0,19 mg A gemischt mit 0,31 mg LPS verabreicht.
Der Antikörper-Spiegel wird wöchentlich be stimmt und die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I
angegeben.
- 12 -
009827/1897
TABEIEE I
Relative immunologische Reaktion
ro σ\ ο ro
WOCHEN
2 3 4
2 3 4
Do ei s
IPS und A, getrennte Stellen
IPS plus A, gemischt
IPS plus A, gebunden 0,5 mg 0,5 mg 0,5 mg
1,5 2,6
3,4 2,6
15
O 1,5
10 19,5
8,7 27 159 115
2602
' if
Die Ergebnisse von Tabelle I zeigen klar, daß bei den Bedingungen dieses Versuchs im wesentlichen keine Hilfsstoffwirkung
vorliegt, wenn nicht LPS vor der Injektion mit Antigen gemischt wird, und daß die Wirkung durch Herstellung
einer Bindung zwischen den beiden Molekülen gesteigert wird. Wenn das Antigen unmittelbar vor der
Injektion mit dem Bromacetyl-LPS von Beispiel 2 bei einem pH von etwa 7 oder weniger gemischt wird, wobei diese Bedingung
die Herstellung einer Bindung nicht begünstigt, so Bind die Ergebnisse die gleichen wie sie mit einer
einfachen Mischung von LPS und Antigen erhalten werden·
Dies bedeutet, daß die Bromacetylierung von LPS als solche keine aussergewöhnlichen Hilfsstoffeigenschaften beiträgt und daß die Überlegenheit von LPS-A tatsächlich der
Bindung zwischen den beiden Molekülen zuzuschreiben ist·
Die oben gezeigte erhöhte Hilfsstoffwirkung ist natürlich
ein sehr vorteilhaftes Ergebnis. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird mit einem
Mittel mit verminderter Toxizität eine äquivalente Immunogenreaktion erreicht· Die Entfernung von im wesentlichen
allen Ester-verknüpften Fettsäuren aus dem Lipopolysaccharid
ohne eine andere bekannte größere Änderung in dem Molekül vermindert die Pyrogenizität beim Kaninchen
um einen Paktor von 1 000 000 und vermindert die Toxlzität bei der Maus um mehr als das 6 000-fache· Diese
Polysaccharidfraktion (PS) ist in der Lage, fast die gesamten Antikörper für LPS in einem Kaninchenantiserum für
die Ausgangsbakterien zu neutralisieren·
Das in hohem Maß succinylierte Lipopolysaccharid (AcLPS)
von Beispiel 4 ist um einen Faktor von mehr als 1 000 weniger pyrogen und bei der Haus um mehr ale das 500-fache
- 14 -
009827/ 1897
2602
weniger toxisch als IPS. Es behält im wesentlichen alle Fettsäuregruppen des LPS bei, jedoch ergibt sich kein Anzeichen
für die Umsetzung mit dem speziellen verwendeten Antikörper.
Diese chemisch modifizierten Derivate PS und AcLPS sind
jeweils viel weniger immunogen als an Antigen gebundenes Lipopolysaccharid. Das an Antigen gebundene Polysaccharid
von Beispiel 3 ergibt sehr wenig primäre Reaktion, jedoch zeigt eine sekundäre Reaktion etwas Aktivität an.
Aus Ergebnissen von getrennten Vergleichsbestimmungen wird abgeschätzt» daß das succinylierte LPS von Beispiel 4 etwa
1/100 mal so wirksam ist wie LPS in Hinblick auf die Erhöhung der Antikörper-Reaktion gegenüber A. Jedoch ist
seine Toxizität mindestens 1 000 und möglicherweise 10 mal niedriger als die von LPS, so daß das Verhältnis von
Toxizität zu Hilfsstoff Wirkung in dem Produkt von Beispiel
4 um einen Paktor von mindestens 10 und möglicherweise
von 100 vermindert ist.
Gemäß einem wichtigen Merkmal der vorliegenden Erfindung liefert eine Mischung des acylierten Lipopolysaccharide
von Beispiel 4 mit einem in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellten Polysaccharid mit niedrigem Lipidgehalt
oder vorzugsweise mit dem gemäß Beispiel 3 hergestellten, an Antigen gebundenen Polysaccharid eine sehr hohe
Hilfsstoffwirkung bei sehr niedriger Toxizität. Die Kombination
von PS und AoLPS hat keine größere Pyrogeniaität als AoLPS allein« Das hohe Ausmaß der Hilfestoffwirkung,
das erreicht wird, ist in Beispiel 6 veranschaulicht.
- 15 -
009827/1897
2602
Wie bei dem Versuch von Beispiel 5 wird eine Versuchszusammensetzung
an 8 bis 12 Ratten injiziert und die Antikörper-Spiegel werden durch eine passive Hämagglutinatione
methode bestimmt· Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden
Tabelle II angegeben« Sie Materialien für die Injektion
werden ausgewählt! um eine konstante Menge, O9 25 ng»
Antigen zu liefern, und zwar folgendermaßen:
- 16 -
0Ό9827/1897
ι α R 2 7 9 5
. I J , * / J J
Versuch Injektion in
Nr·
0,5 mg der Eealctionsxaischimg von Beispiel 3=-A, bei
der etwa 25 bis 30 $ des Antigens an äas Mpopolysaccharid
gebunden sind, um 0,25 mg Antigen ale
eine Vergleichsprobe su liefern*
Eine Chromatographische fraktion awe 6er Eeaktionsmischung
von Beispiel 3-B, die ausreicht 9 um 0,25 mg
Antigen und 0,45 mg Polysaeehariü κιι liefern, wobei
etwa 30 i» des Antigens an das Polysaeeliarici gebunden
sind, gemischt mit 2,5 rag acylierteia Idpopolysaccharid,
liergeßtellt gemäß deio Verfaktreft von Beispiel
4. ·
Eine Mischung von 0,25 mg Antigen, 0,25 Mg PoIysaccharid
und 2,5 mg des acylierten Lipöpoly«
saccharide von Beispiel 4»
Eine Misohung von 0,25 mg Antigen und 2^5 mg des
acylierten Lipopolysaccharide von Beispiel 4·
Eine chromatographische Fraktion aus einer Menge
der Eeaktionsmischung von Beispiel 3-Bj di© ausreicht,
um 0,25 üng Antigen und 0,45'mg PoIysaccharid
zu liefern, wobei etwa 30 $> Se» Antigens
an das Polyeacoharid gebunden sind«
1T -
00 S 8 y7 / 1 897
——————— ■ -ο
Immunologische Reaktion ^5
Ver- Dosis · Häraagglutinationstiter
such (geometrisches Mittel)
Ir· ' . " —
WOGHEl
2 3 4 5 6
20 0,25 mg Antigen (25-30$ gebunden)
0,25 mg LPS 5,7 3,5 14 . 91 92 63
ο . ■'
S 21 i'i5 Sf i«Lpfn {m ßebwldeil) in PS-A \ gemiacht 0 6,6 15 65 69 43
^f -· 22 0,25 mg Antigen
j; · 0,25 mg PS ) gemischt 0 1,9 5,6 37 46 37
co * 2,5 mg AcLPS
23
24 0,25 mg Antigen (25# gebunden) in PS-A 0 0 0 3,4 2,20
2602 IJ
Die statistische Analyse zeigt, daß die Ergebnisse der Versuche Kr. 20 und 21 sich nicht bedeutend unterscheiden«
Die Versuche Nr. 23 und 24 zeigen das Ausmaß der HiIfest off reaktion, das von jedem der chemisch modifizierten
Lipopolysaccharidderivate einzeln hervorgerufen wird· Versuch Nr* 21 zeigt die überraschend große Reaktion, die
eine Mischung der Derivate zeigt. Diese immunologische Reaktion ist statistisch der Reaktion von an Antigen gebundenem Lipopolysaccharid (LFS-A) äquivalent» jedoch Bit
einer mindestens 1 000-fach geringeren Toiizität (PyrogeniGsLtät)·
- 19 -
009827/1897
Claims (1)
- PATENTANSPRÜCHEVerfahren zur Herstellung von bakteriellem Endoibxin mit verminderter Toxizität, dadurch gekennzeichnet, daß man ein bakterielles Lipopolysacoharid in einem nichtwäßrigen Lösungsmittel auflöst, ein zweibasisches Säureanhydrid zu der Lipopolysaccharidesung hinzufügt, das Lipopolysaccharid und das Anhydrid für eine Zeitspanne bewegt bzw. rührt, die ausreicht, um das Lipopolysaccharid zu acylieren, und das Reaktionslösungsmittel durch Dialyse entfernt·2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Anhydrid unter Verbindungen mit der allge meinen Formelausgewählt wird, wobei η eine ganze Zahl von Null bis 1 und R, R^ und R2 Wasserstoff, Alkyl, substituiertes Alkyl, Alkenyl, substituiertes Alkenyl, Cyoloalkyl und/oder Aryl bedeuten, wobei beliebige zwei Gruppen R Busammengenommen einen gesättigten oder ungesättigten cyclischen Bubetituenten bilden können,- 20 -009827/ 1 8973, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein alkalisches Reagens einbringt, um mit den Säuregruppen ein Salz zu bilden.4· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel Formamid und Pyridin umfaßt«5. Verfahren nach Anspruch lt dadurch gekennzeichnet, daß man das Lipopolysaecharid in Gegenwart eines Überschusses an Bernsteinsäureanhydrid für eine Zsitspairaa bewegt bzw, rührt, die ausreicht;, um ein Produkt zu ergeben, das 50 Gew,-# Natriuiüsuecinylgruppen enthält·6· Verfahren nach Anspruch 2» dadurch gekennzeichnet, daß das Alkalieal?. HaHCO, ist«7· Bakterielles Endotoxinderivat mit verminderter Toxizität, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Lipopolysaccharid mit Halbestern von zweibasischen Säuren und Salzen davon in einer Menge, die etwa 8/uMol Halbester pro ng Lipopolysacoharid in dem Endprodukt gleich ist.8· Zusammensetzung nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß das Anhydrid unter'Verbindungen der allgemein tn Formel- 21 «9B27/1S972602 J- ο—/ c V-O -ausgewählt ist, wobei η eine ganze Zahl von Null bis 1 und R, R1 und R2 Wasserstoff, Alkyl, substituiertes Alkyl, Alkenyl, substituiertes Alkenyl, Cycloalkyl und/oder Aryl bedeuten, wobei beliebige zwei Gruppen R zusammengenommen einen gesättigten oder ungesättigten cyclischen Substituenten bilden können, j9. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Salze der Halbester aus der Gruppe der Erdalkalimetalle und Amine ausgewählt sind, wodurch die Zusammensetzung wasserlöslich gemacht wird·10. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekenn-" zeichnet, daß Natriumsuccinylgruppen etwa 50 Gew.-^ des Endotozinderivats ausmachen«1t. Zusammensetzung nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß ein im wesentliches lipidfreies bakterielles Endotoxin-Polysaccharid enthalten ist«12. Zusammensetzung nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß ein im wesentlichen lipidfreiea bakterielleB Endotoxin-Polysaocharid, kovalent gttaindtn an Antigen, tnt~ halttn ist·- 22 -009827/1897260231313· Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Lipopolysaccharidderivat einen größeren !Teil der Zusammensetzung ausmacht als das Endotoxin-Polysaccharid.14. Verfahren zur Herstellung eines Immunisierungsmittels, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer ersten Stufe ein bakterielles Endotoxin-Lipopolysaccharid bei einem pH oberhalb etwa 7 mit einem Halogenacylhalogenid kontaktiert und in einer zweiten Stufe das Halogen— acylierte Lipopolysaccharid bei einem pH oberhalb etwa 7 mit Protein-Antigen kontaktiert·15· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man während der ersten Stufe den pH bei etwa 8,5 bis etwa 9,5 hält.16, Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste Stufe für eine Zeitspanne fortsetzt, die ausreicht, um etwa 0,1/uMol des Halogenide pro mg Lipopolysaccharid umzusetzen«17· Immunogener Hilfsstoff, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Lipopolysaccharid mit damit durch Amidverknüpfungen verbundenen Halogenacylgruppen·18« Zusammensetzung nach Anspruch 17ι dadurch gekennzeichnet, daß die Halogenaoylgruppen Bromacetylgruppen sind.19· Zusammensetzungen naoh Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Bromacetylgruppen in einer Menge ror-- 23 -009827/1897liegen, die etwa 0,1/uMol pro mg Lipopolysaccharid gleich ist.20, Verfahren zur Herstellung eines Immunisierungemittels, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer ersten Stufe ein aus einem bakteriellen Endotoxin stammendes Polysaccharid mit einem Halogenacylhalogenid bei einem pH oberhalb etwa 7 kontaktiert und in einer zweiten Stufe das Halogen acylierte Polysaccharid bei einem pH oberhalb etwa 7 mit einem Protein-Antigen kontaktiert·21· Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid im wesentlichen detoxifiziert ist und dass der pH während der ersten Stufe bei etwa 8,5 bis 9»5 gehalten wird.22· Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste Stufe für eine Zeitspanne fortsetzt, die ausreicht, um etwa 0,04/uMol des Halogenide pro mg Polysaccharid umzusetzen»23. Stoffzusammensetzung, gekennzeichnet durch einen * Gehalt an einem aus einem bakteriellen Endotoxin stammenden Polysaccharid mit Halogenaoylgruppen, die durch Amidverknüpfungen damit verbunden sind··24· Zusammensetzung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Halogenacylgruppen Bromacetylgruppen sind·25· Zusammensetzung nach Anspruch 24, dadurch gekernt··- 24 -009827/1897zeichnet, daß die Bromacetylgruppen in einer Menge vorliegen, die etwa 0,04/uMol pro mg Polysaccharid gleich ist.26. Bestandteil für ein Immunisierungsniittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Protein-Antigen, das kovalent an ein bakterielles Endotoxin-Lipopolysaccharid gebunden ist·27» Bestandteil für ein. ImmunisierungsBiittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Proteln-Üntigen, das kovalent an ein bakterielles Endotoxin-Polysaccharid gebunden ist.28. Verfahren zur Erzeugung einer immunologischen Reaktion in einem Warmblüter, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Warmblüter ein bakterielles Endotoxin-Lipopolysaccharid, das kovalent an ein Protein-Antigen gebunden ist, in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um in dem Warmblüter eine Antikörper-Reaktion hervorzurufen.29« Verfahren zur Erzeugung einer immunologischen Reaktion in einem Warmblüter, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Warmblüter ein acyliertes bakterielles Endotoxin-Lipopolysaocharid und ein bakterielles Endotoxin-Polysacoharid, das kovalent an ein Protein-Antigen gebunden ist, in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um in den Warmblüter eine Antikörper-Reaktion hervorzurufen«30. Immunisierungsmittel in Dosierucgseinhoitsform, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem acylieren bakteriellen Endotoiin-Lipopolyaaocharid und einem bakteriellen Bndotoxin-Polyeacoharid, dft· kovftlent an «in- 25 -008827/18972602Protein-Antigen gebunden ist, in einem inerten Salzlösung-Träger.31. Zusammensetzung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß das acylierte Idpopolysaccharid in einer Menge vorliegt, die größer ist als die Menge an Polysaccharid und gebundenem Antigen.32. Immunisierungsmittel in Dosierungseinheitsform in einem inerten Salzlösung-Träger, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem bakteriellen Endotoxin-Lipopolysaccharid, das kovalent an ein Protein-Antigen gebunden ist·- 26 -009827/1897
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US78417468A | 1968-12-16 | 1968-12-16 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1962795A1 true DE1962795A1 (de) | 1970-07-02 |
Family
ID=25131584
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19691962795 Pending DE1962795A1 (de) | 1968-12-16 | 1969-12-15 | Chemisch modifiziertes Endotoxin-Immunisierungmittel |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS4820291B1 (de) |
BR (1) | BR6914744D0 (de) |
CA (1) | CA943459A (de) |
DE (1) | DE1962795A1 (de) |
FR (3) | FR2026285B1 (de) |
GB (1) | GB1261777A (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3911442A1 (de) * | 1988-04-08 | 1989-11-02 | Nat Inst Health | Impfstoff-praeparation |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4135231A (en) * | 1977-05-10 | 1979-01-16 | American Sterilizer Company | Surgical light assembly |
GB2013211B (en) * | 1978-01-26 | 1982-06-30 | Technicon Instr | Immunoassays using f(ab')2 fragments |
US4806352A (en) * | 1986-04-15 | 1989-02-21 | Ribi Immunochem Research Inc. | Immunological lipid emulsion adjuvant |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB856413A (en) * | 1956-03-08 | 1960-12-14 | Ciba Ltd | New lipo-polysaccharides of bacterial origin and process for prearing same |
-
1969
- 1969-11-13 CA CA067,384A patent/CA943459A/en not_active Expired
- 1969-12-01 GB GB58656/69A patent/GB1261777A/en not_active Expired
- 1969-12-03 BR BR214744/69A patent/BR6914744D0/pt unknown
- 1969-12-15 DE DE19691962795 patent/DE1962795A1/de active Pending
- 1969-12-16 FR FR6943532A patent/FR2026285B1/fr not_active Expired
- 1969-12-16 JP JP44100666A patent/JPS4820291B1/ja active Pending
-
1972
- 1972-02-23 FR FR7206120A patent/FR2123561B1/fr not_active Expired
- 1972-02-23 FR FR7206121A patent/FR2123562B1/fr not_active Expired
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3911442A1 (de) * | 1988-04-08 | 1989-11-02 | Nat Inst Health | Impfstoff-praeparation |
DE3911442C2 (de) * | 1988-04-08 | 2002-09-12 | Nat Inst Health | Impfstoff-Präparation |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2026285A1 (de) | 1970-09-18 |
GB1261777A (en) | 1972-01-26 |
JPS4820291B1 (de) | 1973-06-20 |
FR2026285B1 (de) | 1974-08-30 |
CA943459A (en) | 1974-03-12 |
FR2123561B1 (de) | 1974-10-25 |
FR2123561A1 (de) | 1972-09-08 |
BR6914744D0 (pt) | 1973-02-20 |
FR2123562B1 (de) | 1975-03-14 |
FR2123562A1 (de) | 1972-09-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2954387C2 (de) | Die tumorspezifische Immunität vergrößernder Bakterienzellenextrakt und Verfahren zu seiner Herstellung | |
DE2910998A1 (de) | Verfahren zur herstellung von gebundenes enzym enthaltenden produkten und deren verwendung | |
DE2734654A1 (de) | Quaternaere ammoniumderivate von lanolinfettsaeuren enthaltende mischungen | |
DE2510525C3 (de) | Quartäre 2-Alkylimidazoliumsalze | |
DE2461439B2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines schützenden Antigens von BordeteUa Pertussis sowie jenes enthaltendes Mittel | |
DE2840506A1 (de) | Neue teilchenfoermige materialien, ihre herstellung und ihre anwendung als arzneimittel, insbesondere als choleravaccine | |
DE1962795A1 (de) | Chemisch modifiziertes Endotoxin-Immunisierungmittel | |
DE1924301A1 (de) | Polyaminopolytricarballylsaeuren | |
DE3224217A1 (de) | Enzymimmunoassay-methode zur qualitativen und quantitativen bestimmung von substanzen | |
DE2707913C2 (de) | Verfahren zum Nachweis von rheumatoiden Faktoren | |
DE2823750B2 (de) | Verfahren zur Gewinnung mindestens eines Hydrolyseprodukts eines Endotoxins von Bordetella Pertussis | |
DE3490222T1 (de) | Urokinasederivate | |
DE2055263A1 (de) | Verfahren zum Verflüssigen von Stärke | |
DE2634904A1 (de) | Neue immunologische adjuvantien, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende arzneimittel | |
DE1960713C3 (de) | Mehrfach-Vaccine zur gleichzeitigen Immunisierung gegen Maul- und Klauenseuche und Brucellose und gegebenenfalls gegen Tollwut | |
DE4122906C2 (de) | Impfstoffe gegen virale oder bakterielle Antigene und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE1617344A1 (de) | Verfahren zur Herstellung einer Tetanus-Vaccine | |
EP0187286A1 (de) | Öladjuvierte Vaccine und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE1695308B2 (de) | Verfahren zur Isolierung von Adenosintriphosphat | |
CH645270A5 (en) | Vaccine against coli bacillosis of piglets and process for its preparation | |
DE1667908C (de) | Polyvalenter Impfstoff gegen Pseudo monas aeruginosa Infektionen | |
DE2321951C2 (de) | Verfahren zur Herstellung einer Diphtherie-Vaccine | |
DE186619C (de) | ||
AT332551B (de) | Verfahren zur herstellung eines antilipoid-a-serums | |
DE3727987A1 (de) | Pharmazeutische struktur |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OHJ | Non-payment of the annual fee |