WO1994009038A1 - Verfahren zur herstellung von nativem, intravenös verabreichbarem, stabilisiertem immunglobulin - Google Patents

Verfahren zur herstellung von nativem, intravenös verabreichbarem, stabilisiertem immunglobulin Download PDF

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WO1994009038A1
WO1994009038A1 PCT/EP1992/002405 EP9202405W WO9409038A1 WO 1994009038 A1 WO1994009038 A1 WO 1994009038A1 EP 9202405 W EP9202405 W EP 9202405W WO 9409038 A1 WO9409038 A1 WO 9409038A1
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methanol
water
igg
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precipitate
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PCT/EP1992/002405
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Karl Hillger
Jürgen SETTER
Bernard Schweigle
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Karl Hillger
Setter Juergen
Bernard Schweigle
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Publication date
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39516—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum from serum, plasma
    • A61K39/39525—Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to a method for producing native, intravenously administrable, stabilized immunoglobulin (IgG).
  • natively denotes a chemically unmodified and enzymatically undegraded immunoglobulin that has an unchanged antibody activity.
  • Such an intravenously administrable immunoglobulin forms a valuable means for prophylaxis and for the treatment of infectious diseases and anti-body deficiency conditions in humans and animals.
  • im globulins have no detectable anticomplementary activity which can be attributed to polymeric immunoglobulin aggregates.
  • stabilizing agents such as albumin, sugar, glucose and / or other polyglycols and polyols such as mannitol prevents the polymer-free, applicable IgG preparation from forming polymeric IgG aggregates again after prolonged storage.
  • the invention relates to a method for producing native, intravenously administrable, stabilized immunoglobulin (IgG), at a temperature below 8 ° C. - under known measures for gentle total globulin precipitation from serum, plasma or placenta, a total globulin precipitate containing IgG is precipitated and separated off, which contains less than 1% by weight of polymers,
  • IgG immunoglobulin
  • the IgG solution obtained thereafter in a known manner, including setting an isotonic salt concentration and a physiologically tolerable pH, adding stabilizing agent (s), setting the desired protein concentration, sterilization and, if appropriate, virus inactivation / elimination, is further processed into an applicable preparation.
  • stabilizing agent s
  • document EP 0 085 747 B2 discloses a process for the production of intravenously administrable immunoglobulin for enhancing the immune defense of the human organism, in which the essential cleaning step, ie the generation of the clarified extract, is carried out by means of chromatography on an ion exchanger.
  • the native immunoglobulin used as the starting material is used in a protein concentration of 20 to 40 mg / ml and a pH of 4.0 to 5.5.
  • a Cohn fraction II + III a final precipitation of venous or placental immunoglobulins or a lyophilisate by dissolution or an immunoglobulin solution possibly even containing ethanol is adjusted to pH 4.0 to 5.0 by appropriate dilution and acid addition .
  • This solution of IgG monomers, IgG dimers, IgG trimers and IgG polymers is separated (chromatographed) using an ion exchanger.
  • the IgG monomers are mixed with a 0.02 to 0.2 molar buffer from pH 4.0 to 5.5 additionally contains 0.05 to 0.15 mol of sodium chloride, eluted.
  • Document DE 27 51 717 C2 discloses a method for producing a gamma globulin which is practically free of anticomplementary activity and is suitable for intravenous administration, the antibody spectrum and subclass distribution of which is practically unchanged compared to the plasma used as the starting material.
  • a paste of Cohn fractions II or II + III or of the placenta extract containing them is extracted with pyrogen-free water at a pH of 4.9 to 6.
  • the known methods provide for multi-stage purification steps with the chromatographic separation or with the stepwise polyethylene glycol / ethanol precipitation. If, on the other hand, the extraction of the total globulin precipitate was carried out with a weakly acidic ethanol / water extracting agent under Cohn conditions, polymeric IgG aggregates would appear again in the extract, and that Product could not or only after further elaborate
  • the object of the present invention is to produce, in a process of the type mentioned at the outset, from the total globulin precipitate with an inexpensive extraction agent under defined, easily adjustable extraction conditions in a single extraction step a clarified extract which is fed directly and directly to the fine cleaning can be.
  • Water contains 35 to 40% by volume of methanol and has a pH of 6.5 to 7.0;
  • This set total globulin precipitation is extracted at a temperature of 2 to 8 ° C with an extraction agent which contains 38 to 42% by volume of methanol in addition to water; wherein - the extraction mixture is kept at a pH of 4.7 to 5.3 and at a methanol concentration of 38 to 42% by volume of methanol in the methanol / water mixture; and
  • the extract obtained from methanol extraction does not contain any IgG trimers and higher IgG polymers.
  • Methanol is an inexpensive extractant.
  • the removal of methanol from the IgG solution is unproblematic because, after the fine cleaning to set an isotonic salt concentration and a physiologically compatible pH value, dialysis steps are typically provided which also remove traces of methanol from the preparation.
  • the extraction conditions provided according to the invention require lower energy costs because, in comparison to known processes, it is possible to work at higher temperatures.
  • the methanol extraction according to the invention requires a smaller number of process steps and delivers a higher yield of applicable IgG preparation than comparable known processes.
  • a total globulin precipitate which contains less than 1% by weight of IgG polymers and which already contains a methanol / water mixture as residual solvent serves as the starting material for the methanol extraction according to the invention.
  • this residual solvent should contain 35 to 40% by volume of methanol and have a pH of 6.5 to 7.0.
  • a total globulin precipitate containing another residual solvent, for example the Cohn fractions II and II-III, is washed with a methanol / water mixture which, in addition to water, contains 35 to 40% by volume of methanol and which has a pH of 6.5 up to 7.0.
  • a total globulin precipitation containing this specific residual solvent is referred to below as the set total globulin precipitation.
  • gamma-globulin-containing materials such as supernatants from cryoprecipitation centrifugation, out-dated plasma, fractions II or II + III from Cohn's ethanol-plasma fractionation, placenta, serve as the starting material for providing an adjusted total globulin precipitation.
  • the precipitation treatment (s) of these starting solutions should be carried out under gentle conditions so that the total globulin precipitate contains less than 1% by weight of IgG dimers and IgG polymers.
  • the total globulin deposit obtained from these materials is washed with a methanol / water mixture which, in addition to water, contains 35 to 40% by volume of methanol and has a pH of 6.5 to 7.0, in order to increase the set total globulin deposit receive.
  • the above-mentioned IgG-containing starting solutions are preferably already treated with a methanol / water precipitant in order to obtain a total globulin precipitate which is largely free of IgG dimers and IgG polymers.
  • the starting solution serum, plasma, placenta
  • the starting solution is adjusted with a buffer solution to a protein concentration of about 4.0 to 4.5% and a pH of about 6.4 to 6.8, and this adjusted starting solution with pure methanol or with a methanol / water solution which contains about 60 to 99% by volume of methanol in addition to water, the methanol or the methanol / water solution having a temperature of -8 ° C. to -25 ° C. .
  • the set initial solution is preferably mixed with such an amount of methanol or methanol / water solution which leads to a methanol content of approximately 40% by volume in the solvent of the total globulin precipitation.
  • the precipitate is separated off and already contains the specific residual solvent intended for further processing.
  • the total globulin precipitation set is fed to the methanol extraction according to the invention.
  • the set total globulin precipitation is extracted at a temperature of 2 to 8 ° C. with an extracting agent that contains 38 to 42% by volume of methanol in addition to water.
  • the extracting agent preferably contains about 40% by volume of methanol.
  • the extraction mixture is kept at a pH of 4.7 to 5.3 and at a methanol concentration of 38 to 42% by volume of methanol in the methanol / water mixture.
  • the methanol concentration of the methanol / water mixture in the extraction mixture is less than 38% by volume of methanol, traces of accompanying proteins already go into solution and the product becomes impure.
  • the methanol concentration in the methanol / water mixture of the extraction mixture is more than 42% by volume of methanol, the gam a-globulin does not dissolve sufficiently and the yields drop suddenly. It is preferred to work at a methanol concentration of about 40% by volume in the methanol / water mixture of the extraction mixture. A particularly pure product is obtained here and the gamma-globulin contained in the total globulin precipitate can be completely removed.
  • the methanol extraction according to the invention is carried out at a temperature between +2 to + 8 ° C. It would be possible to work even at lower temperatures, but the methanol concentration would have to be adapted to the solubility of gamma-globulin then given. Apart from special cases, working at lower temperatures has no advantages, but requires a higher energy requirement.
  • the methanol extraction according to the invention is preferably carried out at a temperature of approximately + 4 ° C.
  • the continuous monitoring of the pH value of the extraction mixture can be carried out with the help of hydrogen electrodes.
  • the total globulin precipitate is brought directly into solution with 0.01 m Na acetate buffer 4.7. Any drip denaturation and / or polymer formation is avoided.
  • 1 part by weight of total globulin precipitate is preferably extracted with about 2 to 6 parts by weight of methanol / water mixture. 1 part by weight of total globulin precipitate is particularly preferably extracted with about 4 parts by weight of extractant. Optimal gamma globulin yield is obtained.
  • a clarified extract is obtained which, depending on the residual moisture of the total globulin precipitation, contains between about 1.0 and 3.0% by weight of highly pure gamma globulin (purity over 95%). This clarified extract is fed to the fine cleaning.
  • FIG. 1 a shows an HPLC chromatogram of a commercially available, applicable IgG preparation, that after Cohn fractionation and several
  • FIG. 1b shows the HPLC chromatogram of a clarified IgG extract obtained under analogous conditions, which was obtained after a single methanol extraction according to the invention from a total globule precipitate containing less than 1% by weight of IgG polymers. It can be clearly seen that the absorption characteristic of the IgG dimers is only weak
  • this IgG extract produced according to the invention essentially consists entirely of IgG monomers and that only trace amounts of IgG dimers are present.
  • the conditions of the methanol extraction according to the invention clearly differ from the typical conditions of Cohn's ethanol franking.
  • the starting solution containing gamma globulin is brought to an ethanol content of 9% by volume ethanol at 0 ° C. and pH 5.8 by adding ethanol.
  • the mixture is cooled to -5 ° C. and frozen (-8 ° C.) ethanol is added up to an ethanol concentration of 19% by volume of ethanol in the precipitation mixture. It is further cooled to -8 ° C.
  • the impact Nieder ⁇ formed is separated and removed by centrifugation or Filtra ⁇ tion of überschüs ⁇ igem solvent removed.
  • this precipitate can be treated with an aqueous extraction agent, which is adjusted to a pH of about 4.6 by adding Na acetate and ethyl acetate.
  • An intravenously administrable preparation cannot be obtained under these Cohn conditions; rather, further cleaning steps are necessary, for example with the aid of a step-by-step PEG addition and separation of the precipitates formed in each case.
  • the clearly filtered extract obtained after the methanol extraction according to the invention is fed to the fine cleaning.
  • the fine cleaning can be carried out with the aid of known measures, for example by adsorption of the undesired accompanying components on silica or on other minerals of the alumosilicate type. Good results were achieved, for example, by adsorption on the "SEPHADEX DEAE-A 50" anion exchanger.
  • the fine cleaning can be carried out in one step, or in several stages by repeating the same cleaning step or by using different cleaning steps in succession. Fine cleaning is preferably provided as one In the first cleaning step, the above-described methanol extraction is repeated.
  • IgG precipitation takes place by raising the pH in methanolic solution and then again extracting the precipitate with methanol. From the previous methanol extraction, the clearly filtered extract has a pH of 5.1. While keeping the methanol content constant at about 40 vol.% Methanol, the pH of the extract is raised to 6.5 to 7.3. The pH is particularly preferably raised to 6.9 to 7.0. This pH increase can be done with known buffer solutions; 0.5M NaHCO, solution is preferably added. Under the selected conditions for temperature and methanol content, only the monomeric immunoglobulin is precipitated without the accompanying proteins present in traces being entrained. The precipitate formed is separated off, for example by centrifugation or filtration.
  • the precipitate obtained is washed with the precipitant (40% by volume of methanol, pH 6.9 to 7.0).
  • the washed precipitate is again fed to the methanol extraction according to the invention.
  • the methanol extraction takes place under the conditions specified above, ie at a temperature of about 4 ° C. with an extraction agent containing 40% by volume of methanol and having a pH of about 4.7. Deviatingly, a smaller amount of extraction agent can be used in order to keep the IgG losses in the residual solvent remaining in the precipitation as low as possible.
  • 1 part by weight of precipitate is preferably treated with about 3 parts by weight of extractant in the course of the fine cleaning.
  • the extract obtained afterwards is filtered clear.
  • the clearly filtered IgG solution is practically free of unwanted accompanying proteins and is used for dialysis or dialysis for methanol removal, adjustment of a physiologically compatible pH value and an isotonic salt concentration.
  • dialysis steps are carried out in a known manner. Only in individual cases and if required, a further fine cleaning stage, for example with an anion exchanger, can be provided after the second methanol extraction in the course of the fine cleaning. This can be indicated, for example, when the initial total globular precipitate has contained an unusually high proportion of dimeric and polymeric IgG aggregates.
  • the further processing of the IgG solution obtained after the fine cleaning to the applicable preparation including adjustment of a physiologically compatible pH value, addition of stabilizing agent (s), adjustment of the desired protein concentration, sterilization and, if necessary, virus activation / elimination takes place with the help of usual measures known in the specialist field.
  • dialysis with 0.05 m Na citrate buffer pH 7.0 can be provided to set a physiologically compatible pH value.
  • Glycine, glycose and / or mannitol have proven themselves as stabilizing agents.
  • a final dialysis with a solution of 3% glucose and 0.6% NaCl can be provided for stabilization and for setting an isotonic salt concentration.
  • Sterile filtration can be provided for sterilization.
  • Virus inactivation or virus elimination can also be carried out in a known manner.
  • the applicable preparation is expediently adjusted to an IgG content of 5% by weight.
  • Fractions used In any case, a solution is used, to which 0.05 Na acetate buffer pH 4.7 is added in order to adjust the protein concentration to 4.3% by weight. After addition of the buffer, the mixture has a pH of 6.4 to 6.8. The plasma buffer mixture is brought to a temperature of about 4 ° C.
  • this plasma buffer mixture kept at 4 ° C., is mixed with a deep-frozen, aqueous methanol solution which, in addition to water, contains about 65% by volume of methanol and a temperature of -8 ° C. down to -25 ° C. Any drip denaturation is avoided under these conditions.
  • the frozen aqueous methanol solution is added until long
  • a methanol concentration in the water / methanol solution of 40% by volume of methanol has been reached.
  • the precipitate formed is separated off by centrifugation or filtration and serves as a total globulin precipitate for the production according to the invention of an intravenously administrable IgG preparation. Due to the previous methanol precipitation, this total globulin precipitate contains a solvent which, in addition to water, contains 35 to 40% by volume of methanol and has a pH of 6.5 to 7.0.
  • This total globulin precipitate containing the certain residual solvent is fed to the methanol extraction according to the invention.
  • the extraction of the precipitate is carried out with an extraction agent that consists of 40% by volume of methanol and aqueous 0.01 Na acetate buffer with a pH of 4.7. 1 part by weight of total globulin precipitate is extracted with 4 parts by weight of extractant.
  • the extraction mixture is kept at a pH of 5.1 and at a methanol concentration of about 40% by volume of methanol in the methanol / water mixture.
  • the parts insoluble in the extractant are separated off and the extract formed is filtered clear.
  • This clarified extract is fed to the fine cleaning.
  • the HPLC chromatogram according to FIG. 1b provides a sample of the clarified extract.
  • This clarified extract is repurposed for fine cleaning.
  • 0.5 NaHCO, solution is added in order to raise the pH to 6.9 to 7.0; the methanol content of the mixture is kept constant.
  • the IgG precipitate formed is separated off by centrifugation or filtration.
  • the precipitation obtained is washed under precipitation conditions.
  • the washed precipitate is extracted again with the methanol / water extracting agent under the conditions specified above, 1 part by weight of IgG precipitate being treated with 3 parts by weight of extracting agent.
  • the extract obtained afterwards is filtered clear.
  • the IgG solution obtained after fine cleaning and clear filtration is further processed into the applicable preparation.
  • the dialysis of the IgG solution thus obtained is first carried out with 0.05 Na citrate buffer pH 7.0.
  • the final dialysis is carried out with a solution of 3% glucose and 0.6% NaCl.
  • the resulting IgG solution is finally iso-isotonic and adjusted to a protein content of 5%. All precipitation and separation steps are carried out at a temperature of 4 ° C.
  • the HPLC chromatogram of the applicable IgG preparation obtained in this way shows a content of 99% IgG monomers and only traces of IgG dimers.
  • the precipitate of fraction II + III of the Cohn "see ethanol plasma fractionation serves as the starting material for the production of native, intravenously administrable immunoglobulin, provided that it is largely free of IgG polymers (less than 1% by weight). Due to the Cohn fractionation conditions, this total globulin precipitate contains an ethanol / water solution as residual solvent. Mixture. This ethanol-containing total globulin precipitate is washed at a temperature of 4 ° C. with a methanol / water mixture which, in addition to water, contains 40% by volume of methanol and has a pH of 6.7 to 7.0; 0.01 m Na acetate buffer is used to adjust the pH.
  • This total globulin precipitate is then fed to the methanol extraction according to the invention, as described in Example 1.
  • the extractant consists of 0.01 m Na acetate buffer and 40 vol.% Methanol and has a pH of 4.7. 1 kg of total globulin precipitation is treated with 4 l of extractant.
  • the pH of the extraction mixture is kept at 5.1.
  • the extract obtained is filtered clear and then fed to fine cleaning. The fine cleaning and further processing to the applicable preparation is carried out in the same manner as specified in Example 1 above.
  • the HPLC chromatogram of the preparation which can be applied shows 99% igG monomers and only traces of dimers.
  • the methanol extraction of the total globulin precipitate according to the invention is carried out in the same way as specified in Example 1.
  • the acidic extract obtained after the clear filtration is fed to the fine cleaning.
  • this acidic extract is first dialyzed to remove methanol against 0.05 M citrate-phosphate buffer, pH 7.0 and then dialyzed against a 0.1 M NaCl solution, pH 7.0. and the material obtained is adjusted to a concentration of 6 to 8% protein.
  • This material will treated with the anion exchanger SEPHADEX DEAE-A 50, which had previously been equilibrated to the above-mentioned milieu conditions and autoclaved.
  • About 1 1 concentrated extract is treated with 2 g SEPHDEX DEAE-A 50.
  • trace accompanying components of the IgG are adsorbed on the exchange resin and removed in this way.
  • the loaded exchanger resin is separated off.
  • the IgG solution is then stabilized and adjusted to the applicable preparation.
  • IgG preparations obtainable according to the invention are particularly intended for use in the human field. Because of the low loss and therefore high yield, the method is also well suited for processing hyperimmunized pla ⁇ a.
  • IgG preparations obtainable according to the invention can also be used in the veterinary field, for example for the treatment of horses, cattle, pigs or dogs, provided homologous starting materials are used.

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Abstract

Zur Herstellung von nativem, intravenös verabreichbarem, stabilisiertem Immunglobulin (IgG) wird wenigstens ein Extraktionsschritt mit einem wässrigen Extraktionsmittel vorgesehen, das neben Wasser 38 bis 42 Vol.-% Methanol enthält und das einen pH von 4,7 bis 5,3 aufweist. Als Ausgangsmaterial dient ein Gesamtglobulinniederschlag der weniger als 1 Gew.-% Polymere enthält und dessen Restlösungsmittel neben Wasser 35 bis 40 Vol.-% Methanol enthält und einen pH von 6,5 bis 7,0 aufweist. Ein, ein anderes Restlösungsmittel enthaltender Gesamtglobulinniederschlag wird mit einem entsprechenden Methanol/Wasser-Gemisch umgewaschen. In jedem Falle wird der auf das bestimmte Restlösungsmittel eingestellte Gesamtglobulinniederschlag bei einer Temperatur von 2 bis 8° C mit einem Extraktionsmittel extrahiert, das neben Wasser 38 bis 42 Vol.-% Methanol enthält. Hierbei wird im Extraktionsgemisch ein pH von 4,7 bis 5,3 und eine Methanolkonzentration von 38 bis 42 Vol.-% Methanol im Methanol/Wasser-Gemisch eingehalten. Der erhaltene Extrakt wird geklärt und daraufhin einer Feinreinigung und Weiterverarbeitung zum applizierbaren Präparat zugeführt.

Description

Verfahren zur Herstellung von nativem, intravenös verabreichbarem, stabilisiertem Immunglobulin
Beschreibung:
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von nativem, intravenös verabreichbarem, stabilisiertem Immun- globulin (IgG). Nativ bezeichnet in diesem Zusammenhang ein chemisch nicht verändertes und enzymatisch nicht abgebau¬ tes Immunglobulin, das eine unveränderte Antikörperaktivi¬ tät aufweist. Ein derartiges, intravenös verabreichbares Immunglobulin bildet ein wertvolles Mittel zur Prophylaxe und zur Behandlung von infektiösen Krankheiten und Anti¬ körpermangelzuständen bei Mensch und Tier. Zur gefahrlosen intravenösen Applikation ist wichtig, daß derartige Im un- globuline keine nachweisbare antikomplementäre Aktivität aufweisen, die auf polymere Immunglobulinaggregate zurück¬ führbar ist. Durch Zusatz von Stabilisierungsmitteln wie beispielsweise Albumin, Zucker, Glukose und/oder anderen Polyglykolen, sowie Polyolen wie etwa Mannit wird verhin¬ dert, daß das polymerfreie, applizierbare IgG-Präparat bei längerer Lagerung erneut polymere IgG-Aggregate bildet.
Mehr im einzelnen betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von nativem, intravenös verabreichbarem, sta¬ bilisiertem Immunglobulin (IgG), wobei bei einer Tempera¬ tur unterhalb 8° C - unter bekannten Maßnahmen zur schonenden Gesamtglobu- linfällung aus Serum, Plasma oder Plazenten ein IgG enthaltender Gesamtglobulinniederschlag ausgefällt und abgetrennt wird, der weniger als 1 Gew.-% Polymere enthält,
- dieser Gesamtglobulinniederschlag bei schwach saurem pH mit einem schwach ionischen, wässrigen Extraktions- mittel extrahiert wird, und - schließlich ein geklärter Extrakt erzeugt wird, der einer Feinreinigung zugeführt wird, und
- die danach erhaltene IgG-Lösung in bekannter Weise, einschließlich Einstellung einer isotonischen Salz¬ konzentration und eines physiologisch verträglichen pH-Wertes, Zugabe von Stabilisierungsmittel(n) , Ein¬ stellung der gewünschten Proteinkonzentration, Ste¬ rilisation und gegebenenfalls Virusinaktivierung/ -Elimination, zu einem applizierbaren Präparat wei¬ terverarbeitet wird.
Verfahren dieser Art sind bekannt. So offenbart das Dokument EP 0 085 747 B2 ein Verfahren zur Herstellung von intravenös verabreichbarem Immunglobulin zur Verstärkung der Immunab¬ wehr des menschlichen Organismus, bei welchem die wesent¬ liche Reinigungsstufe, d.h. die Erzeugung des geklärten Extraktes, mittels Chromatographie an einem Ionenaustauscher durchgeführt wird. Das als Auεgangsmaterial eingesetzte na- tive Immunglobulin wird in einer Proteinkonzentration von 20 bis 40 mg/ml und einem pH von 4,0 bis 5,5 verwendet. Bei¬ spielsweise wird eine Cohn-Fraktion II+III, eine Endfällung venöser oder plazentarer Immunglobuline oder ein Lyophilisat durch Auflösung oder eine eventuell sogar Ethanol enthalten¬ de Immunglobulin-Lösung durch entsprechende Verdünnung und durch Säurezusatz auf pH 4,0 bis 5,0 eingestellt. Diese Lösung aus IgG-Monomeren, IgG-Dimeren, IgG-Trimeren und IgG-Polymeren wird mittels eines Ionenaustauschers aufge¬ trennt (chromatographiert) . Die IgG-Monomere werden mit einem 0,02 bis 0,2 molaren Puffer von pH 4,0 bis 5,5, der zusätzlich 0,05 bis 0,15 mol Kochsalz enthält, eluiert. Dieses Eluat (= geklärter Extrakt) weist lediglich eine schwache antikomplementäre Aktivität auf und wird der- Feinreinigung zugeführt. Die IgG-Aggregate und zwar sowohl die Polymere als auch die Tχ-imere und Dimere bleiben am
Ionenaustauscher gebunden und können später mit hochmolarem Puffer abgelöst werden.
Das Dokument DE 27 51 717 C2 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines praktisch von antikomplementärer Aktivität freien und für die intravenöse Verabreichung geeigneten Gamma-Globulins, dessen Antikörperspektrum und Unterklassen- Verteilung gegenüber dem als Ausgangsmaterial verwendeten Plasma praktisch unverändert ist. Hier wird eine Paste von Cohn-Fraktionen II oder II+III oder von diese enthaltendem Plazenta-Extrakt mit pyrogenfreiem Wasser bei einem pH-Wert von 4,9 bis 6 extrahiert. Aus diesem filtrierten Extrakt werden durch stufenweise Fällung mit Polyethylenglykol bis zu einer Konzentration von 4 % und anschließend mit Ethanol bis zu einer Konzentration von 4 bis 12 %, wobei jedesmal die ausgefallenen Verunreinigungen abgetrennt werden, und nach anschließender Steigerung des pH-Wertes auf 7 bis 8,2 durch Erhöhung der Polyethylenglykolkonzentration auf bis zu 12 % oder durch Erhöhung der Ethanolkonzentration auf bis zu 25 % das gewünschte Gamma-Globulin ausgefällt und isoliert. Der Niederschlag wird in einer Lösung aufgenommen, die Human-Albumin, Natriumazetat, Glycin und Mannit enthält und einen pH von 5,1 aufweist. Das applizierbare Präparat kann in Lösung oder als Lyophilisat aufbewahrt werden.
Die bekannten Verfahren sehen mit der chromatographischen Auftrennung oder mit der stufenweisen Polyethylenglykol/- Ethanol-Fällung mehrstufige Reinigungsschritte vor. Würde andererseits die Extraktion des Gesamtglobulinniederschla- ges mit einem schwach sauren Ethanol/Wasser-Extraktions- mittel unter Cohn-Bedingungen durchgeführt werden, so würden im Extrakt erneut polymere IgG-Aggregate auftreten, und das Produkt könnte nicht oder nur nach weiteren aufwendigen
Reinigungsmaßnahmen für eine intravenöse Applikation vor¬ gesehen werden.
Demgegenüber besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, bei einem Verfahren der eingangs genannten Art aus dem Gesamtglobulinniederschlag mit einem preiswerten Extrak¬ tionsmittel unter definierten, leicht einstellbaren Extrak¬ tionsbedingungen in einem einzigen Extraktionsschritt einen geklärten Extrakt zu erzeugen, der unmittelbar und direkt der Feinreinigung zugeführt werden kann.
Ausgehend von einem Verfahren mit den oben angegebenen Ma߬ nahmen ist die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe dadurch gekennzeichnet, daß
- der Gesamtglobulinniederschlag - soweit erforderlich - auf ein Restlösungsmittel eingestellt wird, das neben
Wasser 35 bis 40 Vol.-% Methanol enthält und das einen pH von 6,5 bis 7,0 aufweist;
- dieser eingestellte Gesamtglobulinniederschlag bei einer Temperatur von 2 bis 8° C mit einem Extraktions¬ mittel extrahiert wird, das neben Wasser 38 bis 42 Vol.-% Methanol enthält; wobei - das Extraktionsgemisch bei einem pH von 4,7 bis 5,3 und bei einer Methanolkonzentration von 38 bis 42 Vol.-% Methanol im Methanol/Wasser-Gemisch gehalten wird; und
- der dabei erhaltene Extrakt geklärt und daraufhin der Feinreinigung zugeführt wird.
Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen
Mit der erfindungsgemäßen Methanol-Extraktion werden eine Reihe von Vorteilen erzielt. So wird die Nativität des Ausgangs-Gamma-Globulins im Vergleich zu anderen Verfahren nicht nennenswert denaturiert. Die Methanolextraktion als solche führt nicht zu einer nennenswerten Bildung von IgG-
Dimeren unter den angegebenen Bedingungen. In dem nach der
Methanolextraktion erhaltenen Extrakt treten keine IgG-Tri- mere und höhere IgG-Polymere auf.
Methanol ist ein preiswertes Extraktionsmittel. Die Metha¬ nolentfernung aus der IgG-Lösung ist unproblematisch, weil im Anschluß an die Feinreinigung zur Einstellung einer iso¬ tonischen Salzkonzentration und eines physiologisch verträg¬ lichen pH-Wertes typischerweise Dialyseschritte vorgesehen werden, welche auch Methanolspuren aus dem Präparat entfernen.
Die erfindungsgemäß vorgesehenen Extraktionsbedingungen er¬ fordern geringere Energiekosten, weil im Vergleich zu be¬ kannten Verfahren bei höheren Temperaturen gearbeitet werden kann.
Schließlich erfordert die erfindungsgemäße Methanolextrak¬ tion eine geringere Anzahl an Verfahrensschritten und lie¬ fert eine höhere Ausbeute an applizierbarem IgG-Präparat als vergleichbare bekannte Verfahren.
Als Ausgangsmaterial für die erfindungsgemäße Methanolex¬ traktion dient ein Gesamtglobulinniederschlag, der weniger als 1 Gew.-% IgG-Polymere enthält und der als Restlösungs¬ mittel bereits ein Methanol/Wasser-Gemisch enthält. Dieses Restlösungsmittel soll neben Wasser 35 bis 40 Vol.-% Metha¬ nol enthalten und einen pH von 6,5 bis 7,0 aufweisen. Ein, ein anderes Restlösungsmittel enthaltender Gesamtglobulin¬ niederschlag beispielsweise die Cohn-Fraktionen II und II-III, wird mit einem Methanol/Wasser-Gemisch umgewaschen, das neben Wasser 35 bis 40 Vol.-% Methanol enthält und das einen pH von 6,5 bis 7,0 aufweist. Ein dieses bestimmte Restlösungsmittel enthaltender Gesamtglobulinniederschlag wird nachstehend als eingestellter Gesamtglobulinnieder¬ schlag bezeichnet. Als Ausgangsmaterial zur Bereitstellung eines eingestellten Gesamtglobulinniederschlags dienen bekannte, Gamma-Globulin enthaltende Materialien, wie etwa Überstände der Kryopräzi- pitatzentrifugation, out-dated-Plas a, die Fraktionen II oder II+III der Cohn'sehen Ethanol-Plasma-Fraktionierung, Plazenta-Extrakt, der entsprechende Fraktionen enthält, im Einzelfall gezielt mit Immunkörpern angereichertes Plasma und andere in der Plaε aaufbereitung anfallende Gamma-Glo- obulin enthaltende Fraktionen. Die Fällungsbehandlung(en) dieser Ausgangslösungen soll(en) unter schonenden Bedingun¬ gen durchgeführt werden, so daß der gebildete Gesamtglobu¬ linniederschlag weniger als 1 Gew.-% IgG-Dimere und IgG- Polymere enthält. Soweit erforderlich, wird der aus diesen Materialien erhaltene Gesamtglobulinniederschlag mit einem Methanol/Wasser-Gemisch umgewaschen, das neben Wasser 35 bis 40 Vol.-% Methanol enthält und das einen pH von 6,5 bis 7,0 aufweist, um einen eingestellten Gesamtglobulinniederschlag zu erhalten.
Vorzugsweise werden bereits die vorstehend genannten IgG- haltigen Ausgangslösungen mit einem Methanol/Wasser-Fäl¬ lungsmittel behandelt, um einen Gesamtglobulinniederschlag zu erhalten, der weitgehend frei von IgG-Dimeren und IgG- Polymeren ist. Zur Durchführung dieser Gesamtglobulinfällung wird die Ausgangslöεung (Serum, Plasma, Plazenten) mit Puf¬ ferlösung auf eine Proteinkonzentration von etwa 4,0 bis 4,5 % und einen pH von etwa 6,4 bis 6,8 eingestellt, und diese eingestellte Ausgangslösung wird mit reinem Methanol oder mit einer Methanol/Wasεer-Lösung versetzt, die neben Wasser etwa 60 bis 99 Vol.-% Methanol enthält, wobei das Methanol oder die Methanol/Wasεer-Löεung eine Temperatur von -8° C biε -25° C aufweist. Vorzugsweise wird die ein¬ gestellte Auεgangslöεung mit einer εolchen Menge Methanol oder Methanol/Wasser-Löεung verεetzt, die zu einem Metha- nolgehalt von etwa 40 Vol.-% im Reεtlöεungsmittel der Ge¬ samtglobulinfällung führt. Der Niederεchlag wird abgetrennt und enthält bereits das für die Weiterverarbeitung vorge¬ sehene, bestimmte Reεtlöεungεmittel. Der eingestellte Gesamtglobulinniederschlag wird der er¬ findungsgemäßen Methanolextraktion zugeführt. Hierbei wird der eingestellte Gesamtglobulinniederεchlag bei einer Tempe¬ ratur von 2 biε 8° C mit einem Extraktionsmittel extrahiert, daε neben Waεser 38 biε 42 Vol.-% Methanol enthält. Vorzugs¬ weise enthält das Extraktionsmittel neben Wasεer etwa 40 Vol.-% Methanol. Daε Extraktionsgemisch wird bei einem pH von 4,7 bis 5,3 und bei einer Methanolkonzentration von 38 bis 42 Vol.-% Methanol im Methanol/Waεεer-Gemiεch gehalten.
Beträgt die Methanolkonzentration deε Methanol/Wasser-Ge- miεcheε im Extraktionsgemisch weniger als 38 Vol.-% Metha¬ nol, εo gehen bereits Spuren von Begleitproteinen in Lösung und daε Produkt wird unreiner. Beträgt andererseits die Methanolkonzentration im Methanol/Wasεer-Gemisch deε Extrak- tionsgemischeε mehr alε 42 Vol.-% Methanol, εo geht daε Gam a-Globulin nicht auεreichend in Löεung und die Ausbeuten εinken schlagartig. Vorzugsweiεe wird bei einer Methanolkon¬ zentration von etwa 40 Vol.-% im Methanol/Wasser-Gemisch deε Extraktionεgemiεcheε gearbeitet. Hier wird ein besonders reines Produkt erhalten und das im Gesamtglobulinnieder¬ εchlag enthaltene Gamma-Globulin lδεt εich vollständig.
Die erfindungsgemäße Methanolextraktion wird bei einer Temperatur zwischen +2 bis +8° C durchgeführt. Eε wäre mög¬ lich, auch bei tieferen Temperaturen zu arbeiten, wobei je¬ doch die Methanolkonzentration an die dann gegebene Löεlich- keit von Gamma-Globulin angepaßt werden müßte. Abgeεehen von Sonderfällen bringt ein Arbeiten bei tieferen Temperaturen keine Vorteile, erfordert jedoch einen höheren Energiebe¬ darf. Vorzugεweiεe wird die erfindungεgemäße Methanolextrak¬ tion bei einer Temperatur von etwa +4° C durchgeführt.
Weiterhin wird im Extraktionεgemiεch ein pH zwiεchen 4,7 und 5,3 aufrecht erhalten. Bei einem pH unterhalb 4,7 tritt unter dieεen Extraktionεbedingungen eine Denaturierung des Gamma-Globulins auf. Bei einem pH oberhalb 5,3 wird eine schleichende Auεbeuteabnahme beobachtet. Vorzugεweiεe wird bei einem pH zwiεchen 5,1 und 5,2 im Extraktionsgemisch ge¬ arbeitet. Hier wird eine optimale Ausbeute und Reinheit deε
Gamma-Globulins erhalten.
Die laufende Überwachung des pH-Werteε des Extraktionεge- miεcheε kann mit Hilfe von Waεserεtoffelektroden erfolgen. Zur pH-Einεtellung wird der Geεamtglobulinniederschlag direkt mit 0,01 m Na-Azetat-Puffer 4,7 in Lösung gebracht. Jegliche Eintropfdenaturierung und/oder Polymerbildung wird vermieden.
Vorzugsweise wird 1 Gewichtsteil Gesamtglobulinniederschlag mit etwa 2 bis 6 Gewichtεteilen Methanol/Wasser-Gemiεch extrahiert. Beεonderε bevorzugt wird 1 Gewichtsteil Gesamt- globulinniederεchlag mit etwa 4 Gewichtsteilen Extraktions- mittel extrahiert. Es wird eine optimale Gamma-Globulinaus- beute erhalten.
je nach Art und Zusammenεetzung des Gesamtglobulinnieder- schlags gehen unter diesen Extraktionsbedingungen etwa 1/3 der Eiweißmenge in Lösung. Der restliche Anteil wird ver¬ worfen oder kann zu anderen Produkten aufgearbeitet werden. Der gebildete Extrakt wird durch Filtration und/oder Zentri- fugation von dem verbleibenden Reεt abgetrennt. Es wird ein geklärter Extrakt erhalten, der abhängig von der Reεtfeuchte deε Geεamtglobulinniederεchlagε zwiεchen etwa 1,0 biε 3,0 Gew.-% hochreineε Gamma-Globulin (Reinheit über 95 %) ent¬ hält. Dieεer geklärte Extrakt wird der Feinreinigung zuge- führt.
Die für Fachleute überraεchende Reinheit der erfindungsge¬ mäß erhältlichen IgG-Lösung wird auch durch die Figuren be- εtätigt; eε zeigen:
Figur la ein HPLC-Chromatogramm eineε handelsüblich zugänglichen, applizierbaren IgG-Präparates, das nach Cohn-Fraktionierung und mehreren
Reinigungsschritten erhalten wurde; neben dem Hauptpeak des IgG-Monomeren sind deut¬ lich die Peakε für IgG-Dimere und für Albu- min zu erkennen, das dem Präparat als Stabi- liεator zugeεetzt iεt; und
Figur lb daε unter analogen Bedingungen erhaltene HPLC- Chromatogramm eines geklärten IgG-Extraktes, der nach einmaliger, erfindungεgemäßer Metha¬ nolextraktion auε einem, weniger als 1 Gew.-% IgG-Polymere enthaltenden Gesamtglobulinnie- derεchlag erhalten wurde. Es ist deutlich zu erkennen, daß die für die IgG-Dimeren charak- teristische Absorption lediglich als schwache
Schulter auεgeprägt iεt, waε beεtätigt, daß dieser erfindungεgemäß erzeugte IgG-Extrakt im weεentlichen vollεtändig aus IgG-Monomeren be- εteht und IgG-Dimere lediglich in Spuren vor- handen εind.
Für Fachleute iεt überraεchend, daß eine Methanolextraktion unter den erfindungεgemäß vorgeεehenen Bedingungen keinerlei Denaturierung der Immunglobuline hervorruft und daß bereits eine einstufige Methanolextraktion ein derart hochreines Präparat liefert.
Die Bedingungen der erfindungsgemäßen Methanolextraktion unterscheiden sich eindeutig von den typischen Bedingungen der Cohn 'sehen Ethanol-Franktionierung. Typiεcherweiεe wird nach Cohn die Gamma-Globulin enthaltende Auεgangεlöεung bei 0° C und pH 5,8 durch Ethanolzugabe auf einen Ethanolgehalt von 9 Vol.-% Ethanol gebracht. Nach Einεtellung stabiler Be- dingungen wird auf -5° C abgekühlt und es erfolgt eine Zu¬ gabe von tiefgekühltem (-8° C) Ethanol bis zu einer Ethanol- konzentration von 19 Vol.-% Ethanol im Fällungsgemiεch. Es wird weiter biε auf -8° C abgekühlt. Der gebildete Nieder¬ schlag wird abgetrennt und durch Zentrifugation oder Filtra¬ tion von überschüsεigem Lösungsmittel befreit. Zur Weiter¬ verarbeitung und Lösung des Gamma-Globulins kann dieεer Niederεchlag mit einem wäεεrigen Extraktionεmittel behandelt werden, daε durch Zugabe von Na-Azetat und Eεεigεεäure auf einen pH von etwa 4,6 eingeεtellt iεt. Unter dieεen Cohn'- εchen Bedingungen kann ein intravenös applizierbares Präpa¬ rat nicht erhalten werden; vielmehr sind weitere Reinigungs¬ schritte erforderlich, beispielεweiεe mit Hilfe einer εtu- fenweiεen PEG-Zugabe und Abtrennung der jeweilε gebildeten Niederεchläge.
Würde unter den oben dargelegten Cohn'εchen Fällungsbedin- gungen anstelle von Ethanol mit Methanol als organischem Fällungsmittel gearbeitet werden, so könnte eine nennens¬ werte Ausbeute an Gamma-Globulin nicht erhalten werden. Würde andererseits unter den Bedingungen der erfindungεge- mäßen Methanolextraktion anεtelle von Methanol mit Ethanol gearbeitet werden, so würde das zur Denaturierung führen, und eine verwertbare Ausbeute an Gamma-Globulin könnte ebenfalls nicht erzielt werden. Unter Beibehaltung der restlichen Bedingungen kann Methanol nicht durch Ethanol ersetzt werden und umgekehrt.
Der nach der erfindungsgemäßen Methanolextraktion erhaltene, klar filtrierte Extrakt wird der Feinreinigung zugeführt. Die Feinreinigung kann mit Hilfe bekannter Maßnahmen durch¬ geführt werden, beispielεweiεe durch Adεorption der uner¬ wünschten Begleitkomponenten an Kieselεäure oder an andere Mineralien vom Typ der Alumoεilikate. Gute Ergebnisse wurden beispielsweise durch Adεorption an den Anionenauεtauscher "SEPHADEX DEAE-A 50" erzielt. Die Feinreinigung kann einstu¬ fig durchgeführt werden, oder mehrstufig durch Wiederholung des gleichen Reinigungsschrittes oder durch aufeinander¬ folgende Anwendung verschiedener Reinigungsεchritte. Vor- zugεweise ist eine Feinreinigung vorgeεehen, die als einen ersten Reinigungsschritt eine Wiederholung der oben be¬ schriebenen Methanolextraktion vorεieht.
Bei dieεem vorzugεweiεe vorgesehenen Feinreinigungsschritt erfolgt eine IgG-Ausfällung durch pH-Anhebung in methanoli- εcher Löεung und daraufhin erneut eine Methanolextraktion des Niederschlag . Von der vorausgegangenen Methanolextrak¬ tion her weist der klar filtrierte Extrakt einen pH von 5,1 auf. Unter Konεtanthaltung deε Methanolgehalteε bei etwa 40 Vol.-% Methanol wird der pH deε Extrakteε auf 6,5 biε 7,3 angehoben. Beεonderε bevorzugt wird der pH auf 6,9 biε 7,0 angehoben. Dieεe pH-Anhebung kann mit bekannten Pufferlö- εungen erfolgen; vorzugεweiεe wird 0,5 m NaHCO,-Lösung zu¬ gesetzt. Unter den gewählten Bedingungen für Temperatur und Methanolgehalt wird lediglich das monomere Immunglobulin ausgefällt, ohne daß die in Spuren vorhandenen Begleit¬ proteine mitgeriεεen werden. Der gebildete Niederεchlag wird abgetrennt, beispielsweiεe durch Zentrifugieren oder Fil¬ trieren. Der erhaltene Niederschlag wird mit dem Fällungs- mittel (40 Vol.-% Methanol, pH 6,9 biε 7,0) gewaschen. Das gewaεchene Präzipitat wird erneut der erfindungsgemäßen Methanolextraktion zugeführt. Die Methanolextraktion er¬ folgt unter den oben angegebenen Bedingungen, d.h., bei einer Temperatur von etwa 4° C mit einem 40 Vol.-% Methanol enthaltenden Extraktionεmittel, das einen pH von etwa 4,7 aufweist. Abweichend kann eine geringere Menge Extraktionε¬ mittel eingeεetzt werden, um die IgG-Verluεte in dem im Niederεchlag verbleibenden Reεtlöεungεmittel möglichst ge¬ ring zu halten. Vorzugsweiεe wird bei dieεer erneuten Methanolextraktion im Verlauf der Feinreinigung 1 Gewichtε- teil Niederεchlag mit etwa 3 Gewichtsteilen Extraktions- mittel behandelt. Der danach erhaltene Extrakt wird klar filtriert. Die klar filtrierte IgG-Lösung ist praktisch frei von unerwünschten Begleitproteinen und wird der Dialyse oder den Dialysen zur Methanolentfernung, Einεtellung eines physiologiεch verträglichen pH-Werteε und einer iεotoni- εchen Salzkonzentration zugeführt. Dieεe Dialyseschritte werden in bekannter Weise durchgeführt. Lediglich im Ein¬ zelfall und bei Bedarf kann im Anschluß an die zweite Methanolextraktion im Verlauf der Feinreinigung noch eine weitere Feinreinigungεεtufe, beiεpielεweiεe mit einem Anionenauεtauεcher vorgeεehen werden. Dieε kann beiεpielε¬ weiεe dann angezeigt εein, wenn der Auεgangs-Gesamtglobu- linniederεchlag einen unüblich hohen Anteil an dimeren und polymeren IgG-Aggregaten enthalten hat.
Die Weiterverarbeitung der nach der Feinreinigung erhalte¬ nen IgG-Lösung zum applizierbaren Präparat einschließlich Einstellung eines physiologiεch verträglichen pH-Werteε, Zu¬ gabe von Stabiliεierungεmittel(n) , Einεtellung der gewünεch- ten Proteinkonzentration, Steriliεation und ggf. Virusin- aktivierung/-Elimination erfolgt mit Hilfe üblicher, in der Fachwelt bekannter Maßnahmen. Beispielεweiεe kann zur Ein¬ εtellung eineε physiologiεch verträglichen pH-Werteε eine Dialyεe mit 0,05 m Na-Citrat-Puffer pH 7,0 vorgeεehen werden. Alε Stabilisierungsmittel haben sich beispielεweiεe Glycin, Glykose und/oder Mannit bewährt. Beispielsweiεe kann zur Stabiliεierung und zur Einstellung einer isotoniεchen Salzkonzentration eine Enddialyεe mit einer Löεung von 3 % Glukoεe und 0,6 % NaCl vorgeεehen werden. Zur Steriliεation kann eine Sterilfiltration vorgeεehen werden. Auch eine Viruεinaktivierung oder Viruselimination kann in bekannter Weise erfolgen. Zweckmäßigerweise wird daε applizierbare Präparat auf einen IgG-Gehalt von 5 Gew.-% eingeεtellt.
Die nachεtehenden Beiεpiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung ohne dieεe einzuεchränken.
Beispiel 1:
Als Auεgangεmaterial für die erfindungεgemäße Herεtellung von nativem, intravenöε verabreichbarem, εtabiliεiertem Immunglobulin (IgG) werden Überstände der Kryopräzipi- tatzentrifugation, out-dated-Plasma oder andere in der Plasmaaufarbeitung anfallende, Gamma-Globulin enthaltende
Fraktionen eingesetzt. In jedem Falle wird von einer Lösung auεgegangen, der 0,05 Na-Acetat-Puffer pH 4,7 zugeεetzt wird, um die Proteinkonzentration auf 4,3 Gew.-% einzu- εtellen. Nach Zuεatz deε Pufferε weiεt die Miεchung einen pH von 6,4 biε 6,8 auf. Daε Plaεma-Puffer-Gemisch wird auf eine Temperatur von etwa 4° C gebracht.
Zur Erzeugung eines Gesamtglobulinniederεchlagε wird dieεeε, bei 4° C gehaltene Plasma-Puffer-Gemisch mit einer tiefge¬ kühlten, wäsεrigen Methanol-Löεung verεetzt, die neben Waε- εer etwa 65 Vol.-% Methanol enthält und eine Temperatur von -8° C bis -25° C aufweist. Unter diesen Bedingungen wird jegliche Eintropfdenaturierung vermieden. Die tiefgekühlte wäsεrige Methanol-Lösung wird so lange zugeεetzt, biε im
Fällungεgemiεch eine Methanolkonzentration in der Waεεer/- Methanol-Löεung von 40 Vol.-% Methanol erreicht iεt. Daε ge¬ bildete Präzipitat wird durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt und dient als Gesamtglobulinniederεchlag zur er- findungεgemäßen Herstellung eines intravenös applizierbaren IgG-Präparateε. Aufgrund der vorausgegangenen Methanolfäl¬ lung enthält dieser Gesamtglobulinniederεchlag ein Reεtlδ- εungε ittel, daε neben Waεεer 35 biε 40 Vol.-% Methanol ent¬ hält und daε einen pH von 6,5 bis 7,0 aufweist.
Dieser, das bestimmte Reεtlösungsmittel enthaltende Geεamt- globulinniederεchlag wird der erfindungεgemäßen Methanol¬ extraktion zugeführt. Die Extraktion deε Nieder chlageε er¬ folgt mit einem Extraktionεmittel, daε auε 40 Vol.-% Metha- nol und wäεsrigem 0,01 Na-Acetat-Puffer mit einem pH von 4,7 besteht. 1 Gewichtsteil Geεamtglobulinniederεchlag wird mit 4 Gewichtεteilen Extraktionεmittel extrahiert. Daε Extraktionεgemiεch wird bei einem pH von 5,1 und bei einer Methanolkonzentration von etwa 40 Vol.-% Methanol im Methanol/Waεεer-Gemisch gehalten. Die im Extraktionsmittel unlöεlichen Anteile werden abgetrennt und der gebildete Extrakt wird klar filtriert. Dieεer geklärte Extrakt wird der Feinreinigung zugeführt. Eine Probe dieεeε geklärten Extraktes liefert das HPLC-Chromatogramm gemäß Figur Ib.
Zur Feinreinigung wird dieser geklärte Extrakt erneut umge- fällt. Hierzu wird 0,5 NaHCO,-Löεung zugeεetzt, um den pH auf 6,9 biε 7,0 anzuheben; hierbei wird der Methanolgehalt deε Gemiεcheε konεtant gehalten. Der gebildete IgG-Nieder- εchlag wird mittels Zentrifugation oder Filtration abge¬ trennt. Der erhaltene Niederεchlag wird unter Fällungsbedin- gungen gewaεchen. Daε gewaεchene Präzipitat wird erneut mit dem Methanol/Waεεer-Extraktionεmittel unter den vorεtehend angegebenen Bedingungen extrahiert, wobei 1 Gewichtεteil IgG-Präzipitat mit 3 Gewichtεteilen Extraktionεmittel be¬ handelt werden. Der danach erhaltene Extrakt wird klar filtriert.
Die nach Feinreinigung und Klarfiltration anfallende IgG- Löεung wird zum applizierbaren Präparat weiterverarbeitet. Die Dialyεe der εo erhaltenen IgG-Löεung erfolgt zunächεt mit 0,05 Na-Citrat-Puffer pH 7,0. Die Enddialyεe erfolgt mit einer Löεung von 3 % Glukoεe und 0,6 % NaCl. Die reεul- tierende IgG-Löεung wird abschließend isooεmotisch und auf einen Proteingehalt von 5 % eingestellt. Sämtliche Fällungs¬ und Separationεεchritte werden bei einer Temperatur von 4° C auεgeführt. Daε HPLC-Chromatogramm des so erhaltenen, appli¬ zierbaren IgG-Präparateε zeigt einen Gehalt an 99 % IgG- Monomeren und lediglich Spuren von IgG-Dimeren.
Beispiel 2:
Als Ausgangεmaterial zur erfindungεgemäßen Herεtellung von nativem, intravenös verabreichbarem Immunglobulin dient das Präzipitat der Fraktion II+III der Cohn "sehen Ethanol-Plas- ma-Fraktionierung, sofern dieεes weitgehend frei von IgG- Polymeren (weniger als 1 Gew.-% ) ist. Aufgrund der Cohn'- εchen Fraktionierungεbedingungen enthält dieεer Gesamtglobu¬ linniederschlag als Restlöεungsmittel ein Ethanol/Wasεer- Gemisch. Dieser ethanolhaltige Geεamtglobulinniederεchlag wird bei einer Temperatur von 4° C mit einem Methanol/Was- εer-Gemiεch umgewaεchen, daε neben Waεεer 40 Vol.-% Methanol enthält und einen pH von 6,7 biε 7,0 aufweist; zur pH-Ein- Stellung dient 0,01 m Na-Acetat-Puffer. 1 kg ethanolhaltiger Geεamtglobulinniederεchlag wird in 4 1 Methanol/Wasser-Ge- misch aufgeεchlämmt. Daraufhin wird der Niederεchlag erneut durch Filtration oder Zentrifugation abgetrennt, wobei ein eingeεtellter Geεamtglobulinniederεchlag erhalten wird, deεεen Reεtlösungsmittel neben Waεεer 35 bis 40 Vol.-% Methanol enthält und einen pH von 6,5 bis 7,0 aufweiεt.
Dieεer eingestellte Gesamtglobulinniederεchlag wird darauf¬ hin der erfindungεgemäßen Methanolextraktion zugeführt, wie daε in Beispiel 1 beschrieben ist. Das Extraktionsmittel besteht aus 0,01 m Na-Acetat-Puffer und 40 Vol.-% Methanol und weiεt einen pH von 4,7 auf. 1 kg eingeεtellter Gesamt¬ globulinniederschlag wird mit 4 1 Extraktionsmittel behan¬ delt. Der pH-Wert deε Extraktionsgemischeε wird bei 5,1 ge- halten. Der erhaltene Extrakt wird klar filtriert ,und dar¬ aufhin der Feinreinigung zugeführt. Die Feinreinigung und die weitere Verarbeitung zum applizierbaren Präparat erfolgt in gleicher Weiεe wie oben in Beispiel 1 angegeben. Das HPLC-Chromatogramm des applizierbaren Präparates zeigt 99 % igG-Monomere und lediglich Spuren von Dimeren.
Beiεpiel 3:
Die erfindungεgemäße Methanolextraktion deε Gesamtglobulin- niederεchlagε erfolgt in gleicher Weiεe wie in Beiεpiel 1 angegeben. Der nach der Klarfiltration erhaltene εaure Extrakt wird der Feinreinigung zugeführt. In dieεem Falle wird dieser saure Extrakt zunächst zur Entfernung von Me¬ thanol gegen 0,05 m Citrat-Phosphat-Puffer, pH 7,0 dialy- εiert und danach gegen eine 0,1 m NaCl-Löεung, pH 7,0 dialyεiert, und das erhaltene Material auf eine Konzentra¬ tion von 6 biε 8 % Eiweiß eingestellt. Dieses Material wird mit dem Anionenaustauscher SEPHADEX DEAE-A 50 behandelt, der vorher auf oben genannte Milieubedingungen äquilibriert und autoklaviert worden ist. Etwa 1 1 konzentrierter Extrakt wird mit 2 g SEPHDEX DEAE-A 50 behandelt. Hierdurch werden Spurenbegleitkomponenten deε IgG an daε Austauscherharz adsorbiert und auf diesem Wege entfernt. Das beladene Aus¬ tauscherharz wird abgetrennt. Daraufhin erfolgt die Stabi¬ lisierung und Einεtellung der IgG-Löεung zum applizierbaren Präparat.
Die erfindungεgemäß erhältlichen, nativen, intravenδε appli- zierbaren IgG-Präparate sind insbesondere zum Einsatz im Humanbereich bestimmt. Wegen der geringen Verluεte und deε- halb hohen Auεbeute iεt daε Verfahren auch zur Aufarbeitung von hyperimmunuεiertem Plaε a gut geeignet. Darüber hinauε können erfindungεgemäß erhältliche IgG-Präparate auch im veterinärmedizinischen Bereich eingesetzt werden, beiεpielε- weiεe zur Behandlung von Pferd, Rind, Schwein oder Hund, εo- fern von homologen Auεgangεmaterialien auεgegangen, wird.

Claims

«510Patentanεprüche:15
1. Ein Verfahren zur Herstellung von nativem, intravenös verabreichbarem, εtabilisiertem
Immunglobulin (IgG), wobei bei einer Temperatur unterhalb 8° C
20 ~ unter bekannten Maßnahmen zur schonenden Gesamtglo- bulinfällung auε Serum, Plaεma oder Plazenten ein IgG enthaltender Geεamtglobulinniederεchlag auεge- fällt und abgetrennt wird, der weniger als 1 Gew.-% Polymere enthält,
25 - dieser Gesamtglobulinniederschlag bei schwach saurem pH mit einem schwach ioniεchen, wässrigen Extrak¬ tionsmittel extrahiert wird, und schließlich ein ge¬ klärter Extrakt erzeugt wird, der einer Feinreini¬ gung zugeführt wird, und
30
- die danach erhaltene IgG-Löεung in bekannter Weise einεchließlich Einεtellung einer iεotoniεchen Salz¬ konzentration und eineε phyεiologiεch verträglichen pH-Werteε, Zugabe von Stabiliεierungsmittel(n) , Ein¬ εtellung der gewünεchten Proteinkonzentration,
35
Steriliεation und gegebenenfallε Viruεinaktivie- rung/-elimination, zu einem applizierbarem Präparat weiterverarbeitet wird, dadui'ch gekennzeichnet, daß der Geεamtglobulinniederεchlag - εoweit erforderlich - auf ein Reεtlöεungεmittel eingeεtellt wird, daε neben Wasser 35 bis 40 Vol.-% Methanol enthält und daε einen pH von 6,5 biε 7,0 aufweiεt; dieεer eingeεtellte Gesamtglobulinniederschlag bei einer Temperatur von 2 bis 8° C mit einem Extraktionsmittel extrahiert wird, das neben Wasεer 38 biε 42 Vol.-% Metha¬ nol enthält; wobei daε Extraktionεgemiεch bei einem pH von 4,7 bis 5,3 und bei einer Methanolkonzentration von 38 bis 42 Vol.-% Methanol im Methanol/Wasεer-Gemiεch gehalten wird; und der dabei erhaltene Extrakt geklärt und daraufhin der Feinreinigung zugeführt wird.
2. Daε Verfahren nach Anεpruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein, ein andereε Restlösungsmittel enthaltender Gesamt¬ globulinniederschlag mit einem Methanol/Wasεer-Gemiεch umgewaεchen wird, daε neben Waεεer 35 bis 40 Vol.-% Me¬ thanol enthält und das einen pH von 6,5 bis 7,0 auf¬ weist; und der so eingestellte Gesamtglobulinniederεchlag εepariert und daraufhin extrahiert wird.
3. Daε Verfahren nach Anεpruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gewichtεteil eingeεtellter Gesamtglobulinniederschlag mit etwa 2 bis 6 Gewichtsteilen Extraktionsmittel extra¬ hiert wird.
4. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Feinreinigung des geklärten Extraktes desεen pH auf 6,5 biε 7,0 angehoben wird; der dabei gebildete Niederεchlag separiert wird; und dieεer separierte Niederschlag erneut bei einer Tempera¬ tur von 2 biε 8° C mit einem Extraktionεmittel extrahiert wird, das neben Wasεer 38 biε 42 Vol.-% Methanol enthält; wobei daε Extraktionsgemisch bei einem pH von 4,7 bis 5,3 und bei einer Methanolkonzentration von 38 bis 42 Vol.-% Me¬ thanol im Methanol/Wasεer-Gemiεch gehalten wird.
5. Daε Verfahren nach Anεpruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der im Verlauf der Feinreinigung separierte Niederεchlag mit einer solchen Menge Extraktionεmittel extrahiert wird, um eine IgG-Löεung zu erhalten, die eine IgG-Kon- zentration größer 5 %, vorzugεweiεe eine IgG-Konzentra- tion von 6 biε 9 % aufweiεt.
6. Das Verfahren nach einem der Anεprüche 1 biε 5, dadurch gekennzeichnet, daß daε Extraktionεmittel neben Waεser etwa 40 Vol.-% Metha¬ nol enthält.
7. Das Verfahren nach einem der Anεprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionsmittel einen pH von 4,7 bis 5,3 aufweist.
8. Das Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die pH-Einstellung des Extraktionsmittels mit Na-Azetat- Pufferlöεung erfolgt.
9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionsmittel eine 0,0005 biε 0,02 molare Ionen¬ konzentration aufweiεt.
10. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionεgemiεch bei einem pH von 5,1 biε 5,2 ge¬ halten wird.
11. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zur Durchführung der Gesamtglobulinfällung die Ausgangε- löεung (Serum, Plaεma, Plazenten) mit Puffe löεung auf eine Proteinkonzentration von etwa 4,0 biε 4,5 % und auf einen pH von etwa 6,4 biε 6,8 eingeεtellt wird; und dieεe eingeεtellte Auεgangεlöεung mit reinem Methanol oder mit einer Methanol/Waεεer-Löεung verεetzt wird, die neben Waεεer etwa 60 bis 99 Vol.-% Methanol enthält, wo¬ bei das Methanol oder die Methanol/Waεεer-Löεung eine Temperatur von -8° C biε -25° C aufweiεt.
12. Das Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die eingestellte Ausgangεlöεung mit einer εolchen Menge Methanol oder Methanol/Waεεer-Lösung versetzt wird, die zu einem Methanolgehalt von etwa 40 Vol.-% im Reεtlö- εungεmittel der Gesamtglobulinfällung führt.
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