FR2513640A1 - Procede de preparation d'une composition de gamma globuline qui convient pour l'administration intraveineuse et composition obtenue par ce procede - Google Patents
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Abstract
PROCEDE DE PREPARATION D'UNE COMPOSITION DE GAMMA GLOBULINE QUI CONVIENT POUR L'ADMINISTRATION INTRAVEINEUSE ET COMPOSITION OBTENUE PAR CE PROCEDE. LE PROCEDE CONSISTE A TRAITER UN PREMIER LIQUIDE SURNAGEANT, SEPARE PAR PRECIPITATION PAR L'ALCOOL DE PLASMA DE SANG HUMAIN, EN OPERANT A UN PH DE 5,5 A 6,5 A UNE CONCENTRATION D'ETHANOL DE 30 A 35 EN VOLUME ET A UNE CONCENTRATION TOTALE DE PROTEINES DE 1 A 2 EN POIDS, PUIS A FORMER UN DEUXIEME PRECIPITE CONTENANT DE LA GAMMA GLOBULINE ET DE L'ALBUMINE, ET A ISOLER ET A PURIFIER CE DEUXIEME PRECIPITE POUR FORMER LA COMPOSITION DE GAMMA GLOBULINE. INDUSTRIE PHARMACEUTIQUE.
Description
Procédé de préparation d'une composition de gamma
globuline qui convient pour l'administration intra-
veineuse et composition obtenue par ce procédé.
La présente invention est relative à un pro-
cédé de préparation d'une composition de gamma (y)
globuline qui convient pour l'administration intra-
veineuse Plus particulièrement, l'invention est
relative à un procédé de préparation d'une composi-
tion de gamma (Y) globuline contenant de l'albumine
et ne contenant pas d'agrégat de gamma globuline.
La gamma globuline est très utilisée comme
agent thérapeutique et, en général, elle est admi-
nistrée par injection intramusculaire Des impure-
tés,telles que des agrégats de gamma globuline,conte-
nues,le cas échéant, dans des produits à base de gamma globuline, rendent dangereuse l'administration de ces produits de gamma globuline par injection intraveineuse.
C'est pourquoi, en vue de préparer des com-
position de gamma globuline exemptes de leurs agré-
gats, on a proposé des procédés de préparation de gamma globuline dans des conditions telles qu'il ne se produit pas d'agrégats On a également proposé
des procédés d'élimination des agrégats qui se pro-
duisent au cours de la préparation de la gamma globuline, cette élimination s'effectuant au dernier stade du processus Ces procédés de préparation ou de purification de gamma globuline ont été décrits dans la littérature, par exemple aux brevets des Etats-Unis d'Amérique Nos 3 415 804, 3 763 135 et 4 093 606, et au brevet du Royaume-Uni de Grande-
Bretagne et d'Irlande No 1 372 953.
L'invention vise un procédé de préparation de gamma globuline ne contenant pas d'agrégats de gamma globuline dans des conditions différentes de
celles décrites dans les brevets mentionnés ci-
dessus.
On a trouvé que l'on peut obtenir des pro-
duits de gamma globuline contenant de l'albumine en
certaines quantités, en traitant un liquide surna-
geant séparé du plasma de sang humain par l'éthanol, dans des conditions déterminées comme décrit dans ce qui suit Dans le procédé suivant l'invention, on peut empêcher la production d'agrégats de gamma globuline et on peut obtenir des produits de gamma
globuline qui conviennent pour l'administration in-
traveineuse en un rendement élevé, ces produits conte-
nant une petite quantité d'albumine et ne contenant
pas d'agrégats de gamma globuline.
Le procédé de séparation de gamma globuline
du plasma de sang humain, par précipitation fraction-
née à l'éthanol, est connu sous le nom de processus
Cohn et est décrit dafis J Amer Chem Soc, 68, 459-
( 1946) Le procédé suivant l'invention est un per-
fectionnement du procédé dit Cohn, tel que décrit dans J Amer Chem Soc, 71, 541-50 ( 1949) Dans le
procédé Cohn de 1949, on peut obtenir un liquide sur-
nageant contenant de l'albumine et un précipité con-
sistant en gamma globuline en traitant le plasma de sang humain par l'éthanol, dans des conditions de p H de 6,9 à une concentration en éthanol de 25 % en
,13640
volume et à une concentration en protéine de 3,0 %
en poids.
En revanche, dans le procédé suivant l'inven-
tion, on obtient un premier liquide surnageant, en ajoutant de l'éthanol à du plasma de sang humain
dans des conditions efficaces pour précipiter un pre-
mier précipité contenant la plus grande partie du fibrinogène qui était contenue dans le plasma de sang
initial, tout en rendant minimum les quantités d'al-
bumine et de gamma globuline contenues dans le pre-
mier précipité, puis en séparant le premier liquide
surnageant du premier précipité Des conditions conve-
nables pour cette première précipitation sont une concentration d'éthanol de 8 à 9 % en volume et une
température de O à -30 C On obtient ensuite un deu-
xième liquide surnageant contenant de l'albumine et un deuxième précipité consistant en gamma globuline et en albumine et contenant, de préférence, de 15 à % en poids d'albumine, en ajoutant de l'éthanol
et un tampon au premier liquide surnageant pour obte-
nir les conditions d'un p H de 5,5 à 6,5, une concen-
tration d'éthanol de 30 à 35 % en volume et une con-
centration de protéine de 1,0 à 2,0 % en poids On laisse reposer le mélange à -50 C environ jusqu'à ce
que le deuxième précipité se forme Ensuite, on cen-
trifuge le mélange pour séparer le liquide surna-
geant du deuxième précipité (PI) La concentration de protéines dans ce deuxième stade de précipitation est la concentration totale d'albumine, de globuline
et d'autres protéines contenues dans le premier li-
quide surnageant La force ionique du mélange dans
ledeuxième stade de précipitation est de 0,08 environ.
La force ionique est la force ionique des électroly-
tes du premier liquide surnageant et est égale à
1/2 E MI x (ZI) 2, dans laquelle MI est une concentra-
tion molaire d'ions et ZI est leur valence On préci-
pite le deuxième précipité (PI) consistant en gamma
globuline et en albumine dans ces conditions.
Dans ce procédé, on effectue typiquement les stades de séparation par centrifugation.
Une composition de gamma globuline qui con-
vient pour l'administration intraveineuse, c'est-à-
dire une composition qui ne contient pas d'agrégats de gamma globuline, peut ensuite être obtenue par un autre stade de purification du deuxiène précipité (PI) consistant en gamma globuline et en albumine
obtenu tel que décrit ci-dessus, par l'un des pro-
cédés suivants ( 1) ou ( 2) La gamma globuline puri-
fiée qui convient pour l'administration intraveineu-
se, obtenue par les procédés ( 1) et ( 2)rconsiste typiquement en 90 à 95 % en poids de gamma globuline
et en 5 à 10 % en poids d'albumine.
Procédé ( 1) On met le deuxième précipité (PI), obtenu comme décrit cidessus, en suspension dans de l'eau distillée, et on ajuste le p H de la suspension à une valeur comprise entre 4,0 et 5,0 en ajoutant un tampon On ajoute de l'éthanol à cette suspension pour obtenir une concentration d'éthanol de 10 à 16 % en volume On laisse reposer le mélange à -50 C jusqu'à ce que le troisième précipité se formé On centrifuge alors le mélange pour séparer
le troisième précipité du troisième liquide surna-
geant On lyophilise ensuite le troisième liquide sur-
nageant obtenu pour former le produit de gamma globu-
line.
Au lieu de lyophiliser directement le troi-
sième liquide surnageant, on peut en ajuster le p H entre 4,0 et 5,0, puis y ajouter de l'éthanol pour obtenir une concentration d'éthanol de 20 à 25 % en volume On laisse reposer ce mélange à -50 C jusqu'à ce qu'il se forme un quatrième précipité, puis on
centrifuge le mélange pour séparer le quatrième pré-
cipité qui est jeté, de manière à obtenir un qua-
trième liquide surnageant On lyophilise le quatriè-
me liquide surnageant obtenu pour former le produit
de gamma globuline.
Procédé ( 2) On met en suspension le précipi-
té (PI) obtenu comme décrit ci-dessus, dans de l'eau distillée et on ajuste le p H de la suspension entre 4,5 et 5,0 par addition d'un tampon On ajoute de
l'éthanol à la suspension pour obtenir une concentra-
tion d'éthanol de 20 à 25 % en volume On laisse reposer le mélange à -50 C, jusqu'à ce qu'il se forme un troisième précipité, puis on le centrifuge pour séparer le troisième précipité du troisième liquide surnageant On ajuste le p H du troisième liquide
surnageant entre 4,5 et 5,0 et on en ajuste la con-
centration d'éthanol entre 20 et 25 % en volume par addition d'éthanol et on en ajuste la résistance
ionique à 0,1 environ par addition de Na Cl On lais-
se reposer le mélange jusqu'à ce que se forme un
quatrième précipité, puis on sépare le quatrième pré-
cipité obtenu par centrifugation et on le sèche
pour former le produit de gamma globuline.
Les exemples suivants illustrent l'invention.
Dans ces exemples, les concentrations en éthanol
sont exprimées en pourcentages en volume.
EXEMPLE 1
A 1000 ml de plasma de sang humain qui est
à une température de -20 C, on ajoute 178 ml d'étha-
nol à 50 %, on laisse reposer le mélange à -20 C jusqu'à ce qu'il se forme un premier précipité,
puis on centrifuge pour enlever le premier précipité.
A 900 ml du premier liquide surnageant obtenu, dont le p H a été ajust 6 à 6,0 par une solution tampon à l'acétate 0,8 M, on ajoute 875 ml d'éthanol à 61 % pour amener le mélange à une concentration
d'éthanol de 30 % On centrifuge le mélange pour sé-
parer un deuxième précipité (PI) consistant en gamma globuline et en albumine du deuxième liquide surnageant On dissout 71 grammes de ce deuxième
précipité dans un mélange de 5 ml de solution tam-
pon à l'acétate 4 M et de 930 ml d'eau distillée.
A la solution obtenue, on ajoute 570 ml d'éthanol à 50 % pour obtenir une concentration en éthanol de 16 % et on centrifuge le mélange On ajuste le p H du troisième liquide surnageant obtenu à 5,0 par de la Na OH i N et, à ce liquide surnageant, on ajoute
431 ml d'éthanol à 50 %, pour obtenir une concentra-
tion d'éthanol de 25 % On centrifuge le mélange ob-
tenu en un quatrième précipité que l'on sépare et
que l'on jette et, en un quatrième liquide surna-
geant On lyophilise le quatrième liquide surnageant pour obtenir 5,5 grammes d'une composition de gamma
globuline consistant en 90 % en poids de gamma globu-
line et en 10 % en poids d'albumine.
EXEMPLE 2
A 900 ml du même premier liquide surnageant tel qu'obtenu au premier stade de l'exemple 1, dont le p H a été ajusté à 6,5 par une solution tampon d'acétate 0,8 M, on ajoute 1200 ml d'éthanol à 61 %
pour obtenir une concentration en éthanol de 35 %.
On centrifuge ensuite le mélange pour séparer un deuxième précipité (PI) On dissout 80 grammes du deuxième précipité obtenu dans un mélange de 5 ml d'une solution tampon d'acétate 4 M et de 1000 d 11 d'eau distillée A la solution obtenue, on ajoute
640 ml d'éthanol à 50 % pour obtenir une concentra-
tion d'éthanol de 16 % et on centrifuge le mélange.
On ajuste le p H du troisième liquide surnageant obtenu à 5,0 par de la Na OH i N et, à ce troisième liquide surnageant, on ajoute 480 ml d'éthanol à 50 % pour obtenir une concentration d'éthanol de 25 % On
centrifuge le mélange pour séparer un quatrième pré-
cipité que l'on jette et un quatrième liquide surna- geant On lyophilise le quatrième liquide surnageant obtenu pour obtenir 6 grammes d'une composition de gamma globuline consistant en 92 % en poids de gamma
globuline et en 8 % en poids-d'albumine.
EXEMPLE 3
A 900 ml du même liquide surnageant que ce-
lui obtenu au premier stade de l'exemple 1, dont le
p H est ajusté à 5,5 par une solution tampon d'acéta-
te 0,8 M, on ajoute 875 ml d'éthanol à 61 % pour ob-
tenir une concentration d'éthanol de 30 % On cen-
trifuge le mélange pour séparer un deuxième préci-
pité (PI) On dissout 60 grammes du deuxième précipi-
té obtenu dans un mélange de 5 ml d'une solution
tampon d'acétate 4 M et de 750 ml d'eau distillée.
A la solution obtenue, on ajoute 480 ml d'éthanol à % pour obtenir une concentration d'éthanol de 16 % et on centrifuge le mélange pour former un troisième précipitéique l'on sépare et que l'on
jette, et un troisième liquide surnageant On lyophi-
lise le troisième liquide surnageant obtenu pour
obtenir 4,9 grammes d'une composition de gamma glo-
buline consistant en 95 % en poids de gamma globu-
line et en 5 % en poids d'albumine.
Les compositions de gamma globuline obtenues aux exemples 1 et 2 contiennent de l'albumine dans une quantité allant de 8 % en poids à 10 % en poids, et ont une valeur d'activité anti-complémentaire
(valeur ACA) inférieure à 10 unités/ml La gamma glo-
buline obtenue à l'exemple 3 contient de l'albumine en une quantité de 5 % en poids et a une valeur ACA
13640
de 12 unités/ml Les compositions de gamma globuli-
ne obtenues dans les exemples 1, 2 et 3 conviennent
pour l'administration intraveineuse.
Claims (9)
1 Procédé de préparation d'une composition
de gamma globuline qui convient pour l'administra-
tion intraveineuse, à partir de plasma de sang humain, par précipitation fractionnée de ce plasma par de l'éthanol, caractérisé en ce qu'il consiste à traiter un premier liquide surnageant sépare par précipitation par l'alcool du plasma de sang humain,
en opérant à un p H de 5,5 à 6,5, à une concentra-
tion d'éthanol de 30 à 35 % en volume et à une con-
centration totale de protéines de 1 à 2 % en poids, puis à former un deuxième précipité contenant de la gamma globuline et de l'albumine, et à isoler et à
purifier ce deuxième précipité pour former la com-
position de gamma globuline.
2 Procédé suivant la revendication 1, ca-
ractêrisê en ce que le deuxième précipité contient
de 15 à 20 % en poids d'albumine.
3 Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le premier liquide surnageant
a une force ionique de 0,08 environ.
4 Procédé suivant la revendication 1, ca-
ractérisê en ce que la composition de gamma globu-
line purifiée consiste en 90 à 95 % en poids de gamma globuline et en 5 à 10 % en poids d'albumine
et ne contient pas d'agrégats de gamma globuline.
Procédé de préparation d'une composition de gamma globuline consistant en gamma globuline et en albumine, caractérisé en ce qu'il consiste: à mélanger du plasma de sang humain à de l'éthanol pour obtenir un premier précipité et un premier liquide surnageant sensiblement exempt de fibrinogène; à séparer ensuite le premier liquide surnageant du premier précipite; à ajuster ensuite le p H du premier liquide surnageant à une valeur comprise entre 5,5 et 6,5, à y ajouter de l'éthanol pour obtenir une concentration d'éthanol comprise entre 30 et 35 %
en volume, et à ajuster la concentration de protéi-
ne totale du premier liquide entre 1 % en poids et 2 % en poids, et à former ainsi uoe suspension d'un
deuxième précipité et d'un deuxième liquide surna-
geant; puis à centrifuger la suspension pour séparer le deuxième précipité du deuxième liquide surnageant; et
ensuite à purifier le deuxième préci-
pité pour former la composition de gamma globuline.
6 Procédé suivant la revendication 5, ca-
ractérisé en ce que le stade de purification du deuxième précipité consiste à mettre le deuxième précipité en suspension dans l'eau, à ajuster le p H de la suspension à une valeur comprise entre
4,0 et 5,0, à ajouter de l'éthanol à cette suspen-
sion pour obtenir une concentration d'éthanol com-
prise entre 10 et 16 %, et former ainsi un troisiè-
me précipité et un troisième liquide surnageant, puis à centrifuger la suspension pour séparer le troisième précipité du troisième liquide surnageant, et à lyophiliser le troisième liquide surnageant
1364 O
il
pour former la composition de gamma globuline.
7 Procédé suivant la revendication 5, ca-
ractérisé en ce que le stade de purification du deuxième précipité consiste à mettre en suspension le deuxième précipité dans l'eau, à ajuster le p H
de la suspension obtenue à une valeur comprise en-
tre 4,0 et 5,0, à ajouter de l'éthanol à la suspen-
sion pour y obtenir une concentration d'éthanol de à 16 % en volume, et à former ainsi un troisième précipité et un troisième liquide surnageant, puis
à centrifuger la suspension pour séparer le troi-
sième précipité du troisième liquide surnageant,
puis à ajuster le p H du troisième liquide surna-
geant entre 4,0 et 5,0, à ajouter de l'éthanol au
troisième liquide surnageant pour obtenir une con-
centration d'éthanol comprise entre 20 et 25 % en
volume, et former ainsi un quatrième liquide surna-
geant et un quatrième précipité, puis à centrifuger pour séparer le quatrième liquide surnageant et le quatrième précipité, et à lyophiliser ce quatrième liquide surnageant pour former la composition de
gamma globuline.
8 Procédé suivant l'une des revendications
à 7, caractérisé en ce que le deuxième précipité
contient de 15 à 20 % en poids d'albumine et la com-
position de gamma globuline purifiée consiste en à 95 % en poids de gamma globuline et en 5 à 10 % en poids d'albumine, et ne contient pas d'agrégats
de gamma globuline.
9 Procédé suivant l'une des revendications
à 8, caractérisé en ce qu'il consiste à ajuster la résistance ionique du premier liquide surnageant à 0,08 environ lorsque l'on en ajuste le p H, à y
ajouter de l'éthanol et à en ajuster la concentra-
tion de protéine
? 2513640
Procédé suivant la revendication 5, ca-
ractérisé en ce que le stade de purification du
deuxième précipité consiste à le mettre en suspen-
sion dans de l'eau, à ajuster le p H de la suspension à une valeur comprise entre 4,5 et 5,0, à ajouter de
l'éthanol à la suspension pour obtenir une concentra-
tion d'éthanol de 20 à 25 % en volume et former ainsi
un troisième précipité et un troisième liquide surna-
geant, à centrifuger pour séparer le troisième liqui-
de surnageant du troisième précipité, à ajuster le
p H du troisième liquide surnageant à une valeur com-
prise entre 4,5 et 5,0, à ajouter de l'éthanol pour obtenir une concentration d'éthanol de 20 à 25 % en volume, et à ajuster la force ionique à 0,1, et à former ainsi un quatrième précipité et un quatrième liquide surnageant, puis à centrifuger pour séparer ce quatrième liquide surnageant de ce quatrième précipité et à sécher ensuite ce quatrième précipité
pour obtenir le produit de gamma globuline.
11 Composition de gamma globuline, caracté-
risée en ce qu'elle a les propriétés de celle prépa-
rée par le procédé suivant l'une des revendications
précédentes, et consiste notamment en 95 % en poids
de gamma globuline et en 5 à 10 % en poids d'albu-
mine, sans contenir d'agrégats de gamma globuline-.
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5855432A (ja) | 1983-04-01 |
| FR2513640B1 (fr) | 1986-08-08 |
| DE3236126A1 (de) | 1983-04-14 |
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