DE2301501C3 - Verfahren zur Gewinnung eines stabilen, von hypotensiven Stoffen freien Plasmaproteins - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung eines stabilen Plasmaproteins, das frei von Jeder hypotensiven Substanz ist, als keinerlei depressive Wirkung zeigt taid für eine Schnellinfusion verwendet werden kann.

In der letzten Zeit gewinnt die Infusion von Plasmaprotein als wirksame Mittel für die medizinische Behandlung anstelle der Bluttransfusion zunehmend an Interesse. Insbesondere werden bemerkenswerte therapeutische Wirksamkeiten bei der intravenösen Tropfinfusion von stabilem Plasmaprotein beobachtet, das frei von aktiven Hepatitisviren ist und bei Schock, Hypoproteinämie und übermäßigen Blutverlusten durch Operation angewandt wird.

Eines der Ziek: der Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Erzeugung t /ies stabilen Plasmaproteins, das keinerlei depressive Wirkung zeigt und für eine Schnellinfusion verwendet wen' »n kann. J5

Grundsätzlich wird dieses Ziel gemäß der Erfindung durch Abtrennung eines als Verunreinigung in einem von menschlichem Blut oder Placenta erhaltenen stabilen Plasmaprotein enthaltenen hypotensiven Peptids durch Adsorption an einem Kationenaustauscher- harz oder an einem anorganischen Adsorptionsmittel oder durch Abtrennung des hypotensiven Peptids durch Gelfiltrations- oder Ultrafiltrationsverfahrens erreicht.

Weitere Besonderheiten der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung der Ausgangssituation lowie der Entwicklung und Eigenart der Erfindung hervorgehen, wobei auf die Zeichnungen Bezug genommen wird; es zeigt

Fig. la eine bei intravenöser Verabreichung von 188 mg/kg stabilem Plasmaprotein beobachtete Blut- w druckkurve; das Plasmaprotein stammte von menschlichem Plasmaprotein und wurde vor der lOstündigen Erwärmung auf 6O⁰C verwendet; Drucksenkung: 0%.

Fig. Ib eine bei intravenöser Verabreichung von 188 mg/kg stabilem Plasmaprotein beobachtete Blutdruckkurve; das Plasmaprotein stammte von menschli ehern Plasmaprotein und wurde nach der lOstündigen Erwärmung auf 60°C verwendet; Drucksenkung: 11.5%.

Fig. Ic eine bei intravenöser Injektion von einem •tabilen Plasmaprotein aus menschlichem Plasmaprolein beobachtete Blutdruckkurve; (Protein nach lOstündiger Erwärmung auf 6O⁰C; behandelt mit Silicagel); Drucksenkung: 0%,

Fig. Id eine bei Verarbreichung von 188mg/kg menschlichem Serum-Albumin gemessene Kurve; 6; Drucksenkung: 0%,

F i g. Ie eine Kurve zum Vergleich der bei der glatten Muskulatur mit 10 ng Bradykinin (a), 5%iger stabiler Plasmaproteinlösung aus menschlichem Plasmaprotein (b) und 5%iger Lösung, die durch Behandlung der vorstehenden Lösung mit Silicagel erhalten worden war (c), beobachteten Kontraktionen,

F i g. 2a eine Blutdruckkurve nach bzw. bei intravenöser Verabreichung von 188 mg/kg Plasmaprotein aus der Placenta unmittelbar vor einer einstündigen Erwärmung auf 6O⁰C in Gegnwart von Buttersäure; Drucksenkung: 0%,

Fig.2b eine bei intravenöser Verabreichung von 188 mg/kg stabilem Plasmaprotein aus menschlicher Placenta beobachtete Kurve; Drucksenkung: 19,1%,

F i g. 2c eine bei Verabreichung von 188 mg/kg stabilem Plasmaprotein aus menschlicher Placenta, das mit Silicagel behandelt worden war, gemessene Kurve; Drucksenkung: 0%,

F i g. 2d eine Vergleichskurve für die Kontraktionen am glatten Muskel, die mit 5%iger stabiler Plasmaproteinlösung (aus menschlicher Placenta; behandelt mit Silicagel) (d), mit der gleichen aber nicht behandelten Lösung (e) mit 5%iger Humanserumalbumin-Lösung (f) und mit 20 ng (g), 10 ng (h) und 5 ng (i) Bradykinin beobachtet werden.

(Bei allen diesen Kurvenbildern bezeichnen »A« und »ß« ein Intervall, innerhalb dessen die Verabreichung vorgenommen wurde.)

F i g. 3 eine Verteilung der Fraktionen bei der Gelfiltration von stabilem Plasmaprotein aus menschlicher Placenta unter Verwendung von hydrophilem unlöslichem Molekularsieb für chromatographische Zwecke aus verneutem Dextran von Pharmacia Fine Chemicals. Upsala, Schweden (Sephadex G-50*).

Daten für die Gelfiltration:	5 χ 50 cm
Säulengröße:	11
Packungsvolumen:	stabile Plasma
aufgegebene Lösung:	proteinlösung
	70 ml
Volumen derselben:	10 ml
Volumen von 1 Prüfglas:	03 M NaCI
Effluent:	4 ml/min
EIu tionsgesch windigkeit:

Das stabile Plasmaprotein besteht zur Hauptmenge aus Albumin und geringeren Anteilen an «-Globulin und /!-Globulin. Thermisch stabiles «-Globulin und ^-Globulin wird durch Ultrazentrifugalanalyse vom Albumin nicht unterschieden. Demgemäß wird das stabile Plasmaprotein bei Prüfung durch elektrophoretische Verfahren nicht als reines Albumin identifiziert; es wird jedoch durch das Vorligen eines einzigen dem Albumin entsprechenden Peaks beim Ultrazentrifugieren gekennzeichnet.

Verfahren zur Herstellung von Protein mit thermischer Beständigkeit aus von frischem menschlichen Blut abgetrenntem Plasma wurden bereits praktisch angewandt, jedoch bestehen erhebliche Schwierigkeiten bei der Aufsammlung großer Mengen von frischem Plasma gesunder Personen. Menschliche Placenta dagegen, die erhebliche Mengen Blut enthält, wird allgemein als Abfall betrachtet und ist daher leicht zu erhalten, jedoch haben bislang Versuche iur Erzeugung von stabilem Plasmaprotein durch Extraktion von Plasma aus der Placenta zu keiner praktischen Anwendung geführt.

Typischerweise werden für die Gewinnung von stabilem Plasmaprotein aus Plasma im wesentlichen folgende Verfahren angegeben:

(I) Eine Abwandlung des Verfahrens von Cohn zur Plasmaproteinfraktionierung (6. Verfahren, siehe japa-

nische Patentpublikation Nr. 5297/60). Diese Fraktionierungsverfahran besteht in der Behandlung eines von Fibrinogen und y-GIobulin freien Plasmas mit Äthanol von 25- bis 38%iger Konzentration unter Bedingungen wie pH-Werten von 4,3 - 4,7, Temperaturen im Bereich von -2 bis 20⁰C und einer lonenstärke von 1,2 oder weniger zur Ausfällung einer Mischung von Albumin, α-Globulin und ^-Globulin und Gewinnung des stabilen Plasmaproteins mit nachfolgender lOstündiger Erwärmung desselben auf 60⁰C zur Inaktivierung von Hepatitisviren, die als Verunreinigungen im Plasmaprotein vorhanden sein könnten. Das auf diese Weise erhaltene Plasmaprotein zeigt jedoch eine depressive Wirkung (siehe F i g. 1 b). Diese depressive Wirkung zeigt sich allerdings noch nicht bei der noch nicht wärmebehandelten Lösung dieses Plasmaproteins (siehe F ig. la).

Eine Gewinnung von stabilem Plasmaprotein aus Plasma- oder Gewebeextrakten mit einer großen Menge an Hämoglobin erfolgt (2) nach einem Verfahren »o (siehe japanische Patentpublikation Nr. 16 041/68), bei dem stabiles Plasmaprotein durch Zugabe von Buttersäure zu Plasmaprotein- oder Gewebsextrakt mit einer großen Menge an Hämoglobin und nachfolgende Erwärmung auf 57 bis 60⁰C bei pH-Werten von 4.5 bis 5.5 zur Ausscheidung und Entfernung von instabilem Globin gewonnen wird.

Dieses Verfahren besteht in der Gewinnung eines stabilen Plasmaproteins aus Albumin, «-Globulin und jS-GIobulin aus der überstehenden Flüssigkeit bei der Abtrennung einer y-GlobuIin enthaltgenden Fraktion als Niederschlag vom Plasma- oder Pacentaextrakt mit einer großen Menge an Hämoglobin; zu der (abgetrennten) überstehenden Flüssigkeit wird Buttersäure in solcher Menge zugegeben, daß ihre Endkonzentration 2 bis 6% ausmacht, der pH-Wert dann auf 43 bis 5.5 eingestellt und die Lösung zur Entfernung von wärmeinstabilem Globin als Niederschlag auf 57 bis 60° C erwärmt.

Das nach diesem Verfahren erhaltene stabile Plasmaprotein zeigt ebenfalls depressive Wirkung (siehe F i g. 2b). Die nach dem gleichen Verfahren erhaltene Proteinlösung zeigt allerdings vor der Erwärmung auf 57 bis 60⁰C keinerlei depressive Wirkung(sieheFig. 2a).

Bland u. a. beobachteten eine drucksenkende Wirkung bei Injektion von zumindest 100 ml 5%iger Lösung des nach obigem Verfahren (I) erhaltenen stabilen Plasmaproteins bei der Chirurgie am offenen Herzen innerhalb von 4 Minuten [J. H.L Bland. N.B. w L a ν e r und E. Lowenstein. »Hypotension infolge 5°/oiger Plasmaproteinfraktionen«. New England J. Med. 286,109(1972)}

Harrison u.a. berichteten ebenfalls, daß eine Schnellinfusion von stabilem Plasmaprotein, das nach obenerwähntem Verfahren (1) erhalten worden war. beim Patienten eine Drucksenkung auslöste. [G.A Harrison. M. Robinson. R.V. Stacey. CH. M c C u 11 ο c h . TAT ο r d a und J.S. Wright. »Hypo tensive Effects of Stable Plasma Protein Solution. - a to Preliminary Communication« Medical J. Australia 1040 Vol. 2 [197I]; G.A. Harrison, TA. Torda und P. Schiff, »Hypotensive Effects of Stable Plasma Protein Solution, a Preliminary Communication« Medical J. Australia 1308 Vol. 2 [1971}) b5

Zur Zeit ist die klinische Anwendung des nach obenerwähntem Verfahren (1) erhaltenen stabilen Plasmaproteins allein auf¹ die intravenöse TroDfinfusion beschränkt, da bei der Schnellinfusion beim Patienten die Gefahr einer Hypotension besteht. Der rasche Fortschritt in der operativen Praxis macht jedoch eine Schnellinfusion von stabilem Plasmaprotein in zunehmendem Maße notwendig.

Die Erfinder haben daher die Möglichkeiten zur Ausschaltung der hypotensiven Wirkung der bei den nach den obenerwähnten Verfahren (I) und (2) erhaltenen stabilen Plasmaproteinlösungen untersucht und dabei festgestellt, daß als hypotensive Substanz ein Peptid mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 10 000 in Frage kommt, das als Nebenprodukt bei der Erwärmung auf 56 bis 60° C im Rahmen der bekannten Verfahren gebildet wird. Dieses hypotensiv wirksame Peptid besitzt auch eine Kontraktionswirkung gegenüber der glatten Muskulatur; es wird jedoch durch die Wirkung von Carboxypeptidase B inaktiviert.

Es wurde nun gefunden, daß dieses hypotensive Peptid vom stabilen Plasmaprotein durch Gelfiltrationsoder Ultraiiltrationsverfahren abgetrennt werdtn kann, wobei die Tatsache ausgenutzt wird, aß das Molekulargewicht des Peptids geringer ist als dasjenige des stabilen Plasmaproteins. Darüber hinaus wurde als Ergebnis einer Untersuchung der Adsorptionieigenschaften des besagten hypotensiven Peptids an allen Arten von Adorptionsmitteln gefunden, das dieses Peptid von Kationenaustauschern und anorganischen Adsorbentien adsorbiert wird, während das stabile Plasmaprotein, ohne an diesen Adsorptionsmittel!! absorbiert zu werden, gewonnen wird.

Wenn dieses als Nebenprodukt nach lOstündiger Erwärmung von stabilem Plasmaprotein gemäß Verfahren (1) auf 60° C gebildete hypotensive Peptid nach dem erfindungsgemäßen Verfahren entfernt worden ist. wird es nicht mehr gebildet, selbst wenn die Wärmebehandlung bei 60⁰C nachfolgend fortgesetzt wird.

Darüber hinaus wird das hypotensive Peptid ebenfalls nicht mehr gebildet, selbst wenn das stabile Plasmaprotein einer lOstündigen Erwärmung auf 60"■<." /ur Inaktivierung von Hepatitisviren unterworfen wird, nachdem das hypotensive Peptid durch das erfindungsgemäße Verfahren von dem nach Verfahren (2) erzeugten stabilen Plasmaprotein entfernt worden ist (siehe F i g. 2c).

Gegenstand der Erfindung ist das nach dem Anspruch charakterisierte Verfahren. Es basiert auf der Feststellung, daß stabiles Plasmaprotein, das keinerlei depressive Wirkung zeigt und für die Schnellinfusion verwendet werden kann, aus menschlichem Blut und Placentaextrakt herstellbar ist. Das heißt, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren vird ein stabiles Plasmaprotein ohne depressive Wirkung durch Abtrennung von hypoten'.iver peptidischer Substanz mit einem Molekulargewicht y on .000 bis 10 000 von dem Protein erhalten, das durch Fraktionierung von menschlichem Blut oder Plarenia und Erwärmung auf 57 bis 60 C während oder nach der Fraktionierung erhalten wurde und laut elektrophoretischem Befund im wesentlichen aus Albumin besteht.

Das das slaO'le Plasmaprotein, das gemäß der Erfindung erzeugt wird, keinerlei hypotensives Peptid enthält, besteht keine Gefahr einer Blutdrucksenkung beim Patienten, selbst wenn nicht nur nine intravenöse Tropfinfusion sondern eine Schnellinfusion vorgenommen wird. Damit wird der klinische Anwendungsbereich bedeutend erweitert. Ferner kommen als Materialien für die Gewinnung des stabilen Plasmaproteins gemäß der Erfindung nicht nur reines Plasma, sondern auch Plasma- oder Placentaextrakte in Betracht, die eine

große Menge Hämoglobin enthalten, was einen erheblichen wirtschaftlichen Gewinn bedeutet.

Das Verfahren zur Abtrennung des gemäß der Erfindung zu verwendenden Plasmaproteins vom Blut erfolgt nach dem obenerwähnten abgewandelten Verfahren der Plasmaproteinfraktionierung nach C ο h η (6. Verfahren; ein Verfahren, bei dem Zinkionen bei einem Tieftemperaturäthanolfraktionierungsverfahren eingeführt werden, siehe Daglas M. Sargener u. ft.: Vox. Sunginis. Bd. 5[196O]S. 272) oder nach einem Verfahren, bei dem die lonenstärke des Plasmas durch ein lonenaustauscherharz erniedrigt wird zur Entfernung von instabilem Globulin als Niederschlag (siehe Hans N ich ma η u.a. Vox. Sunginis. Bd. 3 [1956] S. 184).

Zur Erzielung von Plasmaprotein aus Plasma- oder Placentaextrakten mit einem hohen Hämoglobingehalt kann das oben beschriebene Verfahren (japanische Patentpublikation Nr. Ib 041/b8) angewandt werden.

Bei einem konkreten Beispiel für das Verfahren zur Erzielung von Plasmaprotein aus Placenta wird wie folgt vorgegangen:

Eine auf niedrige Temperatur eingefrorene Placenta wird mit einer Eisquetsche grob zerquetscht und weiter mit einem Fleischschneider geschnitzelt. Zu 100 Gewichtsteilen dieser zerschnitzelten Placenta werden 200 ml I%ige Salzlösung hinzugefügt, die Blutantcile durch 30 Minuten lange Extraktion extrahiert und die überstehende Flüssigkeit (Placentaextrakt) durch Zentrifugieren abgesondert. Zu dem erhaltenen Placentaextrakt wird Ammoniumsulfat in einer Menge hinzugegeben, die innerhalb eines Bereichs frei wählbar ist. der /ti einer Konzentration von 35 bis 40% (nach der Zugabe) fiihrt und der erzeugte Niederschlag abgetrennt.

Wenn irgendeine Vorrichtung zur Verfügung steht, mit welcher der Placentaextrakt bei einer ausreichend niedrigen Temperatur gehalten werden kann, ist es alternativ möglich, den Placentaextrakt mit Äthanol in solchen Mengen zu versetzen, daß 25 Gewichtsteile pro 100 Gewichtsteile Placentaextrakt enthalten sind und den erzeugten Niederschlag abzutrennen.

Der Hauptteil des Hämoglobins bleibt in der so erhaltenen überstehenden Flüssigkeit. Diese kann der nachfolgenden Behandlung, d.h. einer Behandlung mit organischer Säure unterworfen werden, vorzuziehen für die nachfolgende Behandlung ist jedoch eine Zugabe '■on Ammoniumsulfat zu dieser Lösung und Aufsammlung einer rohen Albuminfraktion als Niederschlag, da die Proleinkonzentration der überstehenden Flüssigkeit gering ist.

Der durch Filtriei en erhaltene Niederschlag wird durch Zugabe von Wasser (3 bis 4 1 zu 1 kg Niederschlag) gelöst. Existenz und Menge des in der rohen Albuminfraktion enthaltenen Ammoniumsulfats hat keinerlei Einfluß auf das Ergebnis der danach auszuführenden Behandlung mit organischer Säure. Eine das brauchbare Protein enthaltende Lösung wird durch Zugabe einer organischen Säure zu der (Obenerwähnten Albuminlösung zur Ausfällung und Abtrennung des Hämoglobins durch Filtrieren erhalten, |e mehr organische Säure zugegeben wird, um so mehr Hämoglobin fällt aus und die Absonderung des brauchbaren Proteins wird besser, jedoch führt jede übermäßige Zugabe zu einer Abnahme der Ausbeute an stabilem Plasmaprotein durch Mitfällung von Albumin bei der nachfolgenden Wärmebehandlung, und daher ist es günstig, die organische Säure in einer solchen Menge zuzugeben, daß ihre Endkonzentration in besagter Lösung 2 bis 6% ausmacht.

Die Einstellung des pH-Wertes ist ein wirksames Mittel zur vollständigen Abtrennung von Hämoglobin. Die Hämoglobinmenge in der überstehenden Flüssigkeit nimmt merklich ab. wenn der pH-Wert von neutral auf 5,5 gesenkt wird und das Hämoglobin fällt bei einem pH-Wert von 4,3 vollständig aus. Im allgemeinen ist es jedoch günstig, den pH-Wert innerhalb eines Bereichs von 4,5 bis 5,5 einzustellen, da bei weiterer Absenkung des pH-Wertes die Albuminausbeule abnimmt. Die Flüssigkeit wird allmählich erwärmt. Globulin, das wärmeinstabil ist. beginnt bei 50"C oder darüber auszufallen. Die Temperatur der Lösung wird für eine gewisse Zeitdauer bei 57 bis 6O⁰C gehalten. Eine I bis 2 Minuten lange Erwärmung auf 6O⁰C ist für die Ausfällung von instabilem Globulin ausreichend, jedoch ist eine 15 bis 30 Minuten lange Wärmeeinwirkung zur Erlangung der Verläßlichkeit der Verfahrensweise gunstiger, da das stabile Piasmaprotein wie Albumin stabil ist.

Besagte Flüssigkeit wird nach der Wärmebehandlung auf Zimmertemperatur abgekühlt. Die durch Abtrennung des nach dem Abkühlen erhaltenen Niederschlags durch Filtrieren erhaltene Flüssigkeit enthält kein Hämoglobin mehr, und es werden 520 g Ammoniumsulfat pro I I Flüssigkeit zur vollständigen Ausfällung von Protein hinzugegeben. Der Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt und durch Dialyse in kaltem Wasser in einem Ccllophanrohr von Ammoniumsulfai und organischer Säure befreit.

Auf diese Weise wird die stabile Plasmaprotcinlösung erhalten. Die Proteinkonzentration dieser Lösung liegl bei 5.0 bis 6.5 Gew.-%. Die Lösung wird dann durch eine mit einem Ionenaustauscher oder anorganischen Adsorptionsmitteln gepackte Säule geschickt zur Adsorption der hypotensiven Substanz, die alternativ durch Gelfiltrations- oder Ultrafiltrationsverfahren abge trennt werden kann, und das stabile Plasmaprotein wire frei von der hypotensiven Substanz erhalten.

Als gemäß der Erfindung zu verwendende lonenaus tauscher werden »kationische Ionenaustauscherharze«' verwendet, die allgemein in Gebrauch sind, wie beispielsweise Carboxymethylcellulose, hydrophile un lösliche Kationenaustauscher aus vernetztem Dextran und schwach sauren Kationenaustauscher. Als anorga nische Adsorptionsmittel sind z. B. Silicagel odei Aluminiumoxidgel günstig.

Was die Bedingungen für die Adsorption dei innerhalb des stabilen Plasmaproteins enthaltener hypotensiven Substanz durch die obenerwähnter Ionenaustauscherharze oder anorganischen Adsorp tionsmittel betrifft, so ist es günstig, einen lonenaustau scher oder ein anorganisches Adsorptionsmittel in eine Säule zu füllen, die zunächst mit 0.25⁰/oiger Natrium chloridlösung equilibriert und nachfolgend mit besagtei Plasmaproteinlösung mit einer Strömungsgeschwindig keit von 50 bis 150 ml/Std/cm² beschickt wird. Ali Temperatur sind 4 bis 6' C günstig.

Die Gelfiltration erfolgt beim erfindungsgemäßer Verfahren nach der allgemein angewandten Verfah rensweise. Beispiele für konkrete Verfahren werden ir den nachfolgenden Litcraturstcllen angegeben.

1) J.R. Wh i taker »Bestimmung der Molekularge wichte von Proteinen durch Gelfiltration ar Sephadex«. Anal. Chem. 35 (1963) 1950 - 1953.

2) P. Andrews »Ermittlung der Molekulargewichti von Proteinen durch Sephadex-Gelfiltration« Bio chem. J. 91 (1964)222-233.

j) TX. I. a ti r c η ι, J. K i I! a η d c r »Mine Theorie der Gelfiltration und ihre experimentelle Nachprüfung« I.Chromatog. 14(1964)317-330,

4) CR. C a r η c g i e »Abschätzung der Molckülgrößc von Peptid
(1965)9 1'.

durch Gelfiltration«. Biochem. |. 95

Die Ultrafiltration erfolgt im Rahmen der Erfindung unter den in den nachfolgenden l.itcraturstcllen angegebenen Verfahrensbedingungen:

1) H.|. Bixler. R.W. llausslein. I..M. N eisen »Trennung und Reinigung von biologischen Materialien durch Ultrafiltration« May. 1969. Nat. Meeting. Am. Inst, of (."hem. Eng. Cleveland.

2) C.|. Van O s s.. P.M. Bronson »Entfernung von IgM von Serum durch Ultrafiltration«. Anal. Biochem. 36(1970)464.

i) D. HiI(UiIiM. |. H roden r »Ultrafiltration von Humanseruni; Beweis für ncidcrniolckulare Cholincsterasc-Aktivitäl«. Rev. Can. Biol. 29(2). 187 (|un. 1970).

Zu dem so erhaltenen von hypolensivcr Substanz freien stabilen Plasmaprotein werden Stabilisatoren wie N-Acciyltryptophan und NatriumcapryliH hinzugegeben, so dall die Konzentration besagter Lösung bei 0.0032 bis 0.0046 M liegt, und es wird 10.5 bis 14,5 Stunden lang auf 59 bis 61 C erwärmt.

Die Messung der depressiven Wirkung erfolgt im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen an einem Hund. Das heißt, ein männlicher ausgewachsener Hund einer Mischrassc von etwa 8 kg Körpergewicht wurde nach Anästhcsicrung mit Urethan am Rücken festgebunden und eine Kanüle in die linke Artcria corotis eingeführt und der Carotidartcricndruck mit einem Schreibgerät (polygraph transducer) aufgezeichnet. Die zu prüfende Substanz wurde über ein an der rechten Oberschcnkelvcnc befestigtes Katheter verabreicht. Die Drucksenkling wurde nach folgender Gleichung aus dem mittleren Blutdruck bei dem Minimalpunkt, der bei Absenkung durch Verabreichung der zu untersuchenden Substanz beobachtet wurde sowie aus dem mittleren Blutdruck vor der Verabreichung (der als Standard betrachtet wurde) erhalten.

mittlerer Blutdruck mittlerer Blutdruck

Drucksenkung (%) =

vor Verabreichung der Probe — nach Verabreichung der Probe mittlerer Blutdruck vor Verabreichung der Probe

100.

Die Messung der Kontraktionswirkung an der glatten Muskulatur am Uterus der Ratte erfolgte nach der Magnus-Technik unter Verwendung des Uterus von virginaien Ratten der Wistar-Rassc. Ratten von 150 g Körpergewicht wurden intraperitoneal 5 mg Diöstradiol 18 Stunden vor Entfernung des Uterus injiziert, und nach 18 Stunden wurden die Ratten durch Decapitation gelötet und ausbluten gelassen zur Entfernung des Uterus.

Als Nährlösung diente mit Luft gesättigte de |alonl.ösung mit 0.1 mg% Alropinsulfat. Das Volumen der Nährlösung im Organbad lag bei 8,6 ml, das Volumen der Probclösting bei 0.4 ml und die Reaktionsdatier betrug 90 Sekunden.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Eine stabile Plasmaproieinfrakiion wurde aus 100 1 menschlichem Plasma nach dem modifizierten Verfahren von Cohn zur Plasmaproleinfraktionicrung (6. Verfahren: siehe japanische Patentpublikation Nr. 5297/60) gewonnen: Das Plasma wurde auf pH 7.2 eingestellt und mit 53.3% kaltem Äthanol versetzt, so daß die Endkonzentration bei 8% lag und dann zur Entfernung von Fibrinogen bei — 2^CC zentrifugiert. Zu der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde so viel kalter Äthanol hinzugegeben, daß die Endkonzentration

Tabelle 1

Ausbeute an stabilem Plasmaprotein vor und nach Wirkung beim Hund und der Kontraktionswirkung bei bei 21% lag. der pH-Wert wurde auf 6,8 eingestellt und die Temperatur der Lösung allmählich auf —6"C

in gesenkt: dann wurde zur Entfernung von /-Globulin zentrifugiert.

Die überstehende Flüssigkeit wurde einer kalten Äthanolbehandlung unter Bedingungen wie 25% Äthanolkonzentration, pH 4.7, lonenstärkc 0.1 und

j-, -6"C Temperatur unterworfen, wobei eine aus Albumin. «x-Globulin und ^-Globulin bestehende Mischung ausfiel und gewonnen wurde. Diese stabile Plasmaproteinfraktion wurde anschließend lyophilisiert bzw. gefriergetrocknet, wobei 3.2 kg trockenes Portein-

4(i pulver erhalten wurden. Dieses trockene Pulver wurde in destilliertem Wasser gelöst unter Bildung einer 5%igen Proteinlösung, zu der N-Acetyltryptophan und Natriumcaprylat als Stabilisatoren in Mengen zugegeben wurden, daß die Endkonzentration bei 0.04 M lag;

4-, dann wurde die Lösung 10 Stunden lang bei 60"C wärmebehandelt.

Die wärmebehandelte Plasmaproteinlösung wurde erfindungsgemäß durch eine Silicagel-Säule geschickt unter Gewinnung einer nichtadsorbierten Fraktion

-,o (Plasmaproteinfraktion). Die hypotensive Substanz wurde an der Silicagel-Säulc adsorbiert und dadurch entfernt. In der nichtadsorbierten Fraktion wurden etwa 95% des stabilen Plasmaproteins gesammelt. Die experimentellen Daten sind in Tabelle 1 und in den F i g. 1 a bis 1 e wiedergegeben.

der Silicagel-Behandlung; Prüfung der drucksenkenden der glatten Muskulatur am Rattenuterus.

Gruppe

Nr.

Proteinausbeute

Drucksenkung beim
Hund

Kontraktionswirkung beim Rattenuterus

Stabile Plasmaproteinlösung vor
Behandlung mit der Silicagei-Säule

Stabile Plasmaproteinlösung nach
Behandlung mit der Silicagel-Säule

(100%)
(100%)

95,0%
93,5

-H-

-Hf

Die elektrophorctischc Analyse tier Prcotcin/.usammensctziing des stabilen Plasmaproleins ergab 88,5% Albumin, 7.5% ^-Globulin und 4.0% /{-Globulin.

Die erzeugte 5%ige Lösung von stabilem Plasmaprolcin kann als stabiles Plasmaprotein-Produkt verwendet -, werden, das keinerlei depressive Wirkung besitzt und für die Schnellinfusion brauchbar ist.

Beispiel 2

Das nach dem modifizierten Verfahren von Cohn zur ι ο Plasmaproteinfraktionierung(6. Verfahren) aus menschlichem Plasma, wie in Beispiel I beschrieben, erzeugte

10

stabile Plasmaproleinpulver wurde in destilliertem Wasser gelöst zur Urzeugung einer 5%igen Proleinlösung, zu der N-Aeetyltryptophan und Natriumcaprylat in solchen Mengen hinzugegeben wurden, daß die Kndkonzenlration bei 0,04 M lag. Die Lösung wurde dann 10 Stunden lang bei 60"C wärmebchandclt. Die erwärmte Plasmaproleinlösung wurde durch Ultrafiltrationsmethoden unter Verwendung einer Ultrafilirationsmembran filtriert. Das hypolcnsive Peptid wurde dabei abfiltriert und vom Plasmnprotein getrennt.

F.xpcrimentelle Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

Tabelle 2

Depressive Wirksamkeit und Konlraktionswirkung auf die glatte Muskulatur von stabiler

Plasmaproteinlösung vor und nach der Ultrafiltration.

	Gruppe	Protcin-	Druck-	Kontraklions-
	m.	J(UM)CUIC	VCIlHUlIg UCIIII Hund	WIl KUIIg UUI der glatten Muskulatur der Ratte
Stabile Plasmaproteinlösung vor der Ultrafiltration Stabile Plasmaproteinlösung nach der Ultrafiltration	3 4 3 4	100% 100% 99,4% 98,9%	-H- -H-	-Hf Hf

Die durch Ultrafiltration von hypotensivem Peptid befreite Plasmaproteinlösung wurde auf eine Proteinkonzentration von 5% eingestellt und mit N-Acetyltryp lophan und Natriumcaprylai derart versetzt, daß die Endkonzentralion bei 0,04 M lag. und es wurde so ein stabiles Plasmaproteinprodukt erhalten, das frei von jeglicher hypotensiven Substanz und für Schncllinfusionen verwendbar war.

Beispiel 3

Unmittelbar nach Erhalt eingefrorene und frischhaltend gelagerte Placenta wurde fein zerquetscht, und zu 20 kg Placenta wurden 401 1 %ige Natriumchloridlösung hinzugegeben zur Extraktion der Blutkomponenten; eine y-Globulin enthaltende Fraktion wurde ausgefällt und vom Extrakt abgetrennt. Zur überstehenden Flüssigkeit wurde so viel Buttersäure hinzugegeben, daß die Endkonzentration bei 2 bis 6% lag, und der pH-Wert der behandelten Lösung wurde auf 4,5 bis 5,5 eingestellt, die Mischung 1 bis 2 Stunden lang auf 57 bis 60⁰C erwärmt und der gebildete Niederschlag abge·

>o trennt.

Zu der nach Zentrifugieren erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde zur Ausfällung des gesamten Proteins so viel Ammoniumsulfat hinzugegeben, daß die Konzentration 75% ausmachte. Die erhaltene Plasmaproteinpaste oder -masse wurde in ein Dailyserohr überführt und bei 4"C 24 Stunden lang gegen fließendes Wasser dialysiert (bis zu diesem Schritt ist die Behandlung die gleiche wie bei dem Verfahren nach der japanischen Patentpublikation Nr. 16 041/68).

Die auf pH 7,0 eingestellte Plasmaprotoinlösung wurde in eine mit Carboxymethyl-Sephadex® gepackte Säule gegeben, die mit einer Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,1 M enthaltenden 0,05 M Phosphatpufferlösung von pH 6,8 bis 7,0 ins Gleichgewicht gesetzt worden war; die Säule wurde mit obigem Puffer gewaschen und der eluierte Proteinanteil gesammelt. Etwa 90% des in die Säule gegebenen Plasmaproteins wurden wiedergewonnen und das hypotensive Peptid an der Säule adsorbiert und entfernt.

Die experimentellen Ergebnisse sind in Tabelle 3 und den F i g. 2a bis 2d wiedergegeben.

Tabelle 3

Ausbeute an stabilem Plasmaprotein; beim Hund beobachtete Depressionswirkung und Kontraktionswirkung

auf die glatte Muskulatur beim Rattenuterus vor und nach Behandlung mit der Carboxymethyl-Sephadex-Säule.

	Gruppe	OD580	Protein	Druck	Kontraktions
	Nr.		ausbeute	senkung beim	wirkung beim
				Hund	Rattenuterus
Stabiles Plasmaprotein vor	5	32,8	(100%)	■H-	-Hf
Behandlung mit Carboxymethyl-	6	36,7	(100%)	-H-	-itt-
Sephadex
Stabiles Plasmaprotein nach	5	32,0	91,0%	-	-
Behandlung mit Carboxymethyl-	6	35,2	89,5%	-	-
Sephadex

Das mit Carboxymelhyl-Sephadpx behandc-lle stabile Plasmaprotcin wurde auf 5%ige Protcinkon/entration in einer Lösung eingestclli, zu der N-Aeetyltryptophan •nd Natriumeaprylat in solchen Mengen zugegeben wurden, daß die Endkonzentration bei 0,04 M lag. Diese -, Mischung wurde 10 Stunden lang auf 60"C erwärmt und ein vom jeglichen hypotensiven Peptid freies stabiles Plasmaprotein erhallen, das für die Schnellinfusion brauchbar war. Das so gewonnene stabile Plasmaprotein bestand zu 95% aus Albumin, vGlobulin und im /^Globulin bei 5%igcr Proteinkonzentration.
Die Ausbeute (im 1 Placenta betrug 2,2 g.

B e i s ρ i e I 4

Unmittelbar nach Erhalt eingefrorene und frisehgehahene Placenta wurde in gleicher Weise wie in Beispiel J fraktionier!, d. h. durch Zugabe von Buttersäure und Erwärmung auf 57 bis 60"C und die durch Dialyse der /entrifugierten überstehenden Flüssigkeil erhaltene Plasmaproleinlösung wurde der Gelfiltration unter Verwendung einer Sephadex-G-50®-Säule unterworfen. Das Plasmaprotein wurde in eine hochn..)lekulare Fraktion und cine hypoiensi^c Substanz in einer Fraktion mit geringerem Molekulargewicht fraktioniert (siehe F i g. J).

Das erhaltene stabile Plasmaprolein wurde auf eine 5ⁿ/oige Proteinkonzentration in der Lösung eingestellt, zu der N-Aeelyltryplophan und NatriuiiKaprylai in Mengen zugegeben wurden, dall die Endkon/enlration bei 0.04 M lag. Die Mischung wurde IO Stunden lang auf fiOC erwärmt und ein von jeglichem hypotensiven Peptid freies stabiles Plasmaprotein erhalten, das für die Schnellinfusion brauchbar war.

Hierzu K)I)InII '/ricliminivn

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Gewinnung eines von hypotensiver Substanz freien stabilen Plasmaproteins, dadurch gekennzeichnet, daß man von einem stabilen Plasmaprotein mit depressiver Wirkung, das elektrophoretisch im wesentlichen aus einer Albuminfraktion besteht und aus menschlichem Blut oder Placenta gewonnen und während der Gewinnung einer Wärmebehandlung bei 57 bis 60⁰C unterworfen worden ist, peptidische Substanzen mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 10 000 durch Ultrafiltration oder Gelfiltration oder durch Adsorptionen Kationenaustauscherharze, Silicagel oder Aluminiumoxidgel, abtrennt ι