<Desc/Clms Page number 1>
Verfahren zur Herstellung stabiler, hochgereinigter y-Globulinpräparate Es sind Verfahren bekanntgeworden, die es ermöglichen, die infolge ihres Gehaltes an Antikörpern für die Therapie wichtigen y-Globuline des menschlichen oder tierischen Serums durch fraktionierte Ammonsulfatfällung [Cohn, Mc.Meekin, Oncley, Newell und Hughes, J. Amer. Chem. Soc. 62 (1940), 3386] zu isolieren und zu konzentrieren.
Da die auf diese Weise erhaltenen y-Globulinpräparate hinsichtlich ihres durch quantitative Elektrophorese bestimmten Reinheitsgrades nicht befriedigten, ist man später dazu übergegangen, die y-Globulinfraktion des Serums oder Plasmas durch Alkohol bei genau definierten pH-Werten und Ionenstärken abzuscheiden (Cohn und Mitarbeiter, amerik. Patentschrift Nr. 2 390 074, Williams und Deutsch, amerikanische Patentschriften Nrn. 2 437 060, 2 543 215).
Diese auf Alkohol oder andern organischen, wasserlöslichen Flüssigkeiten basierenden Eiweissfraktionierungsverfahren liefern zwar reine y-Globulinfraktionen, erfordern aber erhebliche technische Einrichtungen, weil sie infolge der bei normalen Raumtemperaturen stattfindenden Eiweissdenaturierung nur in tiefgekühlten Arbeitsräumen durchführbar sind. Ausserdem hat sch gezeigt, dass selbst bei Temperaturen unter 0 eine gewisse Schädigung der wertvollen y-Globuline durch Alkohol und ähnlich zusammengesetzte Eiweissfällungsmittel, die mit einer in der Ultrazentrifuge leicht nachweisbaren Zunahme der Molekülgrösse einhergeht, nicht zu vermeiden ist.
Es wurde nun gefunden,, dass man die antikörper- haltige y-Globulinfraktion des Serums in ihrer natürlichen Struktur als eine in der Ultrazentrifuge einheitlich sedimentierende Eiweisskomponente durch ein Verfahren isolieren kann, bei dem denaturierende Fäl- lungsmittel, wie Alkohol, nicht verwendet werden und dessen Durchführung auch nicht an kostspielige kältetechnische Einrichtungen gebunden ist. Das neue Fraktionierungsverfahren beruht auf der kombinierten Anwendung von Neutralsalzen, verdünnter Säure und Aluminiumhydroxyd-Gel in bestimmter Reihenfolge und unter genau definierten Bedingungen.
Es ist dadurch gekennzeichnet, dass man aus der von Albuminen und Salzresten befreiten rohen Globulinfraktion des menschlichen oder tierischen Serums oder Plasmas zur Ausfällung der ss-Globuline durch Zusatz von Neutralsalzen und Essigsäure den Eiweissgehalt auf 3-4%, die lonenstärke auf 0,07 0,02 und das PH auf 5,3 0,05 einstellt, das dialysierte Filtrat der ss-Globulinfällung zwecks Fällung des a-Globulins durch Zusatz von Wasser auf eine Ionenstärke von weniger als 0,001 und durch Zufügen von verdünnter Essigsäure auf einen Eiweissgehalt von 2 0,5 und auf ein p,1 von 5,0 0,
05 bringt und schliesslich durch Zugabe einer den Gehalt an gelösten y-Globu- linen nicht vermindernden MengeAluminiumhydroxyd- Gel bei PH 5,0 0,5 die noch vorhandenen geringen Restmengen von a- und ss-Globulinen als unlösliche Aluminiumverbindungen entfernt.
Am besten geht man von einer rohen Globulin- fraktion aus, wie sie durch Halbsättigung mit Ammon- sulfat aus verdünntem Serum bei neutraler bis schwach. alkalischer Reaktion erhalten wird, wobei je nach Herkunft des Serums der Sättigungsgrad zwischen 45 und 55 % und die Eiweisskonzentration zwischen 3 und 4,5% schwanken kann. Zur Einstellung der Ionenstärke auf 0,07 0,02 kann man z. B. Natriumchlorid oder Natriumacetat verwenden.
Die zur Abtrennung der restlichen a- und ss-Globulinverun- reinigungen zu verwendende Menge Aluminiumhydroxyd-Gel wird zweckmässigerweise durch einen Vorversuch ermittelt.
<Desc/Clms Page number 2>
Bei der Einwirkung des Aluminiumhydroxyds auf die Globulinbeimengungen findet ein chemischer Prozess statt, was daraus hervorgeht, dass das Absorptionsmaximum des ss-Lipoproteins [K.
Heide, R. Schmidtberger und G. Schwick: Behringwerk-Mit- teilungen 33, 96 (1957)], des wesentlichsten Vertreters der mit Al(OH)3 reagierenden a- und ss-Glo- buline, bei pH 5,0 bei einer Wellenlänge von 273 mit, liegt, in Verbindung mit Al(OH)3 aber bei 276 mit gefunden wird.
Das Aluminiumhydroxyd-Gel kann beispielsweise nach Willstätter und Kraut, Ber. dtsch. chem. Ges. 56 (1923), 1117 hergestellt werden. Die y-Globulin- lösung kann zum Schluss für die Anwendung beim Menschen in der üblichen Weise auf den gewünschten Eiweissgehalt, auf physiologisches PH und blut- isotonischen Salzgehalt gebracht, entkeimt und gegebenenfalls auch in gefrorenem Zustand getrocknet werden.
Die nach diesem Verfahren gewonnenen y-Globu- line erweisen sich bei der Elektrophorese in der Tiseliusapparatur als frei von Albuminen, a- und ssGlobulinen und verhalten sich in der Ultrazentrifuge wie ein monodisperser Eiweisskörper mit der Sedimen- tationskonstanten S2, = 6,1.
Unterzieht man jedoch ein erfindungsgemäss isoliertes y-Globulinpräparat nachträglich einer Alkoholfällung bei -5 nach einer der anfänglich zitierten, bisher üblichen Aufarbei- tungsmethoden, so beobachtet man nun in der Ultrazentrifuge dasselbe Denaturierungsprodukt von der Sedimentationskonstanten & o = 9-10, das regelmässig bei mit Alkohol gewonnenen ;,-Globulinprä- paraten aufzutreten pflegt (vgl. Fig. 1 und 2). Die erfindungsgemäss hergestellten y-Globulinpräparate sind frei von proteolytischen Fermenten (Plasmin, Fibrinolysin) und daher stabil.
Beispiel 1 10 1 menschliches Serum werden mit 7,11 Wasser auf 3,8% Gesamteiweiss verdünnt und nach Einstellung mit Alkalihydroxyd auf pH 8,0 unter Rühren langsam mit 13,9 1 gesättigter Ammonsulfatlösung vom gleichen PH versetzt. Der entstandene Niederschlag enthält neben a- und ss-Globulinen praktisch die Gesamtmenge der im Serum vorkommenden y- Globuline und nur sehr wenig Albumin. Er wird durch Zusatz von 1,5 1 Wasser und 23 cm3 10%iger Natriumbicarbonatlösung in Lösung gebracht und das erhaltene Konzentrat zweckmässigerweise durch Zentrifugieren oder Filtrieren von etwa vorhandenen Trübbestandteilen befreit.
Hierauf wird das in die Lösung eingeschleppte Ammonsulfat durch Dialyse gegen schwach alkalisches Aussenwasser auf unter 0,05% gesenkt und das Dialysat durch Hinzufügen von Natriumchlorid und Wasser auf 3,8 /@ Eiweiss und 0,4% NaCl eingestellt. Hierdurch wird eine Ionenstärke von 0,07 erreicht. Nun wird unter Rühren auf pH 5,3 0,05 angesäuert, wozu 90 cm-- 2%iger Essigsäure erforderlich sind. Es bildet sich eine in der Hauptsache aus ss-Globulinen bestehende Fällung, die in einer hochtourigen Zentrifuge entfernt wird.
Der Abguss wird mit 90 cm- 10%iger Natriumbicarbonat- lösung auf pH 7,2 0,1 eingestellt und durch Dialyse gegen destilliertes Wasser, das durch eine Spur Natronlauge auf PH 7,2 gehalten wird, von Chlorionen befreit. Die Ionenstärke liegt dann unterhalb von 0,001. Sodann wird der Abguss mit destilliertem Wasser auf einen Eiweissgehalt von 23;, verdünnt und unter Rühren mit 140 cm-- 2 öiger Essigsäure versetzt, wodurch der für die Abscheidung der a-Globu- line optimale PH-Wert von 5,0 0,05 erreicht wird.
Die entstandene Fällung wird durch Zentrifugieren entfernt und die im Zentrifugat von 6,2 1 verbliebenen geringen Restmengen von a- und /3-Globulinen durch chemische Reaktion mit Aluminiumhydroxyd entfernt. Zu diesem Zweck wird die Menge von 620 cm?, 2%iges Aluminiumhydroxyd-Gel, von der durch einen Vorversuch ermittelt wurde, dass sie der. Gehalt an gelöstem y -Globulin nicht vermindert, in das Zentrifugat eingerührt. Nach Abtrennung der Aluminium-Eiweissverbindung durch Dekantieren, Filtrieren oder Zentrifugieren erhält man eine klare, farblose Lösung von 6,5 1 mit 1,15 ä Eiweiss, das nur aus y-Globulinen besteht.
Da das als Ausgangsmaterial benutzte normale Humanserum 6,5"; Gesamteiweiss enthielt, das auf Grund der elektrophore- tischen Analyse zu 15 % aus "l-Globulinen bestand, ergibt sich eine Ausbeute an "-Globulin von 85% und ein Konzentrationsfaktor von 9.
In dem in bekannter Weise auf neutrale Reaktion, physiologischen Salzgehalt und einen Eiweissgehalt von 16% gebrachten Verfahrensendprodukt sind die im Ausgangsserum vorhandenen natürlichen Diph- therieantitoxine auf das 20fache angereichert. Ausserdem enthält das Konzentrat gegenüber Masern, Hepatitis epedemica, Poliomyelitis und andern Infektionskrankheiten wirksame Schutzstoffe.
Der hohe Reinheitsgrad des nach vorstehendem Verfahren gewonnenen menschlichen ;-Globulinpräparats wird durch die in den Fig. 1 bis 6 wiedergegebenen Ultrazentrifugier- und Elektrophoresedia- gramme belegt.
Fig. 1 zeigt ein Ultrazentrifugendiagramm von erfindungsgemäss gewonnenem 7-Globulin. Rechts oben ist die Gerade zur Berechnung der Sedimen- tationskonstante.
Fig.2 zeigt ein Ultrazentrifugendiagramm von erfindungsgemäss gewonnenem ;1-Globulin nach Alkoholbehandlung und die Geraden zur Berechnung der beiden Sedimentationskonstanten.
Die Fig. 3 bis 5 zeigen Ultrazentrifugendiagramme von verschiedenen durch Alkoholfraktionierung isolierten y-Globulinpräparaten sowie die Geraden zur Berechnung der beiden Sedimentationskonstanten.
Fig. 6 zeigt zwei Elektrophoresendiagramme, und zwar unten: von erfindungsgemäss gewonnenem Globulin, oben: des durch Alkoholfraktionierung iso-
<Desc/Clms Page number 3>
fierten y-Globulinpräparates, dessen Ultrazentrifugendiagramm in Fig. 3 dargestellt ist.
Die Untersuchung der nach der zuvor zitierten Alkoholmethode hergestellten, handelsüblichen y- Globulinkonzentrate in der Ultrazentrifuge (Fig. 3, 4 und 5) zeigt das Vorhandensein eines Denaturierungs- produktes von der Sedimentationskonstanten 9-10, das auch dann auftritt, wenn das Verfahrensprodukt nachträglich nach einem der bisher üblichen Verfahren mit Alkohol bei -5 ausfällt und wieder gelöst wird (Fig. 2). Auch hinsichtlich seiner elektrophore- tischen Beweglichkeit in der Apparatur von Tiselius unterscheidet sich das erfindungsgemäss gewonnene Produkt deutlich von den andern Präparaten (Fig. 6).
Die in den Fig. 1 bis 5 dargestellten Sedimen- tationskurven wurden nach der Methode von O. Lamm erhalten. Nach diesem Verfahren wird eine Skala, deren Teilstriche genau gleichen Abstand besitzen, während des Sedimentationsversuches in bestimmten Zeitabständen durch die Versuchslösung hindurch photographiert. An der Sedimentations- grenze verschieben sich die Abstände der Skalenstriche entsprechend der proportionalen Änderung der Brechungsexponenten mit dem Konzentrationsgradienten. Die Differenzen Z zur ursprünglichen Lage werden als Ordinate über der verschobenen Stellung X der Abszissenwerte aufgetragen.
Das Maximum der auf diese Weise entstandenen Sedimentationskur- ven gibt die Lage der Sedimentationsgrenzschicht wieder. Zwei oder mehrere Maxima in einer solchen Sedimentationskurve entsprechen zwei oder mehreren verschieden schweren Molekülarten. Das Flächen. integral der Kurvenabschnitte gibt dann den relativen Anteil der zugehörigen Komponenten an der Lösung an. Die Sedimentationskonstante S",, wird graphisch ermittelt.
Hierzu werden aus 8-10 Sedimentationsaufnah- men die aus den für die Temperatur korrigierten Sedi- mentationswegen x gebildeten Ausdrücke
EMI3.32
gegen die Zeit t aufgetragen. x" bedeutet den Abstand des n-ten Gipfelpunktes von der Drehachse, x" den Abstand von der Drehachse zum Beginn der Zelle. Die errechneten Punkte sollen auf einer Geraden liegen, deren Neigung ein Mass für die Sedimen- tationskonstante darstellt.
Auf der Zeichnung 6 sind zwei Elektrophoresekurven von 7-Globulinen abgebildet. Diese Diagramme wurden ebenfalls nach der Skalenmethode von O. Lamm gewonnen, nur dass hier die verschobenen Abstände als Ordinate gegen die Normalskala als Abszisse aufgetragen wurden. Auf der Abszisse sind die Einheiten der elektrophoretischen Wanderungsgeschwindigkeit -u - 10-5 . cm'2. V-1 . sec-1 aufgetragen. Beispiel 2 101 Diphtherieserum vom Rind, das 1000 AE im cm3, 9,06 % Gesamteiweiss und 4,41 % y-Globulin enthält, werden mit 13,84 1 Wasser und 23,84 1 gesättigter Ammonsulfatlösung unter Rühren bei PH 8,0 versetzt.
Der gefällte Globulinniederschlag wird auf einer Nutsche gesammelt. Er hat ein Feuchtgewicht von 1,5 kg mit 6,48 g Eiweiss = 71,6% der Ausgangsmenge. Die Entfernung der in ihm enthaltenen ss-Globuline erfolgt gemäss Beispiel 1 nach Dialyse und Verdünnen auf ein Volumen von l7,021 bei einer Ionenstärke von 0,07 = 0,4% NaCl und einem pH- Wert von 5,3, zu dessen Einstellung 380 cm3 2%iger Essigsäure benötigt werden. In Lösung verbleiben 521 g Eiweiss = 57,5% der Ausgangsmenge.
Zur Abscheidung der a-Globuline wird die Ionenstärke durch Dialysieren auf etwa 0,001 herabgesetzt, durch Zugabe von destilliertem Wasser das Volumen auf 26,061 und durch Einrühren von 520 cm3 Essigsäure das pH auf 5,0 eingestellt. Der Abguss von 26,11 enthält eine Eiweissmenge von 470 g, die 51,8 % der Ausgangsmenge entspricht. Die ebenfalls gemäss Beispiel 1 durchgeführte Behandlung mit 2,611 2%igem Aluminiumhydroxyd-Gel bei PH 5,0 ergibt eine reine y-Globulinlösung, die in 28,23 1353 g Eiweiss = 39% der Ausgangsmenge enthält. Die Ausbeute an y-Glo- bulin beträgt 80 %.
Nach Neutralisation mit Natrium- bicarbonatlösung wird die von Albuminen, a- und ss-Globulinen befreite Flüssigkeit bei niederer Temperatur eingefroren und im Hochvakuum getrocknet. Das y-Globulin-Trockenprodukt löst sich schnell und vollkommen klar in physiologischer Kochsalzlösung und ergibt im Tierversuch bei einem Eiweissgehalt von 20% eine Wirksamkeit von 5000 AE Diphtherieanti- toxin im cm?,. Der bei der Aufarbeitung eingetretene Antikörperverlust liegt somit unter 15%.
Beispiel 3 10 1 Tetanusplasma vom Pferd, das 850 AE (neuer, internat. Standard) im cm-, 7,69 % Gesamteiweiss, davon 3,0% T- und 1-Globuline, enthält, werden mit 10,2 1 Wasser und 5,0 1 gesättigter Ammon- sulfatlösung bei pH 8,0 unter Rühren versetzt. Das im gefällten Rückstand hauptsächlich enthaltene Fi- brinogen wird abgesaugt, das Filtrat mit weiteren 151 Ammonsulfatlösung bei PH 8,0 auf Halbsättigung gebracht. Der gefällte Globulinniederschlag wird auf einer Nutsche gesammelt.
Er hat ein Feuchtgewicht von 1,3 kg mit 461,4 g Eiweiss = 60% der Ausgangsmenge. Die in ihm enthaltenen ss-Globuline werden nach Dialyse wie in dem Beispiel für Menschenserum durch Verdünnen auf ein Volumen von 12,1 1 bei einer Ionenstärke von 0,07 = 0,4% NaCl und bei einem PH-Wert von 5,3, zu dessen Einstellung 340 cm?, 2%iger Essigsäure benötigt werden, entfernt. 1n Lösung verbleiben 419,1 g Eiweiss = 54,5% der Ausgangsmenge.
Zur Abscheidung der a-Globuline wird die Ionenstärke durch Dialysieren auf etwa 0,001 herabgesetzt, durch Zugabe von destilliertem Wasser
<Desc/Clms Page number 4>
das Volumen auf 20,9 1 und durch Einrühren von 320 cm3 2%iger Essigsäure das PH auf 5,0 eingestellt. Die Entfernung letzter Spuren Fibrinogen erfolgt in dem 20,91 betragenden Abguss mit 5000 E Thrombin bei pH 7,0 (die notwendige Thrombinmenge wird durch einen Vorversuch bestimmt). Nach Filtration enthalten diese 20,9 1 eine Eiweissmenge von 356,8 g, die 46,4% -der Ausgangsmenge entspricht.
Die ebenfalls wie in den andern Beispielen durchgeführte Behandlung mit 2,091 2%igem Aluminiumhydroxyd-Gel bei pH 5,0 ergibt eine reine, die T-Kom- ponente enthaltende y-Globulinlösung, die in 21,51 269g Eiweiss = 35 % der Ausgangsmenge enthält. Die Ausbeute an y-Globulin beträgt 90%. Nach Neutralisation mit Natriumbikarbonatlösung wird die von Albuminen, a- und (-Globulinen befreite Flüssigkeit lyophil getrocknet. Der Tierversuch ergibt bei einem Eiweissgehalt von 20% eine Wirksamkeit von 5000 AE Tetanusantitoxin im cm3 (25 000 AE/g Protein).
Der Antikörperverlust bei der Aufarbeitung liegt somit bei 20 i. Der Konzentrationsfaktor berechnet sich zu 2,3.