Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia czystej orgoteiny.Orgoteina nalezy do grupy protein posiadajacych charakterystyczne wlasciwosci fizyczne, chemiczne i farmakologiczne. Kazdy z przedstawicieli tej gru¬ py pod wzgledem fizycznym charakteryzuje sie tym, ze daje sie izolowac w postaci kulistego roz¬ puszczalnego w wodzie i w buforze bialka wyka¬ zujacego wysoce zwarta naturalna konformacje czasteczki, która chociaz nietrwala przy ogrzewa¬ niu, jest trwala przy ogrzewaniu w ciagu kilku minut do temperatury 65°C w wodzie lub w roz¬ tworze buforowym zawierajacym sól metalu dwu- wartosciowego o promieniu jonowym — 0,60—1,00A i która po elektroforezie na zelu przy wartosci pH = 8,45 w 0,01 m buforze trisglicynowym daje charakterystyczne wielokrotne pasmo linii. Pod wzgledem chemicznym kazdy z przedstawicieli tej grupy charakteryzuje sie obecnoscia wszystkich lub co najmniej jednego z podstawowych aminokwa¬ sów, mala procento»wo zawartoscia weglowodanów, brakiem lipidów, 0,1—1,0% zawartoscia metalu uzy¬ skanego z okolo 3—5 gramoatomów/mol jednego lub wiecej chelatowanych dwuwartosciowych metali, posiadajacych promien jonowy 0,60—1,00A i na ogól niechelatowanych metali jednowartosciowych lub trucizn komórkowych w czasteczce. Pod wzgledem farmakodynamicznym, kazdy z przedstawicieli tej grupy charakteryzuje sie tym, ze stanowi nietok¬ syczne, immunologicznie dobrze tolerowane, nada- jace sie do injekcji bialko, którego aktywnosc far¬ makologiczna wlacznie z aktywnoscia przeciwza¬ palna, podobnie jak zwarta konformacja jest za¬ lezna od zawartosci chelatowanego metalu dwuwar- tosciowego. Immunologiczne powinowactwo okres¬ lonej orgoteiny jest wystarczajace do wytwarza¬ nia odpowiednich przeciwcial w króliku lub innym zwierzeciu, które to przeciwciala rozpoznaja jako antygen jeden lub wiecej przedstawicieli róznych orgotein i/lub powinowactwo to jest wystarczajace dla jednego lub wiecej przeciwcial wytworzonych pod wplywem innych przedstawicieli orgoteiny w " celu rozpoznania jej jako antygenu, co wykazano w immunoloelektroforezie na zelu i/lub w immuno- dyfuzji na zelu. Chociaz niektóre z wlasciwosci fi¬ zycznych i chemicznych oraz rodzaj i stopien sku¬ tecznosci farmakodynamicznej sa rózne u poszcze¬ gólnych przedstawicieli orgoteiny, jednakze wszy¬ scy przedstawiciele orgotein posiadaja powyzszy zbiór wlasciwosci.Z danych literaturowych, okazalo sie obecnie, ze grupa orgotein metaloproteinowych obejmuje pro¬ teiny uprzednio izolowane w róznych stopniach czystosci, którym nadano nazwy: hepatokupreiny, Mann & Keilin, Proc. Royal. Soc. for Biol. Sci. 126, 303 (1939); cerebrokupreiny, Porter & Ainsworth, J. Neurochem. 1, 260 (1957); erytrokupreiny, Marko- witz i inni, J. Biol, Chem. 234, 40 (1959); i cytokup- reiny, Carrico & Deutsch, J. Biol. Chem. 244, 6087 (1969). Dalsze wzmianki patrz: Mohamed & Green- 85 28685 3 berg, J. Chem. Physiol. 37, 433 (1954); Porter & Folch, Arch. Neurol. Psychiat. 77, 8 (1957); Por¬ ter & Ainsworth, J. Neurochem., 5, 91 (1959); Krimmel i inni; J. Biol. Chem., 234, 46 (1959); Wy- man, Biochem. Biophys. Acta, 45, 387 (1960); Shields et al., J. Clin. Inv., 40, 2007 (1961); Markowitz i in¬ ni, Anal. Chem., 33, 1594 (1961); Porter i inni, Arch.Biochem. Bioph., 105, 319 (1964); Stansell & Deutsch, J. Biol. Chem., 240, 4299 (1965); ibid, 240, 4306 (1965); Stansell & Deutsch, Clin. Chem. Acta, 14, 598 (1936): McCord & Fridovich, J. Biol. Chem., 243, 5753 (1968); McCord & Fridovich, J. Biol.Chem., 243, 6056 (1968); Hartz & Deutsch, J. Biol.Chem., 244, 4565 (1969); Carrico & Deutsch, ibid, l\2£f7^? (1970); Wood i inni., Eur. J. Biochem. 18 I Z tych obserwacji okazalo sie obecnie, ze grupa 1 rt£itif)f£tfft obejmuje równiez metaloproteiny; wobec | ^ggff^fe-" -drgo'teina wykazuje wyrazna aktywnosc dismu^azy clo tworzenia nadtlenku jej zwiazek z po¬ stacia tego enzymu wystepujaca u ssaków zostal równiez ustalony. Podano, ze te metalo-proteiny odznaczaja sie bardzo wysoka aktywnoscia dismu- tazy (sodazy) do tworzenia nadtlenku. (Patrz McCord & Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 6049 (1969); ksele, McCord & Fridovich, J. Biol. Chem., 245, 6176 (1970); ibid., 246, 2975 (1971).W opisie patentowym belgijskim nr 687828 i bry¬ tyjskim nr 1160151 podany jest wielostopniowy pro¬ ces izolacji orgoteiny z tkanki zwierzecej na przy¬ klad watroby wolowej.W opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 3687927 jest opisany ulepszony sposób izolacji orgo¬ teiny z watroby wolu i tkanek innych zwierzat; który eliminuje wielostopniowosc procesu i na ogól podwyzsza wydajnosc.W opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki nr 3579495 zastrzezony jest sposób izolacji orgoteiny z komórek czerwonych cialek krwi w wielostop¬ niowym procesie, który obejmuje wstepne oczysz¬ czanie rozpuszczalnikiem w celu usuniecia hemo¬ globiny oraz etap ogrzewania, przy calkowitej wy¬ dajnosci okolo 0,01%, obliczonej w stosunku do wypelnionych czerwonych komórek.W niektórych danych literaturowych, cytowanych powyzej stosowano oczyszczanie chromatograficzne na celulozie-DEAE jako etap wielostopniowego pro¬ cesu izolacji orgoteiny z watroby i tkanek innych zwierzat. W jednym z tych procesów, Carvico i in¬ ni J. B. C. 244, 6037—6093 (1969), mieszanine wy¬ ekstrahowanych rozpuszczalnych protein poddaje sie trzykrotnemu oczyszczaniu chromatograficzne¬ mu, kazdorazowo polegajacemu na dializie, a na¬ stepnie przesaczeniu przez zel Sephadex G-75. Pro¬ ces ten, jakkolwiek stosowany na skale laborato¬ ryjna nie jest praktykowany na skale przemyslowa.Co wiecej, calkowita wydajnosc wynosi zaledwie 0,0065%.Wedlug innych danych literaturowych cytowa¬ nych powyzej, etap oczyszczania chromatograficz¬ nego na DEAE-celulozie stosowano jako czesc wie¬ lostopniowego procesu izolacji orgoteiny z komórek czerwonych cialek. W najprostszym z tych proce¬ sów, komórki czerwonych cialek byly uwalniane od hemoglobiny przez stracanie rozpuszczalnikiem, a 286 4 nastepnie frakcjonowane K2HP04 i acetonem. Czesc z frakcjonowanych rozpuszczalnych protein podda¬ nych lizie komórek czerwonych cialek wolu, chro¬ matografowano przy wartosci pH 7,4 uzyskujac z 3 litrów wprowadzanych na kolumne komórek 190 mg orgoteiny o aktywnosci dismutazy dó tworzenia nadtlenku, wynoszacej 3.300 jednostek/mg (0,006% calkowitej wydajnosci; 60% odzyskania orgoteiny).Proces ten, chociaz nadajacy sie na skale labora- io toryjna, nie jest odpowiedni na skale przemyslowa.Na przyklad w celu wytworzenia 1 kg orgoteiny potrzebne jest ponad 7500 litrów chloroformu, 4500 litrów etanolu, 7000 kg K2HP04 i 5000 litrów ace¬ tonu, jesli proces bylby wprowadzony bez zmian.Znaleziono, ze sposobem wedlug wynalazku mo¬ zna wyeliminowac stosowanie rozpuszczalnika w celu usuwania hemoglobiny, K2HPO4 w celu usu¬ wania anhydrazy weglowej i rozpuszczalnika w celu stracania orgoteiny, czyniac tym proces wyjatko- wo uproszczony w skali przemyslowej.Sposobem wedlug wynalazku, czysta na ogól or- goteine mozna izolowac z wysoka wydajnoscia z poddanych lizie komórek czerwonych cialek przez jednorazowe oczyszczanie chromatograficzne bez koniecznosci stosowania rozpuszczalnika organicz¬ nego lub wstepnego lub pózniejszego oczyszczania.Istota wynalazku jest to, ze chociaz hemoglobina stanowi co najmniej 96% rozpuszczalnych protein w komórkach czerwonych cialek, a 70% lub wiecej pozostalych protein stanowi anhydraza weglowa, obie mozna rozdzielic na tym samym etapie, w któ¬ rym izoluje sie orgoteine w czystej na ogól postaci.W procesie 'wedlug wynalazku otrzymuje sie orgoteine o czystosci farmakologicznie dopuszczal- nej z mieszaniny rozpuszczalnych protein, znajdu¬ jacych sie w tkankach zwierzat lub komórkach czerwonych cialek, przez jednorazowe oczyszczanie chromatograficzne, dzieki czemu proces wytwarza¬ nia jest wyjatkowo odpowiedni w skali przemyslo- 40 wej.Prostota i ekonomicznosc procesu jest taka, ze calkowita produkcja i koszty materialowe stanowia okolo 7io najnizszych kosztów, mozliwych dotych¬ czas .na skale przemyslowa. 45 Produkty wyjsciowe w procesie wedlug wyna¬ lazku stanowia albo mieszanine rozpuszczalnych w buforze protein wyekstrahowanych z tkanek zwierzat lub rozpuszczalne proteiny z komórek czerwonych cialek, lacznie obie hemoglobina i an- 50 hydraza weglowa.Okreslenie „tkanka zwierzat", stosowana tu, oznacza którykolwiek organ, miesien lub odpowied¬ nia tkanke. Okreslenie to nie obejmuje krwi ani którejkolwiek jej frakcji, która posiada o wiele 55 wyzszy stosunek innych rozpuszczalnych protein do orgoteiny, a mianowicie hemoglobiny i anhy¬ drazy weglowej, gdyz wtedy konieczna jest inna technika ich usuwania. Tkanki zwierzat, zwlaszcza watroba, sa najodpowiedniejsze, poniewaz posiadaja 60 wysokie stezenie orgoteiny. Innymi tkankami, z któ¬ rych mozna otrzymywac sa: nerki, serce, mózg, sle¬ dziona, trzewia, miesnie, luski, szyjne groczoly, pluca, jezyk, grasica i trzustka. Przykladowo naj¬ odpowiedniejszymi rodzajami, zwierzat, których 65 tkanki mozna wykorzystywac jako zródla orgote-5 85 286 6 iny zawierajace mieszanine buforowych rozpusz¬ czalnych protein, sa woly, kuraki, swinie, konie.Innymi sa owca, koza, królik, szczur oraz czlo¬ wiek etc. Najodpowiedniejsze sa rozpuszczalne pro¬ teiny, otrzymywane z tkanki wolowej.Pierwotna mieszanine orgoteiny, zawierajaca roz¬ puszczalne w buforze proteiny, otrzymuje sie przez dokladne zmieszanie tkanki zwierzecej z odpowied¬ nim srodkiem ekstrahujacym. W celu uwolnienia protein rozpuszczalnych od nierozpuszczalnych, tkanke nalezy mozliwie jak najbardziej rozdrob¬ nic. Na przyklad tkanke mozna wstepnie rozdrob¬ nic na miazge w maszynce od miesa i nastepnie dokladnie wymieszac z odpowiednia ciecza eks¬ trahujaca na przyklad w wysoko obrotowym urza¬ dzeniu do mieszania.Stosunek cieczy ekstrahujacej do tkanki zwierze¬ cej nie jest istotny i jest podyktowany przede wszystkim fizycznym charakterem mieszaniny. Bar¬ dzo niski stosunek zmniejsza nieco wydajnosc or¬ goteiny, ekstrahowanej z tkanki i wytwarza mie¬ szanine podobna do szlamu, która jest trudna do rozdzielenia i faza ciekla stanowi nadmiar substan¬ cji koloidalnej, która wykazuje tendencje do zaty¬ kania kolumny chromatograficznej. Bardzo wysoki stosunek jest niekorzystny, wystepuje w rozcien¬ czonych roztworach ekstrahowanych protein, co stwarza wieksza trudnosc w operowaniu takimi objetosciami.Na ogól utrzymuje sie stosunek objetosciowy cieczy ekstrahujacej do tkanki zwierzecej od okolo 2:1 do 4:1, zwlaszcza okolo 2,3:1—2,8:1.Ciecza ekstrahujaca moze byc woda, mieszanina wody z mieszajacym sie rozpuszczalnikiem orga¬ nicznym na przyklad acetonem, etanolem lub przede wszystkim roztworem buforowym o wzglednie ni¬ skim stezeniu jonowym na przyklad 0,1—0,05 m zwlaszcza okolo 0,2—0,03 m. Jakkolwiek ciecz eks¬ trahujaca moze byc faktycznie stosowana przy do¬ wolnym pH na przyklad okolo 4—9, jednakze pH slabo alkaliczne na przyklad miedzy 7—9, przede wszystkim okolo 7,5—7,8, jest korzystne, zwlaszcza, gdy tkanka zwierzeca jest watroba.Jezeli jako ciecz ekstrahujaca tkanke zwierzeca stosuje sie roztwór buforowy lub rozcienczalnik dla lizy komórek czerwonych cialek, bufor moze byc dowolny, taki który utrzymuje wybrane pH. Na przyklad sa to sole kwasu fosforowego, kwasu bo¬ rowego, kwasu kakodylowego, cytrynowego, octo¬ wego, bursztynowego, maleinowego, chlorowodorek kollidyny, chlorowodorek trisglicyny etc. Patrz równiez J. Gomosi „Methods in Enzymology" tom I str. 136—146 (1955), bufory specjalne nr 5—8 i 10—8.Odpowiednim buforem, zwlaszcza przy ekstraho¬ waniu watroby jest bufor tris-glicynowy o pH = = 7,5.Bufor moze zawierac równiez inne sole i inne substancje, zmieniajace jego charakterystyke eks¬ trakcji. Mozna stosowac NaCl, KC1, MnS04 lub in¬ ne sole niebuforujace w celu zwiekszenia stezenia jonowego cieczy ekstrahujacej. Rozpuszczalne cuk¬ ry, na przyklad glukoza, sacharoza etc., mozna równiez dodawac dla ulatwienia ekstrakcji, przez utworzenie buforu bardziej selektywnego.Mieszanine zsuspendowanyeh czesci tkanek i wod¬ ny ekstrakt rozdziela sfe w zwykly sposób na przyklad przez saczenie pod cisnieniem lub pod próznia lub odwirowanie, zwlaszcza odwirowanie.Ekstrakt mozna, ewentualnie sklarowac przez odsa- czenie na filtrze lub w jakikolwiek inny sposób.W sposobie wedlug wynalazku mozna stosowac rozpuszczalne proteiny, pochodzace z komórek czer¬ wonych cialek róznorodnych gatunków. Zasadniczo proteiny, które nadaja sie do stosowania zawieraja orgoteine, posiadajaca punkt izoelektryczny, róznia¬ cy sie o co najmniej okolo 1 jednostke pH od punk¬ tu orgoteiny, pochodzacej z anhydrazy weglowej.Korzystne sa komórki czerwonych cialek rozpusz¬ czalnych protein, zawierajace orgoteine, która po- siada punkt izoelektryczny okolo" 4,5—5,5. Takie proteiny posiadaja na przyklad woly, kurczaki i ko¬ mórki ludzkich czerwonych cialek. Inne proteiny posiadaja króliki, malpy, szczury etc. Rozpuszczalne proteiny z komórek wolowych czerwonych cialek 2f sa najbardziej odpowiednie.Komórki czerwonych cialek, które przecietnie stanowia okolo 35—45% objetosciowych i okolo 39—50% wagowych calej krwi wielu ssaków sa od¬ dzielane od plazmy krwi przez odwirowanie, cho¬ ciaz bylaby wystarczajaca ich sedymentacja.Przemywanie oddzielonych komórek i powtórne odwirowanie usuwa pozostalosci plazmy, przylega¬ jacej do wypelnionych komórek. Mozna stosowac roztwór soli lub bufor o dostatecznych wlasciwos¬ ciach osmotycznych w celu unikniecia ryzyka przedwczesnej lizy.Szczególnie korzystna metoda lizy jest sonifika- cja, to jest rozrywanie komórek za pomoca ultra- dzwieków. Proces ten jest korzystny ze wzgledu na nieistotny wzrost objetosci poczatkowego roz¬ tworu protein oraz na nie wprowadzanie dodat¬ kowych soli lub zwiazków organicznych do tego roztworu. Po usunieciu nierozpuszczalnych skladni- 40 ków komórek, które stanowia okolo 2% wagowych wypelnionej komórki, roztwór rozpuszczalnych pro¬ tein, otrzymanych po lizie komórek czerwonych i cialek podaje sie na adsorbent chromatograficzny, w celu zaadsorbowania orgoteiny. 45 Jesli oddzielny ekstrakt lub rozcienczona miesza¬ nina posiada stezenie jonowe wyzsze niz okolo 0,01 m, konieczne jest zmniejszenie tego stezenia w celu unikniecia przedwczesnej adsorpcji na wy¬ mieniaczach jonowych. Najwygodniej jest wyko- w nac to przez rozcienczenie lub przez dialize na przyklad wobec wody lub zwlaszcza buforu o ni¬ skim stezeniu jonowym. Najkorzystniejszy jest bu¬ for, który bedzie sie stosowalo przy rozdzielaniu chromatograficznym, na przyklad fosforan.Poniewaz rozpuszczone sole znacznie wplywaja na zdolnosc adsorpcji orgoteiny na adsorbencie chromatograficznym pierwotny roztwór rozpusz¬ czalnych protein, przeznaczonych do chromatogra- fowania, powinien posiadac niskie stezenie jonowe, ,0 to jest mniej niz okolo 0,01 m, na przyklad 0,001— —0,005 m. Jesli roztwór posiada wyzsze stezenie, mozna je latwo zmniejszyc przez rozcienczenie lub prosta dialize membranowa wobec wody lub roz¬ tworu buforowego o stezeniu jonowym okolo 1—5 X 10—8 m. Korzystnie jest zastosowac ten sam7 85 286 8 bufor do rozdzielania chromatograficznego na przy¬ klad fosforan.Rodzaj soli, utrzymujacych stezenie jonowe pier¬ wotnego roztworu, nie jest istotny. Sole fosforowe Ea korzystne, poniewaz pozadane pH okolo 6 moze byc z latwoscia regulowane za pomoca tego buforu.Jako inne stosuje sie sole kwasu borowego, kwa¬ su kakodylowego, kwasu cytrynowego, octowego, bursztynowego, maleinowego, chlorowodorek kolli- dyny, chlorowodorek tris-glicyny etc. Patrz rów¬ niez J. Gomori, „Methods in Enzymology" tom I str. 136—146 (1955) zwlaszcza bufory mr 5—8 i 10—S.Sposób wedlug wynalazku przeprowadza sie ko¬ rzystnie przy wartosci pH olkolo 6, to jest 5,7—6,3, wlacznie z etapem adsorpcji orgoteiny na adsor- .bencie chromatograficznym. Jednakze bardziej niz na etapie adsorpcja, na etapie selektywnej elucji efektywnosc procesu zalezy od wartosci pH, Dla¬ tego, chociaz nie jest to korzystne, pierwotny roz¬ twór rozpuszczalnych protein moze miec wartosc pH nieco wyzsza lub nizsza, na przyklad 4—8.W takim przypadku adsorbent chromatograficzny powinien byc doprowadzony do stanu równowagi przed wprowadzeniem probówki i potem do elu¬ cji przy pH okolo. 6 przed próba selektywnej elucji orgoteiny.Chromatograficzny adsorbent w sposobie wedlug wynalazku stanowi zywica jonowymienna, posia¬ dajaca grupy slabo zasadowe, wykazujace powi¬ nowactwo do jonów kwasowych. Na przyklad zna¬ ne sa jako zywice jonowymienne celuloza i wielo- cukry wlacznie z niskc-alMloamino-nisko-alkilo-ce- luloza na przyklad dwuetyloaminoetylo- celuloza (DEAE), trójetylo-aminoetylo-celuloza (TEAE), dwu- etyIoaminaetylo-Sephadex i QAE-Seiphadex (czte- róaminoetylowana sieciowana zywica dekstrano¬ wa). Zywice takie posiadaja na ogól pojemnosc ad- sorpcyjna od okolo 1—5 milirównowazników na gram. Na przyklad DEAE-celuloza posiada pojem¬ nosc 1,0 milirównowaznika (g/suchej masy); DEAE- -Sephadex 3,5±0,5 milirównowaznika/g; DEAE-ce¬ luloza, TEAE-celuloza i sieciowana zywica dekstra¬ nowa, zawierajaca grupy dwuetyloaminoetylowe, sa najodpowiedniejszymi, a zwlaszcza ta poprzednia.Wlóknista DEAE-celuloza jest korzystna z powodu szybkosci przeplywu, który jest w tym wypadku wiekszy, niz przy zastosowaniu postaci mikrogra- nulatu, jakkolwiek posiada on cokclwiek wieksza moc rozdzialu.Orgoteina jest izolowana z zywicy jonowymien¬ nej przez selektywna elucje. Sposób wedlug wyna¬ lazku polega na adsorpcji orgoteiny równoczesnie z innymi proteinami z mieszaniny na kolumnie z zywica jonowymienna i wymyciu z kolumny he¬ moglobiny i innych protein nieadsorbowanych; na¬ stepnie selektywnej elucji orgoteiny z kolumny i odzyskania orgoteiny z frakcji eluatu, zawieraja¬ cej na ogól czysta orgoteine. Jakikolwiek te etapy procesu prowadzone sa w sposób konwencjonalny przy zastosowaniu zywicy jako wypelniacza kolum¬ ny chromatograficznej, wydawalo sie fachowcom z tej dziedziny, ze mozna tu zastosowac oczywiste warianty równowaznikowe na przyklad szlamowa¬ nie zywicy za pomoca pierwotnego roztworu roz¬ puszczalnych protein.Zastosowana ilosc zywicy wymieniacza jonowe¬ go, chociaz nie istotna, wplywa na wydajnosc i czy- stosc izolowanej orgoteiny. Stosuje sie zwlaszcza okolo 0,25—0,5 ml zywicy/ml wprowadzonych ko¬ mórek czerwonych cialek krwi lub stosuje sie okolo 100 miligramów ekstrahowanej proteiny w przeli¬ czeniu na okolo 15% rozpuszczalnych protein w io pierwotnej tkance. Wiekszy stosunek (objetosc/ma¬ sa) zywicy do protein nie przynosi zadnych szcze¬ gólnych korzysci.Poniewaz ani hemoglobina ani myoglobina z pier¬ wotnego roztworu protein nie sa adsorbowane na zywicy jonowymiennej ponizej ich punktu izoelek- trycznego, usuwanie ich razem z innymi nieadsor- bowanymi proteinami jest latwo przeprowadzane przez przemywanie kolumny wodnym eluantem, zwlaszcza posiadajacym pH o wartosci okolo 6.Aby zapobiec elucji orgoteiny, roztwór wodny po¬ winien miec stezenie jonowe nie mniejsze niz 0,01 m. Wode lub zwlaszcza bufory-, jak wymienio¬ nej powyzej, w szczególnosci bufor fosforanowy mozna stosowac na tym etapie. Czeste tylko kilka- krotne zwiekszenie wolnej przestrzeni kolumny jest potrzebne dla usuniecia z kolumny hemoglobiny i innych protein nieadsorbowanych. Usuniecie he¬ moglobiny moze byc z latwoscia stwierdzone po kolorze odcisku.Po usunieciu hemoglobiny z innych nieadsorbo¬ wanych protein z kolumny, nastepnym etapem jest oddzielenie orgoteiny od innych zaadsorbowanych protein w taki sposób, zeby eluat zawieral na ogól czysta orgoteine. Mozna to przeprowadzic na dro- dze selektywnej elucji orgoteiny z kolumny, sto¬ sujac wodny eluant wartosci pH okolo 6, to jest ,7—6,3, i tak zmieniajac stezenie jonowe, zaadsor- bowane proteiny sa kolejno eluowane. Praktycz¬ nym aspektem tego wynalazku, w którym stosuje 40 sie jeden etap izolacji chromatograficznej, otrzy¬ mujac na ogól czysta proteine, jest kolejna eluacja protein, w wyniku której otrzymuje sie frakcje eluatu zawierajaca na ogól czysta orgoteine. Przy postepowaniu w ten sposób zaadsorbowane prote- 45 iny sa stopniowo eluowane z kolumny i zawarty dwuwartosciowy metal, a przede wszystkim rów¬ niez kontrolowane sa w eluacie absorbancje A265 j/lub A280.Jak podano powyzej, najwazniejsze jest utrzy- 50 manie wartosci pH srodka eiuujacego okolo 6 przy sosowanym stezeniu jcinowym. Przy innej wartosci pH eluuje sie inne proteiny razem z orgoteiha, w ilosciach które wplywaja na wytwarzania orgo¬ teiny raczej wysoce zanieczyszczonej niz na ogól 55 czystej.Konwencjonalna metoda kolejnych elucji zaad¬ sorbowanych protein z zywicy jest stosowanie bu¬ foru o stezeniu jonowym stopniowo wzrastajacym od okolo ponizej 0,01 m do powyzej 0,03 m. Przy 60 zastosowaniu DEAE-celulozy zasadnicza ilosc nie- pozadanycli protein eluuje sie przy stezeniu jono¬ wym nie mniejszym niz 0,02 m. Orgoteine eluuje sie buforem o stezeniu 0,02—0,03 m, a ipozostale niepozadane proteiny eluuje sie przy wyzszym ste- 65 zeniu jonoiwytm. Na ogól, 'Stosuje sie koncowe steze-85286 9 .10 nie janowe, co najmniej okolo 0,1 m do okolo 2 m, w celu umozliwienia, zapewnienia oczyszcza¬ nia kolumny tak, aby mogla byc zregenerowana do ponownego uzycia.Zamiast stopniowego wzrostu krzywej stezenia jonowego mozna zastosowac etapowy wzroist na przyklad okolo 0,001—0,005 m w celu eluowania latwo eluujaeych sie 'zanieczyszczen protein, okolo 0,02—0,03 m w celu oczyszczenia kolumny z po- * zoistalych zanieczyszczen protein.Niezaleznie od tego, czy zywica jest eluowana bu¬ forem o stezeniu jonowym wzrastajacym w spo¬ sób ciagly, czy w sposób etapowy, w celu otrzy¬ mania orgoteiny o wysokiej czystosci, wazne jest, aby zastosowac wysoko selektywny rozpuszczalnik.W ten sposób, do pewnego stopnia, calkowita wy¬ dajnosc musi byc wywazana w stosunku do czy¬ stosci koncowej. Jednakze, jezeli zastosuje sie roz¬ puszczalnik optymalnie dobrany, otrzymuje sie na ogól czysta orgoteine z duza wydajnoscia. Podsta¬ wowym aspektem wynalazku jest dokladne okre¬ slenie momentu, w którym nalezy pobrac frakcje orgoteiny.Rozmieszczenie frakcji eluatu, zawierajacej na ogól czysta orgoteine, moze byc oznaczone przez pomiar zawartosci metalu dwuwartosciowego, a tak¬ ze jednej z absorbancji 280 mm i 265 mm eluan- ta, w sposób ciagly lub w czestych regularnych odstepach. Poniewaz zazwyczaj eluant nie zawie¬ ra znacznych ilosci jonów metali dwuwartoscio^ wych, eGiucja orgoteiny moze byc wykrywana przez znaczny wzrost zawartosci metalu dwuwartoscio¬ wego w eluacie. Poniewaz orgoteina zazwyczaj wy¬ stepuje w postaci naturalnej jako mieszany Cu-Zn zwiazek chelatowy, pomiar zawartosci miedzi lub zwlaszcza obu miedzi i cynku okazal sie dokladna metoda wykrywania orgoteiny w eluacie.W celu otrzymania rozpuszczalnika, zawierajacego orgoteine o najwyzszej czystosci, mierzy sie rów¬ niez absorbancje eluatu A280 i A265. We frakcji eluatu, zawierajacej podstawowa zawartosc Cu i Zn, za poczatek rozpuszczalnika orgoteiny uwaza sie moment, gdy jako subtsancje poczatkowa wpro¬ wadza sie rozpuszczalne proteiny z tkanki zwie¬ rzecej, az do momentu, gdy wzrostowi zawartosci Cu i Zn towarzyszy kropla o absorbancji w 265 i 280 mm. Tylko jeden ze skladników Cu i Zn i jedna z absorbancji 265 i 280 mm nalezy uwzgled¬ nic w celu oznaczenia tych punktów. Jednakze przede wszystkim oznacza sie wszystkie cztery wartosci. Gdy uwzglednia sie obie absorbancje 265 i 280, poczatek frakcji orgoiteiny mozna ozna¬ czyc ze stosunku A265/A280, a mianowicie za frak¬ cje orgoteiny przyjmuje sie moment, w którym sto¬ sunek ten osiaga maksimum na przyklad jest bli¬ ski lub wiekszy od jednosci. Za koniec frakcji or¬ goteiny przyjmuje sie moment, w którym stosunek A265/A280 ponownie zmniejsza sie, wykazujac wzrost protein nie bedacych orgoteina.W przypadku protein rozpuszczalnych, pochodza¬ cych z komórek czerwonych cialek krwi, we frak¬ cji eluatu, zawierajacej podstawowa ilosc Cu i Zn, za poczatek frakcji przyjmuje sie moment, w któ¬ rym stosunek A265/A28O osiaga maximum, naprzy- klad jest bliski lub wiekszy od jednosci. Za ko¬ niec frakcji orgoteiny przyjmuje sie moment w którym zmniejsza sie zawartosc, a stosunek A265/ A/280 ponownie spada, dowodzac tym wzrostu pro¬ tein, nie bedacych orgoteina.Odpowiednia metoda do natychmiastowego ozna¬ czania zawartosci metali dwuwartosciowych jest atomowa absorbcja spektrofotometryczna. Apara¬ tem stosowanym do równoczesnego oznaczania mie¬ dzi i cynku jest model 353 Instrument Laborato¬ ries, Inc, Lexington, Mass.Absorbancje A265 i A28O mozna oznaczac w spo¬ sób ciagly lub przerywany - w zwykly sposób lub rejestrowany bezposrednio w spektrofotometrze róznicowym.Krzywe wykreslajace zawartosc miedzi i cynku oraz absorbancje A265 A280 eluatu chromatograficz¬ nego wymieniacza jonowego na przyklad, jak opi¬ sano w przykladzie II, przeprowadzajac pomiar dla kazdej podwielokrotnej eluatu, wykazuja gwaltow¬ nie wzrastajaca zawartosc Cu i Zn wtedy, gdy ste¬ zenie molowe eluatu osiaga wartosc okolo 0,018 m.Po osiagnieciu piku przy stezeniu okolo 0,022— —0,025 m zawartosc ta gwaltownie spada. Absor¬ bancje A265 i A280 wykazuja ostry wzrost zawar¬ tosci protein, nie bedacych orgoteina, przy steze¬ niu 0,022 m, a spadek stosunku A265/A280. Nastepu¬ je to przez stopniowy wzrost absorbancji do okolo 0,04 m. Krzywe zawartosci Cu i Zn oraz absorban¬ cje A265 i A280 eluatu chromatograficznego wymie¬ niacza jonowego opisano w przykladzie IV ^za po¬ moca pomiarów, przeprowadzonych dla kazdej pod- wielokrotnej eluatu, wykazujac gwaltowny wzrost zawartosci Cu i Zn, gdy stezenie molowe eluatu osiaga wartosc okolo 0,02 m. Po osiagnieciu piku przy stezeniu okolo 0,02 m zawartosc ta gwaltow¬ nie maleje. Absorbancje A280 i A265 wykazuja ostry wzroist, parzy stezeniu 0,025 m o stosunku A265/A280 osiagajacym lub bliskim maksimum. Po czym na¬ stepuje stopniowy spadek absorbancji, a nastepnie ponowny wzrost przy stezeniu okolo 0,034 m.Czysta orgoteine mozna wytwarzac przez obrób¬ ke cieplna orgoteiny wstepnie oczyszczonej na DEAE-celulozie, jak opisano w opisie patentowym St. Zjedn. Amer. nr 3579494. Drugie oczyszczanie mozna przeprowadzic chromatograficznie na wy¬ mieniaczu jonowym, jak opisano powyzej.Wedlug innego wariantu, mozna zastosowac du¬ za, na przyklad 0,5—5 ml/ml wypelniona czerwo¬ nymi komórkami, szybkoprzeplywowa kolumna, od¬ dzielajaca hemoglobine do rozpuszczalnych protein, uzyskanych przez lize i dialize z wolnych od plazmy komórek czerwonych cialek krwi; kolumne oczysz¬ cza sie od hemoglobiny buforem o niskim stezeniu jonowym na przyklad 0,005 m fosforanem po kaz¬ dej partii rozpuszczalnych protein, uzyskanych z komórek czerwonych cialek krwi. Proces ten pro¬ wadzi sie az do momentu, gdy slady orgoteiny (wy¬ krywane przez pojawienie aktywnosci dismutazy do tworzenia nadtlenku i/lub wzrostu zawartosci Cu i Zn) wystepuja w eluacie. Orgoteine mozna selektywnie eluowac lub oddzielic od wolnej hemo¬ globiny, na kolumnie, napelnionej orgoteina, za po¬ moca stezonego buforu na przyklad o stezeniu 0,02—0,04 m. Jesli orgoteine usuwa sie z kolumny, usunieta orgoteine mozna nastepnie uwolnic od an- 40 45 50 55 6085 286 ii 12 hydrazy weglowej i innych zanieczyszczen za po¬ moca opisanego tu ogrzewania. Po usunieciu wy¬ traconych protein i dializie przeprowadzonej przy stezeniu jonowym ponizej 0,01 m, ewentualnie mo¬ zna orgoteine oczyszczac dalej na mniejszej, na przyklad 0,05—0,5 ml/mg orgoteiny, drugiej kolum¬ nie, wypelnionej DEAE-celuloza jako wypelnia¬ czem jonowym, jak opisano w przykladzie IV.Wedlug innego wariantu, komórki czerwonych cialek krwi po procesie lizy i dializy, zlewa sie z DEAE-celulozowa zywica jonowymienna okolo 0,25^1 cbj./obj. zywicy, sizlam odsacza sie albo od¬ wirowuje i przemywa, az do wymycia hemoglobi¬ ny. Zywice wolna od hemoglobiny zlewa sie i prze¬ mywa buforem o minimalnym stezeniu jonowym na przyklad 0,005 m fosforanem, doprowadzajac stezenie molowe do 0,04 m za pomoca NaCl, w celu ponownego rozpuszczenia orgoteiny w buforze.Zywice mozna oczyscic od pozostalych zaadsor- bowanych protein za pomoca buforu o wysokim stezeniu jonowym na przyklad 0,1 m i nastepnie zregenerowac i doprowadzic do stanu równowagi w sposób tu opisany. 'Orgoteine i inne rozpuszczal¬ ne proteiny mozna wtedy adsorbowac i selektyw¬ nie eluowac na kolumnie o mniejszej ilosci DEAE- -celulozy na przyklad 0,1—0,25 ml/ml, jak opisano powyzej, i/lub poddac obróbce cieplnej, lub obróbce enzymami proteolitycznymi.Wedlug innego-wariantu opisanego powyzej pro¬ cesu izolacji orgoteiny z tkanek zwierzecych, ko¬ lumne, która zostala uwolniona ze wszystkich pro¬ tein, które moga byc z niej usuniete za pomoca eluanta o stezeniu jonowym ponizej okolo 0,01 m, uwalnia sie z wiekszosci lub wszystkich pozosta¬ lych protein nieorgoteinowych, zaadsorbowanych w niej, przez ogrzewanie kolumny do 65—70°C w ciagu 5—20 minut, i na przyklad przepuszczanie ogrzanego buforu fosforanowego o stezeniu 0,005 m.Orgoteina moze byc izolowana z eluatu w zwyk¬ ly sposób na przyklad przez liofilizacje, zwlaszcza po dializie wobec wody dejonizowanej w celu usu¬ niecia jenów buforowych.Orgoteina, izolowana sposobem wedlug wyna¬ lazku, jest wysokiej jakosci i moze byc wstrzyki¬ wana bez ubocznych reakcji ilummunologicznych.Jak podano w opisach patentowych St. Zjedn.Amer. nr 3579495, belgijskim nr 687828 i brytyj¬ skim nr 1160151, orgoteina jest stosowana miedzy innymi jako srodek przeciwzapalny. Tak izolowa¬ na orgoteina moze, jakkolwiek zawiera sladowe ilosci obcych protein, które nie daja natychmiasto¬ wej reakcji immunologicznej, posiadajac poten¬ cjalna mozliwosc wywolania jej w ciagu dlugiego okresu 'dzialania pozajelitowego.Sladowe ilosci protein moga byc usuniete wie¬ loma sposobami. Jednym z tych sposobów jest sa¬ czenie przez zel przy zastosowaniu mikroporowatej zywicy na przyklad Sephadex C-75 (zywica de¬ kstranowa sieciowana epichlorohydryna, Pharma¬ cia, Szwecja). Sephadex specznia sie, oczyszcza i przemywa typowa technika, opisana w literaturze producenta. Wypelniona kolumne doprowadza sie do równowagi za pomoca buforu 0,05 m tris-HCl o pH — 7,5, 0,15 ni KO, 0,005 m glicyny, 10_4- mCu+f, 10_5Zn++ i nastawia szybkosc przeplywu na okolo 2,0 mlcm2/godz. Dodatek 5—106/o dekstro- zy lub sacharozy do roztworu polepsza jednolitosc stosowania, co w konsekwencji polepsza rozwiaza¬ nie. Po uzyciu kolumny, kolumne rozwija sie do- datkowym roztworem buforu. Poszczególne frakcje zbiera sie. Pojawienie sie piku oznacza sie za po¬ moca pomiairu absorfocji gdziekolwiek od 200 do 28 mm.Ultra-czysta orgoteine mozna równiez wytwarzac przez izolacje orgoteiny z DEAE-celulozy za po¬ moca dalszej obróbki cieplnej czesci eluatu, zawie¬ rajacego orgoteine, Cu++ i Zn++ na przyklad w temperaturze 65—75°C w ciagu 15 minut przy wartosci pH = 5,8, a nastepnie odwirowania i dia- lizy; za pomoca drugiego chromatograficznego oczyszczenia na DEAE-celulozowym wymieniaczu jonowym; lub przez traktowanie enzymami proteo¬ litycznymi, w sposób, jak opisano powyzej.Nastepujace przyklady ilustruja szczególowo spo- sób wedlug wynalazku nie ograniczajac jego za¬ kresu.Przyklad I. Wytwarzania orgoteiny z watro¬ by wolowej. Z pokrajanej watroby wolowej (212'g) na paski o szerokosci 2 cm, usuwa sie tkanki lacz- ne i naczynia krwionosne, przemywa 0,025 m bu. forem tris-HCl, stosujac 3,8 ml/g watroby w celu usuniecia krwi i homogenizuje przy maksymalnej szybkosci szybkoobrotowego mieszalnika przy war¬ tosci pH = 7,5 w 0,3 m sacharozie i 0,005 m KC1.Odwirowuje sie (20 000 G; 0°C, 60 minut); oddziela po odwirowaniu; supernatant poddaje dializie do 0,005 m fosforanu przy wartosci pH — 6,0; ponow¬ nie odwirowuje sie i przesacza przez filtr mikro- porowaty (Versapore) w celu otrzymania klarow- nego roztworu.Przesacz wprowadza sie bezposrednio na kolumne wymieniacza jonowego-dwuetyloaminoetylo-celulozy (okolo 40 g; 2,5 cm X 40 cm) (wlókna DE-83 W&R 3alston, Ltd Hardstone, Kent England). Kolumne 40 przemywa (szybkosc przeplywu 200 ml/godz.) 1 lit¬ rem bufoiru fosforanowego (0,005, pH = 6,0), a na¬ stepnie 4 litrami tego samego buforu, zawierajace¬ go NaCl w ilosci stale wzrastajacej w ograniczo¬ nym stopniu od 0 do 7,5 X 10-2 m; szybkosc prze- 45 plywu 200 ml/godzine. Pomiar absorbancji eluatu A265 i A28O i ciagla kontrola zawartosci Cu i Zn za pomoca spektrofotometrycznej absorpcji atomowej.(Instrumentation Laboratories, Inc. Lexington, Mass, Model 353). 1 litr zebranego eluatu nie zawiera 50 NaCl, a 750 ml eluatu zawiera stopniowo wzrasta¬ jaca ilosc NaCl lub KC1 do momentu, w którym stezenie molowe stopniowo osiagnie wartosc okolo 0,018 m, wartosci absorpcji A265 i A28O spadna do wartosci niskich, a zawartosc Cu i zn wzrosnie rap- 55 townie. Eluat, który nastepnie zbiera sie do mo¬ mentu, w którym zawartosc Cu spada do mini¬ mum, a stezenie molowe osiaga wartosc okolo 2,8 X X 10-2 (550 ml eluatu) zawiera 240 mg orgoteiny o duzej czystosci. Im wezsza frakcja wezmie sie 60 z partii eluatu, tym wyzsza czystosc izolowanej orgoteiny uzyska sie i tym nizsza wydajnosc.Orgoteine o najwyzszej czystosci zawiera eluat o iSitezeniu jonowym okolo 0,022 m (w 950 ml cale¬ go eluatu). W tym momencie obie krzywe absorp- 65 cji Cu i Zn wykazuja piki. Dialize frakcji 750—85 286 13 14 1500 ml eluatu wobec wody prowadzi sie do osiag¬ niecia przewodnictwa 0,04 l/^ohm, przesacza sie przez mokroiporowaty filtr (Millipare 0,22 \i) i pod¬ daje sterylnej liofilizacji, zwlaszcza po zmieszaniu z dkolo dwukrotna wagowo iloscia sacharozy w 5 przeliczeniu na orgoteine. Produkt izoluje sie, otrzymujac pelno aktywna, nie wywolujaca two¬ rzenia przeciwcial, nadajaca sie do injekcji orgo¬ teine o jakosci porównywalnej z dotychczas wy¬ twarzana przemyslowo dla celów weterynaryjnych. 10 Jesli trzeba, przemywanie kolumny w celu usu¬ niecia niezaadsorbowanych i trudno adsorbujacych sie protein mozna przeprowadzic przed elucja or- goteiny przy stalym stezeniu jonowym, lub przy wzrastajacym stezeniu jonowym etapowo lub w 15 sposób ciagly, na przyklad eluujac kolumne za po¬ moca roztworu buforu, opisanego powyzej, o steze¬ niu jonowym od okolo 0,012 m do okolo 0,015 m przy A padajacej absorpcji A265 i S280 do minimal¬ nej wartosci i wówczas elucji orgoteiny przy sta- 20 lym .stezeniu jonowym (na przyklad okolo 0,02) lub wzrastajacym etapowo albo ciagle w granicach oko¬ lo 0,018—0,028 m. Kolumne mozna wówczas oczyscic od pozostalych zaadsorbowanych protein przez pod¬ niesienie stezenia jonowego eluanta do okolo 0,1 m 25 lub wyzej.Postepujac wedlug sposobu, opisanego w przy¬ kladzie I, otrzymano porównywalne wyniki przy zastosowaniu DEAE-celulozy i sieciowanej zywicy dekstrowanej, zawierajacej grupy dwuetyloamino- 30 etylawe (DEAE-Saphadex).Postepujac wedlug sposobu, opisanego w przy¬ kladzie I otrzymano porównywalne wyniki, wy¬ chodzac, zwlaszcza z rozpuszczonych protein, wy¬ ekstrahowanych z tkanek wolowego mózgu, nerek, 35 sledziony, pluc, lusek, trzustki, grasicy, trzewi, miesni i tych samych tkanek ze swin, koni, owiec i kurczat.Przyklad II. Wytwarzanie orgoteiny z wa¬ troby wolowej. Postepujac, jak w przykladzie I, *° zastosowano DE-52, mikrogranulowana DEAE-ce- luloze jako zywice jonowymienna. Zastosowanie tej zywicy jest korzystne, poniewaz daje ona ostrzejszy rozdzial orgoteiny od innych protein, ale posiada te wade, ze mniejsza jest szybkosc prze- *& plywu.Spadek elucji dla frakcji orgoteiny jest miedzy 0,020—0,025 m (probówki 85—110 kazda po 10 ml).Wydajnosc 165 mg orgoteiny o duzej czystosci.Przede wszystkim pobiera sie frakcje od 0,020 do w 0,023 m (probówki 85—100) poniewaz wezsza frak¬ cja daje orgoteine o wyzszej czystosci wlasciwie bez straty orgoteiny. Nawet wezsza frakcja na przyklad probówki 88—92 daje niska wydajnosc orgoteiny o czystosci nawet wyzszej. 55 Przyklad III. Wytwarzanie wstepnie oczysz¬ czanej orgoteiny z watroby wolowej.Jesli trzeba, czesc rozpuszczalnych protein wy¬ ekstrahowanych z watroby w sposób, opisany w przykladzie I, mozna poddac frakcjonowanemu w wstepnemu oczyszczaniu siarczanem amonu. War¬ tosc pH supernatantu, otrzymanego po odwirowa¬ niu ekstraktu (^ 1600 ml, ph = 6,5—6,8) dopro¬ wadza sie do 7,5 za pomoca 3 n NH4. Dodaje sie .25 g/100 ml stalego siarczanu amonu w temperatu- ^ rze pokojowej, miesza, doprowadzajac roztwór do 40*/§ nasycenia, utrzymujac wartosc pH = 7,5. Mie¬ sza sie w ciagu nastepnych 30 minut w tempera¬ turze pokojowej, a nastepnie odwirowuje sie obfi¬ ty osad 20 000 G (0°C) w ciagu 1 godz. Superna- tant dekantuje sie i doprowadza pH do wartosci ,0 (4°C) za pomoca 10°/o H2SO4 i nastepnie dodaje 22 g lub 35 g (100 ml stalego (NH^Oi w celu podwyzszenia stopnia nasycenia do «70°/o lub 80%.Odwirowuje sie obfity osad 20 000 G (0°C) w ciagu 1 godziny. Odrzuca sie supernatant, a osad rozpu¬ szcza w minimalnej ilosci wody dejonizowanej (100 ml). Dialize przeprowadza sie do 0,005 m bu¬ foru fosforanowego (pH = 6,0) (~ zmian kazda po 4 litry). Klarowanie nastepuje przez odwirowanie w 20 000 G (0°C). Supernatant doprowadza sie do wartosci pH = 6,0. Roztwór ten mozna nastepnie wprowadzac na kolumne chromatograiczna z DEAE- -celuloza w sposób, opisany w przykladzie I.Kolejne nastepne oczyszczanie orgoteiny. W celu otrzymania orgoteiny ultraczystej stosuje sie zel mikroporowaty, dzialajacy jako sito molekuralne, rozpuszcza liofilizat orgoteiny otrzymany, jak opi¬ sano w przykladzie I. W buforze 0,05 m tris-HCl (pH =' 7,5; 0,15 m KC1 0,005 m glicyny, 0,02°/t azydku sodu, 10-4Cu++, 10-*++, 4°C) przy ste¬ zeniu okolo 70 mg/ml. Klaruje sie przez odwiro¬ wanie i ewentualnie wprowadza sie na kolumne G-75 SephadexN (3,2 X 96 cm, objetosc zloza ^ 775 ml), cechuje sie tym samym buforem, zawiera¬ jacym 10-/lm Cu++ i 10-5m Zn++. Zbiera sie .4 ml frakcji eluatu i mierzy jego absorpcje A265 i A220. Poczawszy o okolo 50 frakcji absorpcje te wzrastaja gwaltownie, az osiagaja pik przy frakcji okolo 68-. Frakcje 66—73 zawieraja wiekszosc orgo¬ teiny ultraczystej. Przy frakcji 98, absorpcje te spadaja do zera, az do frakcji okolo 116. Znaczne zanieczyszczenia wykazuja tylko probówki 118—150.Orgoteine, otrzymana sposobem opisanym w po¬ wyzszych przykladach, mozna oczyszczac dalej przez powtórna chromatografie na zywicy amoni¬ towej.W celu przygotowania kolumny, miesza sie 30 g Whatman DEAE-celulozy-52, mikrogranulowanej (W&H. Balston, Ltd, Hardstone, Kent, Anglia) w 300 ml 0,1 m buforu fosforanowego o pH = 6,0.Nastepnie po odstaniu szlamu, dekantuje superna¬ tant. Dodaje sie 0,01 m buforu fosforanowego o pH = 6,2 i mieszanine energicznie miesza. Pozo¬ stawia sie szlam do odstania, w ciagu 10 minut i dekantuje supernatant. Celuloze przemywa sie buforem pierwotnym podczas, gdy zarówno pH, jalc i przewodnictwo utrzymuja stala wlasciwa, war¬ tosc. Wytwarza sie niewielka próznie nad szlamem w celu usuniecia zaokludowanego powietrza i dwu¬ tlenku wegla. Szlam uzyskany powinien byc na¬ tychmiast uzyty do wypelnienia kolumny. Jezeli zywice pozostawia sie w zetknieciu z buforami lub polielektrolitami w czasie dluzszym, niz jeden ty¬ dzien, nalezy dodac srodków ochronnych na przy¬ klad toluenu.Dopasowuje sie do szklanej kolumny o srednicy 1.5 cm nylonowa siatke i prostopadle do dna za- mocowuje urzadzenie podtrzymujace mikroporowa¬ ty filtr. Napelnia sie kolumne 0,01 m buforem fos-85 286 16 foranu Sodu o pH = 6,2 i wlewa bedaey w stanie równowagi i wzglednie gesty szlam DEAE-celulo- zy (okolo 120—150e/o wyjsciowej objetosci) do ko¬ lumny przez lejek, umieszczony na wierzchu ko¬ lumny. Spust na dnie kolumny pozostaje zamknie- 5 ty, dopóki 1 cm celulozy nie osiadzie na dnie.Wówczas otwiera sie spust dla swobodnego prze¬ plywu. Kolumne napelnia sie do okolo 20 cm, po¬ zostawiajac okolo 20—30 minut na osiadanie. Wol¬ no osiadajacy, drobnoziarnisty szlam usuwa sie ze io szczytu kolumny przez odessanie.. Kolumne dopro¬ wadza sie do stanu równowagi przez przepuszcza¬ nie pierwotnego buforu przez kolumne w ciagu kil¬ ku godzin lub przez cala noc. Sprawdza sie pH i przewodnictwo eluatu, aby zapewnic calkowita 15 równowage pomiedzy wymieniaczem, a buforem.Szybkosc przeplywu reguluje sie za pomoca cisnie¬ nia hydrostatycznego, wytworzonego przez umiesz¬ czenie zródla buforu na wysokosci okolo 40 cm nad wierzcholkiem kolumny, co powinno dawac szyb- 20 kosc przeplywu okolo 30 ml/godzine przez kolum¬ ne o srednicy 1,5 cm, wysokosci 20 cm i objetosci zloza 30 ml.Rozpuszcza sie 100—200 mg wyjsciowej orgoteiny w 2—4 ml wyjsciowego buforu, a otrzymany zie- 25 lonkawy roztwór latwo rozwarstwia sie nad po¬ wierzchnia zloza. Po absorpcji, roztwór orgoteiny ukazuje sie w postaci szerokiego zielonkawego pa¬ sa w poblizu wierzcholka kolumny. Laczy sie ko¬ lumne ze zbiornikiem z buforem i rozpoczyna elu- 30 cje za pomoca 0,01 m buforu fosforanowego o pH = = 6,2. Zbiera sie 5 ml frakcji, stosujac zbieracz frakcji Simplex (B. Braun, Nelsungen, NRF). Pro¬ wadzi sie kolumne w temperaturze pokojowej, a eluat oziebia sie woda z lodem. Pas brazowo-ró- 35 zowy oddziela od strefy próbki po wprowadzeniu buforu eluujacego, który przeplywa szybko ku do¬ lowi i eluuje natychmiast wolna przestrzen, wy¬ magana objetosc buforu 40—50 ml. Po zebraniu frakcji, zawierajacej szybko eluowane zanieczysz- 40 czenia, prowadzi sie elucje 0,01 m buforem fosfora¬ nowym o pH = 6,2 do calkowitej objetosci okolo 300 ml. Po okolo 120 ml zbiera sie eluat, dodatkowe substancje eluuje sie przy mniej wyraznej absor- bancji w 280 m \i. Nie mozna eluowac nastepnych 45 substancji 0,01 m buforem fosforanowym o pH = = 6,2.Elucje orgoteiny prowadzi sie przy wzrastaja¬ cym etapowo lub w sposób ciagly stezeniu jono¬ wym buforu. Nie obeserwuje sie znacznej elucji, 50 gdy stezenie jonowe wzrosnie do okolo 0,015 m.W tym momencie strefa powstajaca u szczytu ko¬ lumny przesuwa sie ku dolowi w postaci jasno zie¬ lonego pasa. Calkowitej elucji dokonuje sie 0,028 m buforem. 55 Frakcja eluatu, zawierajaca orgoteine zbiera sie, poddaje rozleglej dializie i nastepnie liofilizuje.Wedlug innej metody dalszego oczyszczania orgo¬ teiny, do 550 ml niedializowanego eluatu, otrzyma¬ nego wedlug przykladu I, zawierajacego orgoteine 60 (stezenie jonowe 0,018—0,028 m), dodaje sie 5 ml 10_Jn octanu miedzi i 5 ml 10-8n Zn w celu do¬ prowadzenia ich stezenia w eluacie odpowiednio do okolo 10~4 M0-B. Szybko doprowadza sie eluat do temperatury 75°C, która utrzymuje sie w ciagu 55 minut, korzystnie w atmosferze azotu. Oziebia sie <10°C na lazni z lodem, usuwa obfity osad i dializuje wobec, dejonizowanej wody. Stabilizuje sie przez rozpuszczenie 180 mg sacharozy. Steryli¬ zuje sie przez *s.aczenie poprzez filtr mikroporowa- ty do sterylnych ampulek w celu otrzymania ste¬ rylnego roztworu, który mozna liofilizowac w celu otrzymania czystej orgoteiny.Orgoteine, otrzymana sposobem wedlug przykla¬ du I, mozna równiez dalej oczyszczac na kolum¬ nie, wypelnionej karboksymetyloceluloza. Przygo¬ towuje sie kolumne, wypelniona 11 ml CMC i do¬ prowadzana do stanu równowagi za pomoca 0,01 m octanu sodu o pH = 5,3. 40 mg oczyszczonej na DEAE-celulozie, orgoteiny rozpuszcza sie w 0,01 m buforze octanowym o pH = 5,3 i dializuje wobec wielokrotnie zmienianego tego samego buforu. Sub¬ stancje nierozpuszczalne, jesli sa, odwirowuje sie, a klarowny supernatant wprowadza sie na szczyt kolumny z CMC. Szybkosc przeplywu okolo 12 ml/ /godz. Kolumne przemywa sie 30 ml 0,1 octanu o pH = 5,3 w celu usuniecia niezaadsorbowanych protein. Wówczas prowadzi sie elucje octanem sodu o pH = 5,3 i liniowo wzrastajacym stezeniu od 0,01—0,1 m przy calkowitej objetosci 200 ml. Ultra- czysta orgoteine eluuje sie przy stezeniu 0,018— —0,028 m i izoluje sie z eluatu w znany sposób.Przyklad IV. Wytwarzania orgoteiny z wolo¬ wej krwi.Zbiera sie swieza krew wolowa (870 ml) do 3,8°/o cytrynianu sodu (0,5 v/v). Odwirowuje sie przy 4000 obr./min. w temperaturze 0°C. Odrzuca sie plazme i wypelnione czerwone komórki (PRC) przemywa sie trzykrotnie 0,9°/o salina. Wypelnione czerwone komórki poddaje isie isomifikacji w ciagu minut w temperaturze pokojowej (Biosanik III nr 70). Poddaje sie wstepnej dializie wobec wody destylowanej, a nastepnie wobec 0,005 m buforu fosforanowego o pH = 6,0 w ciagu 24 godzin przy temperaturze 4°C (4-krotna wymiana, kazda po 4 litry); wzrost objetosci okolo 110%.Wprowadza sie dializowany ekstrakt na kolumne (2,5 X 30 cm; obj. zloza 147 ml) wypelniona DEAE- -celuloza (Fibrouse DEAE-23, Reevetugel) dopro¬ wadzona do stanu równowagi za pomoca buforu fosforanowego o pH = 6,0. Kolumne rozwija sie 0,005 m buforem fosforanowym przy szybkosci przeplywu 240 ml/godz. Wieksza czesc hemoglobi¬ ny pojawia sie w wolnej przestrzeni, pozostalosc usuwa sie dodatkowymi 230 ml (calosc 450 ml).Elucje orgoteiny przeprowadza sie za pomoca 4 lit¬ rów tego samego buforu o stezeniu NaCl, wzra¬ stajacym od 0—0,03 m. Pomiar zawartosci Cu i Zn oraz absorbancji eluatu A265 i A280 opisano powy¬ zej. Ukazuja sie trzy wieksze piki, kazdy o sub¬ telnej strukturze, poczawszy od 575 ml, 750 ml i 1425 ml spadku eluatu. Orgoteina (drugi pik) jest obecna w czesci eluatu, w której stosunek absor¬ bancji A265/A280 wynosi 1,27, a zawartosc Cu i Zn jest maksymalna. W czesci wyplywajacego eluatu 750—1030 ml (0,025—0,035 m) zawarta jest na ogól cala orgoteina o wysokim stopniu czystosci. Wzór elucji pokazany jest na rysunku, na którym wy¬ kreslona jest zawartosc Cu i Zn i absorbancje elu¬ atu A265 i A28O. Jak widac na rysunku, zawartosc85 286 17 18 Cu i Zn zaczyna gwaltownie wzrastac od okolo 60 probówki. Od probówki 70 zaczyna wzrastac absor- bancja A265 i przy okolo 80 probówce przewyzsza absorbancje A280- Ta czesc eluatu zawiera orgo¬ teine najwyzszej czystosci. Zawartosc zanieczysz¬ czen wzrasta nastepnie, na co wskazuje wzrost absorbancji A265 i A2ao, któremu towarzyszy spadek zawartosci Cu i Zn. Zbiera sie zawartosc probó-* wek 70^92 i izoluje z niej orgoteine.Frakcje orgoteiny poddaje sie dializie wobec wo¬ dy dejonizowanej do okolo 0,3—0,45 V\iohm, prze¬ sacza przez filtr o srednicy 0,45 mikrona i lifili- zuje. Otrzymuje sie okolo 52 mg orgoteiny, co sta¬ nowi 0,013% wydajnosci w przeliczeniu na wypel¬ nione czerwone komórki, przy aktywnosci sodazy 2500 jednostek/mg, co stanowi blisko 75°/o calko¬ witej aktywnosci nadtlenku dismutazy, obecnej po¬ czatkowo w lizacie, co zostalo oznaczone przez po¬ laczenia procesów McCord'a i Fridovich'a, JEC 244, 6049 (1969).Kolumne mozna zregenerowac do ponownego uzycia przez przemycie buforem o stezeniu co naj¬ mniej 0,1—2 m, a nastepnie przeplukaniu dejonizo- wana woda.Postepujac, jak opisano w (przykladzie IV, izo¬ luje sie na ogól czysta orgoteine z odpowiednich czerwonych cialek krwi ludzi, królików, szczurów i kurczat.Postepujac, jak opisano w przykladzie IV, otrzy¬ muje sie porównywalne wyniki, stosujac TEAE- -celuloze i sieciowana zywice dekstranowa, zawie¬ rajaca grupy dwuetyloaminowe (DEAE-Sephadex).Przyklad V. Postepuje sie dokladnie, jak w przykladzie IV, z wyjatkiem, ze wolna od hemo¬ globiny kolumne zwalnia sie od% latwo eluujacych sie protein za pomoca 500 ml 0,005 m buforu fos¬ foranowego doprowadzonego NaCl do stezenia 0,02 m. Orgoteine eluuje sie 100 ml tego samego buforu o stezeniu, doprowadzonym za pomoca NaCl do 0,035 m. Pobiera sie frakcje orgoteiny z czesci eluatu, której stosunek absorbancji A265/A280 jest okolo 1 lub wiekszy, a zawartosc Cu i Zn jest ma¬ ksymalna. Kolumne oczyszcza sie 1000 ml tego sa¬ mego buforu, doprowadzonego do stezenia 0,1 m za pomoca NaCl.Przyklad VI. Orgoteina z krwi ludzkiej. Od¬ wirowanie, liza i dializa 2 jednostek pobranej ludz¬ kiej krwi w antykoagulancie ACD (1 jednostka — 450 ml krwi w 67,5 ml ACD; 100 ml ACD zawiera 2,45 g dekstrozy, 0,30 g kwasu cytrynowego, 2,2 g cytrynianu sodu, w przeliczeniu na uwodniony, jak opisano w przykladzie IV.Wprowadza sie dializowany ekstrakt na kolumne (2,5 X 38 cm; obj. zloza 186,2 ml) stosujac taka sama, doprowadzona do stanu równowagi DEAE- -celuloze, jak w przykladzie IV. Kolumne rozwija sie, jak opisano tamze. Orgoteine eluuje sie 6 li¬ trami tego samego 0,005 m buforu fosforanowego o wzrastajacym stezeniu NaCl 0—0,10 m. Pomiar zawartosci Cu i Zn oraz absorbancji eluatu A265 i A280 jak opisano powyzej. Orgoteina wystepuje w pierwszym piku przy stosunku A265/A28O bliskim lub wiekszym od 1,0 i wówczas zawartosc Cu i Zn jest maksymalna. Frakcja eluowana przy spadku stezenia NaCl 0,05—0,06 (probówki 150—170, cal¬ kowita Objetosc okolo 200 ml) zawiera na ogól ca¬ la orgoteine o wysokim stopniu czystosci.Frakcje eluanta orgoteiny dializuje sie wobec wo¬ dy dejonizowanej do okolo 0,3—0,45 l/|iohma; prze- sacza sie przez filtr Q,45 mikrona i liofilizuje.Otrzymuje sie okolo 60 mg orgoteiny (0,0125°/o wy¬ dajnosci w przeliczeniu na wypelnione czerwone komórki).Porównywalne wyniki otrzymuje sie przez roz- wijanie kolumny etapowo 0,005 m buforem fosfo¬ ranowym, zawierajacym okolo 0,015 m NaCl, w ce- krwi królika w 3,8°/o cytrynianie sodu (0,5 v/v). Od- orgoteiny. Buforem zawierajacym okolo 0,03 m NaCl eluuje sie orgoteine, a buforem zawieraja- cym okolo 0,1 m NaCl oczyszcza sie kolumne.Przyklad VII. Stosuje sie 1100 swiezej krwi krwi królika w 3,8% cytrynianie sodu (0,5 v/v). Od¬ wirowuje, poddaje lizie i dializie, jak opisano w przykladzie IV (objetosc wzrasta ~100%).Wprowadza sie dializowany ekstrakt na kolumne (2,5 X 41 cm, objetosc zloza 201 ml) i stosuje te sama DEAE-celuloze, jak w przykladzie IV. Ko¬ lumne rozwija sie, jak opisano uprzednio. Wiek¬ szosc hemoglobiny pojawia sie w wolnej przestrze- ni, a pozostalosc usuwa sie dodatkowymi 500 ml (calosc 650 ml). Orgoteine eluuje sie 3 litrami tego samego 0,005 m buforu fosforanowego, zawieraja¬ cego NaCl o wzrastajacym stezeniu 0—0,08 m. Po¬ miar zawartosci Cu i Zn oraz absorbancji eluatu A265 i A28O, jak wyzej. Orgoteina wystepuje w pierwszym piku przy stosunku A265/A28O bliskim lub wiekszym od 1, a Cu++ i Z++ sa w maksimum absorbancji. Frakcje eluuje sie przy spadajacym stezeniu NaCl 0,020—0,030 m (probówki 60—90, cal- kowita objetosc 240 ml) zawiera ona na ogól calo orgoteine o wysokiej czystosci.Przeprowadza sie dialize frakcji orgoteiny wobec wody dejonizowanej do okolo 0,3—0,45 l/^ohma, saczy przez filtr o 0,45 mikronach i liofilizuje. 40 Otrzymuje sie okolo 45 mg orgoteiny (0,01%) w przeliczeniu na wypelnione czerwone komórki. Do¬ datkowo orgoteine o mniejszej czystosci zawieraja sasiednie partie eluatu.Porównywalne wyniki otrzymuje sie przy etapo- 45 wym rozwijaniu kolumny 0,005 m buforem fosfo¬ ranowym, zawierajacym NaCl o stezeniu 0,015 m, w celu eluowania protein eluujacych sie szybciej od orgoteiny, buforem zawierajacym NaCl o ste¬ zeniu 0,02 m eluuje sie orgoteine, a buforem z NaCl 50 o stezeniu 0,1 m oczyszcza sie kolumne. Koncowe oczyszczanie orgoteiny. Orgoteine, otrzymana we¬ dlug opisanych powyzej przykladów, mozna oczysz¬ czac dalej za pomoca isit molekularnych, zel/u chro¬ matograficznego ma kolumnie (3,2X88 cm; calkowi- 55 ta objetosc zloza 711,5 ml, pusta objetosc '265,5 ml) Sephadex G-75 Superfine (Pharmacia, Szwecja) z zywica dekstranowana sieciowana epichlorohy- dryna, zbierajac eluat w 5,4 ml frakcjach i mierzac ich absorpcje A265 i A2so. Poczawszy od okolo 60 frakcji 50, absorpcja ta wzrasta gwaltownie i osia¬ ga pik okolo frakcji 63. Frakcje 66—73 zawieraja wieksza ,czesc calej orgoteiny w stanie ultraczy- stym. Po*frakcji 98, absorpcje te spadaja do 0 az do frakcji okolo 116. Jedynie znaczne zanieczysz- 65 czenie wykaiauja probówki 118—150.19 85 286 Orgoteine, otrzymana wedlug przykladu IV mo¬ zna oczyszczac dalej na kolumnie, wypelnionej kar- boksymetyloceluloza CMC. Przygotowuje sie 11 ml wypelniacza CMC doprowadza do stanu równowagi 0,01 m octanem sodu o pH = 5,3 40 mg orgoteiny oczyszczonej na powyzszej celulozie rozpuszcza sie w 0,01 m buforze octanowym o pH = 5,3 i diali¬ zuje wobec wielokrotnie zmienianego tego samego buforu. Substancje nierozpuszczalne, jesli sa, od¬ wirowuje sie i klarowny supernatant wprowadza sie na szczyt kolumny CMC. Szybkosc przeplywu okolo 12 ml/godz. Kolumne przemywa sie 30 ml 0,01 m octanu o pH = 5,3, w celu eluowania nie- zaadsorbowanych protein. Nastepnie kontynuuje sie elucje przy liniowym spadku stezenia od 0,01—0,1 m octanu sodu o pH = 5,3, w calkowitej objetosci 200 ml. Ultra czysta orgoteine eluuje sie przy ste¬ zeniu 0,018—0,028 m i izoluje z eluatu w sposób opisany powyzej. PL