JP2693786B2 - 耐熱性のリポプロテインリパーゼとその製造法及びそれを用いた定量用試薬 - Google Patents
耐熱性のリポプロテインリパーゼとその製造法及びそれを用いた定量用試薬Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，熱安定性に優れ，かつグリセロール生成活
性の割合が高い性質を有するリポプロテインリパーゼと
その製造法及びそれを用いたトリグリセリド定量用試薬
に関するものである。
性の割合が高い性質を有するリポプロテインリパーゼと
その製造法及びそれを用いたトリグリセリド定量用試薬
に関するものである。
（従来の技術） リポプロテインリパーゼ（以下LPLという）は,1943年
Hahnによる赤血球循環量の研究において食餌性脂血症の
イヌにヘパリンを注射すると，血液の濁りが減少したこ
とからクリアリング フアクター（Clearing factor）
としてその存在が指摘された。その後そのメカニズムが
血液中のリポプロテインのグリセリドの水解によるもの
であることが明らかとなって以来，各種動物組織中から
検出され，動物体内の脂質代謝において重要な役割を果
たしている酵素であることが知られている。1966年，有
馬らにより，微生物にも動物由来のLPLと類似の酵素が
存在していることが報告され〔アグリカルチユラルアン
ドバイオロジカルケミストリー（Agr.Biol.Chem.）30,5
15（1966）〕，微生物LPLと称されるに至った。この微
生物LPLは，大量生産が可能であることから，その利用
研究が盛んで，特に血液の生化学的検査項目の一つであ
る血中トリグリセリドの定量用として開発されている。
Hahnによる赤血球循環量の研究において食餌性脂血症の
イヌにヘパリンを注射すると，血液の濁りが減少したこ
とからクリアリング フアクター（Clearing factor）
としてその存在が指摘された。その後そのメカニズムが
血液中のリポプロテインのグリセリドの水解によるもの
であることが明らかとなって以来，各種動物組織中から
検出され，動物体内の脂質代謝において重要な役割を果
たしている酵素であることが知られている。1966年，有
馬らにより，微生物にも動物由来のLPLと類似の酵素が
存在していることが報告され〔アグリカルチユラルアン
ドバイオロジカルケミストリー（Agr.Biol.Chem.）30,5
15（1966）〕，微生物LPLと称されるに至った。この微
生物LPLは，大量生産が可能であることから，その利用
研究が盛んで，特に血液の生化学的検査項目の一つであ
る血中トリグリセリドの定量用として開発されている。
従来,LPLを生産する微生物は，シュードモナス属，ム
コール属，ストレプトミセス属，セラチア属，エアロモ
ナス属，バチルス属〔アグリカルチユラルアンドバイオ
ロジカルケミストリー（Agr.Biol.Chem.），31,924、
（1967）、特公昭41−7836号公報，特公昭58−37835号
公報参照。〕，リゾプス属〔アグリカルチユラルアンド
バイオロジカルケミストリー（Agr.Biol.Chem.），43,2
125,（1979），特公昭58−37834号公報参照。〕等広い
属にわたっており，シユードモナス属，ムコール属及び
リゾプス属については，精製の後，諸性質が明らかにさ
れている。しかしながら，これらの全ては，常温性微生
物であり，生産されたLPLも当然ながら安定性に優れな
いものであった。
コール属，ストレプトミセス属，セラチア属，エアロモ
ナス属，バチルス属〔アグリカルチユラルアンドバイオ
ロジカルケミストリー（Agr.Biol.Chem.），31,924、
（1967）、特公昭41−7836号公報，特公昭58−37835号
公報参照。〕，リゾプス属〔アグリカルチユラルアンド
バイオロジカルケミストリー（Agr.Biol.Chem.），43,2
125,（1979），特公昭58−37834号公報参照。〕等広い
属にわたっており，シユードモナス属，ムコール属及び
リゾプス属については，精製の後，諸性質が明らかにさ
れている。しかしながら，これらの全ては，常温性微生
物であり，生産されたLPLも当然ながら安定性に優れな
いものであった。
一方,LPLを含むリパーゼ類は，基質であるトリグリセ
リド中の３つのエステル結合に対し特異性を示すことが
今までに明らかになっている。LPLを血中トリグリセリ
ドの定量に利用する場合，生成したグリセロールを他の
共役酵素により検出系に導く方が望ましく，したがっ
て，トリグリセリド量に対応したグリセロールを生成さ
す為には,3つのエステル結合を選択性なく加水分解する
酵素が好ましい。LPLの位置特異性に関しては，グリセ
ロール生成活性の脂肪酸生成活性に対する割合として表
わした場合シユードモナス属のもので1.97％という低い
値が現在まで報告されている中で最高値である（特開昭
59−187780号公報参照）。
リド中の３つのエステル結合に対し特異性を示すことが
今までに明らかになっている。LPLを血中トリグリセリ
ドの定量に利用する場合，生成したグリセロールを他の
共役酵素により検出系に導く方が望ましく，したがっ
て，トリグリセリド量に対応したグリセロールを生成さ
す為には,3つのエステル結合を選択性なく加水分解する
酵素が好ましい。LPLの位置特異性に関しては，グリセ
ロール生成活性の脂肪酸生成活性に対する割合として表
わした場合シユードモナス属のもので1.97％という低い
値が現在まで報告されている中で最高値である（特開昭
59−187780号公報参照）。
（発明が解決しようとする課題） 近年，診断用検査薬として酵素法の占める割合は増加
する一方であるが，酵素を用いた場合酵素が蛋白質であ
ることに由来する失活現象は避けがたい問題で，試薬自
体の安定性を大きく左右する重要な問題である。
する一方であるが，酵素を用いた場合酵素が蛋白質であ
ることに由来する失活現象は避けがたい問題で，試薬自
体の安定性を大きく左右する重要な問題である。
最近，このような問題を解決する為に好熱性細菌由来
の耐熱性酵素を組込んだ診断用検査薬が開発され，試薬
の不安定性の問題は飛躍的に改善されている。
の耐熱性酵素を組込んだ診断用検査薬が開発され，試薬
の不安定性の問題は飛躍的に改善されている。
しかしながら,LPLにおいては，前記したとおりその起
源を問わず耐熱性であるものはなく，試薬の安定性を改
善する為に耐熱性のLPLが強く望まれていた。
源を問わず耐熱性であるものはなく，試薬の安定性を改
善する為に耐熱性のLPLが強く望まれていた。
また,LPLを血中トリグリセリドの定量に利用する場合
には，少量の添加量で済み，かつ反応終了までの時間が
短縮できるようなグリセロール生成活性の割合が高いも
のが望まれているが，これも前記したとおり低いものし
か知られていない。
には，少量の添加量で済み，かつ反応終了までの時間が
短縮できるようなグリセロール生成活性の割合が高いも
のが望まれているが，これも前記したとおり低いものし
か知られていない。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは，耐熱性で，かつグリセロール生成活性
の割合が高い微生物LPLを求めて鋭意研究した結果，静
岡県伊豆熱川温泉の土壌より分離した好熱性放線菌に属
するストレプトミセス（Streptomyces）7825〔微工研菌
寄第9983号（FERM P−9983）〕が，上記の性質を有する
LPLを生産することを見出し，本発明を完成するに至っ
た。
の割合が高い微生物LPLを求めて鋭意研究した結果，静
岡県伊豆熱川温泉の土壌より分離した好熱性放線菌に属
するストレプトミセス（Streptomyces）7825〔微工研菌
寄第9983号（FERM P−9983）〕が，上記の性質を有する
LPLを生産することを見出し，本発明を完成するに至っ
た。
すなわち，本発明は，以下の理化学的性質を有する耐
熱性のLPL並びに好熱性放線菌を培養し，培養物から耐
熱性のLPLを採取することを特徴とする耐熱性のLPLの製
造法及びLPLを含有する体液中のトリグリセリドを定量
するトリグリセリド定量用試薬において,LPLが請求項１
記載のLPLであることを特徴とするトリグリセリド定量
用試薬を要旨とするものである。
熱性のLPL並びに好熱性放線菌を培養し，培養物から耐
熱性のLPLを採取することを特徴とする耐熱性のLPLの製
造法及びLPLを含有する体液中のトリグリセリドを定量
するトリグリセリド定量用試薬において,LPLが請求項１
記載のLPLであることを特徴とするトリグリセリド定量
用試薬を要旨とするものである。
（イ）作 用 リポプロテイン中のトリグリセリドに作用し，グリセ
ロールと脂肪酸に加水分解する。
ロールと脂肪酸に加水分解する。
（ロ）耐熱性（熱安定性） 約60℃の緩衝液中で約15分間処理したのちの活性が処
理前の活性の約100％の値を保持している。
理前の活性の約100％の値を保持している。
（ハ）グリセロール生成活性の割合 グリセロール生成活性の割合が脂肪酸生成活性に対し
て少なくとも約15％有する。
て少なくとも約15％有する。
（ニ）基質特異性 オリーブ油に対する活性を100としたときのトリラウ
リンに対する相対活性は234であり，トリカプリンに対
する相対活性は153である。
リンに対する相対活性は234であり，トリカプリンに対
する相対活性は153である。
（ホ）至適pH及び安定pH範囲 8.0〜9.0に至適pHを有し,pH4.0〜7.0で安定である（6
0℃,30分処理）。
0℃,30分処理）。
（ヘ）作用適温の範囲 50〜60℃である。
（ト）分子量 ３万〜５万（ゲル濾過法）。
本発明のLPLは，約60℃の緩衝液中で約15分間処理し
たのちの活性が処理前の活性の約100％の値を保持して
いるという優秀な性質を有している。このときの緩衝液
の濃度及びpHは，特に限定されないが，一般には濃度は
5mMないし500mMであり,pHは４ないし７である。特に本
発明においては，酢酸緩衝液（pH5.0）を用いることが
好ましい。
たのちの活性が処理前の活性の約100％の値を保持して
いるという優秀な性質を有している。このときの緩衝液
の濃度及びpHは，特に限定されないが，一般には濃度は
5mMないし500mMであり,pHは４ないし７である。特に本
発明においては，酢酸緩衝液（pH5.0）を用いることが
好ましい。
本発明のLPLの理化学的性質は次のとおりであるが，
これはストレプトミセス（Streptomyces）7825（微工研
菌寄第9983号）から得られた理化学的性質である。
これはストレプトミセス（Streptomyces）7825（微工研
菌寄第9983号）から得られた理化学的性質である。
（ａ）作用：リポプロテインのトリグリセリドに作用
し，グリセロールと脂肪酸に加水分解する。リポプロテ
インとしては，人工リポプロテインに限らず，ヒト由来
の天然血中リポプロテインも含まれる。
し，グリセロールと脂肪酸に加水分解する。リポプロテ
インとしては，人工リポプロテインに限らず，ヒト由来
の天然血中リポプロテインも含まれる。
（ｂ）基質特異性：表−１に示すような各種トリグリセ
リドに対して以下のような活性を有する。
リドに対して以下のような活性を有する。
（ｃ）至適pH:第１図に示すとおり8.0〜9.0である。
安定pH:第２図に示すとおり4.0〜7.0（60℃,30分
処理）である。
処理）である。
（ｄ）作用適温：第３図に示すとおり50〜60℃である。
（ｅ）耐熱性：第４図に示すとおり約60℃の緩衝液中で
約15分間処理したのちの活性が処理前の活性の約100％
の値を保持している。
約15分間処理したのちの活性が処理前の活性の約100％
の値を保持している。
（ｆ）阻害:Zn 2+,Fe 3+,Mg 2+（各1mM）で30〜40％阻害，
またNaCl（3M）の存在下で約40％，デオキシコール酸
（10mM）の存在下で約40％，プロタミン硫酸（400μg/m
l）存在下で約30％阻害される。
またNaCl（3M）の存在下で約40％，デオキシコール酸
（10mM）の存在下で約40％，プロタミン硫酸（400μg/m
l）存在下で約30％阻害される。
（ｇ）分子量:3万〜５万（ゲル濾過法）。
（ｈ）力価の測定法：測定原理は，オリーブ油で調製し
た人工リポプロテインを基質としてこれに酵素を作用さ
せ，生成するグリセロールを定量するものである〔クリ
ニカ・キミカ・アセタ（Clin.Chim.Acta）22,393（196
8）参照。〕。
た人工リポプロテインを基質としてこれに酵素を作用さ
せ，生成するグリセロールを定量するものである〔クリ
ニカ・キミカ・アセタ（Clin.Chim.Acta）22,393（196
8）参照。〕。
基質：オリーブ油5gと５％（V/V）トリトンＸ−100溶液
5mlとの混合液を10分間超音波処理し，エマルジヨンと
する。
5mlとの混合液を10分間超音波処理し，エマルジヨンと
する。
メタ過ヨウ素酸溶液:25mMメタ過ヨウ素酸12mlとイソプ
ロパノール20mlとを混合し,IN酢酸で全量を100mlとす
る。
ロパノール20mlとを混合し,IN酢酸で全量を100mlとす
る。
アセチルアセトン溶液:2.4−ペンタンジオン0.75mlとイ
ソプロパノール2.5mlとを混合し,2M酢酸アンモニウムで
全量を100mlとする。
ソプロパノール2.5mlとを混合し,2M酢酸アンモニウムで
全量を100mlとする。
上記基質70μと0.5Mグリシンバッファー（pH8.5）2
0μと10％BSA50μと水55μとを試験管にとり,37
℃で予備加温する。酵素溶液（約10U/mlに調製）５μ
を添加し,37℃で10分間反応させる。反応終了後，沸騰
水中に10分間浸し，反応を停止させ，放冷後イソプロパ
ノール400μを添加し，よく撹拌する。遠心後，上清1
00μにイソプロパノール2mlを加え，これにメタ過ヨ
ウ素酸溶液1mlとアセチルアセトン溶液0.5mlとを混合
し,50℃で30分間反応させた後,405nmにおける吸光度を
測定する。盲検は，酵素溶液無添加のものについて同様
に処理して得られた値とする。
0μと10％BSA50μと水55μとを試験管にとり,37
℃で予備加温する。酵素溶液（約10U/mlに調製）５μ
を添加し,37℃で10分間反応させる。反応終了後，沸騰
水中に10分間浸し，反応を停止させ，放冷後イソプロパ
ノール400μを添加し，よく撹拌する。遠心後，上清1
00μにイソプロパノール2mlを加え，これにメタ過ヨ
ウ素酸溶液1mlとアセチルアセトン溶液0.5mlとを混合
し,50℃で30分間反応させた後,405nmにおける吸光度を
測定する。盲検は，酵素溶液無添加のものについて同様
に処理して得られた値とする。
このようにして得られた値から，あらかじめ濃度既知
のグリセロール溶液を用いて求めておいた検量線より反
応液中のグリセロール量を定量する。
のグリセロール溶液を用いて求めておいた検量線より反
応液中のグリセロール量を定量する。
酵素活性の表示は,1分間に１μmolのグリセロールを
生成する酵素量を1Uとする。
生成する酵素量を1Uとする。
（ｉ）グリセロール生成活性の割合 グリセロール生成活性の割合が脂肪酸生成活性に対し
て少なくとも約15％有する。
て少なくとも約15％有する。
通常，活性は上述のようにグリセロール生成活性とし
て表わすが，グリセロール生成活性の脂肪酸生成活性に
対する割合を知る為には，脂肪酸生成活性を求めること
が必要である。脂肪酸生成活性は，上記と同様の操作で
得られたイソプロパノール抽出液について，市販の遊離
脂肪酸測定用キット（例えば，和光純薬製NEFAC−Tes
t）を用いて，生成脂肪酸を定量し,1分間に１μ当量の
脂肪酸を生成する酵素量を脂肪酸生成活性の1Uとした。
て表わすが，グリセロール生成活性の脂肪酸生成活性に
対する割合を知る為には，脂肪酸生成活性を求めること
が必要である。脂肪酸生成活性は，上記と同様の操作で
得られたイソプロパノール抽出液について，市販の遊離
脂肪酸測定用キット（例えば，和光純薬製NEFAC−Tes
t）を用いて，生成脂肪酸を定量し,1分間に１μ当量の
脂肪酸を生成する酵素量を脂肪酸生成活性の1Uとした。
したがって，グリセロール生成活性の脂肪酸生成活性
に対する割合は，以下の式にて算出した。
に対する割合は，以下の式にて算出した。
グリセロール生成活性（Ｕ）／ 脂肪酸生成活性（Ｕ）×100（％） （ｊ）精製方法：後記のとおり。
（ｋ）結晶構造及び元素分析：確認していない。
本発明のLPLを製造するには，次のごとき方法を採用
することができる。すなわち，好熱性放線菌を培養し，
その培養物から本発明のLPLを採取することによって得
ることができる。
することができる。すなわち，好熱性放線菌を培養し，
その培養物から本発明のLPLを採取することによって得
ることができる。
本発明に使用する好熱性放線菌としては，本発明のLP
Lを生産しうるものであれば，いかなるものでもよい。
その一例として，土壌より分離したストレプトミセス
（Streptomyces）7825があげられ，その菌学的性質を以
下に示す。
Lを生産しうるものであれば，いかなるものでもよい。
その一例として，土壌より分離したストレプトミセス
（Streptomyces）7825があげられ，その菌学的性質を以
下に示す。
尚，菌学的性質を調べる実験方法は，放線菌の同定実
験法〔日本放線菌研究会編，（1975）〕，微生物の化学
分類実験法〔駒形和男編，（1982）〕に記載されている
方法に従った。
験法〔日本放線菌研究会編，（1975）〕，微生物の化学
分類実験法〔駒形和男編，（1982）〕に記載されている
方法に従った。
（ａ）形態 栄養寒天培地で50℃で４日間スライド培養したものを
顕微鏡及び走査型電顕で観察した。
顕微鏡及び走査型電顕で観察した。
胞子形成菌糸の分岐法：単純分岐 胞子形成菌糸の形態：曲状及びらせん状 胞子の数:10胞子以上 胞子の表面構造及び大きさ：平滑，直径 0.5〜1.0μｍ×1.0〜1.5μｍ 鞭毛胞子：無 胞子のう：無 胞子柄の着生位置：気菌糸上 菌核形成性：無 （ｂ）以下の各培地における生育状態 50℃で６日間培養後の観察である。
シユークロース・硝酸塩寒天培地 拡散性で平坦な乳白色のコロニー，粉状の茶色気菌糸が
うっすらと着性 グルコース・アスパラギン寒天培地 拡散性で平坦な乳白色のコロニー，気菌糸は着生せず グリセリン・アスパラギン寒天培地 拡散性で平坦な乳白色のコロニー，気菌糸は着性せず スターチ寒天培地 拡散性で平坦な乳白色のコロニー，粉状の茶色気菌糸が
豊富に着生 チロシン寒天培地 拡散性で盛上がった乳白色のコロニー，粉状の白色気菌
糸がうっすらと着生，コロニー周囲の寒天中に茶色色素
を生成 栄養寒天培地 拡散性で盛上がった乳白色のコロニー，粉状の灰色気菌
糸が豊富に着生 イースト・麦芽寒天培地 拡散性でしわ状の乳白色のコロニー，粉状の灰色気菌糸
が豊富に着性 オートミール寒天培地 拡散性で平坦な白色のコロニー，気菌糸は着生せず （ｃ）生理的性質 生育温度範囲:25〜55℃ ゼラチンの液化：有 スターチの加水分解：有 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化：無 メラニン様色素の生成：有 （ｄ）各炭素源の同化性 Ｌ−アラビノース ± Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース Ｄ−フラクトース イノシトール Ｄ−マンニツト ：強く利用する。グルコースと同等もしくはより良
い。
うっすらと着性 グルコース・アスパラギン寒天培地 拡散性で平坦な乳白色のコロニー，気菌糸は着生せず グリセリン・アスパラギン寒天培地 拡散性で平坦な乳白色のコロニー，気菌糸は着性せず スターチ寒天培地 拡散性で平坦な乳白色のコロニー，粉状の茶色気菌糸が
豊富に着生 チロシン寒天培地 拡散性で盛上がった乳白色のコロニー，粉状の白色気菌
糸がうっすらと着生，コロニー周囲の寒天中に茶色色素
を生成 栄養寒天培地 拡散性で盛上がった乳白色のコロニー，粉状の灰色気菌
糸が豊富に着生 イースト・麦芽寒天培地 拡散性でしわ状の乳白色のコロニー，粉状の灰色気菌糸
が豊富に着性 オートミール寒天培地 拡散性で平坦な白色のコロニー，気菌糸は着生せず （ｃ）生理的性質 生育温度範囲:25〜55℃ ゼラチンの液化：有 スターチの加水分解：有 脱脂牛乳の凝固・ペプトン化：無 メラニン様色素の生成：有 （ｄ）各炭素源の同化性 Ｌ−アラビノース ± Ｄ−キシロース Ｄ−グルコース Ｄ−フラクトース イノシトール Ｄ−マンニツト ：強く利用する。グルコースと同等もしくはより良
い。
±：利用するか否か疑わしい。コントロールよりわずか
に良いかグルコースよりはるかに劣る。
に良いかグルコースよりはるかに劣る。
利用しない。コントロール同等でグルコースより大きく
劣る。
劣る。
（ｅ）細胞壁の化学組成 細胞壁タイプ Ｉ 上記の菌学的性質をバージエイのマニユアル・オブ・
デタミネイテイブバクテリオロジー（Bergey's Manual
of Determinative Bacteriology）第８版により検討し
た結果，本菌株は，ストレプトミセス（Streptomyces）
属に属するものと同定れた。さらに種の検索を行ったと
ころ，胞子の色，胞子柄の形態，胞子の表面構造，メラ
ニン様色素の生産及び炭素源の利用性において，ストレ
プトミセス・ガルバス（Streptomyces galbus）の性質
とほぼ一致した。しかし,L−アラビノースの利用性およ
び基生菌糸の色において差異が見られたので，ストレプ
トミセス・ガルバスに近縁の種であるが，同一種ではな
いと判断し，ストレプトミセス（Streptomyces）7825と
命名して工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した
（微工研菌寄第9983号,FERM P−9983）。
デタミネイテイブバクテリオロジー（Bergey's Manual
of Determinative Bacteriology）第８版により検討し
た結果，本菌株は，ストレプトミセス（Streptomyces）
属に属するものと同定れた。さらに種の検索を行ったと
ころ，胞子の色，胞子柄の形態，胞子の表面構造，メラ
ニン様色素の生産及び炭素源の利用性において，ストレ
プトミセス・ガルバス（Streptomyces galbus）の性質
とほぼ一致した。しかし,L−アラビノースの利用性およ
び基生菌糸の色において差異が見られたので，ストレプ
トミセス・ガルバスに近縁の種であるが，同一種ではな
いと判断し，ストレプトミセス（Streptomyces）7825と
命名して工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した
（微工研菌寄第9983号,FERM P−9983）。
次に本菌を用いて本発明のLPLを製造する方法につい
て説明すると，本菌は，誘導物質を含有する適当な栄養
培地を用いて，通常の液体培養を行うことにより本発明
のLPLを培地中に分泌させることができる。培養終了
後，培養濾液を回収し，種々の方法により精製を行うこ
とによって本発明のLPLの標品を得ることができる。
て説明すると，本菌は，誘導物質を含有する適当な栄養
培地を用いて，通常の液体培養を行うことにより本発明
のLPLを培地中に分泌させることができる。培養終了
後，培養濾液を回収し，種々の方法により精製を行うこ
とによって本発明のLPLの標品を得ることができる。
すなわち，まず，本菌の培養方法について具体的に説
明すると，本菌によるLPLの合成は誘導的に行われる
為，培地中に誘導物質を添加することが望まれる。誘導
物質としては，油脂類及び脂肪酸が用いられ，油脂類の
具体例としてラード，バター，魚油，鯨油などの動物性
油脂，あるいはオリーブ油，大豆油，米ぬか油，綿実
油，ごま油のような植物性油脂，または脂肪酸の具体例
としてオレイン酸，パルミチン酸，リノレン酸などがあ
げられる。これらの誘導物質は0.1〜３％添加するのが
良好であるが，この範囲に限定されるものではない。そ
れ以外の培地組成としては，放線菌の培養で通常用いら
れる炭素源，窒素源及び無機塩類等を用いればよい。炭
素源としては，例えばグルコース，グリセロール，可溶
性デンプンなどが使用できる。また窒素源としては，例
えばペプトン，尿素，硫安，コーンステイープリカー，
脱脂大豆粉，イーストエキス，肉エキス等が使用でき
る。無機塩類としては，例えばリン酸，カリウム，ナト
リウム，硫酸マグネシウムなどが用いられる。さらに,L
PLの培地中への分泌を促すために，界面活性剤の添加が
有効である。特に非イオン系界面活性剤であるツイーン
40,ツイーン60,ツイーン80等を0.05〜0.5％培地に添加
することがより望ましい。培地のpHとしては，中性付近
とし，通常撹拌などの好気条件で培養すれば良好な結果
が得られる。培養温度としては,30℃付近から50℃の範
囲で行えばよいが，培養日数を短縮できることから50℃
付近で行うのがより好ましい。このような条件で約４日
間培養することにより，培地中にLPLを著量蓄積させる
ことができる。
明すると，本菌によるLPLの合成は誘導的に行われる
為，培地中に誘導物質を添加することが望まれる。誘導
物質としては，油脂類及び脂肪酸が用いられ，油脂類の
具体例としてラード，バター，魚油，鯨油などの動物性
油脂，あるいはオリーブ油，大豆油，米ぬか油，綿実
油，ごま油のような植物性油脂，または脂肪酸の具体例
としてオレイン酸，パルミチン酸，リノレン酸などがあ
げられる。これらの誘導物質は0.1〜３％添加するのが
良好であるが，この範囲に限定されるものではない。そ
れ以外の培地組成としては，放線菌の培養で通常用いら
れる炭素源，窒素源及び無機塩類等を用いればよい。炭
素源としては，例えばグルコース，グリセロール，可溶
性デンプンなどが使用できる。また窒素源としては，例
えばペプトン，尿素，硫安，コーンステイープリカー，
脱脂大豆粉，イーストエキス，肉エキス等が使用でき
る。無機塩類としては，例えばリン酸，カリウム，ナト
リウム，硫酸マグネシウムなどが用いられる。さらに,L
PLの培地中への分泌を促すために，界面活性剤の添加が
有効である。特に非イオン系界面活性剤であるツイーン
40,ツイーン60,ツイーン80等を0.05〜0.5％培地に添加
することがより望ましい。培地のpHとしては，中性付近
とし，通常撹拌などの好気条件で培養すれば良好な結果
が得られる。培養温度としては,30℃付近から50℃の範
囲で行えばよいが，培養日数を短縮できることから50℃
付近で行うのがより好ましい。このような条件で約４日
間培養することにより，培地中にLPLを著量蓄積させる
ことができる。
次に本発明のLPLの精製方法について説明すると，ま
ず，培養終了後，培養液から菌体を除き濾液を回収する
が，菌体の除去は，遠心分離や濾過で行うことができ
る。濾液からの精製としては従来よく知られている糸状
菌の菌体外酵素などに用いられる精製方法が広く適用で
きる。すなわち硫安塩析あるいはアセトン，アルコール
等を用いる有機溶媒沈殿などの種々の方法で不溶化せし
て粗酵素標品を得ることができる。さらに高度に精製さ
れた酵素標品を得るには，イオン交換クロマトグラフイ
ー，ゲル濾過クロマトグラフイー，疏水性クロマトグラ
フイー等の各種クロマトグラフイーを用いることができ
る。本発明のLPLは，疎水性が強い為に，特に疎水性ク
ロマトグラフイーを用いた場合，精製倍率が高くなり，
より好ましい。上記のような方法により，本発明のLPL
の標品が得られる。
ず，培養終了後，培養液から菌体を除き濾液を回収する
が，菌体の除去は，遠心分離や濾過で行うことができ
る。濾液からの精製としては従来よく知られている糸状
菌の菌体外酵素などに用いられる精製方法が広く適用で
きる。すなわち硫安塩析あるいはアセトン，アルコール
等を用いる有機溶媒沈殿などの種々の方法で不溶化せし
て粗酵素標品を得ることができる。さらに高度に精製さ
れた酵素標品を得るには，イオン交換クロマトグラフイ
ー，ゲル濾過クロマトグラフイー，疏水性クロマトグラ
フイー等の各種クロマトグラフイーを用いることができ
る。本発明のLPLは，疎水性が強い為に，特に疎水性ク
ロマトグラフイーを用いた場合，精製倍率が高くなり，
より好ましい。上記のような方法により，本発明のLPL
の標品が得られる。
本発明のLPLは，熱に対して非常に安定であるから，
従来のLPLと比較して，これを長期間保存することがで
きる。このため，本発明のLPLを利用する場合，非常に
有効である。例えば血液の生化学的検査項目の一つであ
る血中のトリグリセリドを酵素法によって測定する定着
用試薬にLPLが使われていることはよく知られている。
その測定原理は，血中のトリグリセリドをLPLにより加
水分解し，生成したグリセロールを酵素法により定量す
るものである。このグリセロールを定量するには，グリ
セロールキナーゼを用い，生成物であるADPやグリセロ
ール３リン酸を共役酵素系で定量するか，グリセロール
脱水素酵素を用い,NADHの増加を直接定量するか，ある
いはグリセロール酸素酵素を用い，生成される過酸化水
素を発色糸に導き定量すればよいが，その中でも共役酵
素系で定量することが好ましい。
従来のLPLと比較して，これを長期間保存することがで
きる。このため，本発明のLPLを利用する場合，非常に
有効である。例えば血液の生化学的検査項目の一つであ
る血中のトリグリセリドを酵素法によって測定する定着
用試薬にLPLが使われていることはよく知られている。
その測定原理は，血中のトリグリセリドをLPLにより加
水分解し，生成したグリセロールを酵素法により定量す
るものである。このグリセロールを定量するには，グリ
セロールキナーゼを用い，生成物であるADPやグリセロ
ール３リン酸を共役酵素系で定量するか，グリセロール
脱水素酵素を用い,NADHの増加を直接定量するか，ある
いはグリセロール酸素酵素を用い，生成される過酸化水
素を発色糸に導き定量すればよいが，その中でも共役酵
素系で定量することが好ましい。
この共役酵素系としては，例えばグリセロールキナー
ゼ，グリセロール３リン酸酸化酵素及びパーオキシダー
ゼの３種類の酵素を用いるが，これらの酵素のメーカー
や起源は特に限定されず，試薬中に200〜500U程度含有
させればよい。また，緩衝液も特に限定されるものでは
ないが，共役酵素の作用に適している弱酸性領域の緩衝
液を用いることが好ましく，濃度も10〜100mMが適当で
ある。グリセロールキナーゼの反応に必要なATP Na2・3
H2O及びMgCl2・6H2Oは各々20〜30mg及び３〜50mg添加す
ればよい。さらにパーオキシダーゼの基質となる４アミ
ノアンチピリンと色原体を添加するが，色原体として
は，フエノール誘導体，アニリン誘導体及びトルイジン
誘導体等の中から任意に選択することができる。また，
色原体の溶解性を増すために，トリトンＸ−100等の界
面活性剤を加える方がより好ましい。
ゼ，グリセロール３リン酸酸化酵素及びパーオキシダー
ゼの３種類の酵素を用いるが，これらの酵素のメーカー
や起源は特に限定されず，試薬中に200〜500U程度含有
させればよい。また，緩衝液も特に限定されるものでは
ないが，共役酵素の作用に適している弱酸性領域の緩衝
液を用いることが好ましく，濃度も10〜100mMが適当で
ある。グリセロールキナーゼの反応に必要なATP Na2・3
H2O及びMgCl2・6H2Oは各々20〜30mg及び３〜50mg添加す
ればよい。さらにパーオキシダーゼの基質となる４アミ
ノアンチピリンと色原体を添加するが，色原体として
は，フエノール誘導体，アニリン誘導体及びトルイジン
誘導体等の中から任意に選択することができる。また，
色原体の溶解性を増すために，トリトンＸ−100等の界
面活性剤を加える方がより好ましい。
以上のようにして調製した定量用試薬1mlに血清を希
釈せずに数μ添加し，さらに本発明のLPL（５〜10U/m
l）を数μ添加した後，キユベツト中でインキユベー
トすることにより，血清中のトリグリセリドの量に対応
して色原体の発色が生じるので，その発色を吸光度で測
定することにより，トリグリセリドを定量することがで
きる。
釈せずに数μ添加し，さらに本発明のLPL（５〜10U/m
l）を数μ添加した後，キユベツト中でインキユベー
トすることにより，血清中のトリグリセリドの量に対応
して色原体の発色が生じるので，その発色を吸光度で測
定することにより，トリグリセリドを定量することがで
きる。
（実施例） 以下に本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１ ペプトン0.5％（重量％を表す，以下同様）,KH2PO4
0.1％,Na2HPO4・12H2O 0.1％,MgSO4・7H2O 0.05％，酵
母エキス0.03％，オリーブ油0.2％，ツウイーン40 0.5
％,pH7.0よりなる培地100mlを500ml容の三角フラスコに
入れ,121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。
0.1％,Na2HPO4・12H2O 0.1％,MgSO4・7H2O 0.05％，酵
母エキス0.03％，オリーブ油0.2％，ツウイーン40 0.5
％,pH7.0よりなる培地100mlを500ml容の三角フラスコに
入れ,121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。
他方，同組成の培地5mlでストレプトミセス（Strepto
myces）7825（微工研菌寄第9983号,FERM P−9983）を試
験管培養した。
myces）7825（微工研菌寄第9983号,FERM P−9983）を試
験管培養した。
この培養液を前記培地に植菌し,50℃で３日間回転振
とう培養し，ジヤーフアーメンターの種培養とした。同
様の前記培地２を３容のジヤーフアーメンターに仕
込み,121℃で15分間オートクレーブ滅菌し，これに種培
養100mlを植菌後,50℃,400rpm,1VVMの通気条件下で培養
した。
とう培養し，ジヤーフアーメンターの種培養とした。同
様の前記培地２を３容のジヤーフアーメンターに仕
込み,121℃で15分間オートクレーブ滅菌し，これに種培
養100mlを植菌後,50℃,400rpm,1VVMの通気条件下で培養
した。
培養開始後３日目の培養濾液をアツセイしたところ,
0.2U/mlのLPLが蓄積されていた。この時点で培養を終了
し，濾過により菌体を除き培養濾液を回収した。
0.2U/mlのLPLが蓄積されていた。この時点で培養を終了
し，濾過により菌体を除き培養濾液を回収した。
あらかじめ25mMリン酸バツフア−pH7.0で平衡化した
フエニルセフアロースカラム（サイズ4.4cmφ×10cm）
に培養濾液をアプライしたところ,LPLが吸着されたの
で，同バツフアーで十分洗浄した後,1％トリトンＸ−10
0を含む同バツフアーに切り換えた。１％トリトンＸ−1
00含有バツフアーにより,LPLがシヤープなピークとして
溶出された。その活性画分を回収し，限外濾過法により
濃縮した後,0.1％トリトンＸ−100含有同バツフアーで
平衡化したセフアデツクスＧ−75カラム（サイズ2.2cm
φ×90cm）にアプライした後，トリトン含有同バツフア
ーを送液したところ，タンパクピークと活性ピークが一
致した。
フエニルセフアロースカラム（サイズ4.4cmφ×10cm）
に培養濾液をアプライしたところ,LPLが吸着されたの
で，同バツフアーで十分洗浄した後,1％トリトンＸ−10
0を含む同バツフアーに切り換えた。１％トリトンＸ−1
00含有バツフアーにより,LPLがシヤープなピークとして
溶出された。その活性画分を回収し，限外濾過法により
濃縮した後,0.1％トリトンＸ−100含有同バツフアーで
平衡化したセフアデツクスＧ−75カラム（サイズ2.2cm
φ×90cm）にアプライした後，トリトン含有同バツフア
ーを送液したところ，タンパクピークと活性ピークが一
致した。
この活性画分を回収し，濃縮後SDS−ポリアクリルア
ミド電気泳動を行ったところ，単一なバンドが得られ
た。
ミド電気泳動を行ったところ，単一なバンドが得られ
た。
この酵素標品の比活性は,1.2U/mgであった。
なお，蛋白質量は，ワングースミス（Wang−Smith）
法〔アナリテイカル・バイオケミストリー（Anal.Bioch
em.）63,414（1975）〕で定量した。
法〔アナリテイカル・バイオケミストリー（Anal.Bioch
em.）63,414（1975）〕で定量した。
得られた精製酵素を用いて，酵素の理化学的性質を調
べたところ，前記したとおりの結果が得られた。
べたところ，前記したとおりの結果が得られた。
特に，耐熱性に関しては，市販の他の微生物由来のLP
Lに比較して，はるかに優れていた。すなわち，シユー
ドモナス属由来LPL（東洋紡社製）をpH7.0（この酵素が
最も安定なpH）で，アルカリジエネス属由来LPL（名糖
産業社製）をpH8.0（この酵素が最も安定なpH）でそれ
ぞれ60℃で15分間処理した後の残存活性は，各々約70％
及び約０％であったのに対して，本発明のLPLは,pH5.0
（この酵素が最も安定なpH）で同様に処理した後の残存
活性が，ほぼ100％であった。
Lに比較して，はるかに優れていた。すなわち，シユー
ドモナス属由来LPL（東洋紡社製）をpH7.0（この酵素が
最も安定なpH）で，アルカリジエネス属由来LPL（名糖
産業社製）をpH8.0（この酵素が最も安定なpH）でそれ
ぞれ60℃で15分間処理した後の残存活性は，各々約70％
及び約０％であったのに対して，本発明のLPLは,pH5.0
（この酵素が最も安定なpH）で同様に処理した後の残存
活性が，ほぼ100％であった。
次に本発明のLPLのグリセロール生成活性の脂肪酸生
成活性に対する割合を測定したところ,16％という値が
得られ，シユードモナス属由来LPL（東洋紡社製）の1.9
7％に比較し，はるかに高い値であった。
成活性に対する割合を測定したところ,16％という値が
得られ，シユードモナス属由来LPL（東洋紡社製）の1.9
7％に比較し，はるかに高い値であった。
実施例２ 実施例１で得られたLPLを用いて調製した定量用試薬
で血中のトリグリセリドを測定した。測定は,LPLにより
血中トリグリセリドを加水分解し，生成したグリセロー
ルをグリセロールキナーゼとグリセロール−３−リン酸
オキシダーゼとパーオキシダーゼとの共役酵素系で測定
した。
で血中のトリグリセリドを測定した。測定は,LPLにより
血中トリグリセリドを加水分解し，生成したグリセロー
ルをグリセロールキナーゼとグリセロール−３−リン酸
オキシダーゼとパーオキシダーゼとの共役酵素系で測定
した。
グリセロール発色液 ５％トリトンｘ−100 4ml N,N−ジエチル−ｍ−トルイジン 40μ ４−アミノアンチピリン 4mg ATP Na2・3H2O 25mg MgCl2・6H2O 40mg グリセロールキナーゼ 200U グリセロール−３−リン酸オキシターゼ 500U パーオキシターゼ 300プルプロガリンＵ 上記グリセロール発色液を50mM MESバツフアーpH6.5
に溶かし，全量を200mlにした。このグリセロール発色
液1mlに血清10μを加え,37℃で３分間プレインキユベ
ーシヨンを行い,545nmの吸光度を読み取った後，実施例
１で得たLPL（５〜10U/mlに調整）を５μ添加し,37℃
でインキユベーシヨンを行い545nmでの吸光度を測定し
た。
に溶かし，全量を200mlにした。このグリセロール発色
液1mlに血清10μを加え,37℃で３分間プレインキユベ
ーシヨンを行い,545nmの吸光度を読み取った後，実施例
１で得たLPL（５〜10U/mlに調整）を５μ添加し,37℃
でインキユベーシヨンを行い545nmでの吸光度を測定し
た。
10分後，一定値に達した吸光度より，吸光度の増加分
（△A545）を求め，以下の式によりトリグリセリド量を
算出した。
（△A545）を求め，以下の式によりトリグリセリド量を
算出した。
△A545:545nmの吸光度の増加分 28.2:色素の分子吸光係数（/m mol/cm） 0.5:H2O2の１分子から形成される色素が1/2分子である
ことによる係数 1:セルの光路長（cm） 885.45:トリオレインの分子量 上記の定量用試薬で、市販の管理血清（和光純薬社
製）２種類（104mg/dl、280mg/dlの表示）のトリグリセ
リド量を測定したところ、各々104mg/dl、280mg/dlと求
まった。
ことによる係数 1:セルの光路長（cm） 885.45:トリオレインの分子量 上記の定量用試薬で、市販の管理血清（和光純薬社
製）２種類（104mg/dl、280mg/dlの表示）のトリグリセ
リド量を測定したところ、各々104mg/dl、280mg/dlと求
まった。
一方，この管理血清を，水酸化カリウムでけん化する
方法（クリニカ・キミカ・アクタ（Clin.Chim.Acta）2
2,393（1968）参照）でトリグリセリド量を算出したと
ころ，各々103mg/dl,279mg/dlと求まり，本発明のLPLを
用いた定量用試薬による値とよく一致していた。
方法（クリニカ・キミカ・アクタ（Clin.Chim.Acta）2
2,393（1968）参照）でトリグリセリド量を算出したと
ころ，各々103mg/dl,279mg/dlと求まり，本発明のLPLを
用いた定量用試薬による値とよく一致していた。
また，本発明のLPLを用いて調製したトリグリセリド
定量用試薬において，吸光度が一定値に達するまでの時
間は約８分であったのに対し，本発明のLPLに代えて，
シユードモナス属由来のLPL（東洋紡社製）を用いて調
製した定量用試薬においては，吸光度が一定値になるの
に要する時間は23分であった。
定量用試薬において，吸光度が一定値に達するまでの時
間は約８分であったのに対し，本発明のLPLに代えて，
シユードモナス属由来のLPL（東洋紡社製）を用いて調
製した定量用試薬においては，吸光度が一定値になるの
に要する時間は23分であった。
これより，本発明のLPLを用いて調製した定量用試薬
は，測定時間を大幅に短縮させることが可能になった。
は，測定時間を大幅に短縮させることが可能になった。
さらに上記のグリセロール発色液に実施例１で得たLP
L（8U/ml）を５μ添加した本発明の定量用試薬と，同
グリセロール発色液にシユードモナス属由来のLPL
〔（東洋紡社製）8U/ml〕を５μ添加した従来の定量
用試薬とをそれぞれ25℃で４日間放置させた後に，その
定量用試薬で上記の管理血清のトリグリセリドを定量し
た。
L（8U/ml）を５μ添加した本発明の定量用試薬と，同
グリセロール発色液にシユードモナス属由来のLPL
〔（東洋紡社製）8U/ml〕を５μ添加した従来の定量
用試薬とをそれぞれ25℃で４日間放置させた後に，その
定量用試薬で上記の管理血清のトリグリセリドを定量し
た。
その結果，本発明の定量用試薬は，測定開始８分後に
トリグリセリドを100％検出することができたが，従来
の定量用試薬は，同じ８分後に80％しか検出することが
できなかった。
トリグリセリドを100％検出することができたが，従来
の定量用試薬は，同じ８分後に80％しか検出することが
できなかった。
（発明の効果） 本発明のLPLは，従来知られているLPLに比べ，はるか
に熱安定性に優れ，かつグリセロール生成活性の脂肪酸
生成活性に対する割合が高いので，検査試薬として用い
た場合，そのライフタイムが著しく延長されるとともに
１検体の測定に要する時間が短縮されるため，産業界に
与えるメリツトは甚大である。
に熱安定性に優れ，かつグリセロール生成活性の脂肪酸
生成活性に対する割合が高いので，検査試薬として用い
た場合，そのライフタイムが著しく延長されるとともに
１検体の測定に要する時間が短縮されるため，産業界に
与えるメリツトは甚大である。
第１図は，本発明のLPLの至適pH曲線，第２図は，本発
明のLPLのpH安定性曲線，第３図は本発明のLPLの作用適
温曲線，第４図は，本発明のLPLの熱安定性（耐熱性）
曲線を示す。
明のLPLのpH安定性曲線，第３図は本発明のLPLの作用適
温曲線，第４図は，本発明のLPLの熱安定性（耐熱性）
曲線を示す。
Claims (3)
- 【請求項１】以下の理化学的性質を有する耐熱性のリポ
プロテインリパーゼ。 （イ）作 用 リポプロテイン中のトリグリセリドに作用し，グリセロ
ールと脂肪酸に加水分解する。 （ロ）耐熱性（熱安定性） 約60℃の緩衝液中で約15分間処理したのちの活性が処理
前の活性の約100％の値を保持している。 （ハ）グリセロール生成活性の割合 グリセロール生成活性の割合が脂肪酸生成活性に対して
少なくとも約15％有する。 （ニ）基質特異性 オリーブ油に対する活性を100としたときのトリラウリ
ンに対する相対活性は234であり，トリカプリンに対す
る相対活性は153である。 （ホ）至適pH及び安定pH範囲 8.0〜9.0に至適pHを有し,pH4.0〜7.0で安定である（60
℃,30分処理）。 （ヘ）作用適温の範囲 50〜60℃である。 （ト）分子量 ３万〜５万（ゲル濾過法）。 - 【請求項２】好熱性放線菌を培養し，培養物から耐熱性
のリポプロテインリパーゼを採取することを特徴とする
請求項１記載のリポプロテインリパーゼの製造法。 - 【請求項３】リポプロテインリパーゼを含有する体液中
のトリグリセリドを定量するトリグリセリド定量用試薬
において，リポプロテインリパーゼが請求項１記載のリ
ポプロテインリパーゼであることを特徴とするトリグリ
セリド定量用試薬。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63199639A JP2693786B2 (ja) | 1988-08-09 | 1988-08-09 | 耐熱性のリポプロテインリパーゼとその製造法及びそれを用いた定量用試薬 |
| EP89114726A EP0354551B1 (en) | 1988-08-09 | 1989-08-09 | Thermostable lipoprotein lipase, process for producng the same, and triglyceride determining reagent using the same |
| DE68924738T DE68924738T2 (de) | 1988-08-09 | 1989-08-09 | Hitzestabile Lipoproteinlipase, Verfahren zu deren Herstellung sowie ein Reagenz zur Bestimmung von Triglyceriden, welches diese Lipase enthält. |
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