DE2334521B2 - Verfahren zur gewinnung von gereinigten enzymloesungen - Google Patents

Description

Erfindung.

Beispiel 1

Enzyme, und insbesondere solche, die durch Fermen- ^ Ein Stamm von Escherichia CoIi wurde nach üblichen lation hergestellt wurden, haben in den letzten Jahren Fermentationsverfahren zur Erzeugung von an Penicileine beträchtliche Bedeutung erlangt und werden in lin-amidase reichen Zellen kultiviert,
vielen chemischen Verfahren als Reaktionskatalysato- 1 kg Zellpaste, die 2200 Einheiten/g enthielt (1 Einheit ren verwendet. Es ist jedoch sehr schwierig, ein Enzym 30 Penicillin-amidase ist die Menge an Enzym, die 1 μΜ im industriellen Maßstab zu reinigen. Die Anzahl der Penicillin G in 1 Std. bei 37°C hydrolysiert) wurde in 2 ! notwendigen Reinigungsstufen ist immer sehr hoch und tris-HCl-Puffer (0,01 m) bei pH 8,5 suspendiert. Die die einzelnen Stufen sind häufig schwierig durchzufüh- homogene Suspension wurde zweimal in einen Homoren und sehr kostspielig. Dies gilt beispielsweise für die genisator bei 700 kg/cm² geleitet,
aus der französischen Patentschrift 15 05 666 bekannte 35 Das Produkt wurde bei 20 000 UpM 30 Minuten Reinigung von Penicillin-amidase. Diese muß unter zentrifugiert, und das Sediment wurde entnommen.
Einsatz verschiedener Chemikalien ausgefällt, von der Das überstehende Produkt, das 420 Einheiten/ml und überstehenden Flüssigkeit abgetrennt, erneut gelöst, 27 mg Proteine/ml enthielt, wurde mit Hexadecyl-pyrivon Feststoffen befreit, mit einem Absorptionsmittel dinium-chlorid bis zu einer Endkonzentration von 0,2% versetzt und erneut von Feststoffen befreit werden. Ein 40 versetzt. Gleichzeitig wurde der pH-Wert auf 4.5 derartiges Verfahren verlangt also den Einsatz verschie- eingestellt, wobei das Medium unter langsamem Rühren dener Chemikalien sowie die Durchführung mehrfacher 2 Std. bei 37⁰C gehalten wurde.

Ausfällungs-, Abtrennungs- und Wiederauflösungsstu- Nach Filtration und Zentrifugieren wurde der

fen. unlösliche Rückstand entfernt. Aus dem klaren überste-

Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher ein einfach 45 henden Produkt wurde das Enzym durch Ammonium-

durchzuführendes Verfahren zur Reinigung von Enzy- sulfat (70%) mit 59% Ausbeute ausgefällt. Das Enzym

men, durch Vereinfachung der Zentrifugalions- und zeigte eine spezifische Aktivität von 50,3 Einheiten/mg

Filtrationsvorgänge, bei dem hohe spezifische Aktivitä- Protein, was eine 3,3fache Reinigung bedeutet,
ten (spezifische Aktivität = Aktivität/mg Protein)

erhalten werden. 50 Beispiel 2

Es wurde nun gefunden, daß durch die Verwendung

von oberflächenaktiven quaternären Ammoniumsalzen Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet, jedoch wurde

bei einer gegebenen Konzentration und einem speziel- die Behandlung mit Hexadecyl-pyridinium-chlorid bei

len pH-Wert eine leicht filtrierbare und bei einer pH 5,0 durchgeführt.

geringen Gravitation zentrifugierbare Ausfällung an $5 Man erhielt eine 2,5fache Reinigung mit einer

Proteinen, Nucleoproteinen und Nucleinsäuren erhalten 63%igen Ausbeute,
werden kann.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Beispiel 3

Gewinnung von gereinigten Enzymlösungen durch: Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet, wobei jedoch die

a) mechanisches Brechen der mikrobiellen Zellen 60 Behandlung mit Hexadecyl-pyridinium-chlorid bei pH oder Lysis der Zellen, 6,0 durchgeführt wurde.

b) Ausfällung der Proteine, der Nucleoproteine und Man erzielte eine zweifache Reinigung mit einer Nucleinsäuren und Ausbeute von 67%.

c) Entfernen der hierdurch gebildeten Ausfällungen . .
durch Zentrifugieren oder Filtration, 65 Beispiel 4

das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Ausfällung in Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet, jedoch wurde

Stufe b) mit einem oberflächenaktiven quaternären die Behandlung mit Hexadecyl-pyridinium-chlorid bei Ammoniumsalz vorgenommen wird, oder daß die pH 7,0 durchgeführt.

Man erzielte eine 2,2fache Reinigung mit einer Ausbeute von 66%.

Beispiel 5

Es wurde wie in Beispiel 1 gearbeitet unter s Verwendung von Benzyl-dimethyl-alkyl (Ci₀-Ci₈)-ammoniumchlorid als oberflächenaktives Mittel bei den gleichen pH-Wert-(4,5) und Konzentrations-(0,2%)-Bedingungen.

Man erhielt eine 2,5fache mit einer Ausbeute von

Beispiel 6

48 kg EColi-Zellen, die Penicillin-amidase enthielten, wurden unter Rühren in 101 tris-44-Puffer (0,01 m, pH 8,5)dispergiert

Die Suspension wurde zweimal be¹ 700 kg/cm² durch einen Hoaiogenisator geleitet.

Es wurde 30 Minuten bei 20 000 UpM zentrifugiert, und 11,7 I überstehendes Produkt wurden gewonnen, die 11 χ 10⁶ Einheiten Penicillin-amidase und 545 g Proteine enthielten. Hexadecyl-pyridinium-chlorid wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,4% zugeführt, und der pH-Wert wurde auf 4,5 gebracht. Das Ganze wurde unter Rühren 3 Std. bei 37° C gehalten und zentrifugiert.

Man erhielt 141 einer klaren, enzymfreien Lösung, die 8 5x10* Einheiten und 126 g Proteine enthielt.

' Die Ausbeute betrug 77% bei einer 3,3fachen Reinigung.

Beispiel 7
1 kg E.Coli-Zellen mit einem reichen ß-Galactosidasegehalt wurde in 21 Phosphatpuffer (0,1 m, pH 7,2), der MgSO₄ (2XlO-³M) und EDTA (10-³M) enthielt, dispergiert.

Die Dispersion wurde durch einen Homogenicator bei 750 kg/cm² geleitet und durch Entfernung des abgesetzten Produkts zentrifugiert.

Man erhieit 2,7 I überstehendes Produkt, das 29,7 g Proteine und 900 000 Einheiten /3-Galaetosidase enthielt. (1 Einheit= Enzym, das 1 μΜοΙ o-Nitrophenylgalactosid pro Minute bei 25° C hydrolysiert.)

Die Lösung wurde mit 0.2% Hexadecylpyridiniumchlorid bei pH 7,0 während 1,5 Std. behandelt und anschließend zentrifugiert.

Aus dem überstehenden Produkt wurde durch Sättigen mit Ammoniumsulfat auf 35% das Enzym in 90%iger Ausbeute gewonnen. Es hatte eine spezifische Aktivität von 130 Einheiten, was einer 4,3fachen Reinigung entsprach.

Beispiel 8

Es wurde wie in Beispiel 7 gearbeitet, ausgehend von 1 kg Saccharomyces lactis-Zellen mit einem reichen Gehalt an ß-Galactosidase. Die spezifische Aktivität betrug zu Beginn 17 Einheiten/mg Proteine und am Ende der Reinigung 40 Einheiten. Die Ausbeute betrug 71.%.

Claims (2)

7 Ausfällung in Stufe b) mit einem oberflächenaktiven Patentansprüche- ^ quaiernären Ammoniumsalz und einem teilweise mit Wasser mischbaren Lösungsmittel vorgenommen wird.

1. Verfahren zur Gewinnung von gereinigten Quaternäre Ammoniumsalze sind im Handel erhält-Enzymiösungen durch: ^e₆₅ ^ ^ ^ _{Ergebmsse weroe}n nut Hexadecylpyndi-

a) mechanisches Brechen der mikrowellen Zellen niumchlond erzielt

oder Lysis der Zellen Die zweckmäßigen Konzentrationen fur diese ober-

b) Ausfällen der Proteine, der Nucleooroteine und flächenaktiven Mittel liegen im Bereich von 01 bis Nucleinsäuren und ' 0,010/0, der pH-Wert kann zwischen 3,5 und 8,5.

c) Entfernen der hierdurch gebildeten Ausfäüun- 10 vorzugsweise bei einem sauren Wert liegen.

gen durch Zentrifugieren oder Filtration, Die Verwendung eines m der Erfindungsdefinition

d a d u r c h g e k e η η ζ e i c h η e t, daß die Ausfäi- genannten oberflächenaktiven Mittels zusammen mit

lung in Stufe b) mit einem oberflächenaktiven teilweise mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln erwies

quaternären Ammoniumsalz vorgenommen wird, sich auch als sehr nützlich. ....

oder daß die Ausfällung in Stufe b) mit einem 15 In vielen Fällen ist es möglich, das Zentrifugieren

oberflächenaktiven quaternären Ammoniumsalz nach dem Brechen der Zellen zu vermeiden und d.rekt

und einem teilweise mit Wasser mischbaren eine Behandlung mit einem dieser oberflächenaktiven

Lösungsmittel vorgenommen wird. Mittel vorzunehmen, wodurch das Verfahren beträcht-

2. Verfahren gemäß Anspruch 1. dadurch gekenn- lieh vereinfacht wird. Es ist jedoch auch möglich, die zeichnet, daß nach dem Brechen der Zellen zur 20 Zellfragmente nach dem Brechen der Zellen abzuzentn-Entfernung der Zellfragmente zentrifugiert wird. fugieren.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der