DE2008842A1 - Verfahren und Vorrichtung zur kontinuierlichen Durchführung von Enzymreaktionen - Google Patents

Verfahren und Vorrichtung zur kontinuierlichen Durchführung von Enzymreaktionen

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DE2008842A1 DE19702008842 DE2008842A DE2008842A1 DE 2008842 A1 DE2008842 A1 DE 2008842A1 DE 19702008842 DE19702008842 DE 19702008842 DE 2008842 A DE2008842 A DE 2008842A DE 2008842 A1 DE2008842 A1 DE 2008842A1
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Description

DIPL-CHEM. DR. ELISABETH JUNG'" ' '"· ' 8*M0NCHEN 23. 25.FEBJ9TS
DIPL-OHEM. DR. VOLKER VOSSIUS
D)PL-PHYS. DR. JÖRGEN SCHIRDEWAHN ίΚϊϊιίϊϊώ*0"""1 lNVENT/MoNCHEN
PATENTANWÄLTE
2D08842
u.Z.: P 009C (Vo/ho/kä)
Case 9-4
KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.»
Tokyo/ Japan
" Verfahren und Vorrichtung zur kontinuierlichen Durchführung von Enzymreaktionen "
Priorität: 27. Februar 1969, Japan, ITr. 14246/69
Auf biochemischem Wege lassen sich mit Enzymen, die aus 'tierischen oder pflanzlichen Zellen oder Mikroorganismen gewonnen wurden, die verschiedensten Verbindungen herstellen, z.B. optisch aktive Aminosäuren und Steroide. Jedoch ergeben sich bei der grosstechnischen Durchführung von Enzymreaktionen viele Schwierigkeiten. So kann z.B. das Ausgangsmaterial für die verwendeten Enzyme schwer erhältlich sein, oder es ist vor der Durchführung der Enzymreaktion ein kompliziertes Reinigungsverfahren erforderlich. Ferner kann unmöglich sein-, die Enzyme nach beendeter • Umsetzung wiederzugewinnen und wiederzuverwenden, da sie in Form von wässrigen Lösungen verwendet werden. " -
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Wird die Enzymreaktion trotz dieser Schwierigkeiten dHrchgiführt» so wird eine komplizierte Nachbehandlung erforderlich^ um, die « aus dem Enzympräparat etammenden Protein-Vemareiaigungtn tow wünschten Produkt abatttrennen, Dieae Sohwierigkeiten h«ben\die
*».- ?008842
grosstechnische Nutzung von Enzymreaktionen stark beeinträch-
Um diese Schwierigkeiten bei der grosatechnisohen nutzung von Bnzymreaktionen zu vermeiden» wurden Verfahren zur Durchführung von Bnzymreaktionen entwickelt, wobei ein wasserunlösliches Enzympräparat verwendet wird, das durch chemische Bindung oder ' physikaliach-chemische Adsorption eines Bnzyme an einen wasserunlösliohen Träger hergestellt wurde· Bekannt sind z.B. ein Verfahren zum Lactamisieren von Glutaminsäure (vergl. Jap'. Patent-Veröffentlichung Nr. 13 785/66) und ein Verfahren zur Aufspaltung von Aminosäuren in ihre optischen Antipoden (vergl. USA.-Patentschriften 3 243 356 und 3 386 888). Kontinuierliche Verfahren unter Verwendung eines derartigen, unlöslichen Enzyms ermöglichen die Herstellung von groeeen Mengen der gewünschten Substanz, wobei nur eine geringe Menge des Enzympräparats er-
ύ ■
ι forderlich ist. Darüberhi^aus werden Abtrennung und Reinigung das gewünschten produkte nach der Umsetzung verhältnismässig vereinfacht. :
Auch bei diesen Verfahren muss man jedoch ein hochreines Enzympräparat zur Herstellung des unlöslichen Enzyms durch chemische 1" oder physikalisch-chemische Bindung verwenden· Darüberhinaus ist eins komplizierte Vorbehandlung zur Reinigung des Enzym-Proteins erforderlich. Sie Enzymreaktion dauert auch wesentlich länger, da di# Umsetzung in einem heterogenen System durchgeführt wird
»nd gross« Mengen an unlösliohfm Enzym verwendet werden müssen, tfpie bisher bekannten Verfahren haben daher, noch immer Nachteile*
'*' BAD-ORIGINAL
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein neues Verfahren zur Durchführung biochemischer Umsetzungen zu schaffen, das die Nachteile der bekannten Verfahren nicht aufweist und eine wirksame, kontinuierliche Durchführung von Enzymreaktionen gestattet. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur kontinuierlichen Durchführung von Enzymreaktionenr das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Reaktion in einem wässrigen· Reaktionsmedium durchführt, das mindestens ein Enzym und mindestens ein δμΐ>~ strat enthält, wobei das wässrige Reaktionsmedium mit einer nicht-porösen, semipermeablen Membran in Berührung steht, und das Umsetzungsprodukt durch die Membran entfernt·
Bei dem erfindungsgemässen Verfahren sind nur geringe. Mengen an Enzympräparat erforderlich, und die Produkte lassen sich in grosstechnischem Maßstab leicht und wirtschaftlich und in hoher Ausbeute kontinuierlich herstellen.
Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung Eur kontinuierlichen Durchführung von Enzymreaktionen, bestehend aus einem geschlossenen, die Substratlösung enthaltenden Druckgefäss, einem geschlossenen, .das wässrige Reaktionsmedium enthaltenden ReaktionsgefäBs, dessen Wandung zumindest zum Teil aus einer' nichtporösen, semipermeablen Membran (3) ausgebildet ist, wobei das Druckgefäss und das jjleaktionegefäse^Über7eine Leitung (17* 4) miteinander verbunden sind, die unterhalb dee flüieigkeltssplft-» gels der Substratlösung la Druckgefäss In das Reaktionsgefäss mündet, und Einrichtungen zur Aufrechterhaltung eines praktisch konstanten Drucke im Druokgefäss und la Reaktionegefäes,
■ · ■ ■ r
GÖ984S/121I bad original
Erfindun^sgemäss wird die Enzymreaktion an einer nichtporösen, semipermeablen Membran durchgeführt, indem man ein Substrat und ein Enzym miteinander in einer wässrigen Lösung reagieren lässt. Die durch die Umsetzung gebildete Substanz tritt durch die Membran hindurch, indem man vorzugsweise ein Druckgefälle an der Membran anwendet. Hierdurch wird das Produkt vom Enzymprotein abgetrennt. Gleichzeitig mit der Abtrennung des Produkts wird zusätzliches Substrat in Form einer wässrigen Lösung zum Reaktionssystem gegeben. Auf diese Weise wird die Enzymreaktion kontinuierlich durchgeführt. Das Enzymprotein tritt nicht durch die Membran und verbleibt im Reaktionssystem. Es können also grosse Mengen Substrat umgewandelt werden, und man benötigt nur eine sehr geringe Menge Enzympräparat.
Der Vorteil des Verfahrens der Erfindung besteht darin, dass eine grosse Menge Substrat mit einer geringen Menge Enzym behandelt werden kann und dass« die abgetrennte Produktlösung keine aus dem Enzympräparat stammenden Verunreinigungen enthalt, wodurch die Reinigung des Produkts erleichtert wird. Weiterhin hat das Verfahren den Vorteil, dass das bei der Umsetzung verwendete Enzympräparat kein hochreines Präparat zu sein braucht, da Rohenzympräparate verwendet werden können.
Als semipermeable Membran kann z.B. eine Membran aus einem Kunststoff verwendet werden, die durch Formung eines vernetzten Dextrangels zu einer Folie (z.B. "Diaflow", Amicon Corp., USA) hergestellt wird, oder eine durchlässige Membran (z.B. "Cellulose Tubing", Visking Co., USA), oder eine Schwe insblaseninembran. Die nichtporöse Membran unterscheidet sich wesentlich von einen porösen Mikrofilter, denn sie verstopft nicht wie eine poröse
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Membran und ist praktisch dimensionsstabil. Die Filtration erfolgt durch Erzeugung eines Druckgefälles an der Membran. Dadurch diffundiert nur das Produkt mit niederem Molekulargewicht durch die Membran und kann von dem hochmolekularen Enzymproteih im Reaktionssystem wirksam abgetrennt werden. Die im Handel erhältlichen, semipermeablen Membranen weisen unterschiedliche Vernetzungs^rade und elektrische Eigenschaften auf; im erfindungsgemässen Verfahren sind hochvernetzte und elektrisch neutrale Membranen am geeignetsten, da die Produkte der meisten Enzymreaktionen niedermolekular sind. Die Membran muss biologisch inaktiv und chemisch stabil sein, damit sie wiederholt verwendet- werden kann.
Die im Verfahren der Erfindung verwendbaren Enzympräparate können gereinigte oder rohe Präparate sein. Es kann beispielsweise ein flüssiger Extrakt von Mikroorganismenzellen oder tierischen oder pflanzlichen Zellen ohne weitere Reinigungsbehandlung verwendet werden. In einigen Fällen können sogar die Zellen als solche verwendet werden. Die niedermolekularen Verunreinigungen im Rohenzympräparat können.durch die Membran leicht abgetrennt werden, ehe man mit der Umsetzung beginnt, indem man das Präparat unter Bedingungen behandelt, die die Enzymaktivität nicht beeinträchtigen, z.B. es mit einer geeigneten Pufferlösung wäscht. Darüberhinaus gelangen die nichtfiltrierbaren, makromolekularen.Verbindungen nicht in das vom Reaktionssystem abfiltrierte Produkt und können dieses daher nicht verunreinigen. Wenn jedoch derartige makromolekulare Verbindungen die gewünschte Enzymreaktion beeinträchtigen oder als Katalysatoren für Nebenreaktionen wirken, die .das gewünschte Produkt spalten, ist es ratsam, das Enzympräparat
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zu reinigen.
! Typische Reaktionsbedingungen für das Verfahren der Erfindung sind: Temperaturen von 20 bis 5O0C, p„ 5 bis 10, d.h. man arbeitet unter den für die jeweilige Enzymreaktion optimalen Bedin-
; gungen. Zur Erhöhung der Lebensdauer der Membran wird jedoch bei verhältnismässig niedrigen Temperaturen, vorzugsweise unterhalb
Γ 30 C, gearbeitet. Die Reaktion wird bei der normalerweise UbIi-
t .
' chen Substratkonzentration durchgeführt, jedoch ist bei der erfindungsgemässen kontinuierlichen Durchführung der Enzymreaktion eine verhältnismässig hohe Substratkonzentration, z.B. etwa 100 mg/ml, möglich, da geringere Möglichkeit besteht, dass sie die Bildung des Produktes hemmt.-
! Ist für die Umsetzung z.B. ein Coenzym erforderlich, so kann die Umsetzung dadurch beschleunigt werden, dass man das Coenzym zur kontinuierlich zugeführten Substratlösung zugibt.
Das Produkt lässt sich von der aus dem Reaktions system abfiltrierten Lösung leicht isolieren und kann auf herkömmliche Weise gereinigt werden. Man kann jedes beliebige Enzym verwenden, vorausgesetzt es bleibt unter den Bedingungen der kontinuierlichen .Umsetzung verhältnismässig stabil.
Die Erfindung ist anhand der Zeichnungen näher erläutert.
Pigur 1 ist ein Schnitt durch ein im Verfahren der Erfindung ver-* wendetes Reaktionsgefäss.
Q (UMU S/I'll·
Figur 2 ist ein Schnitt durch ein im Verfahren der Erfindung verwendetes Druckgefäss, das mit dem Reaktionsgefäss von Figur 1 verbunden ist.
In dem in Figur 1 veranschaulichten Reaktionsgefäss "bezeichnet 1 einen Auslass für das Produktfiltrat, 2 eine Bodenplatte aus einem porösen Material, die eine semipermeable Membran 3 aus einem Kunststoff mit einer Filterfläche von 43 mm Durchmesser trägt. Die Membran 3 besteht aus einem stark vernetzten Dextrangel (Diaflow Membran UM-2 der Amicon Corp., USA). . . 4 ist ein Einlass für eine Puffer- oder Substratlösung aus einem Druckgefäss, 5 ein Sicherheitsventil, 6 ein Deckel, an den ein Magnetrührstab angebracht ist, 7 eine druckfeste Seitenwand·, 8 ist ein Keizmantel für heisses Wasser, 9 und 10 bezeichnen einen Einlass bzw. einen Auslass für das heisse Wasser, 11 ist ein Rührstab und 12 ein Magnetrührer. Die Kapazität des Reaktionsgefässes beträgt etwa 60 ml. L
In dem in Fig. 2 gezeigten Druckgefäss "bezeichnet 13 eine Pufferoder Substratlösung, 14 eine druckfeste Seitenwand, 15 einen Einlass für die Puffer- oder Substratlösung, 16 einen Einlass für Stickstoffgas aus einer Stickstoffbom"be, 17 ist ein Auslass für die Puffer- oder Substratlösung, der mit dem Einlass 4 von Figur 1 verbunden ist, und 18 "bezeichnet ein Sicherheit sdruckventil.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Ss wird eine Suspension von 10 g Zellen von Pseudomonas cruciviae (ATCG 21283), die die Fähigkeit besitzen, L-Glutaminsäure enzymatisch zu dehydratisieren, in 50 ml einer 0,05 M Tris-
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(hydroxymethyl)-aminomethan-Pufferlösung mit einem p^-Wert von 8,0 hergestellt. Durch Behandlung mit Ultraschall erhält man eine Extraktlösung, die in das in Figur 1 gezeigte Reaktionsgefäss verbracht wird· Der Einlass 4 des Heaktionsgefässes ist mit dem Auslass 17 des Druckgefässes von Figur 2 mittels einer druckfesten Leitung verbunden. Es werden 300 ml einer 0,05 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Pufferlösung mit einem p„-Wert von β,O in das Druckgefäes gegeben· Sie Extraktlösung im Reaktionsgefäse wird gerührt und durch die Leitung 16 des Druckgefässes wird Stickstoff aus einer Stickstoffbombe mit einem Druck von 4,5 kg/cm eingeleitet. Danach wird der Druck mit Hilfe eines Reduzierventils an der Bombe auf diesem Wert gehalten. Sofort strömt ein FiItrat, das nur niedermolekulare Verbindungen enthält, aus dem Auslass 1 des Reaktionsgefässes, die Pufferlösung wird durch die Auslassleitung 17 und den Einlass 4 in das Reaktionegefäes eingespeist· Auf diese Weise wird die Enzymlösung zunächst gewaschen· Durch das Vaschen werden die niedermolekularen Verbindungen aus der durch Behandlung der Pseudomonascruciviae-Zellen mit Ultraschall erhaltenen Extraktlösung völlig abgetrennt. Nach 4-stündigem Vaechen wird der Druck aufgehoben.
Hierauf wird eine wässrige Substgatlösung, aus 1 kg L-Glutaminaäure in 10 Liter Wasser mit einem pg-Wert von 8,0 in das Druckgefäes gegeben. Warmes Wasser von 3O0C wird durch den Heizmantel 8 des Reaktionsgefässes geleitet. Der Inhalt dee Reaktionsgefässes wird gerührt. Das Druckgefäss wird wiederum mit einem
■ ρ ■ ' ■
Druck von 4,5 kg/cm beaufschlagt. In das Reaktionsgefäss gelangt
die Substratlösung, und gleichzeitig wird eine Lösung abgezogen, die das Produkt-L-Pyrrolidoncarbonsäure enthält.
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ORIGINAL INSPECTED
liach 3-tätiger, kontinuierlicher Umsetzung wird die abgezogene .Lösung unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand aus Äthanol umkristallisiert. Man erhält 820 g hochreine L-Pyrrolidoncarbonsäure. Die im Reaktionsgefäss verbliebene Enzyralösung weist noch Enzymaktivität auf und. kann wiederverwendet werden. ■
Beispiel 2
Es wird ein Reaktionsgefäss derselben Bauart wie in Beispiel 1 mit einer Kapazität von etwa 400 ml und einer semipermeablen Membran mit einer Filterfläche von 76 nua Durchmesser verwendet. . m
Eine Rohenzymlösung mit L-Aminosäureacylase-Aktivität, die durch j Extraktion von 20 g Zellen von Alcaligenes faecalis, mit einer : 0,001 M Phosphatpufferlösung mit einem p^-Wert von17,0 hergestellt wurde, wird mit etwa dem 10-fachen Volumen derselben Pufferlösung, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewaschen. Eine " wässrige Lösung von 1,5 kg N-Ace.tyl-DL-methionin in 4 Liter Wasser mit einem pH~Wert von 7t0 wird in ein Druckgefass gegeben, und die Umsetzung wird bei einer Temperatur von 370G und-einem Druck von 6,0 kg/cm , wie in Beispiel 1 beschrieben, kontinu*» · w ierlich durchgeführt. Die ausströmende, L-Methionin und N-Acetyl-D-methionin enthaltende Lösung wird direkt durch eine mit einem stark sauren Kationenaustauscher in der H -Farm ("Diaion SK IA" (H-Iyp)) gefüllten Kolonne geleitet. Die Substratlösung wird innerhalb 24 Stunden verbraucht. Der Kationenaustaueeher wird ,mit Wasser gewaschen und mit einer wässrigen 2n Ammoniaklösung eiuiert. Das Eluat wird eingedampft und gekühlt« Man erhält 390 g L-Methionin. Die im Reaktionsgefäss verbliebene Enzymlösung hat ihre Aktivität beibehalten und kann wiederverwendet werden*
Beispiel 3
Ein Extrakt aus 20 g Zellen von Micrococcus lysodeikticue (AICC 4698) mit Histidaseaktivitat und eine Substratlösung von 300 g L-Hi st id in (lt) mg/ml) werden gemäss Beispiel 2 umgesetzt. Die Reaktion wird bei 370C und Pu 7,2 durchgeführt. Sie das Produkt Urocansäure (4-ImidaZolacrylsäure) enthaltende» ausströmende Lösung wird durch einen stark basischen Anionenaustauscher (HDowex 1x2**) in der Chloridfore geleitet. Nach Beendigung der Umsetzung Wird der Anionenaustauecher mit Wasser gewaschen, mit 0,5 η Salzsäure eluiert und das Sluat konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird auf p« 4,5 eingestellt. £e werden421 g Urocaneäure in Form von nadeiförmigen Kristallen erhalten, fp; 223 bis. 2250C.
INSPECTED

Claims (10)

  1. - 11 Patentansprüche
    Verfahren zur kontinuierlichen Durchführung von Enzymreaktionen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktion in einem wässrigen Reaktionsmedium durchführt, das mindestens ein Enzym und mindestens ein Substrat enthälty wobei das wässrige Reaktionsmedium mit einer nichtporösen, semipermeablen Membran in Berührung steht, und das Umsetzungsprodukt durch die Membran entfernt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Substratlösung kontinuierlich zu dem wässrigen Reaktionsmedium gibt und das Produkt kontinuierlich durch die Membran entfernt·
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn· , zeichnet, dass nan ein Druckgefälle über der Membran aufrechterhält. L
  4. 4-. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass aan das wässrige Reaktionsmedium mittels eines inerten Gases unter Druck hält. ;
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn- < zeichnet, dass man die wässrige Substratlösung mit im , wesentlichen gleicher Geschwindigkeit zugibt, wie das Produkt ' abgezogen wird.
  6. 6. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch bis 5, bestehend aus einem geschlossenen» die Substratlösung enthaltenden Druckgefäss, einem geschlossenen, das wässrige Reaktionsmedium enthaltenden Reaktionsgefäss, dessen Wandung zu-
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    mindest zum Teil aus einer nichtporösen, semipermeablen Membran (3) ausgebildet ist, wobei das Druckgefäss und das Reaktionsgefäss über eine Leitung (17; 4) miteinander verbunden sind, die unterhalb des Flüseigkeitsspiegels der Substratlösung im Druckgefäss in das Reaktionsgefäss mündet, und Einrichtungen ! zur Aufrechterhaltung eines praktisch konstanten Drucks im Druckgefäss und im Reaktionsgefäss.
  7. 7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (3) aus einem Dextrangel
    ™ besteht.·
  8. 8. Vorrichtung nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet/ dass die Membran (3) eine Folie aus einem hochvernetzten Dextrangel ist.
  9. 9. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (3) aus einer semipermeablen Folie besteht.
  10. 10. Verwendung der Vorrichtung nach Anspruch 6 bis 9 zur
    Durchführung von Enzymreaktionen nach Anspruch 1 bis 5.
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    L e e rs e i t e
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