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Immobilisierte Multienzymsysteme
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Die Erfindung betrifft immobilisierte Multienzymsysteme in flüssigen
Membranen, ein Verfahren zur Immobilisierung von Multienzymsystemen bzw. Multienzymsystemen
und Kofaktoren mit kontinuierlicher Kofaktorregenerierung unter Verwendung von lipophilen
flüssigen Membranen und die Verwendung von Multienzymsystemen für Biotransformationen.
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In der industriellen Biotechnologie hat sich die Verwendung von Enzymen
für die unterschiedlichsten Reaktionen breit durchgesetzt. Auch die Immobilisierung
von einfachen Enzymen mit dem Ziel einer Erleichterung der Wiederverwendbarkeit
und damit der wirtschaftlicheren Produktion ist heute Stand der Technik (s. L. Buchholz,
Characterisation of Immobilized Biocatalysts, Dechema Monographien 84 (1979)).
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Im Gegensatz zu der Immobilisierung einfacher Enzyme bereitet heute
die Immobilisierung von Multienzymsystemen oder von Enzymsystemen, die einen Kofaktor
und Kofaktorregenerierung benötigen, noch größere Probleme.
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Beschrieben wurde z.B. die Immobilisierung in Festmembranreaktoren
R. Wichmann, Ch. Wandrey, A.F. Bückmann, M.R. Kula; Biotechn. Bioeng. 23 (1981),
2789-2802, die Einkapselung in Mikrokapseln aus semipermeablen Nylon-oder Cellulosenitrat-Membranen
und die sog. Reverse Micelles" (Y. Aamaraki, M. Maeda, A. Kamibayaski; Biotechn.
Bioeng., Vol. 24 (1982), 1915-1918).
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Nach der von N.N. Li entwickelten Flüssigmembran-Technik (US Patent
3 410 794 (1968)) lassen sich auch Enzyme einfach und wirtschaftlich nach Art einer
Wasser-inbl-Emulsion fixieren (T. Scheper, W. Halwachs, K. Schügerl; Chem.-Ing.-Techn.
54 (1982)).
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Es wurde nun gefunden, daß mit der Flüssigkeitsmembran-Technik auch
die Immobilisierung von Multienzymsystemen bzw. von Multienzymsystemen oder Enzymsystemen
mit kontinuierlicher Kofaktorregenerierung möglich ist.
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Die Erfindung betrifft daher immobilisierte Multienzymsysteme bzw.
immobilisierte Enzyme mit Kofaktoren, immobilisiertes Enzym mit Kofaktorregenerierung
und immobilisierte Multienzymsysteme mit kontinuierlicher Kofaktorregenerierung,
die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Multienzymsysteme bzw. Multienzymsysteme
mit kontinuierlicher Kofaktorregenerirung bzw. Enzyme mit Kofaktoren von einer flüssigen
Membran umgeben sind.
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Durch die Flüssigmembran-Technik werden im Prinzip zwei miteinander
mischbare wäßrige Phasen, von denen die eine das Multienzymsystem bzw. Enzym-Koenzymsystem
enthält, durch eine dritte organische Phase, die Flüssigmembran, getrennt. Die Herstellung
der Membrankapseln erfolgt gemäß Abb. 1 in zwei Schritten. Im 1. Schritt wird die
Multienzymlösung bzw. Enzym-Koenzymlösung in die Membranphase durch Verwendung eines
geeigneten Rührers mit hoher Rührerdrehzahl eingerührt, bis sich eine Emulsion bildet.
Um eine Emulsion mit hoher Stabilität zu erhalten, werden der Membranphase gegebenenfalls
geeignete Tenside zugesetzt. Im 2. Schritt wird die hergestellte Emulsion in die
Substratphase mit einem geeigneten Rührer bei kleinerer Rührerdrehzahl eingebracht
und dispergiert. Hierbei bilden sich Emulsionströpfchen mit einem Durchmesser zwischen
etwa 0,1 mm und 1mm. Es können aber auch Tröpfchen mit kleinerem oder größerem Durchmesser
erzeugt werden.
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Weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung
der immobilisierten Multienzymsysteme bzw. immobilisierten Enzyme mit Kofaktoren
und der immobilisierten Multienzymsysteme mit kontinuierlicher Kofaktorenregenerierung.
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Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Multienzymlösung
bzw. eine Enzym-Kofaktor-Lösung in eine Membranphase bis zur Bildung einer Emulsion
gegebenenfalls unter Zusatz von Tensiden einrührt.
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Zur Herstellung der lipophilen, organischen Membran können alle geeigneten
organischen Lösungsmittel verwendet werden. Besonders geeignete Emulsionen ergeben
z.B. Paraffine, Kerosin, Cyclohexan oder Xylol. Es können aber auch alle anderen
geeigneten organischen Lösungsmittel verwendet werden. Wie gefunden wurde, wird
die Stabilität der Emulsion durch Zusatz eines geeigneten Tensids erhöht.
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Die Menge und die Art der verwendeten Tenside sind breit variierbar.
Gut geeignet sind Tenside mit einem HLB-Wert unter 10. Ganz besonders geeignet sind
oberflächenaktive Proteine (z.B. Lecithin); höhere Alkohole (z.B.
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Dodecanol) sowie alle Miglieder der Span -, Bri3 -, MYRJ(3-, Tween
-, PluronicO- oder Atmos2)-Rethe.
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Der Zusatz von Span 8 i der Atlas Chemical Inc., USA als Tensid in
Verbindung mit einem der vorgenannten organischen Lösungesmittel ist besonders gut
geeignet. Als günstig haben sich Konzentrationen zwischen 0,1 und 20 % erwiesen.
Besonders günstig sind Konzentrationen von etwa 5 *.
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Die in der flüssigen Membran eingeschlossenen Enzymsysteme können
in jedem für das Substrat/Enzymsystem geeigneten Lösungsmittel verwendet werden.
Es können auch Lösungsmittelgemische benutzt werden. In diesen Lösungsmitteln darf
sich die organische Membranphase nicht auflösen. Sowohl wäßrige als auch wäßrig
organische Systeme sind geeignet. Bevorzugt werden wäßrige Puffersysteme eingesetzt.
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Mitunter kann es zweckmäßig sein, zwischen Innenphase und Außenphase
eine pH-Differenz aufrechtzuerhalten.
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Die Membran bildet für das immobilisierte System eine selektive Barriere,
die das Enzym in seiner nativen Umgebung hält. Andererseits wird ein Substrat- und
Produktaustausch zwischen den beiden Phasen (Innen-und Außenphase) ermöglicht.
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Die Selektivität des Stofftransportes durch die Membran kann dadurch
gesteigert werden, daß man dem System einen selektiven Carrier zugibt, der bestimmte
Substrate oder Produkte durch die Membran transportieren kann. Als Carrier können
z.B. in der organischen Phase lösliche Ionenaustauscher, Komplexbildner, Kronenether
und biologische Carrier dienen. Zum Transport von Säuren empfiehlt sich die Verwendung
von organischen Aminen, die im Wasser nicht nennenswert löslich sind.
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Es können z.B. verwendet werden: primäre, sekundäre, tertiäre und
besonders quartäre Amine und Amide z.B. N-Lauryl-N-trialkylmethylamin oder Trioctylmethylammoniumchlor
id.
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Als Anionencarrier hat sich Adogen 464ßt (Adogen 46 ist Trioctylmethylammoniumchlorid;
Handelsprodukt der Firma Serva) ganz besonders bewährt. Die Carrier können in verschiedenen
Konzentrationen eingesetzt werden.
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Bewährt haben sich Konzentrationen zwischen 0,5-2 %.
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Ganz besonders bewährt hat sich das in Beispiel 1 -beschriebene System
unter Verwendung von 1 % Adogen 464.
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Als Carrier für basische Verbindungen und Kationen können im Prinzip
alle löslichen Säuren, vorzugsweise organische Säuren, verwendet werden. Es ist
daher im Prinzip möglich, z.B. geeignete organische Carbonsäuren oder Sulfonsäuren
einzusetzen. Besonders bewährt haben sich auch aliphatische und aromatische Hydroxime
(z.B. Lix 6 Henkel) und Phosphorsäureester (z.B. HOE F 2574 Hoechst), Hydroxychinoline
(z.B. Lix 2Henkel), organische Säuren (z.B. Kersatic 1(QR/Shell) und Thiophosphorsäureester
(z.B. O,O-Diethyldithiophosphorsäure).
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Der Einsatz der Enzymsysteme kann dabei in jedem geeigneten Reaktor
erfolgen, sowohl für diskontinuierlichen als auch für kontinuierlichen Einsatz.
Voraussetzung für den kontinuierlichen Betrieb ist die Durchlässigkeit der Flüssigmembran
für Substrate und Produkte.
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Die Verwendung der durch die Flüssigmembran immobilisierten Enzymsysteme
kann entweder diskontinuierlich, halb- oder vollkontinuierlich erfolgen. Bei satzweiser
Verwendung können die Produkte entweder in der Außenphase oder in der Innenphase
angereichert werden.
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Je nach Arbeitsweise wird entweder die Außen- oder die Innenphase
aufgearbeitet. Werden die Produkte in der Außenphase angereichert, muß dafür Sorge
getragen werden, daß sie von der Innenphase durch die Membran nach außen gelangen
können. Bei reiner Diffusion des Produktes kann dieses z.B. durch einen pH-Gradienten
in der Außenphase
angereichert werden. Ist eine Permeation aufgrund
der physikalischen Löslichkeit nicht möglich, wird einer der vorher beschriebenen
Carrier verwendet. Die Aufarbeitung sowohl der Innen- als auch der Außenphase erfolgt
je nach Reaktionstyp in an sich bekannter Weise.
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Für die Außenphase gelten sinngemäß die gleichen Voraussetzungen wie
für die Innenphase Sie müssen aber nicht dieselbe Zusammensetzung haben.
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Wird mit dem immobilisierten System der Reaktor in kontinuierlicher
Reaktionsführung betrieben, muß auf jeden Fall dafür Sorge getragen werden, daß
die Produkte in die Außenphase gelangen. Man geht dabei wie bei dem diskontinuierlichen
Betrieb vor, aber die Außenphase wird kontinuierlich ausgetauscht. Dies geschieht
in an sich bekannter Weise, z.B. durch vorsichtiges Abpumpen oder durch Austausch
über ein geeignetes Filtrationssystem z.B. Membran bzw. Ultrafilter. Wird ein geeignetes
Membranfilter gewählt, hat dieses die Eigenschaft, die Emulsionstropfen im Reaktor
zurückzuhalten, ohne die Emulsion zu brechen. Man kann einen Reaktor mit einem durch
Flüssigmembran immobilisierten Enzymsystem theoretisch unbegrenzt lange betreiben.
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In der Praxis sind allerdings die Standzeiten durch die Stabilität
des Enzyms und der Emulsion begrenzt.
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Temperatur und pH-Wert im Reaktor sind in weiten Grenzen variierbar,
hängen aber im einzelnen von dem verwendeten Enzymsystem ab. Die Enzymkonzentration
im Reaktorsystem ist im Prinzip im Rahmen der experimentellen Grenzen frei wählbar.
Da aber das
Substrat und die Produkte durch die Membran diffundieren
müssen, ist es in der Regel sinnvoll, die Enzymkonzentration an die Diffusionsgeschwindigkeit
anzupassen, da überhöhte Enzymkonzentrationen dann keine weitere Erhöhung der Umsatzraten
erbringen. In einem solchen Falle ist es sinnvoll, die Enzymkonzentration aus wirtschaftlichen
Gründen niedrig zu halten.
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Da Aminosäuren heute z.B. in der Nahrungsmittelindustrie, in der Futterveredelung,
in der Medizin und in der Kosmetikindustrie immer größere Bedeutung erlangen, wurde
die Flüssigmembran-Immobilisierungsmethode an einem System ausgearbeitet, das im
Prinzip zur Darstellung von reinen, natürlichen und unnatürlichen Aminosäuren breit
verwendet werden kann. Im besonderen wurde ein System zur Herstellung von L-Leucin
aus g-Ketoisocaproat entwickelt. Bei diesem Prozeß handelt es sich um die reduktive
Aminierung von $ -Ketoisocaproat (2-Oxo-4-Methylpentansäure) zu L-Leucin. Der Katalysator
ist das Enzym Leucin-Dehydrogenase (LEUDH) (E.C.1.4.1.9). Um ein Enzymsystem mit
kontinuierlicher Kofaktorregenerierung zu erhalten, wird in an sich bekannter Weise
NADH als Kofaktor und als Enzym Formiatdehydrogenase (FDH) (E.C.1.2.1.2) verwendet
(Abb. 3).
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Bei der Reaktion wird Ammoniumformiat eingesetzt, das sowohl als Substrat
für die reduktive Aminierung als auch für die Kofaktoregenerierung dient. Die Anionen
DC -Ketoisocaproat und Formiat werden mit Hilfe des Carriers Adogen 464d) in die
innere Phase transportiert.
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In der Innenphase findet die enzymatische Reaktion statt.
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Die durch die Reaktion entstehende L-Aminosäure liegt bei dem pH-Wert
von 8 in der Innenphase in der anionischen Form vor und wird mit Hilfe des Carriers
in die Außenphase transportiert. Das während der Reaktion gebildete Rohlendioxid
wird in der inneren, wäßrigen Phase gelöst und ebenfalls als Hydrogencarbonation
mit Hilfe des Carriers in die Außenphase transportiert. Bei der beschriebenen Umsetzung
von £-Ketoisocaproat zu L-Leucin mit den oben beschriebenen Enzymen hat sich der
nachfolgende Immobilisierungsprozeß zur Herstellung des Flüssigmembransystems analog
Beispiel 1 als besonders geeignet erwiesen.
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Die Herstellung der Membrankapseln erfolgt in 2 Schritten. Im 1. Schritt
wird die wäßrige Lösung von LEUDH, NADH und FDH mit der organischen Phase und dem
Tensid mit einem geeigneten Rührer, der eine sehr hohe Rührerdrehzahl ermöglicht,
emulgiert. Es bilden sich hierbei Tröpfchen der inneren Phase von einem Durchmesser
zwischen 0,01 mm und 0,1 mm. Die Größe der Tröpfchen ist variierbar durch die Menge
des verwendeten Tensids und durch die Rührerdrehzahl. Das Verhältnis von wäßriger
zu organischer Phase ist in breiten Grenzen variierbar. Ein Verhältnis von ca.
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4-1 : 2 von wäßriger zu organischer Phase hat sich bewährt. Ganz besonders
geeignet ist in diesem Falle ein Phasenverhältnis wäßriger zu organischer Phase
von 3:2. Als Tensid können alle gebräuchlichen Tenside zur Verwendung kommen.
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Besonders bewährt haben sich oberflächenaktive Proteine (z.B. Lecithin);
höhere Alkohole z.B. Dodecanol sowie alle Mitglieder der Span#-, Brij#-, MYRJ#-,
Tween#-, Pluronic#- und Atmos#-Reihe.
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Ganz besonders geeignet für diesen Prozeß ist Span 8 .
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Es kann in Konzentrationen von etwa 0,1 - 20 % eingesetzt werden.
Ganz besonders geeignet ist eine Konzentration von 5 % Span 8 g (Gewichtsprozente,
bezogen auf die organische Phase gemäß Beispiel 1). Nach Herstellung der Emulsion
mit einem hochtourigen Rührer wird diese in der wäßrigen Außenphase dispergiert,
indem mit einem Rührer geringerer Drehzahl Außenphase und Emulsion verrührt werden.
Zur Erzeugung dieser Dispersion haben sich Rührerdrehzahlen zwischen 100 und 1000
Umdrehungen/ Min. bewährt. Besonders geeignet ist eine Drehzahl von etwa 300 Umdrehungen
/Min., z.B. bei Verwendung eines Propellerrührers.
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Die Umsetzung von -Keto-isocaproat zu L-Leucin kann in einer diskontinuierlichen
Versuchsanordnung oder in einer halb- bzw. vollkontinuierlichen Versuchsanordnung
durchgeführt werden. Bei der diskontinuierlichen Arbeitsweise (analog Beispiel 2)
wird in die organische Phase zunächst der Carrier zugegeben, so daß eine 1 %ige
Lösung entsteht. Danach wird die Enzymlösung in dieser Phase emulgiert und die Emulsion
in der äußeren Phase, die Ammoniumformiat und -Ketoisocaproat enthält, dispergiert.
Der pH-Wert der Außenphase wird konstant bei 8 gehalten. Bei diesem System wird
durch Verwendung des Carriers Adogen 464# das Substrat durch
die
flüssige Membran in die Innenphase transportiert und die Produkte von der Innenphase
durch die Membran in die Außenphase. Nach beendeter Reaktion wird die Außenphase
aufgearbeitet. Dies geschieht in an sich bekannter Weise. Man kann aber auch durch
erneute Zugabe von Ammoniumformiat und G6-Ketoisocaproat gemäß Beispiel 3 die Reaktion
weiterlaufen lassen. Die erneute Zugabe von Substrat kann einmal oder mehrfach geschehen,
bis eine ausreichend hohe Endkonzentration an L-Leucin erhalten wird. Man kann dann
entweder die Reaktion abbrechen und durch Abtrennen der wäßrigen organischen Enzymphase
die Außenphase aufarbeiten, oder man kann aber auch nach Trennen der Emulsion von
der Außenphase durch erneute Zugabe frischer Außenphase die Reaktion in Gang bringen.
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Dieser Prozeß kann im Prinzip beliebig oft wiederholt werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann ebenfalls in einer kontinuierlichen
Versuchsanordnung durchgeführt werden.
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Zu diesem Zweck wird die Reaktion in einem Reaktor durchgeführt, der
es ermöglicht, die wäßrige Außenphase durch ein geeignetes Filtersystem von der
organischen Phase kontinuierlich abzutrennen. Man benutzt hierzu ein Filter, vorzugsweise
ein Membranfilter. Diese sind in geeigneter Ausführung im Handel erhältlich. Bei
dieser Arbeitsweise wird die Außenphase durch das Membranfilter kontinuierlich abgesaugt
und der Reaktor wird mit der gleichen Menge frischer Außenphase kontinuierlich versorgt.
Bei dieser Arbeitsweise kann über einen längeren Zeitraum kontinuierlich gearbeitet
werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Immobilisierung von Multienzymsystemen
bzw. von Multienzymsystemen mit kontinuierlicher Kofaktorregenerierung durch Flüssigmembran
kann nicht nur für die Herstellung von Aminosäuren eingesetzt werden, sondern ist
allgemein verwendbar für Reaktionen mit Multienzymsystemen bzw.
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Multienzymsystemen mit Kofaktorregenerierung. So ist es z.B. einsetzbar
für Biotransformationsreaktionen aller Art und für Racematspaltungen. Es ist einsetzbar
im Bereich der Arzneimittelherstellung, der Diagnostika und der Detoxifikation von
Blut oder auch von Abwässern. Die vorgenannten Verwendungen sind ebenfalls Gegenstand
dieser Erfindung.
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Das erfindungsgemäße Verfahren hat gegenüber den bisher beschriebenen
Verfahren eindeutige Vorteile aufzuweisen. Gegenüber dem bekannten Enzymmembran-Reaktorverfahren
hat es z.B. eine wesentlich höhere Austauschfläche und zusätzlich eine durch den
Carrier und die Membran steuerbare Substratselektivität. Dies hat den Vorteil, daß
die Umsatzraten erhöht werden und daß auch unreine Substrate zur Verwendung kommen
können, ohne daß das Enzym dadurch beeinträchtigt wird. Eine mikrobielle Kontamination
der Enzyme wird verhindert, da eine Permeation von Keimen durch die Flüssigmembran
nicht erfolgen. Außerdem hemmt die organische Membran mikrobielles Wachstum.
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Die Flüssigmembran verhindert außerdem das Eindringen von Fremdpeptiden,
Fremdproteinen oder Enzymen, so daß
eine Beeinträchtigung des eingeschlossenen
Enzymsystems, z.B. durch Proteasen, verhindert wird. Die Enzyme und Kofaktoren sind
im Flüssigmembransystem in der Innenphase frei beweglich und nicht durch Diffusionshemmungen
behindert. Hieraus ergibt sich gegenüber Systemen, die mit an Trägern immobilisierten
Enzymen bzw. Kofaktoren arbeiten, eine deutliche Erhöhung der Umsatzraten und damit
eine gesteigerte Wirtschaftlichkeit des Systems.
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Ein großer Vorteil des Flüssigmembran-Prozesses ist der geringe Verlust
an Enzymaktivität durch den Immobilisierungsprozeß. Da keine chemische Veränderung
oder Kupplung des Enzyms erfolgt, wird seine Aktivität auch nicht beeinträchtigt.
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Das erfindungsgemäße Flüssigmembranverfahren kann sowohl für ionische
und hydrophile, als auch für hydrophobe Substrate verwendet werden. Die besondere
Beschaffenheit der hydrophoben Membran verhindert ein Austreten von Enzymprotein
aus der inneren Phase in die äußere Phase. Daher sind hohe Standzeiten des Systems
möglich.
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Abb. 1 zeigt schematisch das erfindungsgemäße Verfahren, d.h. die
Herstellung von Flüssigmembranemulsionen. Die Zahlen in Abb. 1 haben die folgende
Bedeutung: Rührgefäß (1), innere Phase (2), enthaltend das Multienzymsystem, Membranphase
(3) = (6), Rührer (4), innere Phase (5) = (2)-, äußere Phase (7), Membranphase (8),
enthaltend die innere Phase und gegebenenfalls Tensid und Carrier.
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Abb. 2 zeigt ein Modell der Flüssigmembranemulsionen.
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a) stellt den Modellfall dar, b) entspricht der Realität. Die Zahlen
in Abb. 2 haben die folgende Bedeutung.
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Flüssigmembran (9), disperse Phase (10), Tenside (11), kontinuierliche
Phase (12) entsprechend der Produkt-bzw. Substratlösung.
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Abb. 3 zeigt im Schema die Herstellung von L-Leucin.
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Abb. 4, Abb. 5 und Abb. 6 zeigen Flußdiagramme für die Manipulationen
nach den Beispielen 2, 3 und 4.
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Im einzelnen bedeuten die Zahlen in den Abbildungen 4, 5 und 6 folgendes:
Abb. 4 Polarimeter (13), Pumpe (14), pH-Elektrode (15), Dosiaat (16+17), Schreiber
(18), Fritte mit Membranfilter (18a), thermostatisierbarer Reaktor (19).
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Abb. 5 Polarimeter (20), Pumpe (21), pH-Elektrode (22), Dosimat (23+24),
Schreiber (25), Fritte mit Membranfilter (26), thermostatisierbarer Reaktor (27),
Ventil (28), Pumpe (29), Vorratsbehälter (30).
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Abb. 6 Polarimeter (31), Pumpe (32), pH-Elektrode (33), Dosimat (34+35),
Schreiber (36), Fritte mit Membranfilter (37), thermostatisierbarer Reaktor (38),
Pumpe
(39), Pumpe (40), Vorratsbehälter (41), Produktgefäß (42).
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Abb. 7 zeigt ein Diagramm, das die Arbeitsweise nach Beispiel 2 im
kontinuierlichem Betrieb wiedergibt.
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Auf der Y-Achse ist der Umsatz in % wiedergegeben. Die X-Achse entspricht
den Verweilzeiten # in Minuten in der Außenphase.
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Beispiel 1 Herstellung eines Flüssigmembransystems für L-Leucin Als
organische Membranphase zur Herstellung von Enzymemulsionen zur Darstellung von
L-Leucin hat sich Paraffin (dünn) mit 5 % Span 80# (Tensid) und 1 % # Adogen 46
» (Anionencarrier) bewährt. Die Innenphase besteht aus einem Kaliumphosphatpuffer
(50 mM, pH = 8) und den in verschiedenen Konzentrationen gelösten Enzymen (LEUDH;
FDH) und Coenzymen (NAD+). Die wäßrige Phase wird in die organische Phase im Volumenverhältnis
21:1 bei hohen Rührdrehzahlen (Ultra Turrax) 60-120 sec. emulgiert. Es hat sich
herausgestellt, daß eine Standzeit von 5-15 Minuten für die Emulsionsstabilität
beim Dispergieren in die kontinuierliche Substratphase ist.
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Beispiel 2 Herstellung von L-Leucin mit Flüssigmembransystem im Batch-Reaktor
Zur enzymatischen Herstellung von L-Leucin in Satzversuchen wird die Enzymemulsion
- wie unter Beispiel 1 beschrieben -hergestellt. In den Versuchen haben Innen- und
Außenphase folgende Zusammensetzung: Die Zusammensetzung der Innenphase entspricht
50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH=8), 3 mM/l NAD+, verschiedene En-zymkonzentrationen
(siehe Tabelle).
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Die Zusammensetzung der Außenphase entspricht 50 mM Kaliumphosphatpuffer
(pH=8) 800 mM/l Ammoniumformiat, 43,86 mM/l ,-Ketoisocaproat.
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Verkapselte Enzyme (hinter den Spalten Gesamt-Aktivität und Vmax sind
jeweils die Prozentzahlen bezüglich der Werte der nativen Enzyme).
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Zum Start der Reaktion werden 8 ml Enzymemulsion in 60 ml Substratphase
dispergiert (Rührdrehzahl 300-600 (Urpm). Der Reaktor wird auf die optimale Betriebstemperatur
(250'C) thermostatisiert. Der pH-Wert wird konstant gehalten (pH = 8).
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LEUDH (U/ml) Gesamt % Vmax (mM/min) % Ks(mM) FDH (U/ml) Aktivität
(U/ml) 18/10 3,35 62 0,295 90,7 23,8 27/15 5,10 61,2 0,317 88 18,2 36/20 6,08 60,2
0,340 86 8,1 45/25 7,37 59,3 0,411 84,3 11,5 54/30 9,72 58,9 0,440 83,9 9,25
Beispiel
3 Gemäß Beispiel 2 aber mit Nachfüttern (fed batch) Der Beginn der Reaktionsführung
erfolgt wie unter Beispiel 2 beschrieben. Gegen Ende der Reaktion (oder jeweils
nach bestimmten Zeiintervallen) werden 5 ml Substratlösung (800 mM/l Ammoniumformiat
und 87,72 mM/l $ -Ketoisocaproat) zugegeben. Dies kann solange wiederholt werden,
wie die Emulsion stabil ist. Diese Versuche können auch so durchgeführt werden,
daß am Ende der Reaktion die Substrat-, Produktphase abgezogen und neue Substratphase
zugegeben wird.
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Beispiel 4 Beispiel 2 aber im kontinuierlichen Betrieb Die kontinuierlichen
Versuche werden bei verschiedenen Verweilzeiten der Außenphase durchgeführt. Diese
wird ständig durch den Reaktor gepumpt. Je nach der Verweil zeit der Außenphase
werden verschiedene Umsätze (siehe Diagramm) erreicht, wenn die Enzymmengen in der
Innenphase das Verhältnis LEUDH LÜ/ml7/FDH La/ml7 = 45/25 haben.
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Beispiel 5 Mit der beschriebenen Flüssigmembranemulsionstechnik, bei
der die organische Phase eine selektive Barriere bildet, lassen sich weitere enz.
Reaktionen durchführen. Unter anderem: a) Beispiel weiterer Aminosäuredarstellungen
mit Flüssigmembranen:
| HCOOH NAD L-Alanin + H20 |
| ) FDH ( ) ALADH ( |
| FDH zu NADH2 xESuvat + NH4 |
(E.Fiolitakis, C. Wandey /Enzymtechnology, ed. by R.M. Lafferty, Springer Verlag
1983) b) Beispiel für Biotransformationen :
| 1) Pyruvat zactatdehydroqenase . L-Lactat |
| + |
| NADH ?tAD |
| Acetaldehyd Älkoholdehydrogenase Ethanol |
(H. Okada, I. Urabe, M. Muramatsu, S. Furukawy; Adv. in Biotechn. Vol.I, ed. M.
Moo-Young, Pergamon Press 1981)
2) Uridin-5'-dRphospho-glucuronat
+ Phenol
ß-Glucuronid + Uridin-5'-diphosphat (W. Poppe, W. Halwachs, R. Schügerl. Chem.-Ing.-Tech.
56 (1984), Nr. 1,70-71) c) Beispiel für Racemattrennung: 1) N20 + D,L-Phenylalaninmethylester
L-Phenylalanin+D-Phenylalaninmethylester + MeOH (T. Scheper, W. Halwachs, K. Schügerl;
Chem.-Ing.-Tech. 54 (1982) Nr. 7, 696-697) 2) Umkehrung der oben beschriebenen Reaktionen,
d.h. Umsetzung der D.L-Aminosäuren zur α-Ketosäure und der D-Aminosäure.