DE2431002A1

DE2431002A1 - Fermentationsverfahren

Info

Publication number: DE2431002A1
Application number: DE2431002A
Authority: DE
Inventors: Michael Koplove; Thomas Benton Young
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1973-06-28
Filing date: 1974-06-27
Publication date: 1975-01-30
Also published as: FR2235195A1; FR2235195B3; SE7408531L; JPS5036680A; DK346274A; NO742344L; BE817062A; AR203852A1; NL7408666A; US3886046A

Description

DIPL.-CHEM. DR. VOLKER VOSSlUS PATENTANWALT

u.Z.: K 875 (Vo/Mü/kä)
Casei A-374 721-S

E.R. SQUIBB & SONS, INC.
Princeton, N.J., V,St.A.

8 MÜNCHEN 86, SIEBERTSTRASSE 4 PHONE: 47 40 75

CABLE ADDRESS: BENZOLPATENT MÖNCHEN TELEX 5-29453 VOPAT D

27. Juni 1974

¹¹ Fermentationsverfahren "

Priorität: 28. Juni 1973, V.St.Ä., Nr. 374 721

Die Erfindung betrifft ein Fermentationsverfahren unter teilweiser Kreislauf führung der Gärmaische.

Der Bedarf an auf mikrobiologischem Wege hergestellten Produkten nimmt ständig zu, insbesondere auf dem Arznei- und Nahrungsmittelgebiet. Die Herstellungskosten für diese Produkte sind jedoch relativ hoch. Außerdem treten mit steigender Produktion Schwierigkeiten bei der Beseitigung der verbrauchten Fermentationsmaterialien auf. Es wurden zahlreiche Untersuchungen angestellt, um die Herstellungsverfahren möglichst rasch zu gestalten, die Kosten zu vermindern und die Umweltverschmutzung möglichst gering zu halten. Insbesondere wurden solche Bemühungen von der pharmazeutischen Industrie angestellt, wo in großem Umfang mikrobiologische Verfahren zur Herstellung von Antibiotika und anderen biologisch wirksamen Produkten eingesetzt werden. Beispielsweise werden Antibiotika im allgemeinen im Chargenbe-

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trieb hergestellt. Nach beendeter Züchtung werden die Antibiotika aus der Gärmaische abgetrennt. Die verbrauchte Gärflüssigkeit wird im allgemeinen nicht wieder verwendet, sondern als Abwasser verworfen. Es wurden jedoch bereits einige Versuche gemacht, das Mikroorganismenzellmaterial wieder zu verwenden. Dabei wird das Zellmaterial vom gebildeten Produkt abgetrennt, in geeigneter Weise behandelt und bei einer nachfolgenden,chargenweise betriebenen Züchtung der anfänglich vorgelegten Charge zugesetzt.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Fermentationsverfahren zur Verfügung zu stellen, bei dem die eingesetzten Rohstoffe und das gebildete Zellmaterial möglichst gut ausgenutzt werden, das Produkt sich in hoher Konzentration in der Gärmaische anreichert und die Menge an Abfallmaterial möglichst gering gehalten wird.

Gegenstand der Erfindung ist ein Fermentationsverfahren zur Züchtung von ein wertvolles Produkt bildenden Mikroorganismen in einem belüfteten Rührfermenter, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Mikroorganismen kontinuierlich und aseptisch mit einer vorbestimmten Ausflußgeschwindigkeit aus dem Fermenter entfernt, die so entfernten Mikroorganismen ganz oder teilweise in Gegenwart des Produkts unter Bedingungen, die für das Produkt unschädlich sind, abtötet und den das Produkt und die ganz oder teilweise abgetöteten Mikroorganismen enthaltenden Strom mit einer der Ausflußgeschwindigkeit entsprechenden Geschwindigkeit in den Fermenter zurückleitet.

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Vorzugsweise werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Antibiotika, insbesondere Penicillin, Nystatin, Tetracyclin und Amphotericin hergestellt. Jedoch lassen sich nach diesem Verfahren auch andere wertvolle Fermentationsprodukte herstellen, wie Aminosäuren und Vitamine, insbesondere Vitamin B^₂. Ferner lassen sich Steroide herstellen oder umwandeln, insbesondere Triamcinolon.

Beispielsweise wird bei der Herstellung eines Antibiotikums kontinuierlich Gärmaische aus dem Fermenter entnommen. Diese Gärmaische wird ohne vorherige Entfernung des Antibiotikums so behandelt, daß die Lebensfähigkeit der Zellen teilweise oder vollständig zerstört wird. Schließlich wird die so behandelte, das Antibiotikum und das ganz oder teilweise abgetötete Zellmaterial enthaltende Gärmaische kontinuierlich in den Fermenter zurückgeleitet, wo der Züchtungsvorgang weitergeführt wird.

Nach einer Ausführüngsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Mikroorganismenzellen,wie oben: besehrieben, kontinuierlich zerstört und im Kreislauf geführt, wobei aber das Antibiotikum von dem im Kreislauf geführten Strom abgetrennt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich kontinuierlich oder halbkontinuierlich durchführen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform können zu Spitzenzeiten während des Züchtungsvorgangs die Zellen direkt im Fermenter zerstört werden.

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Die Zeichnungen erläutern die Erfindung.

In Fig. 1 wird der mit einer Rührvorrichtung 7 versehene Fermenter 10 mit Hilfe der Pumpe 4 aus dem Vorratsbehälter 5 beschickt. Mit Hilfe der Pumpe 2 wird zusätzlich aus dem Vorratsbereich 1 ein Antischaummittel eingespeist. Der Sauerstoffgehalt im Fermenter wird mit Hilfe eines Meß- und Regelgeräts 3 festgestellt und geregelt. Mit Hilfe der mit der Uhr 9 gekuppelten Pumpe 8 wird Material aus dem Fermenter 10 in die Zerstörungskammer 13 oder 14 gepumpt. Die Zerstörungskammer 13 ist mit einem pH-Meß- und Regelgerät 12 versehen. Mit Hilfe der Umlaufpumpe 11 wird schließlich das Material in den Fermenter 10 "zurückgeleitet.

Die Figuren 2 und 3 zeigen Diagramme, bei denen die Penicillinkonzentration (PEN), die Trockenzellengewichtskonzentration (DCW),

an
die Konzentration an löslichem /organischem Phosphat (PI) und die Konzentration an Ammoniakstickstoff (NH,-N) gegen die Zeit aufgetragen sind, wobei eine Zerstörungskammer mit Ultraschall bzw. mit hohen Scherkräften verwendet wird.

Gegenüber herkömmlichen Fermentationsverfahren zur Herstellung von Antibiotika zeigt das erfindungsgemäße Verfahren verschiedene Vorteile. Die Züchtung kann so durchgeführt werden, daß das Zellwachstum auf eine gewünschte, bestimmte Wachstumsgeschwindigkeit eingestellt werden kann, ohne daß der große Volumendurchsatz eines herkömmlichen kontinuierlichen einstufigen Fermentationsverfahrens mit einer einzigen Passage notwendig ist. Bei

der Gewinnung des Produkts müssen bei herkömmlichen Verfahren re-L -1

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lativ große Gärmaischevolumina aufgearbeitet werden, in denen das Produkt in relativ verdünnter Form vorliegt. Demgegenüber ist beim erfindungsgemäßen Verfahren nur ein geringeres Gärmaischevolumen, dessen Produktkonzentration höher ist, aufzuarbeiten. Ferner macht sich beim erfindungsgemäßen Verfahren eine

da

Einsparung an Rohmaterial bemerkbar,/die Kohlenstoff-, Stickstoff- und Mineralquellen, die im Zellmaterial enthalten sind, im Gegensatz zu den herkömmlichen, mit einer einzigen Gärmaischepassage arbeitenden Verfahren "im Kreislauf geführt werden. Außerdem ergibt sich eine Kosteneinsparung bei der Abfallbeseitigung, da das Volumen an verbrauchtem Material beträchtlich vermindert wird. Schließlich ergeben sich Einsparungen daraus, daß die Fermentationsdauer verlängert werden kann, wodurch sich die Zeit, in der der Fermenter still liegt, vermindert, und die Produktivität-gesteigert wird»

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens muß die Zerstörung der Zellen so vorgenommen werden, daß in den Fällen, bei denen keine Abtrennung des Produktes, insbesondere des Antibiotikums, in dem im Kreislauf geführten Strom vorgenommen wird, keine Zersetzung des Produkts eintritt. Die Lebensfähigkeit der Zellen kann beispielsweise durch kontrollierte Ultraschallbehandlung, pH-Änderung, Temperaturänderung, Nährstoffentzug

(Aushungern), Homogenisieren oder Anwenden von hohen Scherkräftfeldern ·
/ zerstört werden. Besonders bevorzugt ist die Anwendung von hohen Scherkraftfeldern.. Insbesondere wenn die Zerstörung der Zellen in situ, vorgenommen werden soll, ist das Anlegen von hohen Scherkraftfeldern das Verfahren der Wahl.

' -1

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Die nachstehend verwendeten Symbole haben die folgende Bedeutung:

V = Fermentervolumen, ml

X - = Konzentration der lebensfähigen Zellmasse, mg/ml

y. = spezifische Wachstumsgeschwindigkeit, Std.~

F = Geschwindigkeit der Zufuhr bzw. der Entnahme, ml/Std. F_R = Umlaufgeschwindigkeit, ml/Std.

K = abgetöteter Anteil

_·< D = P/V= Verdünnungsgeschwindigkeit, Std." Kjj= Fd ^spezifische Zerstörungsgeschwindigkeit, Std.

Da die Aufrechterhaltung einer bestimmten spezifischen Geschwindigkeit erwünscht ist, ist es notwendig, in der im Kreislauf geführten Gärmaische die dem Wachstum entsprechende Menge an Zellen zu zerstören. Dies erreicht man, indem man die Zerstörungsgeschwindigkeit so einstellt, daß in 1 Stunde die Anzahl an Zellen zerstört wird, die in 1 Stunde im Fermenter gebildet werden. Für beliebige Systeme läßt sich die Umlaufgeschwindigkeit folgendermaßen berechnen:

Cu-D)

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird also ein geeignetes Nährmedium in ein mit einer Belüftung und einer gründlich arbeitenden Rührvorrichtung versehenes Fermentationsgefäß gegeben, sterilisiert, auf die gewünschte Temperatur abgekühlt und mit einer Anzuchtkultur eines Mikroorganismus angeimpft. Man läßt sodann die Zellen solange wachsen, bis die Nähr-

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stoffe der ursprünglichen Vorlage erschöpft sind. Sojdann wird mit der Zufuhr von sterilem Nährmedium begonnen. Wenn die Konzentration der Zellmasse einen gewünschten Wert erreicht hat, wird-ein Teil der Gärmaische.kontinuierlich unter aseptischen Bedingungen aus dem Fermenter entfernt, in eine Zellzerstörungseinrichtung, in der die Zellen teilweise oder ganz abgetötet werden, gepumpt und anschließend in den Fermenter zurückgeleitet. Die Umlaufgeschwindigkeit läßt sich dabei nach folgender Gleichung berechnen. '

V F_R = (n - D) V

Man erreicht einen stationären Zustand, bei dem

(a) die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen und die Konzentration an Zellmasse im Fermenter auf einem gewünschten Wert gehalten werden und

(b) das Produkt sich kontinuierlich anreichert.

Das Ausmaß der Produktanreicherung kann mit Hilfe des Verhältnisses von spezifischer Wachstumsgeschwindigkeit zur Verdünnungsgeschwindigkeit bestimmt werden.

Wenn μ ;ξ> D, d.h. wenn der Fermenter -mit einem geringen Volumen an konzentrierter Nährflüssigkeit gespeist wird, so ergibt sich die Umlaufgeschwindigkeit näherungsweise aus der Formel

^KD

und die Produktkonzentration erreicht ihr Maximum. Wenn die durch die Nährstoffzufuhr hervorgerufene Verdünnung beachtlich ist, so _Lwird am Fermenter zusätzlich eine Leitung zur Entnahme von Gär- ,

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maische vorgesehen. Durch regelmäßige Flüssigkeitsentnahme aus dem Fermenter wird dabei das Volumen im Fermenter auf einem bestimmten Wert gehalten. In diesem Fall besteht das kontinuierliche Verfahren aus.einer kontinuierlichen Nährstoffzufuhr, einer kontinuierlichen Zerstörung und Kreislaufführung der Zellen und einer periodischen Entnahme von Gärmaische aus dem Ferme"nter, um die Produktanreicherung zu gewährleisten.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung von Kalium-Penicillin G unter Verwendung eines Stammes von Penicillium chrysogenum

Es wird ein mit einer Rührvorrichtung versehener Glasfermenter mit einem Arbeitsvolumen von 8 Liter in der in Fig. 1 gezeigten Anordnung verwendet. Die Beschickung des Fermenters mit Nährmedium ergibt sich aus der Tabelle I. Das Nährmedium wird 1 Stunde in einem Autoklaven bei 121⁰C sterilisiert. Sodann wird der Fermenter auf 25 C abgekühlt. Diese Temperatur wird unter Verwendung einer automatischen Temperaturkontrollvorrichtung beibehalten. Der pH-Wert des Nährmediums wird sodann auf 7,0 eingestellt

(einwegige An-aus-steuerung)

und'durch automatische Zugabe/einer lOprozentigen wäßrigen Natriumhydroxidlösung (Volumen/Volumen) auf diesem Wert gehalten. Zu Beginn beträgt die Belüftungsgeschwindigkeit 0,5 WM (Volumteile Luft/Volumteile Nährflüssigkeit/Minute) und die Rührgeschwindigkeit 600 bis 800 U/Minute. Mit dieser Behandlung erreicht man eine Sättigung des Mediums mit gelöstem Sauerstoff. Während der Züchtung wird die Konzentration des gelösten Sauerstoffs durch Erhöhung der Belüftungs- und/oder Rührgeschwindig-

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keit je nach Bedarf auf einem Wert über 50 Prozent gehalten. Eine lOOprozentige Konzentration an gelöstem Sauerstoff ergibt sich dabei aus einem bei 25⁰C und Atmosphärendruck mit. Sauerstoff gesättigtem Nährmedium.

Nachdem die Einstellung des pH-Werts, der Temperatur und der Konzentration an gelöstem Sauerstoff vorgenommen ist, werden 100 ml einer Pilzanzuchtkultur, die bei 25°C im gleichen Nährmedium in einem Schüttelkolben gezüchtet worden ist, in den Fermenter gegeben. Anschließend führt man 24 Stunden die Züchtung wie bei einem einfachen Chargenverfahren durch. Nach dieser Zeit wird die in Tabelle II angegebene Lösung in'einer Geschwindigkeit von 13 ml/Std. eingespeist. Gleichzeitig wird aus dem Fermenter Gärmaische unter aseptischen Bedingungen in einer Menge von 133 ml/Std. entnommen. Davon werden 13 ml/Std.. entfernt und die restlichen 120 ral/Std. werden in ein 4 Liter fassendes, nicht belüftetes Gefäß gepumpt.

Die das Pilznfycel enthaltende Gärmaische wird in diesem Zerstörungsgefäß hohen Scherkräften ausgesetzt, wobei keine Nährstoffe zugesetzt werden (Hungerbedingungen). Die durchschnittliche Verweilzeit im Zerstörungsgefäß beträgt 33 Stunden. Anschließend wird die Flüssigkeit kontinuierlich in den Fermenter zurückgeleitet. Auf diese Weise wird gemäß Fig. 2 eine 300-stündige Produktanreicherung vorgenommen, wobei die Konzentration an lebender Zellmasse konstant bleibt. Der beobachtete Anstieg der Konzentration der Gesamtzellmasse ist darauf zurückzuführen, daß die zerstörten Zeilen im Fermenter nur unvollständig verwertet

werden.
L

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Beispiel 2

Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber anstelle des 4 Liter fassenden Zerstörungsgefäßes ein kontinuierlich arbeitendes Ultraschallgerät zur Zellzerkleinerung. Es werden ebenfalls kontinuierlich 120 ml/Std. Gärmaische aus dem Fermenter entfernt und unter aseptischen Bedingungen durch eine Ultraschallfließzelle (20 KH2), in der die Temperatur mit Hilfe eines

_o gepumpt.

Wasserkühlmantels auf 10 C gehalten wird,/ Dabei reichert sich Kalium-penicillin G bei konstant bleibender Konzentration an lebensfähiger Zellmasse an, wie aus Fig. 3 hervorgeht.

Beispiel 3

Herstellung von Nystatin unter Verwendung von Streptomvces noursei

Während der Züchtung des genannten Stammes werden folgende Bedingungen eingehalten:

Fr = (U-D) V

p= 0,03 Std."*¹
V = 50 000 Liter

K = 0,5

D = 0,006 Std."¹

F_R « (0.03 - 0.006) . 50 000

0,5
H
0,5~

F_R = 0.024 . 50 000

F_R = 2 400 L/HR

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240	g
120	g
8	g
24	g
41,	5 g
2	g
1	g

Tabelle I Vorgelegte Nährmedien

Saccharose (flüssig, 67prozentig Gew./Gew.)

a. Versuchsreihe A

b. Versuchsreihe B

Phenylessigsäure (flüssig ^Opr.ozentig Gew./Gew.) NatriuradihydrogenphQsphat
Ammoniumsulfat
Spurenmineralien

a. -MgSO₄. 7H₂O

b. FeSO/, .

Die vorgenannten Bestandteile werden in den Glasfermentern mit Leitungswasser auf 8 Liter aufgefüllt.

Tabelle II Kontinuierlich eingespeistes

Nährmedium

Saccharose 3800 g

Ammoniumsulfat . 176 g

Phenylessigsäure 350 g

Die vorgenannten Bestandteile werden mit Leitungswasser auf 16 Liter aufgefüllt und 1 Stunde in einem Autoklaven bei 121⁰C sterilisiert.

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Claims

Patentansprüche

Q. Fermentationsverfahren zur Züchtung von ein wertvolles Produkt bildenden Mikroorganismen in einem belüfteten Rührfernren ter, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen kontinuierlich und aseptisch mit einer vorbestimmten Ausflußgeschwindigkeit aus dem Fermenter entfernt, die

so entfernten

/Mikroorganismen ganz oder teilweise in Gegenwart des Produkts unter Bedingungen, die für das Produkt unschädlich sind, abtötet und den das Produkt und die ganz oder teilweise abgetöteten Mikroorganismen enthaltenden Strom mit einer der Ausflußgeschwindigkeit entsprechenden Geschwindigkeit in den Fermenter zurückleitet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen in dem im Kreislauf geführten Strom kontinuierlich vom Produkt abtrennt, den nur die Mikroorganismen enthaltenden Strom durch eine Zerstörungszone leitet und anschließend in den Fermenter zurückführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Fermentationsverfahren chargenweise, halbkontinuier lich oder kontinuierlich durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Antibiotika herstellt.

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5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Penicillin, Nystatin oder Tetracyclin herstellt.
6. Verfahren nach. Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß-man die Zellen durch Hitzebehandlung, Homogenisierung, Behandlung mit Scherkräften, pH-Änderung, Ultraschallbehandlung oder Bestrahlung mit UV-Licht abtötet.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis' 6, dadurch gekennzeichnet, daß man es mit einer spezifischen Zerstörungsgeschwindigkeit der Zellen im Bereich von .0,01 bis 0,02 Std. durchführt.

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