DE3533615A1

DE3533615A1 - Verfahren zur durchfuehrung einer enzymatischen oder mikrobiellen reaktion

Info

Publication number: DE3533615A1
Application number: DE19853533615
Authority: DE
Inventors: Kunizo Hashiba; Masaru Wakayama Sakata; Masanobu Tanigaki; Hidetoshi Wada
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1984-09-22
Filing date: 1985-09-20
Publication date: 1986-04-03
Also published as: GB2164663B; FR2570715B1; JPH0338834B2; JPS6178397A; FR2570715A1; GB2164663A; DE3533615C2; GB8523279D0

Description

-3-Be Schreibung

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen oder mikrobiellen Reaktion, sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen oder mikrobiellen Reaktion, an der mindestens zwei Substanzen teilnehmen, das umfaßt die Verwendung eines Bioreaktors, der so aufgebaut ist, daß ein Enzym oder eine Mikrobe (ein Mikroorganismus) in einem inneren Hohlraum (einer Enzymkammer) angeordnet ist, der (die) vonzwei Folien bzw. Lagen aus porösen Materialien, wie z.B. Membranen, begrenzt ist, die das Enzym oder die Mikrobe (den Mikroorganismus) nicht frei hindurchlassen, und daß die an der Reaktion teilnehmenden Substanzen in äußeren Hohlräumen im Kontakt mit den zwei porösen Materialien angeordnet sind, so daß diese Substanzen die porösen Materialien in Richtung auf den inneren Hohlraum passieren können, um dadurch die Reaktion in der Kammer zu bewirken, und daß die Reaktionsprodukte die porösen Materialien in Richtung auf die äußeren Hohlräume der Kammer passieren können, wodurch sowohl die enzymatisch^ oder mikrobielle Reaktion als auch die Trennung der Reaktionsprodukte wirksam durchgeführt werden können.

Bei den meisten enzymatischen und mikrobiellen Reaktionen sind in der Regel mindestens zwei Substrate und zusätzlieh ein von den Substraten verschiedener Aktivator erforderlich zur Durchführung der Reaktion und es ist selten, daß nur eine einzige Substanz an der Reaktion teilnimmt. Dementsprechend werden in der Regel mindestens zwei Reaktionsprodukte gebildet und es ist ungewohnlich, daß nur ein Reaktionsprodukt gebildet wird. Es ist daher üblich, daß mindestens zwei Reaktionssubstrate und mindestens zwei Reaktionsprodukte an der

enzymatischen oder mikrobiellen Reaktion beteiligt sind. Wenn jedoch zwei oder mehr Reaktionsprodukte erhalten werden, müssen diese Reaktionsprodukte nach Beendigung der Reaktion voneinander getrennt werden, um die gewünschten Produkte zu erhalten. Außerdem kann im Falle einer Reaktion, die mindestens zwei Substrate erfordert, eines davon manchmal als inhibierender oder desaktivierender Faktor gegenüber dem Enzym oder der Mikrobe (dem Mikroorganismus) wirken. Selbst ein Reaktionsprodukt allein kann manchmal als Inhibitor wirken.

Enzymatische und mikrobielle Reaktionen können daher wirksamer durchgeführt werden, wenn die Mengen an diesen Inhibitoren, die in das enzymatische oder mikrobielle Reaktionssystem eingeführt werden sollen, kontrolliert werden können oder wenn diese"Inhibitoren schnell aus der Verfahrensapparatur ausgetragen werden können. Außerdem ist es möglich, eine Stufe der Produkttrennung einzusparen, wenn es möglich ist, einen Reaktor zu verwenden, der auch zur Trennung der Reaktionsprodukte dient. Das Enzym ist im allgemeinen so teuer, daß seine Wiederverwendung zur Herabsetzung der Herstellungskosten unerläßlich ist. Daher ist es von großer Bedeutung für einen Bioreaktor/ daß ein Enzym oder eine Mikrobe (ein Mikroorganismus) leicht aus dem Reaktionssystem für die Wiederverwendung entnommen werden kann.

Ein Bioreaktor, der allen diesen Anforderungen genügt, ist bisher nicht bekannt. Obgleich die Abtrennung eines Enzyms oder einer Mikrobe (eines Mikroorganismus) von einem Reaktionssystem, in dem ein immobilisiertes Enzym oder Mikrobe verwendet wird, oder seine Wiederverwendung möglich ist, ist es beispielsweise unmöglich, den Anforderungen in bezug auf die gleichzeitige Durchführung der Reaktion und Trennung sowie in bezug auf die Kontrolle des Inhibitors zu genügen. In den letzten Jahren wurde bereits versucht, einem immobilisierten Träger, wie z.B.

einem immobilisierten Enzym oder einer immobilisierten Mikrobe, eine Produktabtrennungsfunktion (Adsorptionsvermögen) zu verleihen. Dieses Verfahren bringt jedoch verschiedene Nachteile mit sich. Wenn bei der Reaktion eine als Inhibitor oder Desaktivator wirkende Substanz erforderlich ist, ist es beispielsweise schwierig, bei diesem Verfahren die Menge der Substanz zu kontrollieren. Wenn das Adsorptionsvermögen des Trägers ausgenutzt werden soll, ist eine sehr große Menge des Trägers erforderlich, um die Produkte zu adsorbieren,und dies ist ein Hindernis für die industrielle Anwendung.

Es wurden nun Untersuchungen über einen Reaktor für die Verwendung in einer enzymatischen oder mikrobiellen Reaktion durchgeführt und dabei wurde ein Reaktor entwickelt, mit dessen Hilfe es möglich ist, den obengenannten Anforderungen zu genügen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen oder mikrobiellen Reaktion, an der mindestens zwei Substanzen teilnehmen, das dadurch gekennzeichnet ist-, daß zwei Folien bzw. Blätter bzw. Lagen (nachstehend der Einfachheit halber stets als "Folien" bezeichnet) aus porösen Materialien, die ein Enzym oder eine Mikrobe (einen Mikroorganismus) nicht passieren lassen, in Paaren verwendet werden; daß ein Enzym, eine Mikrobe (ein Mikroorganismus), ein immobilisiertes Enzym oder eine immobilisierte Mikrobe (Mikroorganismus) in einen zwischen diesen porösen Materialien vorgesehenen inneren Hohlraum eingeführt wird; daß jede der an der Reaktion teilnehmenden Substanzen in jeden von zwei äußere Hohlräumen,die außerhalb der porösen Materialien vorgesehen sind, eingeführt werden; und daß die obengenannten Substanzen die porösen Materialien in Richtung auf den inneren Hohlraum passieren gelassen werden, um die Reaktion in diesem Hohlraum zu bewirken.

Das erfindungsgemäße Reaktionsverfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß zwei Folien aus porösen Materialien, wie z.B. Membranen, die ein Enzym oder eine Mikrobe nicht frei passieren lassen, in Paaren verwendet werden; daß ein Enzym oder eine Mikrobe in einen durch die porösen Materialien begrenzten inneren Hohlraum eingeführt wird; daß die an der Reaktion teilnehmenden Substanzen durch die porösen Materialien hindurch in den inneren Hohlraum passieren gelassen werden, um eine enzymatische oder mikrobielle Reaktion zu bewirken; und daß die Reaktionsprodukte nach der Reaktion durch die porösen Materialien passieren gelassen werden, um sie aus dem enzymatischen oder mikrobiellen Reaktionssystem zu entfernen.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegende Zeichnung näher erläutert-. Es zeigen:

Fig. 1 in schematischer Form eine ÄusfÜhrungsform einer erfindungsgemäß verwendeten Vorrichtung in der die Bezugsziffern 1 und 2 poröse Mate

rialien, die Bezugsziffern 3 und 5 Seaktäntenkammern, die Bezugsziffer 4 eine Ehzymkammer und die Bezugsziffer 6 einen äußeren Rahmen darstellen;

Fig. 2 in schematischer Form eine Ausführühgsform

eines erfindungsgemäßen Reaktors vom planaren Membran-Typ;

Fig. 3 in schematischer Form eine Ausführungsform eines Reaktors vom Rohr-Typ; und

Fig. 4 in schematischer Form eine ÄusfÜhrungsform eines Reaktors vom Spiral-Typ.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegende Zeichnung, die bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darstellt, näher beschrieben.

Eine lipolytische Reaktion, in der Lipase verwendet wird, wird nachstehend als Beispiel für die enzymatisch^ Reaktion angegeben, die dargestellt werden kann durch die Formel: A+B —> C+D (worin A und B die an der Reaktion teilnehmenden Substanzen und C und D die Produkte darstellen; wobei beispielsweise in der Reaktion, in der Lipase verwendet wird, A ein Öl, B Wasser, C eine Fettsäure und D Glycerin bedeuten).

Gemäß Fig. 1 wird ein Enzym in einen inneren Hohlraum (eine Enzymkammer) eingeführt, der (die) durch poröse Materialien 1 und 2 begrenzt ist, ein Substrat A wird in einen äußeren Hohlraum 3 (eine Reaktantenkammer) eingeführt und ein Substrat B wird in einen anderen äußeren Hohlraum 5 (eine Reaktantenkammer) eingeführt. Die porösen Materialien 1 und 2 sind so aufgebaut, daß Enzyme sie nicht passieren können, das Substrat A das poröse Material 1 passieren kann und das Substrat B das poröse Material 2 passieren kann. In dem Reaktor gemäß Fig. 1 werden die Substrate A und B, die in den jeweiligen Reaktantenkammern 3 und 5 vorliegen, durch die jeweiligen porösen Materialien hindurch in die Enzymkammer 4 passieren gelassen, worin sie einer enzymatischen Reaktion in Gegenwart des Enzyms unterliegen unter Bildung der Produkte C und D. Ein bevorzugtes poröses Material 1 , das verwendet werden kann, ist ein solches, welches das " Substrat A passieren läßt, jedoch das Substrat B nicht passieren läßt und das nur eines (beispielsweise das Produkt C) der Reaktionsprodukte C und D passieren läßt. Ein bevorzugtes poröses Material 2 ist dagegen ein solches, welches das Substrat B passieren läßt, das Substrat A jedoch nicht passieren läßt und das nur das Reaktionsprodukt D passieren läßt. Poröse Materialien, die

-δ-solche Eigenschaften besitzen, können hergestellt werden durch geeigneteWahl der Qualität und Porengröße des porösen Materials. Bei der Reaktion, bei der Lipase verwendet wird, kann ein hydrophobes Material, wie z.B. Polypropylen oder Polyethylen, als poröses Material verwendet werden, das nur das Öl als Substrat und die Fettsäure als Reaktionsprodukt passieren läßt, und es kann ein hydrophiles Material, wie z.B. ein Cellulosematerial (z.B. Celluloseacetat) oder ein Aerylnitrilpolymeres als poröses Material verwendet werden, das nur Wasser und Glycerin passieren läßt. Die Porengröße der porösen Materialien muß so sein, daß das Enzym oder die Mikrobe diese nicht passieren kann. Da die Größe des Enzyms, wie angenommen wird, in der Größenordnung von mehreren Zehn bis mehreren Hundert A liegt, müssen die porösen Materialien eine Porengröße in der obengenannten Größenordnung haben. In einigen Fällen ist jedoch eine solche feine Porengröße nicht erforderlich, was von den Reaktionssystemen abhängt. So wird beispielsweise bei der Lipolyse mit Lipase in dem Hohlraum 4, der durch die porösen Materialien begrenzt ist, eine Öl/Wasser-'Emulsion gebildet und das Enzym wird auf den Oberflächen der Emulsion suspendiert. Die porösen Materialien können daher eine solche Porengröße haben, daß die Emulsion diese nicht passieren kann,und eine Porengröße innerhalb des Bereiches von 0,1 bis mehreren pm reicht aus, um den Durchgang des Enzyms durch die porösen Materialien zu inhibieren. Wenn ein immobilisiertes Enzym oder eine immobilisierte Mikrobe verwendet wird, ist keine feine Porengröße erforderlich.

Daher können die porösen Materialien entsprechend dem Zweck und der Verwendung ausgewählt werden ohne spezielle Beschränkungen in bezug auf die Qualität oder Porengröße, so lange sie den obengenannten Anforderungen ge^nü9^en·

Ein Enzym oder eine Mikrobe, das (die) in den durch die

— ΟΙ porösen Materialien begrenzten Hohlraum 4 eingeführt werden soll, kann in Form eines Pulvers oder einer Lösung oder einer Suspension in einem Lösungsmittel, das weder das Enzym noch die Mikrobe desaktiviert, vorliegen. Bei der praktischen Durchführung der Erfindung ist es bevorzugt, daß innerhalb des Hohlraums 4 ein Abstandhalter vorgesehen ist und daß das Enzym oder die Mikrobe über den Abstandhalter verteilt oder gegossen wird, um eine Lokalisierung des Enzyms oder der Mikrobe zu verhindern.

IQ Alternativ kann eine Lösung des Enzyms oder der Mikrobe in dem Hohlraum 4 (der Enzymkammer 4) mittels einer Pumpe im Kreislauf geführt werden, wie weiter unten näher beschrieben. Der innerhalb des Hohlraums 4 vorgeseheneAbstandhalter kann ohne spezielle Beschränkungen in bezug auf Material, Gestalt und dgl. verwendet werden. Wenn beispielsweise ein Material, das ein Enzym adsorbieren kann, wie z.B. eine Ionenaustauschfaser, als Abstandhalter verwendet wird, kann das Enzym daran immobilisiert werden. Außerdem können zusätzliche Eigenschaften dem Abstandhalter verliehen werden.

Die Substrate in den Reaktantenkammern 3 und 5 werden in die Enzymkammer 4 diffundiert durch Konzentrationsdiffusion und die Reaktionsprodukte werden aus der Enzymkammer 4 heraus in die Reaktantenkammer 3 oder 5 diffundiert, ebenfalls durch Konzentrationsdiffusion. Wenn die Diffusionsgeschwindigkeit, die nur auf die Konzentrationsdiffusion zurückzuführen ist, zu niedrig ist un'd keine ausreichende Reaktionsgeschwindigkeit erzielt werden kann,

QQ kann jedoch die Diffusion beschleunigt werden durch Anwendung einer Diffusionsbeschleunigungskraft, wie z.B. von Druck oder Temperatur auf jede Kammer. Alternativ ist es möglich, eine Diffusionsbeschleunigungskraft anzuwenden durch Ausnutzung einer osmotischen Druckdifferenz, die dadurch hervorgerufen wird, daß man jeder Kammer ein drittes Material zugibt/ das weder die enzymatische Reaktion noch die mikrobielle Reaktion stört noch das poröse

-ΙΟMaterial passiert.

Per erf^äuhgs%einäB verwendete Bioreaktor kann auf verschlei|ep6 einzymatische und mikrobielle Reaktionen angewendet wenden. Zu Beispielen für solche enzymatischen Reäkti©:^en, an 'denen mindestens zwei Substanzen teilnehmen, gehören <äie obengenannte Lipölyse mit Lipase, die frigiy-ceridsynthese mit Lipase, eine Esteraustauschreaktion von Triglycerid in Gegenwart von Lipäse, die Hydrolyse von iphosphölipid mit Phöspholipase, eine Reihe von Reäktiöne'h mit einer Transferase, wie z.B. die Phosphorolyse eines fölysaeeharids in Gegenwart von Phösphorylase, die Apfeisäuresynthese unter Verwendung von Fumarase, eine Reihe von Reaktionen in Gegenwart einer Hydrolase, wie z.B, Phosphatase oder Nucleotidase, und eine Reihe von Reaktionen in Gegenwart einer Oxidoreduktase, wie z.B. Aikoholdehydrogenase oder Aminosäüreoxidoreduktase. Außerdem kann der erfindungsgemäße Reaktor für die meisten mikiöBieilien Reaktionen verwendet werden, da viele Substanzen zusätzlich zu den Substraten für das Wachstum von Mikroben ei: forder lieh sind. So kann beispielsweise Glu^tämirits-iure"^; aus dem Substrat Glucose in dem GlutaminsäuEefermentationsverfahren unter Verwendung des Mikroorgäriismenstammes: Corynebacterium glütamicum hergestellt werd'en.. Für das Wachstum des Stammes ist jedoch Biotin erforde'riieh und die Ausbeute an Glutaminsäure Variiert in Äbfeämgig/kfeit von der Biotinmenge. Die mikrobiellen Reaktion-eri- erfordern häufig Vitamine, wie z.B. Biotin, ein anor-gaßische's; salz,, eine Aminosäure und dgl., zusätziich zu dem Substrat, wie eö in der obengenannten mikrobie-lletf Reaktion genannt ist, und der erfindungsgemäBe Reaktor kann in den meisten mikrobiellen Reaktionen eingesetzt wer.deri.-.

Die erf indungsgemäß verwendeten' Enzyme und Mikroben sind nicht immer hoch-*rein und sie können sein ein Extrakt, ein: teilweise- gereinigtes Produkt oder eine Fermentations-

flüssigkeit. Zur wirksamen Durchführung der Reaktion mit dem erfindungsgemäßen Bioreaktor/ ist dieser wie in Fig. dargestellt, so aufgebaut, daß eine Vielzahl von Reaktion skammer η vorgesehen ist, wobei jede Kammer gebildet wird, indem man eine Enzymkammer 7 zwischen porösen Materialien 9 und 10 in der Weise anordnet, daß die porösen Materialien der gleichen Art einander gegenüberliegen, zwischen zwei porösen Materialien 9 und 9 eine Reaktantenkammer 5 gebildet wird und zwischen zwei anderen porösen Materialien TO und 10 eine Reaktantenkammer 6 gebildet wird. Jeder der Reaktanten wird in jede der Reaktantenkammern 5 und 6 mittels der jeweiligen Pumpen 3a und 3b eingeführt. In dem Reaktor gemäß Fig. 2 kann auch ein Enzym oder eine Mikrobe mittels einer Pumpe 3 in die Enzymkammer 7 eingeführt werden. In der Fig. 2 stehen die Bezugsziffern 1 und 2 jeweils für einen Reaktantenvorratsbehälter, die Bezugsziffer 4 steht für einen Enzym- oder Mikroben-Vorratsbehälter und die Bezugsziffer 8 steht für einen äußeren Rahmen. Alternativ kann das Enzym oder die Mikrobe auf einem Abstandhalter angeordnet sein durch Vorsehen des Abstandhalters innerhalb der Enzymkammer 7 und Verteilen oder Gießen des Enzyms oder der Mikrobe darauf, wie vorstehend beschrieben.

Der erfindungsgemäß verwendete Reaktor ist nicht beschränkt auf einen solchen vom planaren Membran-Typ, wie in den Fig. 1 und 2 dargestellt, sondern kann auch in einer anderen Form, beispielsweise in Form eines Rohres, wie in Fig. 3 dargestellt, oder in Form einer Spirale, wie in Fig. 4 dargestellt, vorliegen. In dem rohrförmigen Reaktor gemäß Fig. 3 ist zwischen den porösen Materialien 1 und 2 eine Enzymkammer 4 vorgesehen, im Innern der rohrförmigen Membran 1 aus dem porösen Material ist eine Reaktantenkammer 3 vorgesehen, außerhalb der rohrförmigen Membran 2 aus dem porösen Material ist eine Reaktantenkammer 5 vorgesehen und die Bezugsziffer 6 stellt einen äußeren Rahmen dar.

In dem -"Reaktor vom Spiral-Typ gemäß Fig. 4 ist ein Abstandhalter 2 mit einem darauf aufgebrachten Enzym in einen Hohlraum eingeführt, der zwischen Membranen 1 und 3 aus einejn porösen Material gebildet wird unter Aus— bildjung eimer Bnzymkammer. Die Membranen 1 und 3 werden zwischen zwei -folien der äußeren Rahmen 4 und 4 gelegt und sie werden zu einer Spiral-form aufgerollt. Zwischen einem äußeren Rahmen und der Membran 1 wird eine Reaktantenkammer gebildet und zwischen dem anderen äußeren Rahmen und der Membran 3 wird eine andere Reaktantenkammer gebildet.

Eines .der Merkmale der vorliegenden -Erfindung besteht darin, daß ein En_szym oder eine Mikrobe {ein Mikroorganismus) leicht aus dem Reaktionssystem entfernt werden kann wie im Falle eines immobilisierten Enzyms und daß das Enzym oder die Mikrobe (der Mikroorganismus) nicht auf den porösen Materialien immobilisiert ist/ so daß es möglich ist/ nur das Enzym oder die Mikrobe {den Mikroorganismus) auszufeauöichen/ wenn es (sie) desaktiviert ist/ ohne daß es erforderlich ist, die porösen Materialien auszutauschen» Auf diese Weise können die teuren porösen Materialien beibehalten werden■. Wenn inhibitoren bei der enzymatischen pder mikrobiellen Reaktion vorhanden sind, können die Mengen dieser dem Reaktionssystem zuzusetzenden Inhibitoren kontrolliert werden durch Auswahl der Materialien der Membranen oder durch Kontrolle (Steuerung) der Porengröße derselben. Wenn ein Reaktionsprodukt als Inhibitor wirkt, kann das Reaktionsprodukt schnell aus dem Reaktionssystem entfernt werden. Dadurch kann verhindert werden, daß das Enzym oder die Mikrobe desaktiviert wird, und fs (sie) kann wiederverwendet werden. So wirkt Wasser als Substrat beispielsweise als ein Faktor der Lipasedesaktivierung bei der Lipolyse mit Lipäse. Deshalb wird dann,/ wenn die Menge an Wasser übermäßig erhöht wird, das Enzym stark desaktiviert . Wenn die Menge an das poröse. Material passierendem Wasser kontrolliert (ge-

steuert) werden kann, kann nur die erforderliche Menge Wasser dem Reaktionssystem zugeführt werden und es kann verhindert werden, daß die Lipase desaktiviert wird.

wie vorstehend beschrieben, sind die Mengen an Substraten und Reaktionsprodukten in einem enzymatischen Reaktionssystem der vorliegenden Erfindung häufig größer als diejenigen in konventionellen enzymatischen Reaktionen. Außerdem ist die Enzymkonzentration in dem Reaktionssystem im allgemeinen höher als in konventionellen Fällen. Daher ist die Umgebung des Enzyms in dem Reaktionssystem gemäß der vorliegenden Erfindung verschieden von denjenigen konventioneller Systeme, was verschiedene Vorteile mit sich bringen kann. So führte beispielsweise die lipolytische Reaktion unter Verwendung von Lipase, wie vorstehend beschrieben, zu einer Erhöhung der WärmeStabilität des Enzyms. Das heißt, durch Verwendung des erfindungsgemäßen Reaktors wird es möglich, die lipolytische Reaktion mit nicht-wärmebeständiger Lipase bei 40 bis 60⁰C bei geringer Inaktivierung durchzuführen, obgleich diese Lipase als für die Hydrolyse von Ölen mit einem hohen Schmelzpunkt, wie z.B. Rindertalg, ungeeignet anzusehen ist, da sie in der Regel gegenüber Wärme instabil ist und bei einer Temperatur unter 40⁰C behandelt werden sollte. Daher ändert das erfindungsgemäße Verfahren manchmal die Eigenschaften des Enzyms selbst, wie z.B. die Wärmebeständigkeit oder den optimalen pH-Wert, je nach Bedingungen des Reaktionssystems.

Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Reaktion und die Trennung der Reaktionsprodukte gleichzeitig durchgeführt werden können. So können beispielsweise die Reaktion und die Trennung von Fettsäuren und Glycerin, die als Reaktionsprodukte gebildet werden, bei der Lipolyse mit Lipase gleichzeitig durchgeführt werden.

Die Reaktionsrate bzw. -geschwindigkeit in dem erfindungsgemäßen Bioreaktor hängt stark von der Übertragungsrate

bzw. -geschwindigkeit eines Reaktanten durch die poröse Membran des erfindungsgemäßen Reaktors und der Oberflächengröße der Membran ab. Es ist daher wichtig, ein poröses Material· ztt wählen, das den Durchgang der Substrate mit einer hotis'i* Gfesehwindagkeit erlaubt, um· die Reaktionsgeschwindigkeit zn erhöhen. Da die Reaktionsgeschwindigkeit ferner stark von der Oberf lächertgröße der Membranen abhängt, karü* diö; R-estktiöÄSZ&it durch Erhöhung der Oberflächengröße stark verkürzt werden.

Wie vorstehend besehrieben, ergibt der erfindungsgemäße Bionääktor ein Verfahren 2ur makroskopischen. Immobilisierung eines Enzyms oder einer Mikrobe zwischen den porösen Materialien* bei dem das Enzym oder die Mikrobe leicht aus dem Reäkti.öiVs system entfernt y?^erden kann. Außerdem wird es dadurch, möglich, das Enzym oder die. Mikrobe wieder zuverwenden und die D&s&ktivierung desselben (derselben} zu verhindern öoWie gleichzeitig die Reaktion und Trennung der Reaktionsprodukte durchzuführen. Der erfindungsgemäße Bioreaktor ergiijt daheir ein völlig neues Reaktionsverfahren mit verschiedenöii Vorteilen,; welche die konventionellen Verfahren, ifi denen eiß ijfiffiobilisiertes Enzym verwendet wird, nicht ■aufweisen * Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher industriell sehr wertvoll.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher errgüter-ki otoe gedoch darauf beschränkt zu sein.

Beisp^ie-1 1

TO Bögen von .porösen Membranen (Ultrafilter mit einem Frak-

tionie'i?ü.ngsmölekülargewicht von 2Q00), bestehend aus Polyacrylnitril und einer Oberflächengröße von 0,02 m², und TO -Bög^n'von ,porösen Membranen (Porengröße 0,1 \xm) , bestegg hend aus Teflon, einem Warenzeichen für ein Fluorharz, wurden hergestellt. 2 g eines lipolytisehen Enzyms, nämlich Lipase, -deren ikktivität 320 000 Einheiten pro Gramm be-

lfcrug, wurden in einer geringen Menge Sojabohnenöl suspendiert. Etwa 1/10 der Suspension wurden pro Abstandhalter auf einen zwischen den beiden Membranen vorgesehenen Abstandhalter gegossen und der Abstandhalter wurde zwischen die ^beiden Membranen eingesetzt zur Herstellung eines Reaktors vom planaren Membran-Typ, wie er in Fig. 2 dargestellt ist. Bei dem Verfahren dieses Beispiels wird das Enzym auf den Abstandhalter aufgebracht durch Aufgießen der Enzymlösung darauf, während die Enzymlösung mittels einer Pumpe bei dem in Fig. 2 dargestellten Verfahren im Kreislauf geführt wird.

400 g Sojabohnenöl und 400 g Wasser wurden in der Weise im Kreislauf geführt, daß das Sojabohnenöl mit der Teflonmembran in Kontakt gebracht wurde und das Wasser mit der ISpolyacrylnitrilmembran in Kontakt gebracht wurde. Die Temperatur wurde in einem konstanten Temperaturbad bei 30⁰C gehalten, um das Sojabohnenöl in Gegenwart von Lipase zu hydrolysieren.

Nach 24 h betrug die Hydrolyserate des Sojabohnenöls 70 % und die Glycerinkonzentratxon in Wasser betrug 7 %. Der Glyceringehalt des Öls und der Fettsäuregehalt des Wassers betrugen jeweils 0,1 % oder weniger.

Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daß Sojabohnenöl und Wasser die porösen Membranen in Richtung auf die zentrale Enzymkammer passieren können, in der sie mitein-, ander umgesetzt werden, und daß nach der Reaktion die Fettsäuren die poröse Membran passieren können und in die ölkammer diffundieren, während Glycerin die poröse Membran passieren kann und in die Wasserkammer diffundiert. Auf diese Weise können die Reaktion und die Trennung der Reaktionsprodukte gleichzeitig durchgeführt werden.

Beispiel 2

Das in Beispiel 1 verwendete Enzym wurde als solches in dem

Reaktor belassen und die Fettsäure lösung und eine wäßrige Glycerin-J-Qsung wurden nach der Reaktion des Beispiels 1 ana s ge tragen. Dann wurden 400 g frisches Sojabohnenöl und 400 g-, fiiischeS: Wasser, auf ähnliche Weise wie in Beispiel f besqiteiefcen in. den Reaktor eingeführt. Nach 24 h betrug die- Hy#Eolyserate des Sojabohnenöls 70 %, die etwa die gleiche war wie in Beispiel 1.

Außerdem wurde, das Enzym als solches in dem Reaktor be la s-SenuTvdj· && wurden; 400 g frisches Sojabohnenöl und 400 g friiSiih@s- Wasser in den Reaktor eingeführt. Nach 24 h zeigte; der diEi;tte_; Versuph, daß die Hydrolyserate des Sojabohnenils ΤΘ; % betrug.

E)ementspr@0heri;di trat in dem erfindungsgemäßen Bioreaktor Begakfcivierung des Enzyms auf,

i, wurde wirksam durchgeführt,, indem man das Eh,zym SlSy solches in dem Reaktor beließt, nur die Lösungen 2Q-. nash; <iit£- R^a.kti©B austruf und frisches Öl und frisches Wasser einführte,

Is ist kl.§r, daß eine Stufe der Entnahme des Systems aus der Pr.c-ze&apparatur nicht erforderlich ist.

Dieser Versuch wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei diesmal jedoch 10 Bögen

3Q Polyviny3LGhlprid^Membi:anen (Oberflächengröße 0,02 m² und E*or©ng-5Öße 2,5 ^m) als poröse Membranen verwendet wurden, die mit dem öl in Kontakt gebracht werden sollen. Die porösen Membranen, die mit Wasser in Kontakt gebracht werden sollen, waren Polyacrylnitrilmembranen wie in Beispiel

gg 1. Unter ahnlicheii Bedingungen wie in Beispiel 1 wurden 400 g Sojäbohnenöl und 400 g Wasser durch Zirkulation in dejj Eeaktor eingeführt zur Durchführung der Lipolyse. Bei

Verwendung der Polyvinylchloridmembranen wurde eine Diffusion von Wasser in die ölkammer beobachtet und daher wurde eine Druckdifferenz von etwa 0,03 kg/cm² an die Ölkammerseite angelegt, um zu verhindern, daß Wasser in die Ölkammer diffundierte.

Nach 24 h betrug die Hydrolyserate des Sojabohnenöls 80 % und die Glycerinkonzentration in Wasser betrug 8,1 %. Nach 48 h betrug die Hydrolyserate des Sojabohenöls 90 % und die Glycerinkonzentration in Wasser betrug 9 %.

Es wurde gefunden, daß die Reaktionsgeschwindigkeit variierte in Abhängigkeit von dem Material der Membran und der Porengröße derselben, verglichen mit den Ergebnissen des Beispiels 1.

Beispiel 4

Es wurden die gleichen porösen Membranen wie in Beispiel 1 verwendet, wobei diesmal jedoch die Anzahl der Membranen 5 betrug. 400 g Sojabohnenöl und 400 g Wasser wurden in den Reaktor eingeführt. Nach 24 h betrug die Hydrolyserate des Sojabohnenöls 44 %.

Es wurde somit gefunden, daß die Reaktionsgeschwindigkeit stark von der Oberflächengröße der Membran abhing.

Beispiel 5

5 Bögen Celluloseacetatmembranen (Umkehrosmosemembranen mit einem Ausschlußverhältnis von gewöhnlichem Salz von 10 %) mit einer Oberflächengröße von 0,02 m² und 5 Bögen poröse Membranen (Porengröße 0,1 μΐη) wurden hergestellt. Diese Membranen wurden auf die in Fig. 2 dargestellte Weise angeordnet zur Bildung einer porösen Struktur. Eine Enzymsuspension, enthaltend 2,4 g Lipase und 30 0 g Sojabohnenöl, wurde mittels einer Pumpe zwischen den

- und .Polyethylenmembranen im Kreislauf gefühjTt, 55j7.SlT.ren4 300 g SojabohnenÖl und 300 g Wasser mittels einer fpnp.e in .4er Weis.e im Kreislauf geführt wurden, daß ersteres un.4 letzteres jeweils mit der Polyethylenmembran bzw.. mi£. |er Gelluloseacetatmembran in Kontakt gebracht wurden. Das Reaktionssystem wurde in einer thermostatischen Kammer -bei -5Q°C gehalten/ um das SojabohnenÖl mit Lipase z,u hydrolysieren, ©ie Hydrolyserate des Sojabohnenöls nach 48 h beitrug 32 S.

Danach »wurden 4ie Fettsäurelösung uixd die wäßrige Glycerinlösyng ausgetragen, währen4 das Enzym so wie es vorlag zurückgehalten wurde, und es wurden 300 g>-Portionen frisches Sojabohße_:n§| und Wasser auf die gleiche Weise wie vorstehend

IS beschrieben in 4en Reaktor eingeführt. Die liydrolyserate des S^i^bohnenö^s nach 48 h betrug 92 %. Dann wurden 300 g-Pqrtionen zusatz; 1 zehes frisches SojabohnenÖl und Wasser in den Reaktor eingeführt, während das Enzym so wie es vorlag beibehalten, wur-de.

Als irgebmi.s 4er 4ritten Reaktion wurde nach 48 h eine ejf|tss©r§c.hende ^ydrolyserate des Sojabohnenöls (d.h. von 92 %)

Der erfindpngsgemäße Reaktor ermöglicht somit die Abtrennung (Gewinnung), des Produkts und die Wiederverwendung des Enzyms urtte© Apf^echterhaltung der enzymatischen Aktivität bei einer hohen Temperatur (d,fe,, bei 5O⁰C), ohne daß sich, 4,4© Eigenschaften des Enzyms selbst än4ern, noch die-

QQ sef; Yorbehan,4flt; wird,, beispielsweise durch eine Immobilisie-

Vergleichgb^iap ImX

Das ^erfahr-en, des Beispiels 5 wurde wiederholt, wobei dies mal das Substrat. (:dr^h. SojabohnenÖl) _ti Wasser und Lipase unter- S;{Jhr.^-n, miteinander gemischt wurden ohjie Verwendung

des Membranreaktors, um dadurch das Enzym wiederzuverwenden. 300 g Sojabohnenöl, 300 g Wasser und 2,4 g des Enzyms wurden unter Rühren bei 50⁰C ähnlich wie in Beispiel 5 miteinander gemischt. Die Hydrolyserate des SojabohnenÖls nach 48 h betrug 92 %. Nach 48 h wurde die Reaktionsmischung 5 min lang bei 5O⁰C und bei 8000 UpM zentrifugiert. Auf diese Weise wurde die Reaktionsmischung in drei Schichten aufgeteilt, d.h. in eine Ölschicht (obere Schicht), eine Emulsionsschicht (mittlere Schicht) und eine wäßrige Schicht (untere Schicht). Etwa 90 % des Enzyms waren in der Emulsionsschicht verteilt, während die restlichen 10 % dessselben sich in der wäßrigen Phase befanden. Die Emulsionsphase wurde bei der nachfolgenden enzymatischen Reaktion herausgenommen, während die wäßrige Phase der Ultrafiltration unterworfen wurde, um dadurch das darin enthaltene Enzym zurückzugewinnen. Das heißt, die wäßrige Phase wurde durch eine Polyacrylnitrilmembran mit einem Fraktionierungsmolekulargewicht von 2 0 000 unter einem Druck von 1 kg/cm² ultrafiltriert. Dann wurde das in der Membran verbleibende Enzym zurückgewonnen und bei der nchfolgenden enzymatischen Reaktion wiederverwendet. Die konzentrierte Enzymlösung wurde auf diese Weise aus der Emulsionsschicht gewonnen und die Membran wurde dann zu 300 g-Portionen Sojabohnenöl und Wasser zugejeben und 48 h lang bei 50⁰C gerührt ähnlich wie bei der ersten Reaktion. Die Hydrolyserate des Sojabohnenöls bei der zweiten Reaktion betrug 4 5 %. Das Enzym wurde nach dem gleichen Abtrennungsverfahren gewonnen und der dritten Reaktion unterworfen. Die Hydrolyserate des Sojabohnenöls bei der dritten gg Reaktion betrug 6 %.

Die Aktivität des Enzyms nahm somit in signifikanter Weise ab bei dem Verfahren, bei dem Lipase mit einem Öl und Wasser unter Rühren ohne irgendwelche Membranreaktoren 3g bei einer hohen Temperatur (50⁰C) gemischt wurde, wenn die Anzahl der Reaktionen zunahm, so daß es unmöglich war, das Enzym wiederzuverwenden.

3 5 3 3 Z" b

Beispiel 6^: -

Das Verfahre©· des Beispiels. 5 wurde wiederholt, wobei diesmal jedoch das. Sojabohnenöl durch Rindertalg ersetzt wurde,,, der ;bei Raumtofoiperatur fest war. Nach Durchführung der Reaktion. 48· h lang bei 50⁰C betrug die Hydrolyserate des Rindertalgs 90 %. Die zweite und die dritte Reaktion; ergaben ebenfalls ein Hydrolyseverhältnis nach 48 h von jeweils 90 %, 10 Feste- Fe~te,- ψ±& ζ,B. Rindertalg, können somit hydrolysiert werden bei geringer Inaktivierung durch Verwendung des erf ir-dungs.gemäß en Reaktors.

WSPlCTiO

Claims

DR. E. WIEGAND (1932-1980) DIPL.-ING. W. NIEMANN (1937-1982) DR. M. KÖHLER "(1965-1984)- KANZLEI/OFFICE: HERZOG-WILHELM-STR. D-JM)(X) MÜNCHEN 2 W. 44779/85 20. September 1985 KAO CORPORATION Tokyo / Japan Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen oder mikrobiellen Reaktion Patentansprüche - ,

1. Verfahren zur Durchführung einer eηzymatischen oder mikrobiellen Reaktion zwischen mindestens zwei Reaktanten, dadurch gekennze lehne t , daß es die folgenden Stufen umfaßt:

Einführen eines Enzyms, einer Mikrobe (eines Mikroorganismus) , eines immobilisierten Enzyms oder einer immobilisierten Mikrobe (Mikroorganismus) in einen inneren Hohlraum, der zwischen zwei Folien bzw. Lagen aus porösen Materialien vorgesehen ist, die das Enzym und die _f Mikrobe (den Mikroorganismus) nicht passieren lassen, , \ Einführen der Reaktanten in zwei äußere Hohlräume, die Ϊ

jeweils außerhalb der beiden Folien bzw. Lagen vorgesehen sind,
Passierenlassen jedes der Reaktanten durch eine Folie bzw. Lage zur Durchführung der enzymatischen oder mikrobiellen Reaktion in dem inneren Hohlraum und Passierenlassen jedes Produkts durch eine Folie bzw. Lage nach außen.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine·der Folien bzw. Lagen nur einen der Reaktanten und nur eines der Produkte leicht passieren läßt und die andere den anderen Reaktanten und das andere Produkt leicht passieren läßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vielzahl von Paaren der beiden Folien bzw. Lagen so vorgesehen und angeordnet ist, daß zwei Folien bzw. Lagen aus dem gleichen ,porösen Material einander gegenüberliegen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hydrolyse von Ölen und Fetten durchgeführt wird unter Verwendung von Wasser und Öl als Reaktanten und von Lipase als Enzym.

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