DE2030103A1

DE2030103A1 - Verfahren zur Extraktion oder Konzentrierung von antiviralen Stoffen

Info

Publication number: DE2030103A1
Application number: DE19702030103
Authority: DE
Inventors: Colin Crawley Sussex Burbidge (Großbritannien)
Original assignee: Beecham Group Ltd., Brentford, Middlesex (Grossbritannien)
Priority date: 1969-06-18
Filing date: 1970-06-18
Publication date: 1970-12-23
Also published as: BE752144A; GB1252208A

Description

" Verfahren zur Extraktion oder Konzentrierung von antiviralen Stoffen ■".■■"' ·

Priorität: 18. Juni 1969, Grossbritannien, Nr. 30 743/69

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion oder Kon- . zentrierung von antiviralen Stoffen aus mikrobiologischen Re aktionsmedien. · '

Bestimmte mikrobiologische Gärmaischen besitzen antivirale Wirk samkeit, die im Zusammenhang steht mit der Gegenwart von virusartigen .Partikeln und/oder deren "Nuclein"-Säuren, insbesondere Ribonucleinsäuren mit Doppelhelix-Struktur. Die klinische Auswertung dieser antiviralen Wirksamkeit hängt davon ab, ob es gelingt, ^in Verfahren zur Extraktion und Konzentrierung dieser virusartigen Partikel und/oder Nuoleinsäuren (nachstehend bezeichnet als "antivirale Stoffe") zu schaffen.

- Antiviral wirksame Stoffe wurden im Zusammenhang mit bestimmten Sohimmelpilzarten, wie Penicillium, beobachtet. Es sind verschie-

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dene Verfahren zur Extraktion und Konzentrierung dieser antiviralen Stoffe bekannt; keines dieser Verfahren "befriedigt Jedoch.

Aufgabe der Erfindung war es, ein neues, wirksames Verfahren zur Extraktion und Konzentrierung antiviraler Stoffe zur Verfügung zu stellen, bei dessen Anwendung die antiviralen Eigenschaften dieser Stoffe erhalten bleiben.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Extraktion oder Konzentrierung-antiviraler Stoffe aus einer geklärten Gärmaische eines Schimmelpilzes oder einer geklärten und gepufferten lösung eines homogenisierten Mycels eines Schimmelpilzes, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Gärmaische oder gepufferte Lösung der Ultrafiltration unterwirft.

Der Ausdruck "Ultrafiltration" bezieht sich hier auf eine Arbeitsweise, nach der das zu filtrierende Material durch eine semipermeable Membran, vorzugsweise eine Membran vom Celluloseester-Typ, gepresst wird. Die Diffusion der Komponenten des flüssigen Materials durch die Membran erfolgt dabei mit verschiedenen Geschwindigkeiten, welche von den unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften der verschiedenen Komponenten abhängen. Hochmolekulare Komponenten und unlösliche Partikel können somit leicht von der Membran zurückgehalten werden, während das Wasser aus dem System abgetrennt wird. Es erfolgt somit in einer einzigen Stufe eine Fraktionierung und Konzentrierung.

Das Verfahren der Erfindung ist insbesondere auf Schimmelpilze

der Gattung PeniciUium,, wie Penicillium stoloniferum, anwendbar.

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Zur Erhöhung der Wirksamkeit des Verfahrens der Erfindung können weitere Verfahrensstufen angewendet werden. Man kann der Gärmaische oder Pufferlösung beispielsweise zur Ausfällung der antiviral en Stoffe vor der Ultrafiltration mit Ribonucleinsäure (RNS) oder einem ihrer Salze behandeln. Eine bevorzugte Ribonucle irisäure ist die aus Hefe gewonnene Ribonucleinsäure in Form ihres Natriumsalzes.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.·

Beispiel 1

Penicillium stoloniferum (A.T.C.C. 14586) wird folgendermassen

gezüchtet: '

Es wird ein Nährmedium folgender Zusammensetzung verwendet:

Sporulierende Schrägagarkultur (Impfkultur )

Menge,' g/Liter

Glycerin 7#5

Melasse . , . 7» 5

Hefeextrakt 5,0

. NaCl 10,0

MgSO₄.7 H₂O 0,005

KH₂PO₄ 0,006

Pe₂(S0₄)₃(ira₄)₂S0₄.24 H₂O 0,0016

CuSO₄.5 H₂O 0,0001

CaSO₄ 0,25

Agar 20,0

Das Nährraedium wird mit vollentsalztem Wasser angesetzt und auf einen p_H~Wert von 6,6 eingestellt. Dann werden jeweils 40 ml

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in etwa 250 ml fassende Medizinflaschen abgefüllt. Die Flaschen werden mit Watte verschlossen und anschliessend 15 Minuten bei 121⁰C dampfsterilisiert.

Hierauf beimpft man die Schrägagarflaschen aus einer Vorratskultur in Erde und inkubiert bei 26 C, bis' eine gute Sporenbildung erfolgt ist, ' . ■

Piaschenkultür

Mit Watte verschlossene Thompson—Flaschen, die jeweils 150 g Gerste enthalten, werden 2 Stunden bei 121⁰C dampfsterilisiert. Die Sporen einer Schrägagarflasche werden dann in 25 ml einer 3,0 Gew.-$ Glycerin und 0,1 $ Asparagin enthaltenden Lösung suspendiert, und die erhaltene Suspension wird zum Beimpfen von 5 Thompson-Flaschen verwendet, in die jeweils weitere 50 ml des Suspendiermediums eingefüllt werden. Die Flaschen werden dann bei 26 C inkubiert, wobei man sie jeden Tag von Hand schüttelt. Die Inkubation wird solange durchgeführt, bis eine gute Sporenbildung erfolgt, was 'in der Regel 3 bis 4 Tage lang dauert. Man kann die Flaschen mehrere Monate lang bei Temperaturen von 2 bis 3°C lagern,
Nährmedium
Es wird ein Nährmedium folgender Zusammensetzung verwendet:

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JAI-Ir .^O Ort

Tabelle II	■ .	. ··■ -	Gew. -sfo
	0,5
	0,5
ton	0,25
	- 0,25
	0,125
	1,25
	0,1

Bestandteile

Glycerin

Glucose

Trypton

bakteriologisches Pepton

Hefeextrakt

Maisquellwasser

K₂HPO₄

NaCl ■",■"· 0,5

Antischaummittel *) 0,03

p„-Wert eingestellt auf 7»0

*) Sojabohnenöl mit einem Gehalt von 10 fo eines im Handel erhältlichen nichtionischen PolyoxyalkylPnderivats von Propylenglykol (Pluronic L 81).

Das Nährmedium wird mit Leitungswasser angesetzt.

Anzüchtung von vegetativen Keimen für die Einsaat Es werden 75 Liter des Nährmediums in einem 100 Liter fassenden, mit Prallblechen ausgerüsteten Gärtank aus korrosionsbüständigem Stahl dampfsterilisiert. Dann beimpft man den Gärtank mit einer Sporensuspension, die durch Zusatz von 100 ml einer sterilen 0,01 prozentigen wässrigen Lösung eines Netzmittels (Polyoxyäthylenderivat von Fettsäurepartialestern von Sorbitanhydriden) zu einer Thompson-FlaBchenkultur und Schütteln erhalten wurde. Die Vergärung wird 40 Stunden "bei 26⁰C unter Belüften und Rühren durchgeführt.

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• Hauptvergärung .

1500 Liter dea in Tabelle II genannten Nährmediums in einem ■ 2000 Liter fassenden, vollständig mit Prallblechen ausgerüsteten Gärtank aus korrosionsbeständigem Stahl werden dampfsterilisiert. Anschliessend beimpft man den Inhalt des Gärtanks mit 75 Liter der vorgenannten Einsaatkultur und inkubiert unter Belüften und Rühren bis zu 5 Tage bei 26⁰C.

Die Gärmaische (I5OO Liter) wird anschliessend durch Zentrifugieren (Zentrifuges Modell SAHR 5036 von Westfalia Separator Ltd.) geklärt und das Myeel verworfen.

45 Liter der erhaltenen geklärten'Gärmaische, die antivirale Stoffe enthält, werden bei einem' Anfangsdruek von etwa

2
31,5 kg/cm mit einer Geschwindigkeit voa etwa 1000 ml/Min. in Berührung mit einer G©llkl©s©ae«itat-Mesabran einer Oberfläche von

ρ
0,121 βΓ-zirkulieren gelassen. Unter diesen Bedingungen tritt Wasserj das die Hauptmenge der in der Gärmaische vorhandenen einfachen Salze enthält,, durch die Membran hindurch. Wenn der osmotische Druck der Gärmaische während der Konzentrierung an-. steigt, erhöht man den Druck allmählich auf etwa 52 _g 5 kg/cm · Wenn man .bei diesem Punkt angelangt ist₉ hat sich die Gesamtmenge der zirkulierenden-Flüssigkeit auf 1/12 ihres Anfangsvolomens verringert.

ρ Druck stehenden Gärmaische ausgesetzt ist, auf etwa 0,0402 m (1/3 der ursprünglichen Oberfläche) und ezbuht. die Zirkulationsgeschwindigkeit bei einem Druck voä etwa 56, kg/era auf.etwa

1500 ml/Min. Wenn die Gesamtmenge der glrtailierenden Gärmaisohe ;

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sich auf 1 Liter verringert hat, erhöht man den Druotc auf etwa 70 kg/cm². ■■■'·" ' .

Im Dialysat wird keine antivirale Aktivität festgestellt; sie ist vollständig im Retentat verblieben. Etwa 80 $ der in der Gärmaische enthaltenen Salze sind" in das Dialysat übergegangen.

Aufbau der' Membran

Beim vorstehend beschriebenen Versuch'weiden Membranen eines modifizierten Celluloseacetat-Typs verwendet, die ihre Befähigung zur Konzentrierung hochmolekularer Substanzen in technisch tragbaren Geschwindigkeiten behalten, sowie die Diffusion von niedermolekularen Verbindungen, wie Natriumchlorid oder Lactose, gestatten. Typische Kennzahlen derartiger Membranen bei Verwendung einer 0,4 prozentigen Natriumchloridlösung bzw. einer 2 prozentigen LactoseXösung bei einem Druck von 42 kg/cm sind nachstehend angegeben:

Durchsatz, Liter/m² . Tag 2040

zurückgehaltener Natriumchlorid-Anteil, $ 20 zurückgehaltener Lactose-Anteil, $> 70 _:

Beispiel 2

Man kann die vorstehend beschriebene geklärte Gärmaische auch

• ί

folgendermassen behandeln:

Das gekühlte Kulturfiltrat wird mit einer Lösung von 300 g Heferibonueleinsäure in Form ihres Natriumsalzes in 20 Liter Wasser versetzt, das erhaltene Gemisch mit 25 volumprozentiger Schwefelsäure auf einen p_H-Wert von 4»0 eingestellt und pro Volumendes Gemisches mit 0,5 Gewichtsteilen'Kieselguhr-Pilterhilfe

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versetzt. Nach 30 Minuten Rühren filtriert man das Gcmifsch mittels einer Filterpresse. Die in.der Presse zurückgehaltenen Feststoffe wäscht man mit 100, Liter eines Citratpuffers (1,205 g Trinatriumcitrat und 1,235 g Citronensäure/Liter) vom p„-Wert 4,0. Die Waschlösung wird verworfen. Die gewaschenen· Feststoffe werden sodann mit 150 Liter einer 2 gewichtsprozentigen Natriumbicarbonatlösung gewaschen, wobei man die Lösung 1 Stunde im Kreislauf durch die Filterpresse laufen lässt.

Der auf diese Weise erhaltene Extrakt wird durch Ultrafiltration unter Verwendung von "Millipore VS-Membranen" (Gesamtfläche = etwa 0,325 m ) auf etwa 5 Liter konzentriert, und das erhaltene Konzentrat wird durch 1-stündiges Zentrifugieren bei 23 000 g geklärt. Danach werden die virusartigen Partikel in einer Ultrazentrifuge (Beckman Typ 42) bei 186 000 g abzentrifugiert und in der nachstehenden Weise gereinigt.

Die aus rohen virusartigen Partikeln bestehenden Pellets werden in einer Pufferlösung '(0,01-m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan'/ 0,15-m Natriumchlorid mit einem Gehalt von 10/VmI Penicillin G und 50 /"/ml Neomycin suspendiert und die teilchenförmigen Verunreinigungen durch 30 minütiges Zentrifugieren bei 12000 g abgetrennt. Zur weiteren Reinigung überschichtet man eine 10 #-ige Rohrzuckerlösung mit der vorgenannten Suspension und zentrifugiert sofort 90 Minuten bei 186 000 g, wonach man die Pellets nochmals in der vorgenannten Pufferlösung suspendiert und in gleicher Weise, bei 12 000 g zentrifugiert.

009852/2118 BAOORIQINAt.

- ⁹ - 203 01G3

-Ansehliessend wird die Ribonucleinsäure mit Doppelheli;c-Struktur von den gereinigten virusartigen Partikeln durch Behandlung mit einem Netzmittel und Phenol..in Freiheit gesetzt. Dazu .wird die Suspension pro Volumenteil mit 0,1 Gewichtsteil Natriumdodecylsulfat versetzt und 45 Minuten bei 37°C mit einem gleichen Volumenanteil von mit Pufferlösung gesättigtem Phenol extrahiert. Die Phasen werden dann durch Zentrifugieren bei 500 g voneinander getrennt und weitere Extraktionen mit Phenol werden bei Raumtemperatur .durchgeführt,, bis man in zwei aufeinanderfolgenden Extraktionsstufen eine klare Grenzfläche erhält. Nach vollständiger Deproteinisierung wird das Phenol durch Extraktion mit Diäthyläther abgetrennt,-die wässrige lösung mit Natriumacetat bis zu einer Konzentration von 0,2 molar versetzt und die Ribonucleinsäure durch Zugabe von 2 Volumteilen 100 #-igem Äthanol ausgefällt. Das erhaltene Geraisch wird zur vollständigen Ausfällung bei -20⁰C stehen gelassen. Man kann · das Gemisch in dieser Form bis zum Gebrauch aufbewahren oder auch in der vorstehend genannten Pufferlösung v/ieder aufnehmen u,nd lyophilisieren.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren'zur Extraktion oder Konzentrierung von antiviralen Substanzen aus einer geklärten Gärmaische eines Schimmelpilzes, insbesondere der Gattung Penicillium, speziell Penicillium stoloniferum, oder einer geklärten Pufferlösung des homogenisierten Mycels dieses Schimmelpilzes, dadurch gekennzeichnet, dass man die Gärcnaische oder Pufferlösung der Ultrafiltration unterwirft.

2. Verfahren nach Anspruch. 1, dadurch gekennzeichnet,-dass man für die Ultrafiltration eine semipermeable Membran'des Celluloseester-Typs verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch' gekennzeichnet, dass man bei Drücken von etwa 0,7

2
bis 70 kg/cm arbeitet»

4." Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die geklärte Brühe oder Puf- ferlösung vor der Ultrafiltration zur Ausfällung der antiviralen Substanzen mit Ribonucleinsäure oder einem ihrer Salze behandelt.

QQ98S2/.2118 BAD ORIGINAL