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Abstract

本发明涉及一种制备L-肉碱的方法。本发明方法能用一种经济上有利的方式、在一种连续操作的细胞反应器中，通过固定化了的大肠杆菌044 K74、由巴豆基甜菜碱、其盐或衍生物制备L-肉碱。生长性的或静态性的大肠杆菌细胞通过微—或超滤膜保留在一个连续操作的细胞循环反应器中，所说滤膜布置成一种平面膜模式或中空纤维模式。

Description

由巴豆基甜菜碱制备L-肉碱的方法
本发明涉及一种由巴豆基甜菜碱、其盐、它们的其它衍生物或类似物制备L-肉碱的方法。
现在已知，L-肉碱作为一种广泛存在的化合物在物质代谢—尤其是在长链脂肪酸经线粒体膜的转移过程中发挥重要作用。由于肉碱在真核生物体的物质代谢中的功能，导致了它有众多的临床应用，例如用于治疗患肉碱缺乏综合症的病人、用于预防和治疗不同类型心脏病和用于治疗哈默透析病人(Hamodialysepatienten)中。因此L-肉碱就具有作为补充营养物质的价值，且它作为向发酵介质中的添加物，促进酵母和细菌的生长。对这些生物活性的L-肉碱对映体在这些和其它应用中增大的需求导致了在全世界范围对旋光纯的这些甜菜碱的合成途径的研究，因为从抑制由碱乙酰基转移酶和抑制由碱载体蛋白的角度看，化学合成的外消旋体不可用。
为了分离L-异构体，至今所采用的方法是，在使用旋光活性的酸时借助分级结晶方法来拆分外消旋体(例如US 4,254,053，1981)，其中D(+)-肉碱作为副产物产生。该问题可由便宜的手性前体出发，通过不同的生物学方法(高等生物化学工程，生物学工艺150，21-44，1993)来克服。特别感兴趣的是，在使用Genera Escherichia菌株时(ED 0121444，1984；DD 221905，1987；EP 0320460，1989)或在使用Proteus(农业生物化学，52，2415-2421，1988；美国专利US5,300,430，1994)时，使反-巴豆基甜菜碱作立体特异性水合而成为L-肉碱。该方法的优点在于，通过使副产物D-肉碱作化学脱水合，可得到该手性前体。
在文献中描述了的、数量众多的、在一个连续操作的反应系统中使用固定化了的微生物进行的方法具有下述优点：
·可使用较纯的反应介质，因而使提取和/或提纯工艺变得容易；
·通过在反应介质中使用较高的生物催化剂浓度，获得了较高的生产能力并同时抑制了受污染的可能性；
·它对抑制剂或营养物质缺乏的敏感性降低了；
·生物催化剂获得了高的稳定性。
上述优点也适用于一种工业使用的方法。
一个连续操作的反应器—其中微生物通过微滤—或超滤膜持留—是一种固定化的方法，它除了具备前述的优点外，还具有其固定化的成本低和同时使工业放大易于进行的优点。
相应地，本发明的目的是提供一种在一个连续反应器中由巴豆基甜菜碱、巴豆基甜菜碱的盐或其它巴豆基甜菜碱衍生物生产L-肉碱的方法，其中使用了游离的或固定化了的细胞、即大肠杆菌044 K74(DSM8828)的生长性的或静态性的细胞，该细胞借助微滤或超滤膜持留在平面膜—或空心纤维模件中。
大肠杆菌在反应器中保持在20-40℃、pH为6.0-8.0和厌氧条件下，这些条件是诱导肉碱—代谢性酶所必须的。采用一种最小(Minimalmedium)或复合介质作为反应介质。在两种情况下，加入巴豆基甜菜碱、巴豆基甜菜碱盐或其它巴豆基甜菜碱衍生物，直至浓度为25mmol-1M。最小介质中含有不同浓度的酪蛋白水解物和盐(NH4)2SO4、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4·7H2O，而复合介质中含有不同浓度的胰蛋白胨和NaCl。为了改善大肠杆菌的生长，加入了甘油、葡萄糖、核糖、精糖或乳糖。另外，向介质中还加入了抑制巴豆基甜菜碱转变成γ-丁酸甜菜碱的抑制剂(富马酸盐、葡萄糖或硝酸盐)以及诱导剂肉碱—代谢性酶如D-、L-、DL-肉碱、其盐和衍生物，或巴豆基甜菜碱、其盐或衍生物。
在此处所用的、连续式细胞循环反应器中的反应进程可划分成两阶段。第一段由一个反应器罐—其中大肠杆菌细胞与反应介质巴豆基甜菜碱的大部分转化，成为L-肉碱。该反应器罐具有控制pH值、温度和搅拌速度以及用于控制和校正酸浓度的控制单元。借助一个计量泵将反应介质输送到反应器中。必要时，反应器罐需对过量的介质进行卸料。第二段由一个外部返回环路构成，它接到反应器罐之后，并通过一个泵将反应器中的内容物导通经过一个过滤单元。在收集滤液以从中分离作为反应产物的L-肉碱时，过滤中的残留物再返回反应器。为了过滤细胞悬浮体，可使用不同来源的市售过滤器系统，只要它们具有比大肠杆菌细胞粒子小的孔径即可。回泵的速度保持不变，以便达到最好的过滤速率，且以便在过滤过程中使极化膜的生成最小化。
术语“游离的大肠杆菌细胞”表示这样一种状态，在此状态下，整个细胞悬浮在反应介质中，在通过流出溶液作细胞向外流出时不会受到阻碍。术语“固定化了的细胞”描述这样一种状态，其中，整个细胞结合于溶解的聚合物或不溶的载体上，或被包封在膜体系中(见酶工艺学中的方法，卷135，3-30，1987)。
概念“生长条件”定义为这样一种情况，其中整个细胞在其生活周期中消耗底物并形成产物。“静态性的细胞”应理解为未经触动的但非生长性的细胞，它们在特定的条件下具有特定的物质代谢作用(见“生物技术”(Kieslich，K.；Eds.Rehm，H.J.and Reed，G.)化学出版社，魏海姆，德国，卷6a，5-30，1984)。
下面用一些实施例对本发明方法进行解释：
实施例1：
将大肠杆菌044 K74放入一个填充至边缘的、气密封闭的锥形瓶中，在37℃、厌氧条件下、在一个旋转式震动器上(150r.p.m.)培养。使用的复合介质具有下列组成：50mM巴豆基甜菜碱、50mM富马酸酯、5g/l NaCl和不同的胰蛋白胨浓度(介于0.5-10g/l之间)。用KOH将pH调节至7.5。表1中汇总列出了在不同的蛋白胨浓度下的特定的生长速率。
表1：大肠杆菌044 K74的最大的特定生长速率
蛋白胨(g/l) 0.5 1.0 2.5 5.0 10.0
μ最大(h-1) 0.224 0.296 0.351 0.372 0.325
在所说条件下，大肠杆菌生长性细胞处于这样的状态，直至各试验结束时产生20-30mM L-肉碱。
高于5g/l蛋白胨的浓度给出既相似的生长—和动力学参数，又给出生物物质含量(OD 600nm)。与此相对照的是，在低的蛋白胨浓度下，得到了较低的生长参数。
实施例2：
将大肠杆菌044 K74放入一个装填至边缘的、气密封闭的锥形瓶中，在37℃、厌氧条件下、在一个旋转式震动器上(150r.p.m.)培养。所用的复合介质具有下列组成：50mM巴豆基甜菜碱、5g/l胰蛋白胨、5g/l NaCl以及逐次变化的富马酸盐浓度(介于0至75mM)。用KOH将pH调节至7.5。
表2表明，添加富马酸盐造成了大肠杆菌044 K74较高的生长速率，且在稳态下OD在600nm下接近1.0。因此，直到试验结束时，富马酸盐导致产生了20-30mM的L-肉碱生成。在不存在富马酸盐时，仅得到了5mM的肉碱浓度。
表2.在10小时试验期后，在不同富马酸盐浓度下的生物物质(OD600nm)
富马酸盐(mM)       0           25        50       75
μ最大(h-1)      0.21        0.37      0.38     0.39
生物物质OD(600nm)  0.980       0.910     1.00     0.950
实施例3：
大肠杆菌044 K74由巴豆基甜菜碱生成L-肉碱的能力将通过巴豆基甜菜碱诱导产生。诱导试验在使用静态细胞且使用5-75mM巴豆基甜菜碱的条件下进行。在高的巴豆基甜菜碱浓度下，L-肉碱的转化率达到大于60％(表3)。
表3：通过大肠杆菌044 K74的静态细胞生产L-肉碱的量与不同巴豆基甜菜碱浓度的关系
巴豆基甜菜碱(mM) 5 25 50 75
L-肉碱生产(％) 55 60 62 65
实施例4：
将大肠杆菌044 K74装入一个填充直至边缘、气密封闭的锥形瓶中，在37℃和厌氧条件下放在一个旋转式震动器上(150r.p.m.)培养。所用的复合物介质具有下列组成：50mM巴豆基甜菜碱、5g/l胰蛋白胨、5g/l NaCl和50mM富马酸酯。用KOH将pH值调节到7.5。
为了升高反应器中生物催化剂的浓度，且为了在稀释率高于最大的特定生长率的情况下使L-肉碱生产成为可能，采用了一个膜反应器。细胞用一个排除极限为0.1μm的聚砜微滤膜持留并再次使用。膜以一种平面方式排布。表4中汇总列出了在该体系中生物物质含量，表5中汇总列出了该系统中肉碱生产，巴豆基甜菜碱转化率和生产能力。
表4：在一个连续操作的膜反应器中大肠杆菌044 K74的生物物质含量
稀释率(h-1) 0.0 0.2 1.0 2.0
生物物质(g干重/l) 0.5 2.1 9.4 27.0
表5：在一个用大肠杆菌044 K74进行连续操作的细胞反应器中L-肉碱生产巴豆基甜菜碱转化和生产能力
稀释率(h-1) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
L-肉碱生产(％) 0.0 38 42 42 38
巴豆基甜菜碱转化(％) 0.0 24 26 26 30
生产能力(g/l反应器/小时) 0.0 1.75 3.5 5.5 6.5
从表中可明显看出，在一个细胞循环反应器中，使用大肠杆菌044K74的固定了的细胞，由巴豆基甜菜碱生成了6.5/1/小时的L-肉碱，其代谢率接近40％。

Claims (3)

1.由巴豆基甜菜碱制备L-肉碱的方法，包含以下步骤：
1)将巴豆基甜菜碱或其盐或其衍生物加入到两阶段的连续操作的细胞循环反应器中，并且向反应介质中加入防止巴豆基甜菜碱氢化形成γ-丁酸甜菜碱的抑制剂，其中第一阶段的组成是，含有大肠杆菌属的菌株细胞的反应器缸将巴豆基甜菜碱转化为L-肉碱，所述细胞固定于选自陶瓷体、玻璃珠、聚氨酯片的载体上，第二阶段的组成是与反应器缸相连的外部循环回路，其意义在于使反应器的内容物流经过滤器；
2)在无氧条件下合成L-肉碱；且
3)将所述反应介质输送至所述过滤器，收集过滤物，即从反应介质中分离L-肉碱，并将经过滤的含有未反应的巴豆基甜菜碱的剩余液体循环进入步骤1)的细胞反应器中。
2.根据权利要求1的方法，其中细胞是大肠杆菌044 K74(DSM8828)。
3.根据权利要求1的方法，其中细胞是固定在陶瓷体上的。
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