CN1153823A - 发酵生产维生素b6 - Google Patents

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Abstract

一种生产维生素B6的方法，包括培养属于根瘤菌属并能够在有氧条件下在培养基中生产维生素B6的微生物，然后从培养液中分离所得的维生素B6。其中所述培养是在含微生物生长所必需的可吸收碳源，可消化氮，无机盐和其他营养成分，所述培养基还可含有丙酮酸，D-甘氨酸醛，乙醇醛，甘氨酸，1-脱氧-D-苏-戊酮糖，4-羟基-L-苏氨酸或其混合物。本方法提供了高产率的维生素B6，维生素B6是动物，植物和微生物营养所必需的，而且在医药和食品中也是有用的。

Description

发酵生产维生素B6
本发明涉及发酵生产维生素B6的方法。本申请中所用的“维生素B6”包括吡哆醇，吡哆醛和吡哆胺。
维生素B6是动物，植物和微生物营养所必需的。并用在医药和食品中。本发明的目的是提供高效的维生素B6发酵生产方法。
对维生素B6的生产已经有很多研究，而且已知糖酵母，毕赤氏酵母，克雷白氏杆菌，无色杆菌，芽孢杆菌和黄杆菌均产生维生素B6。但是还从未报道用属于根瘤菌属的微生物积累大量的维生素B6。
本发明使其以高产率生产维生素B6成为可能。已经发现属于根瘤菌属的微生物能够在培养液中积累大量的维生素B6，从该培养液中可以以令人满意的纯度回收维生素B6。
因此，本发明涉及生产维生素B6的方法，包括培养属于根瘤菌属并能够在有氧条件下在培养基中生产维生素B6的微生物，然后从发酵液中分离所得的维生素B6。
可以用卡尔斯伯糖酵母ATCC9080[The analysis of Nutrients inFoods，academic Press，London，224-227(1978)]检测发酵液中维生素B6的含量，而且还可以用高效液相色谱分别测量发酵液中维生素B6组分，如吡哆醇，吡哆醛和吡哆胺的含量[Vitain，63,349-369(1989)]。
为了完成本发明，在含有微生物生长所必需的可吸收碳源，可消化氮源，无机盐和其他营养成分的培养基中培养根瘤菌属的微生物。可以使用的碳源有，如葡萄糖，果糖，乳糖，半乳糖，蔗糖，麦芽糖，淀粉，糊精或甘油。可使用的氮源有如胨，大豆粉，玉米浆，肉提取物，硫酸铵，硝酸铵，脲或其混合物。此外可以使用的无机盐有，钙，镁，锌，锰，钴或铁的硫酸盐，盐酸盐或磷酸盐。而且如果需要，还可以补充常规营养因子或抗泡剂如动物油，植物油或矿物油。适宜的培养基pH为约5.0-约9.0，优选的是6.5-7.5。适宜的培养温度为约10-40℃，优选的是26-30℃。培养时间适宜为1-14天，优选2-7天。在培养过程中，通气和搅拌通常会得到有利的结果。丙酮酸盐，D-甘油醛，乙醇醛，甘氨酸，1-脱氧-D-苏-戊酮糖，4-羟基-L-苏氨酸或其适当的组合在培养基中的存在对维生素B6的滴定度更有利，因此其存在是优选的。作为维生素B6生产的补充，1-脱氧-D-苏-戊酮糖和4-羟基-L-苏氨酸的组合的特别有效的。还可以通过在有适当pH的缓冲液中培养从培养液中分离的根瘤菌属微生物来生产维生素B6，所述缓冲液含有适当组合的D-甘油醛，乙醇醛，甘氨酸，1-脱氧-D-苏-戊酮糖，4-羟基-L-苏氨酸。培养后，从培养液中分离生产的维生素B6，然后纯化。为了达到该目的，利用维生素B6的特性可以使用从培养液中分离维生素B6的常用方法。因此，如从培养液中除去细胞后，用离子交换树脂或相似的方法纯化在滤液中的所需物质。洗脱后，从醇中再结晶所需的物质。
根据本发明所用的微生物包括属于根瘤菌属的所有菌株，它们能够生产维生素B6并且被保藏在任何人要求后均可得到的公开的保藏机构(收集中心)，如Institute of Fermintation Osaka，Japan(IFO)，the Ministry ofagricuture，Forestry and Feshery，Japan(MAFF)或the Institute ofApplied Microbiology，the University of Tokyo，Japan(IAM)；所述保藏菌株的实例是苜蓿根瘤菌IFO14782，苜蓿根瘤菌MAFF303040，苜蓿根瘤菌MAFF303047，苜蓿根瘤菌MAFF303097，Rhizobium trropiciIFO15247，Rhizobium huakuii IFO 15243，豌豆根瘤菌IFO 14778，Rhizobium galegae IFO 14965，Rhizobium fredii IFO 14780，Rhizobiumloti IFO 14998，Rhizobium sp.IAM 13623和Rhizobium sp.IAM 13631。在根瘤菌属的这些菌株中特别优选的是苜蓿根瘤菌IFO14782和Rhizobiumtrropici IFO15247。苜蓿根瘤菌IFO14782和Rhizobium trropiciIFO15247还于1995年9月4日被保藏在德国的DSM(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkultren GmbH)，保藏号分别为DSM 10226和10227。
通过下列实施例将更详细地说明本发明；但是应理解本发明不限于这些特定的实施例。
                   实施例1
将在含0.1％酵母提取物(Difco)，0.5％甘露醇，0.07％K2HPO4，0.01％KH2PO4，0.1％MgSO4·7H2O和1.5％琼脂(pH7.0)的琼脂培养基上生长的一菌环量苜蓿根瘤菌IFO14782(DSM No.10226)接种到含5ml种子培养基的试管中，所述种子培养基含1％葡萄糖，0.5％聚胨(Nippon Seiyaku Co.，Japan)，0.2％酵母提取物(Difco)，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.001％MnSO4·5H2O和0.001％FeSO4·7H2O，然后在28℃将试管在往复振荡器(285rpm)上振荡17小时。将4ml种子培养物接种到带2个隔板，含200ml培养基的500-ml烧瓶中，所述培养基含4％葡萄糖，4％聚胨S(Nippon SeiyakuCo.，Japan)，0.8％酵母提取物(Difco)，0.05％MgSO4·7H2O，0.05％MnSO4·5H2O，0.001％FeSO4·7H2O和一滴消泡剂CA-115(Nippon Seiyaku Co.，Japan)，然后在28℃旋转振荡(180rpm)培养烧瓶。培养168小时后，按如下所述，用卡尔斯伯糖酵母ATCC9080，通过浊度法检测培养上清液维生素B6的含量。用蒸馏水将所述上清液和吡哆醇(0-100mg/l)标准溶液系列稀释到1.731×10-4。依次将200μl稀释的溶液，1.5ml蒸馏水和40μ1.155NH2SO4加到试管中。于120℃高压灭菌20分钟后，将1.5ml含卡尔斯伯糖酵母ATCC9080的维生素B6的检测培养基(Nissri Co.，Japan)加到试管中，在28℃以30°角培养。培养17小时后，通过加入5ml 0.2N的盐酸使细胞停止生长，然后测量在660nm的吸收值。将样品的浊度与卡尔斯伯糖酵母ATCC 9080的标准生长曲线比较，从而确定样品中的维生素B6量。结果，168小时培养液的上清液每升含84mg维生素B6。此外，将100μl 4’-脱氧-吡哆醇(100mg/l)作为内物质加到168小时培养液的上清液中后，在Capcell pakC18 SG120柱(4.6×250mm，Shiseido Co.，Japan)上，用HPLC系统，在λ＝292nm，以1.0ml/分的流速用0.1M高氯酸钠，0.1M磷酸钾和2％乙腈(pH3.5)混合溶剂分析混合物，所述HPLC系统由Waters Model600E系统控制器，Waters Model 600F泵，Waters Model 99J光敏二极管箭头指示标记，Waters Model 700卫星WISP样品注射器和Waters5200打印机组成。结果发现所述上清液每升含有78.6mg吡哆醇。
                 实施例2
用与实施例1中所述相似的方法，培养苜蓿根瘤菌MAFF303040，苜蓿根瘤菌MAFF303047，苜蓿根瘤菌303097，Rhizobium huakuii IFO15243，豌豆根瘤菌IFO14778，Rhizobium trropici IFO15247(DSMNo.10227)Rhizobium galegae IFO 14965，Rhizobium fredii IFO14780，Rhizobium loti IFO，Rhizobium sp.IAM 13623和Rhizobiumsp.IAM 13631。在每个菌株均培养168小时后，通过使用卡尔斯伯糖酵母ATCC 9080的浊度法，检测培养液上清液中维生素B6的含量。结果示于表1。
              表1用根瘤菌菌株生产维生素B6
根瘤菌菌株     维生素B6(mg/L)
苜蓿根瘤菌MAFF 303040苜蓿根瘤菌MAFF 303047苜蓿根瘤菌MAFF 303097Rhizobium huakii IFO 15243Rhizobium leguminosarum IFO 14778Rhizobium tropici IFO 15247Rhizobium galegae IFO 14965Rhizobium fredii IFO 14780Rhizobium loti IFO 14998Rhizobium sp.LAM 13623Rhizobium sp.LAM 13631     10.830.511.619.79.859.007.814.0210.36.705.11
                         实施例3
从与实施例1所述相同的条件下制备的苜蓿根瘤菌IFO14782(DSMNo.10226)的培养液中回收维生素B6。通过使用卡尔斯伯糖酵母ATCC9080的浊度法确定各纯化步骤中维生素B6的浓度。将1升168小时的培养液以8000rpm离心10分钟。用1N盐酸将所得上清液的pH调到3.1，然后将上清液加到装有350ml Amberlite CG120(H+形式，100-200目，Organo Co.Ltd)的柱(3.6×40cm)。用300ml去离子水洗涤该柱，然后用5％氢氧化铵洗脱。减压浓缩维生素B6组分。将由此所得的残留物溶解在10ml 0.01M甲酸铵(pH3.2)中。将该溶液加到装有180mlDowex 50wx8(铵形式，200-400目，Dow Chemical Co.Ltd U.S.A.)的柱(2.4×40cm)上。用200ml 0.01M甲酸铵(pH3.2)洗柱。然后用200ml 0.05M甲酸铵(pH4.25)的起始缓冲液，接着用200ml各0.05M和0.5M甲酸铵(pH7.0)缓冲液的线性梯度将柱展开。色谱得到有抗卡尔斯伯糖酵母ATCC 9080生长活性的一个主峰和2个小峰。将主峰的组分减压浓缩到小体积，用1N盐酸将溶液pH调到3.1，然后将溶液加到装有75mlAmberlite CG 120(H+形式，100-200目)的柱(1.8×40cm)上。用150ml去离子水洗涤该柱，然后用5％氢氧化铵洗脱。减压浓缩具有抗卡尔斯伯糖酵母ATCC 9080生长活性的组分。将固体残留物溶解在少量热乙醇中，将所述溶液在4℃过夜保持。通过过滤收集所得的沉淀，真空干燥以得到51mg的粗晶体。将这些从乙醇中再结晶以得到44mg熔点为160℃的白色晶体。产物的红外吸收值，UV吸收值和NMR谱与真正的吡哆醇的一致。另一方面，在实施例1中所述的分析条件下用HPLC分析与有抗卡尔斯伯糖酵母ATCC 9080生长活性的两个小峰，并且证明分别是吡哆胺和吡哆醛。
                       实施例4
在与实施例1相同的培养条件下制备Rhizobium trropici IFO15247(DSM No.10227)的种子培养物。将4ml种子培养物接种到两个含200ml培养基的500ml烧瓶中，所述培养基含有2％葡萄糖，1％聚胨，0.2％酵母提取物(Difco)，0.05％MgSO4·7H2O，0.05％MnSO4·5H2O和0.001％FeSO4·7H2O和一滴消泡剂CA-115。另外将4ml含1％1-脱氧-D-苏-戊酮糖(下文称为DTP)和1％4-羟基-L-苏氨酸(下文称为HT)的灭菌水加到一个烧瓶中，将4ml灭菌水加到另一烧瓶中。在28℃旋转振荡器(180rpm)上振荡这两个烧瓶。在28℃培养96小时后，按实施例1中所述，通过使用卡尔斯伯糖酵母ATCC 9080的浊度法检测培养液上清液中维生素B6的含量。正如表2中所总结的，在含用DTP和HT补充的培养基的烧瓶中每升生产45mg维生素B6，而在不含DTP和HT的培养基的烧瓶中每升只生产3.16mg维生素B6。此外，用实施例3中描述的方法，从1升用各0.02％的DTP和HT补充的96小时培养液中分离得到了19.3mg熔点为159.5℃白色晶体。所述产物的红外吸收值，UV吸收值和NMR与真正吡哆醇的一致。表2用Rhizobium trropici IFO15247(DSM No.10227)生产的维生素R6
    培养基     维生素B6(mg/l)
用DTP和HT补充的培养基      45.0
不含DTP和HT的培养基      3.16
DTP：1-脱氧-D-苏-戊酮糖，HT：4-羟基-L-苏氨酸
                  实施例5
在与实施例1所述相同的培养条件下培养苜蓿根瘤菌IFO 14782(DSM No.10226)。在28℃培养72小时后，以8000rpm离心10分钟收集细胞，用100ml灭菌的0.85％氯化钠溶液洗涤两次，然后悬浮在88ml灭菌蒸馏水中。于28℃在含10ml 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)的试管中往复振荡(285rpm)完成维生素B6的生产，所述缓冲液含有0.02％DTP，0，24％乙醇醛，0.24％甘氨酸和细胞悬浮液(在600nm的最后光密度＝20/ml)。在28℃振荡24小时后，在与实施例1所述相同的分析条件下用HPLC确定反应混合物上清液中的维生素B6。正如在表3中所总结的，从DTP，乙醇醛和甘氨酸生产出9.66mg/l吡哆醇。表3用苜蓿根瘤菌IFO14782(DSM No.10226)从DTP，乙醇醛和甘氨酸生产吡哆醇
    底物     吡哆醇(mg/l)
DTP＋乙醇醛＋甘氨酸    9.66
无     0
DTP：1-脱氧-D-苏-戊酮糖
                    实施例6
用与实施例5所述相同的方法制备苜蓿根瘤菌IFO 14782(DSM No.10226)的洗涤的细胞悬浮液。在28℃含10ml 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.6)和洗涤的细胞悬浮液(在60nm的最后光密度＝20/ml)的试管中往复振荡(285rpm)完成维生素B6的生产，所述缓冲液由0.24％丙酮酸盐，0.24％D-甘油醛和0.02％HT组成。在28℃培养24小时后，按实施例1中描述的分析条件用HPLC得到反应混合物上清液中的维生素B6。正如表4中所总结的，从丙酮酸盐，D-甘油醛，和HT每升生产了9.66mg吡哆醇。表4用苜蓿根瘤菌IFO 14782(DSM No.10226)从丙酮酸盐，D-甘油醛，和HT生产吡哆醛
    底物     吡哆醇(mg/l)
丙酮酸＋D-甘油醛＋HT     10.1
无     0
                 实施例7
用与实施例5所述相同的方法制备苜蓿根瘤菌IFO 14782(DSM No.10226)的洗涤的细胞悬浮液。在28℃含10ml 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.6)和洗涤的细胞悬浮液(在600nm的最终光密度为20/ml)的试管中往复振荡(285rpm)完成维生素B6的生产，所述缓冲液由0.24％丙酮酸盐，0.24％D-甘油醛、0.24％乙醇醛和0.24％甘氨酸组成。在28℃培养24小时后，按实施例1中描述的分析条件用HPLC得到反应混合物上清液中的维生素B6。正如表5中所总结的，从丙酮酸盐，D-甘氨酸醛，乙醇醛和甘氨酸每升生产了9.66mg吡哆醇。表5用苜蓿根瘤菌IFO 14782(DSM No.10226)从丙酮酸盐，D-甘氨酸醛，乙醇醛和甘氨酸生产吡哆醛
            底物     吡哆醇(mg/l)
丙酮酸＋D-甘氨酸醛＋乙醇醛＋甘氨酸     9.66
无     0

Claims (10)

1.生产维生素B6的方法，包括培养属于根瘤菌属并能够在有氧条件下在培养基中产生维生素B6的微生物，然后从培养液中分离所得的维生素B6。
2.根据权利要求1的方法，其中所述培养是在含微生物生长所必需的可吸收碳源，可消化氮，无机盐和其他营养成分以及存在丙酮酸，D-甘氨酸醛，乙醇醛，甘氨酸，1-脱氧-D-苏-戊酮糖，4-羟基-L-苏氨酸或其混合物的培养基中完成的。
3.根据权利要求2的方法，其中所述培养是在含微生物生长所必需的可吸收碳源，可消化氮，无机盐和其他营养成分以及存在1-脱氧-D-苏-戊酮糖，4-羟基-L-苏氨酸或其混合物的培养基中完成的。
4.根据权利要求1-3的任一方法，其中所述培养是在pH为约5.0到约9.0完成的。
5.根据权利要求4的方法，其中所述培养是在pH为约6.5到约7.5完成的。
6.根据权利要求1-5的任一方法，其中所述培养是在温度为约10-40℃完成的。
7.根据权利要求6的方法，其中所述培养是在温度为约26-30℃完成的。
8.根据权利要求1-7的任一方法，其中所述培养是1-14天。
9.根据权利要求8的方法，其中所述培养是2-7天。
10.根据权利要求1-9的任一方法，其中所述微生物是苜蓿根瘤菌IFO 14782(DSM No.10226)或Rhizobium tropici IFO 15247(DSM No.10227)。
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