DE69622114T2

DE69622114T2 - Fermentative Herstellung von Vitamin B6

Info

Publication number: DE69622114T2
Application number: DE69622114T
Authority: DE
Inventors: Tatsuo Hoshino; Keiko Ichikawa; Masaaki Tazoe
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1995-09-30
Filing date: 1996-09-25
Publication date: 2003-02-27
Anticipated expiration: 2016-09-26
Also published as: CN1153823A; EP0765938A2; JPH09107985A; EP0765938B1; CN1111605C; EP0765938A3; US5766894A; ES2179141T3; DE69622114D1; DK0765938T3; ATE220107T1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B&sub6; durch Fermentation. "Vitamin B&sub6;", wie es in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, schließt Pyridoxol, Pyridoxal und Pyridoxamin ein.
Vitamin B&sub6; ist wesentlich für die Ernährung von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen und wird als Arzneimittel und in Lebensmitteln verwendet. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein fermentatives Herstellungsverfahren für Vitamin B&sub6; in höchst effizienter Weise bereitzustellen.
Es gibt viele Untersuchungen zur Herstellung von Vitamin B&sub6; und es ist bekannt, dass verschiedene Mikroorganismen, die zu den Gattungen Saccharomyces, Pichia, Klebsiella, Achromobacter, Bacillus, Flavobacterium und Rhizobium gehören, Vitamin B&sub6; erzeugen. So wird in Soobshch. Akad. Nauk. Gruz. SSR 1977, 87(2), 465-7/Chem. Abs. 88, Nr. 3, 18836d (1978) berichtet, dass alle sechs Stämme von Rhizobium leguminosarum variable Mengen an Pyridoxin und Riboflavin in der Kultur erzeugten; die Menge an Pyridoxin variierte von 115 bis 302 ug/g Trockengewicht Zellen. Isopol'z Mikroorganizmov Ikh Metab. Nar. Khoz. 1973, 79-83/Chem. Abs. 81, Nr. 23, 150221j (1974) präsentieren eine Untersuchung der Synthese der Vitamine B&sub1;, B&sub6; und von Nicotinsäure durch Rhizobium-Bakterien von Lupinen, wobei Nicotinsäure in den größten Mengen von den Rhizobium- Bakterien synthetisiert wird, z. B. von einem Stamm in der Menge von 197,6 ug/g Trockengewicht Zellen. Die Untersuchung schließt daraus, dass die Fähigkeit von Rhizobium-Bakterien, Pyridoxin zu synthetisieren, nützlich sein kann als indirektes Kriterium zur Selektion aktiver Bakterienstämme. Mikrobiologiya 1968, 37(3), 433-439/Chem. Abs. 69, Nr. 19, 74622a (1968) deutet an, dass neun bakterielle Stämme von Rhizobium, die in Bohnenknötchen gefunden wurden, u. a. Pyridoxin erzeugen und dass verschiedene dieser Stämme sich in ihrer Fähigkeit, Pyridoxin und Riboflavin zu erzeugen, unterscheiden. Eine weitere Untersuchung wird in Ekol. Pochv. Mikroorg. 1974, 3-6/Chem. Abs. 83, Nr. 1, 4617t (1975) berichtet, worin bei aktiven und inaktiven Stämmen von Rhizobium lupini die Abhängigkeit der Synthese von Riboflavin und Pyridoxin von der Kohlenstoffquelle untersucht wurde unter Anwendung von Mannit, Glucose und Saccharose; es wurde gefunden, dass der intrazelluläre Gehalt an Pyridoxin in aktiven Stämmen in Medien mit Mannit und Glucose höher war, als in solchen mit Saccharose und dass die Pyridoxinsynthese bei inaktiven Stämmen weniger durch die Kohlenstoffquelle beeinflusst wurde. Schließlich berichtet das Sowjet-Union-Patent SU 629204A/- Derwent (C) Week 7931-79-S7755B; XP-002055631, dass der neue Bakterienstamm Rhizobium meliloti 441, der in Wurzelknötchen von Luzerne gefunden wurde, äußerst aktiv ist als Stickstoff fixierendes Mittel und u. a. die Produktion von Vitaminen der Gruppe B fördert. Die Ansammlung einer großen Menge von Vitamin B&sub6; durch die Mikroorganismen, die zur Gattung Rhizobium gehören, wurde jedoch nie berichtet.
Die vorliegende Erfindung macht es möglich, Vitamin B&sub6; in hoher Ausbeute zu erzeugen. Es wurde gefunden, dass die Mikroorganismen, die zur Gattung Rhizobium gehören, eine große Menge an Vitamin B&sub6; in der Kulturbrühe ansammeln können in Gegenwart von Pyruvat, D-Glyceraldehyd, Glycolaldehyd, Glycin, 1-Desoxy-D-threopentulose, 4-Hydroxythreonin oder einer Mischung davon. Das Vitamin B&sub6; kann aus der Kulturbrühe in der gewünschten Reinheit gewonnen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin B&sub6;, das umfasst, dass ein Mikroorganismus, der zur Gattung Rhizobium gehört und Vitamin B&sub6; in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, verdaubare Stickstoffquellen, anorganische Salze und andere Nährstoffe, die für das Wachstum von Mikroorganismen notwendig sind, enthält, in Gegenwart von Pyruvat, D-Glyceraldehyd, Glycolaldehyd, Glycin, 1-Desoxy-D-threopentulose, 4-Hydroxythreonin oder einem Gemisch davon unter aeroben Bedingungen erzeugen kann, gezüchtet wird und das erhaltene oder entstandene Vitamin B&sub6; aus der Fermentationsbrühe abgetrennt wird.
Der Gehalt an Vitamin B&sub6; in einer Fermentationsbrühe kann mit Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080 [The Analysis of Nutrients in Foods, Academic Press, London, 224-227 (1978)] untersucht werden und der Gehalt an Vitamin B&sub6;-Komponenten, wie Pyridoxol, Pyridoxal und Pyridoxamin in einer Fermentationsbrühe kann auch getrennt durch Hochleistungsflüssig- Chromatographie gemessen werden [Vitamin, 63, 349-369 (1989)].
Um die vorliegende Erfindung auszuführen, werden Mikroorganismen, die zur Gattung Rhizobium gehören, in einem Kulturmedium inkubiert, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, verdaubare Stickstoffquellen, anorganische Salze und andere für das Wachstum von Mikroorganismen notwendige Nährstoffe enthält. Als Kohlenstoffquelle kann z. B. Glucose, Fructose, Lactose, Galactose, Saccharose, Maltose, Stärke, Dextrin oder Glycerin angewendet werden. Als Stickstoffquelle können z. B. Pepton, Sojapulver, Maiseinweichwasser, Fleischextrakt, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Harnstoff oder Mischungen davon angewendet werden. Weiterhin können als anorganische Salze Sulfate, Hydrochloride oder Phosphate von Calcium, Magnesium, Zink, Mangan, Cobalt und Eisen angewendet werden. Und falls notwendig, können ergänzend auch übliche Nährstofffaktoren oder Antischaummittel, wie tierische Öle, pflanzliche Öle oder mineralische Öle vorhanden sein. Der pH des Kulturmediums ist geeigneterweise etwa 5,0 bis etwa 9,0, bevorzugt 6,5 bis 7,5. Die Züchtungstemperatur ist geeigneterweise etwa 10 bis 40ºC, bevorzugt 26 bis 30ºC. Die Züchtungszeit ist geeigneterweise etwa 1 bis 14 Tage, bevorzugt 2 bis 7 Tage. Bei der Züchtung ergeben Belüftung und Rühren gewöhnlich vorteilhafte Ergebnisse. Die Gegenwart von Pyruvat, D-Glyceraldehyd, Glycolaldehyd, Glycin, 1-Desoxy-D-threopentulose, 4- Hydroxy-L-threonin oder einer geeigneten Kombination davon in dem Medium liefert bessere Ergebnisse für den Vitamin-B&sub6;- Titer. Die Kombination von 1-Desoxy-D-threopentulose und 4- Hydroxy-L-threonin ist besonders wirksam als Ergänzung zur Herstellung von Vitamin B&sub6;. Die Herstellung von Vitamin B&sub6; kann auch erreicht werden, indem Zellen der Mikroorganismen, die zur Gattung Rhizobium gehören, die aus der Kulturbrühe abgetrennt wurden, in einem Puffer mit dem richtigen pH-Wert mit der geeigneten Kombination aus Pyruvat, D-Glyceraldehyd, Glycolaldehyd, Glycin, 1-Desoxy-D-threopentulose und 4-Hydroxy-L-threonin gezüchtet werden. Nach der Züchtung kann erzeugtes Vitamin B&sub6; aus der Kulturbrühe abgetrennt und gereinigt werden. Für diesen Zweck kann ein Verfahren angewendet werden, das allgemein zur Isolierung von Produkt aus der Kulturbrühe verwendet wird, indem verschiedene Eigenschaften von Vitamin B&sub6; verwertet werden. So wird z. B., nachdem die Zellen aus der Kulturbrühe entfernt worden sind, die gewünschte Substanz in dem Filtrat gereinigt unter Verwendung von Ionenaustauschharz oder ähnlichen Mitteln. Nach der Elution wird das gewünschte Produkt aus Alkohol umkristallisiert.
Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus schließt alle Stämme ein, die zur Gattung Rhizobium gehören, die Vitamin B&sub6; erzeugen können und in einer öffentlichen Hinterlegungsstelle (Kultursammlung) aufbewahrt werden und auf Anforderung für jedermann zugänglich sind, z. B. Institute of Fermentation Osaka, Japan (IFO), Ministerium für Landwirtschaft, Forsten und Fischerei, Japan (MAFF) oder Institute of Applied Microbiology, Universität Tokio, Japan (IAM); Beispiele für solche hinterlegten Stämme sind Rhizobium meliloti IFO 14782, Rhizobium meliloti MAFF 303040, Rhizobium meliloti MAFF 303047, Rhizobium meliloti MAFF 303097, Rhizobium tropici IFO 15247, Rhizobium huakuii IFO 15243, Rhizobium leguminosarum IFO 14778, Rhizobium galegae IFO 14965, Rhizobium fredil IFO 14780, Rhizobium loti IFO 14998, Rbizobium sp. IAM 13623 und Rhizobium sp. IAM 13631. Von diesen Stämmen der Gattung Rhizobium sind bevorzugte Rhizobium meliloti IFO 14782 und Rhizobium tropici IFO 15247. Die Stämme Rhizobium meliloti IFO 14782 und Rhizobium tropici IFO 15247 wurden auch bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) in Göttingen, Deutschland, unter den Nummern DSM 10226 bzw. 10227 am 4. September 1995 hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung wird genauer durch die folgenden Beispiele erläutert; es versteht sich jedoch, dass die vorliegende Erfindung nicht auf diese speziellen Beispiele beschränkt ist.

Beispiel 1

Eine Öse von Zellen von Rhizobium meliloti IFO 14782 (DSM Nr. 10226), die auf Agarmedium gezüchtet worden waren, das aus 0,1% Hefeextrakt (Difco), 0,5% Mannit, 0,07% K&sub2;HPO&sub4;, 0,01% KH&sub2;PO&sub4;, 0,1% MgSO&sub4;·7 H&sub2;O und 1,5% Agar (pH 7,0) aufgebaut war, wurde in ein Röhrchen geimpft, das 5 ml Impfmedium enthielt, das aus 1% Glucose, 0,5% Polypepton (Nippon Seiyaku Co., Japan), 0,2% Hefeextrakt (Difco), 0,1% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 0,001% MnSO&sub4;·5 H&sub2;O und 0,001% FeSO&sub4;·7 H&sub2;O bestand, und dann wurde das Röhrchen auf einem Umkehrschüttler (285 Upm) bei 28ºC 17 Stunden lang geschüttelt. 4 ml der Saatkultur wurden in einen 500-ml-Kolben mit zwei Leitblechen geimpft, der 200 ml des Kulturmediums mit 4% Glucose, 4% Polypepton S (Nippon Seiyaku Co., Japan), 0,8% Hefeextrakt (Difco), 0,05% MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 0,05% MnSO&sub4;·5 H&sub2;O, 0,001% FeSO&sub4;·7 H&sub2;O und 1 Tropfen Antischaummittel CA-115 (Nippon Yushi Co., Japan) enthielt und dann wurde der Kolben unter Drehschütteln (180 Upm) bei 28ºC gezüchtet. Nach 168-stündiger Züchtung wurde der Gehalt an Vitamin B&sub6; im Überstand der Kulturbrühe untersucht mit der Trübungsmethode mit Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080, wie unten beschrieben. Der Überstand und Standardlösungen von Pyridoxol (0 bis 100 mg/l) wurden seriell verdünnt auf 1,731 · 10&supmin;&sup4; in destilliertem Wasser. 200 ul der verdünnten Lösung, 1,5 ml destilliertes Wasser und 40 ul 1,155 n H&sub2;SO&sub4; wurden in dieser Reihenfolge den Röhrchen zugegeben. Nach 20-minütigem Autoklavieren bei 120ºC wurden 1,5 ml Testmedium für Vitamin B&sub6; (Nissui Co., Japan), das Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080 enthielt, den Röhrchen zugegeben und mit einem Winkel von 30ºC bei 28ºC inkubiert. Nach 17- stündiger Inkubation wurde das Zellwachstum gestoppt durch Zugabe von 5 ml 0,2 n Salzsäure und dann wurde die Extinktion der Proben bei 660 nm gemessen. Die Menge an Vitamin B&sub6; in einer Probe wurde bestimmt, indem die Trübung der Probe mit der Standardwachstumskurve von Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080 verglichen wurde. Als Ergebnis enthielt der Überstand der 168-Stunden-Kulturbrühe 84 mg Vitamin B&sub6;/l. Weiterhin wurde die Mischung, nachdem dem Überstand der 168- Stunden-Kulturbrühe 100 ul 4'-Desoxypyridoxol (100 mg/l) als interne Substanz zugegeben worden waren, auf einer Capcell pak C18 SG120-Säule (4,6 · 250 mm, Shiseido Co., Japan) mit dem gemischten Lösungsmittel aus 0,1 M Natriumperchlorat, 0,1 M Kaliumphosphat und 2% Acetonitril (pH 3,5) mit einer Durchflussrate von 1,0 ml/min bei λ = 292 nm analysiert mit dem HPLC-System, das aus einer Waters Modell 600E-Systemkontrollvorrichtung, einer Waters Modell 600F-Pumpe, einem Waters Modell 991J-Fotodiodenarraydetektor, einer Waters Modell 700 Satellit-WISP-Probeneinspritzvorrichtung und einem Waters 5200-Drucker bestand. Als Ergebnis wurde gefunden, dass der Überstand 78,6 mg Pyridoxol/l enthielt.

Beispiel 2

In gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden Rhizobium meliloti MAFF 303040, Rhizobium meliloti MAFF 303047, Rhizobium meliloti MAFF 303097, Rhizobium huakuii IFO 15243, Rhizobium leguminosarum IFO 14778, Rhizobium tropici IFO 15247 (DSM Nr. 10227), Rhizobium galegae IFO 14965, Rhizobium fredii IFO 14780, Rhizobium loti IFO 14998, Rhizobium sp. IAM 13623 und Rhizobium sp. IAM 13631 gezüchtet. Nachdem in jedem Fall 168 Stunden lang gezüchtet worden war, wurde der Gehalt an Vitamin B&sub6; im Überstand der Kulturbrühe mit der Trübungsmethode mit Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080 untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Produktion von Vitamin B&sub6; durch Rhizobium-Stämme

Rhizobium-Stamm/Vitamin B&sub6; (mg/l)
Rhizobium meliloti MAFF 303040 10,8
Rhizobium meliloti MAFF 303047 30,5
Rhizobium meliloti MAFF 303097 11,6
Rhizobium huakuii IFO 15243 19,7
Rhizobium leguminosarum IFO 14778 9,85
Rhizobium tropici IFO 15247 9,00
Rhizobium galegae IFO 14965 7,81
Rhizobium fredii IFO 14780 4,0 : 2
Rhizobium loti IFO 14998 10,3
Rhizobium sp. IAM 13623 6,70
Rhizobium sp. IAM 13631 5,11

Beispiel 3

Vitamin B&sub6; wurde aus der Kulturbrühe von Rhizobium meliloti IFO 14782 (DSM Nr. 10226) gewonnen, die unter den gleichen Kulturbedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, erzeugt worden war. Die Vitamin-B&sub6;-Konzentration bei jeder Reinigungsstufe wurde mit der Trübungsmethode mit Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080 verfolgt. Ein Liter der 168-Stunden- Kulturbrühe wurde mit 8000 Upm 10 Minuten lang zentrifugiert. Der pH des entstehenden Überstandes wurde mit 1 n Salzsäure auf 3,1 eingestellt und dann wurde der Überstand auf eine Säule (3,6 · 40 cm) aufgetragen, die mit 350 ml Amberlite CG 120 (H&spplus;-Form, 100-200 mesh, Organo Co. Ltd.) gepackt war. Die Säule wurde mit 300 ml deionisiertem Wasser gewaschen und dann mit 5% Ammoniumhydroxid eluiert. Die Vitamin-B&sub6;- Fraktionen wurden bei vermindertem Druck eingeengt. Der so erhaltene Rückstand wurde in 10 ml 0,01 M Ammoniumformiat (pH 3,2) gelöst und die Lösung wurde auf eine Säule (2,4 · 40 cm), die mit 180 ml Dowex 50 w · 8 (Ammoniumform, 200-400 mesh, Dow Chemical Co. Ltd., USA) aufgegeben und dann mit 200 ml 0,01 M Ammoniumformiat (pH 3,2) gewaschen. Die Säule wurde dann mit 200 ml Startpuffer mit 0,05 M Ammoniumformiat (pH 4,25) und anschließend einem linearen Gradienten von jeweils 200 ml 0,05 und 0,5 M Ammoniumformiat-(pH 7,0)-Puffer entwickelt. Das Chromatogramm zeigte einen größeren und zwei kleinere Peaks mit Wachstumsaktivität gegenüber Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080. Die Fraktion des größeren Peaks wurde auf ein kleines Volumen bei vermindertem Druck eingeengt, der pH der Lösung mit 1 n Salzsäure auf 3,1 eingestellt und dann die Lösung auf eine Säule (1,8 · 40 cm) aufgetragen, die mit 75 ml Amberlite CG 120 (H&spplus;-Form, 100-200 mesh) gepackt war. Die Säule wurde mit 150 ml deionisiertem Wasser gewaschen und dann mit 5% Ammoniumhydroxid eluiert. Die Fraktionen mit Wachstumsaktivität gegenüber Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080 wurden bei vermindertem Druck eingeengt. Nachdem der feste Rückstand in einer kleinen Menge heißem Ethanol aufgelöst worden war, wurde die Lösung bei 4ºC über Nacht stehen gelassen. Der entstehende Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und im Vakuum getrocknet, um 51 mg rohe Kristalle zu erhalten. Diese wurden aus Ethanol umkristallisiert, um 44 mg weiße Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 160ºC zu erhalten. Die Infrarotabsorption, UV-Absorption und die NMR-Spektren des Produktes stimmten mit denen von authentischem Pyridoxol überein. Andererseits wurden zwei kleinere Peaks mit einer Wachstumsaktivität gegenüber Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080 mit HPLC analysiert unter den analytischen Bedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, und wurden als Pyridoxamin bzw. Pyridoxal identifiziert.

Beispiel 4

Eine Saatkultur von Rhizobium tropici IFO 15247 (DSM Nr. 10227) wurde unter den gleichen Kulturbedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. 4 ml dieser Saatkultur wurden in 2 500-ml-Kolben geimpft, die 200 ml Kulturmedium mit 2% Glucose, 1% Polypepton, 0,2% Hefeextrakt, 0,05% MgSO&sub4;·7 H&sub2;O, 0,05% MnSO&sub4;·5 H&sub2;O und 0,001% FeSO&sub4;·7 H&sub2;O und 1 Tropfen Antischaummittel CA-115 enthielten. Weiterhin wurden 4 ml der sterilisierten Lösung, die 1% 1-Desoxy-D- threopentulose (im Folgenden als DTP bezeichnet) und 1% 4- Hydroxy-L-threonin (im Folgenden als HT bezeichnet) enthielten, einem Kolben zugegeben und 4 ml sterilisiertes Wasser zu dem anderen. Beide Kolben würden auf einem Drehschüttler (180 Upm) bei 28ºC geschüttelt. Nach 96-stündiger Züchtung bei 28ºC wurde der Vitamin-B&sub6;-Gehalt im Überstand der Kulturbrühe mit der Trübungsmethode mit Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080, wie in Beispiel 1 beschrieben, untersucht. Wie in Tabelle 2 zusammengefasst, wurden 45 mg Vitamin B&sub6;/l in dem Kolben erzeugt, der das Medium enthielt, das mit DTP und HT ergänzt war, wohingegen 3,16 mg Vitamin B&sub6;/l in dem Kolben erzeugt wurden, der das Medium ohne DTP und HT enthielt. Weiterhin wurden aus 1 l der 96-Stunden-Kulturbrühe in dem Medium, das mit jeweils 0,02% DTP und HT ergänzt war, das Produkt mit der gleichen Methode, wie in Beispiel 3 beschrieben, isoliert, um 19,3 mg weiße Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 159,5ºC zu erhalten. Die Infrarotabsorption, UV-Absorption und die NMR-Spektren des Produktes stimmten mit denen von authentischem Pyridoxol überein.

Tabelle 2

Herstellung von Vitamin B&sub6; durch Rhizobium tropici IFO 15247 (DSM Nr. 10227)

Medium Vitamin B&sub6; (mg/l)
Medium ergänzt mit DTP und HT 45,0
Medium ohne DTP und HT 3,16
DTP: 1-Desoxy-D-threopentulose, HT: 4-Hydroxy-L-threonin

Beispiel 5

Rhizobium meliloti IFO 14782 (DSM Nr. 10226) wurde unter den gleichen Kulturbedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet. Nach 72-stündiger Züchtung bei 28ºC wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 8000 Upm 10 Minuten lang gesammelt, zweimal mit 100 ml steriler 0,85%iger Natriumchloridlösung gewaschen, und in 88 ml sterilem destillierten Wasser suspendiert. Die Vitamin-B&sub6;-Produktion wurde ausgeführt unter Umkehrschütteln (285 Upm) bei 28ºC in einem Röhrchen, das 10 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) enthielt, der aus 0,02% DTP, 0,24% Glycolaldehyd, 0,24% Glycin und der Zellsuspension zusammengesetzt war (endgültige optische Dichte bei 600 nm = 20/ml). Nach 24-stündigem Schütteln bei 28ºC wurde das Vitamin B&sub6; im Überstand der Reaktionsmischung mit HPLC unter den in Beispiel 1 beschriebenen analytischen Bedingungen bestimmt. Wie in Tabelle 3 zusammengefasst, wurden 9,66 mg Pyridoxol aus DTP, Glycolaldehyd und Glycin produziert.

Tabelle 3

Erzeugung von Pyridoxol aus DTP, Glycolaldehyd und Glycin durch Rhizobium meliloti IFO 14782 (DSM Nr. 10226)

Substrat Pyridoxol (mg/l)
DTP + Glycolaldehyd + Glycin 9,66
Nichts 0
DTP: 1-Desoxy-D-threopentulose

Beispiel 6

Die gewaschene Zellsuspension von Rhizobium meliloti IFO 14782 (DSM Nr. 10226) wurde mit der gleichen Methode, wie in Beispiel 5 beschrieben, präpariert. Die Vitamin-B&sub6;-Produktion wurde durchgeführt unter Umkehrschütteln (285 Upm) bei 28ºC in einem Röhrchen, das 10 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) mit 0,24% Pyruvat, 0,24% D-Glyceraldehyd und 0,02% HT und die gewaschene Zellsuspension (endgültige optische Dichte bei 600 nm = 20/ml) enthielt. Nach 24-stündigem Schütteln bei 28ºC wurde Vitamin B&sub6; im Überstand der Reaktionsmischung mit HPLC unter den in Beispiel 1 beschriebenen analytischen Bedingungen bestimmt. Wie in Tabelle 4 zusammengefasst, wurden 10,1 mg Pyridoxol/l aus Pyruvat, D-Glyceraldehyd und HT erzeugt.

Tabelle 4

Erzeugung von Pyridoxol aus Pyruvat, D-Glyceraldehyd und HT durch Rhizobium meliloti IFO 14782 (DSM Nr. 10226)

Substrat Pyridoxol (mg/l)
Pyruvat + D-Glyceraldehyd + HT 10,1
Nichts 0
HT: 4-Hydroxy-L-threonin

Beispiel 7

Die gewaschene Zellsuspension von Rhizobium meliloti IFO 14782 (DSM Nr. 10226) wurde mit der gleichen Methode, wie in Beispiel 5 beschrieben, präpariert. Die Vitamin-B&sub6;-Produktion wurde durchgeführt unter Umkehrschütteln bei 285 Upm bei 28ºC in einem Röhrchen, das 10 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) mit 0,24% Pyruvat, 0,24% D-Glyceraldehyd, 0,24% Glycolaldehyd, 0,24% Glycin und die gewaschene Zellsuspension (endgültige optische Dichte bei 600 nm = 20/ml) enthielt. Nach 24- stündiger Inkubation bei 28ºC wurde Vitamin B6 im Überstand der Reaktionsmischung mit HPLC unter den in Beispiel 1 beschriebenen analytischen Bedingungen bestimmt. Wie in Tabelle 5 zusammengefasst, wurden 9,66 mg Pyridoxol/l aus Pyruvat, D- Glyceraldehyd, Glycolaldehyd und Glycin erzeugt.

Tabelle 5

Erzeugung von Pyridoxol aus Pyruvat, D-Glyceraldehyd, Glycolaldehyd und Glycin durch Rhizobium meliloti IFO 14782 (DSM Nr. 10226)

Substrat Pyridoxol (mg/l)
Pyruvat + D-Glyceraldehyd + Glycolaldehyd 9,66
+ Glycin
Nichts 0

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Vitamin B&sub6;, umfassend das Züchten eines Mikroorganismus, gehörend zur Gattung Rhizobium und in der Lage, in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, verdaubare Stickstoffquellen, anorganische Salze und andere für das Wachstum von Mikroorganismen erforderliche Nährstoffe enthält, in Gegenwart von Pyruvat, D-Glycerinaldehyd, Glycolaldehyd, Glycin, 1-Desoxy-D- threopentulose, 4-Hydroxythreonin oder einem Gemisch davon und unter aeroben Bedingungen Vitamin B&sub6; zu erzeugen und Abtrennen des erhaltenen Vitamin B&sub6; aus der Fermentationsbrühe.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Züchten in Gegenwart von 1-Desoxy-D-threopentulose und 4-Hydroxy-L- threonin ausgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Züchten bei einem pH-Wert von etwa 5,0 bis etwa 9,0 ausgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Züchten bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 ausgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Züchten bei einer Temperatur von etwa 10 bis 40ºC ausgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Züchten bei einer Temperatur von 26 bis 30ºC ausgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Züchten für 1 bis 14 Tage ausgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Züchten für 2 bis 7 Tage ausgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Mikroorganismus Rhizobium meliloti IFO 14782 (DSM Nr. 10226) oder Rhizobium tropici IFO 15247 (DSM Nr. 10227) ist.