JP4085055B2 - ビタミンb6リン酸ホスファターゼ - Google Patents
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Description
a) 分子量:29,000±5,000(29,000±5,000の分子量を有するモノマーからなる)
b) 補因子:Mn2+、Mg2+、Co2+、Sn2+、またはNi2+
c) 基質特異性:ピリドキソール5'-リン酸(以後PNPとする)、ピリドキサール5'-リン酸(以後PLPとする)、およびピリドキサミン5'-リン酸(以後PMPとする)に活性
d) 至適温度:pH 7.5で30℃〜40℃
e) 至適pH:7.0〜8.0。
本発明の新規VB6PPは、二価の金属イオン、即ちMn2+、Mg2+、Co2+、Sn2+、またはNi2+の存在下、以下の式に記載の通り、VB6PのビタミンB6への加水分解を触媒する:
VB6P + H2O → ビタミンB6 + H3PO4
酵素の分子量(以後MWとする)は、ゲルろ過カラムHi PreHiPrep Sephacryl S-200HR(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)を用いて測定した。酵素の見かけ上のMWは、MWマーカータンパク質:ゲルろ過標準キット(Gel filtration Standard kit, Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, USA);サイログロブリン(thyroglobulin、MW 670,000)、ウシガンマグロブリン(bovine gamma globulin、MW 158,000)、ニワトリ卵白アルブミン(chicken ovalbumin、MW 44,000)、ウマミオグロビン(equine myoglobin、MW 17,000)、およびビタミンB12(vitamin B12、MW 1,350)と比較して、29,000±5,000と算出された。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(以後SDS-PAGEとする)により、分子マーカータンパク質:低分子量電気泳動較正キット(Low MW Electrophoresis calibration kit, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden);ウシ血清アルブミン(bovine serum albumin、MW 67,000)、卵白アルブミン(ovalbumin、MW 43,000)、炭酸脱水酵素(carbonic anhydrase、MW 30,000)、ダイズトリプシンインヒビター(soybean trypsin inhibitor、MW 20,100)、およびα-ラクトアルブミン(α-lactalbumin、MW 14,400)と比較して、MW 29,000±5,000の単一のバンドが得られた。これは、酵素がモノマー単位で構成されていることを示している。酵素のMW値(MW 29,000±5,000)は、可能な各方法、即ちゲルろ過カラム法およびSDS-PAGE法のように正確に決定された。
VB6PをビタミンB6に変換するための酵素の補因子要求性を調査した。その結果、二価の金属イオン、即ちMn2+、Mg2+、Co2+、Sn2+、またはNi2+がこの変換の補因子として働きうることが確認された。
酵素の基質特異性は、様々な基質溶液(160 μM、反応混合液における最終濃度)を使用した以外は、1)に記載したものと同じ方法を用いて決定した。
酵素活性は、5℃〜45℃の温度で測定した。酵素活性の至適温度は、30℃〜40℃であった。
酵素活性と反応混合液のpH値との相関を、1)に記載したものと同じ酵素アッセイ法を用いて決定した。酵素反応の至適pHは、7.0〜8.0であることが判明した。
酵素溶液を様々な温度で10分間処理し、残存する酵素活性を、1)に記載したものと同じ酵素アッセイ法を用いて測定した。温度が上昇すると酵素活性は減少し、50℃で完全に失活することが確認された。
酵素のKm値は、基質としてPNPおよびPLPを用いて測定した。基本的な酵素アッセイ法は、1)に記載したものと同じであるが、基質濃度は変更した。PNPに対するKmおよびVmax値は、それぞれ330 μMおよび92 nmol/分/mgであった。一方、PLPに対するKmおよびVmax値は、それぞれ1.22 mMおよび46 nmol/分/mgであった。
VB6PPの精製は、原則的には、例えば硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコールなどの沈殿剤による分画、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ならびに、塩析および透析など、既知の精製方法を任意に組み合わせることにより行われる。
細胞を遠心分離またはろ過により液体培養から回収する。
回収した細胞を、水、生理的塩類溶液、または適切なpHを有する緩衝液溶液で洗浄する。
洗浄した細胞をEDTA/ライソザイム(lysozyme)を含む緩衝液において前処理し、ホモジナイザー、ソニケーター、フレンチプレスなどにより破壊して、破壊された細胞の溶液を得る。
VB6PPを、破壊された細胞の無細胞抽出物から単離および精製する。
特記しない限り、すべての操作は4℃で行い、緩衝液は1 mMジチオスレイトール、0.1 mMフッ化フェニルメチルスルホニル、および15%スクロースを含む10 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)であった。
Claims (15)
- 以下の物理化学的性質を有するビタミンB6リン酸ホスファターゼ:
a) ゲル濾過によって測定される分子量:29,000±5,000(29,000±5,000の分子量を有するモノマーからなる)
b) 補因子:Mn2+、Mg2+、Co2+、Sn2+、またはNi2+
c) 基質特異性:ピリドキソール5'-リン酸、ピリドキサール5'-リン酸、およびピリドキサミン5'-リン酸に活性
d) 至適温度:pH 7.5で30℃〜40℃
e) 至適pH:7.0〜8.0。 - ビタミンB6リン酸ホスファターゼを製造することができる微生物であるシノリゾビウム属に属する微生物から得られる、請求項1記載のビタミンB6リン酸ホスファターゼ。
- 微生物がシノリゾビウム・メリロティIFO 14782(DSM No. 10226)である、請求項2記載のビタミンB6リン酸ホスファターゼ。
- 以下の段階を含む、請求項1記載のビタミンB6リン酸ホスファターゼを製造する方法:上記の物理化学的性質を有するビタミンB6リン酸ホスファターゼを製造することができるシノリゾビウム属に属する微生物を、栄養培養液中、好気性条件下で培養する段階;該微生物の細胞を破壊する段階;ならびに、該微生物の破壊された細胞の無細胞抽出物からビタミンB6リン酸ホスファターゼを単離および精製する段階。
- 微生物がシノリゾビウム・メリロティIFO 14782(DSM No. 10226)である、請求項4記載の方法。
- pH範囲5.0〜9.0、温度範囲10℃〜45℃で1日〜5日間発酵させる、請求項4記載の方法。
- pH範囲6.0〜8.0、温度範囲25℃〜40℃で1日〜3日間発酵させる、請求項4記載の方法。
- 以下の段階を含む、ビタミンB6リン酸からビタミンB6を製造する方法:ビタミンB6リン酸を、Mn2+、Mg2+、Co2+、Sn2+、またはNi2+の存在下、請求項1記載のビタミンB6リン酸ホスファターゼに接触させる段階;および結果として得られるビタミンB6を反応混合液から単離する段階。
- ビタミンB6リン酸ホスファターゼがシノリゾビウム・メリロティIFO 14782(DSM No. 10226)から得られる、請求項8記載の方法。
- pH範囲5.5〜9.0、温度範囲15℃〜45℃で15分〜5時間反応させる、請求項8または9記載の方法。
- pH範囲6.5〜8.0、温度範囲25℃〜40℃で30分〜3時間反応させる、請求項8から10のいずれか一項記載の方法。
- 以下の段階を含む、ビタミンB6リン酸からビタミンB6を製造する方法:ビタミンB6リン酸を、請求項1記載のビタミンB6リン酸ホスファターゼを製造することができるシノリゾビウム属に属する微生物の無細胞抽出物に接触させる段階;および結果として得られるビタミンB6を反応混合液から単離する段階。
- 微生物がシノリゾビウム・メリロティIFO 14782(DSM No. 10226)である、請求項12記載の方法。
- pH範囲5.5〜9.0、温度範囲15℃〜45℃で15分〜5時間反応させる、請求項12記載の方法。
- pH範囲6.5〜8.0、温度範囲25℃〜40℃で30分〜3時間反応させる、請求項12記載の方法。
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