JP5354490B2 - ジフェニルアルシン酸の分解能を有する新規な微生物 - Google Patents
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Description
[1] ジフェニルアルシン酸の分解能を有するシノリゾビウム(Sinorhizobium)属に属する微生物。
[2] 次の(A)又は(B):
(A) 配列番号1に記載の塩基配列からなるDNA、
(B) 配列番号1に記載の塩基配列と95%以上の同一性を有するDNA、
を含む16SリボゾーマルRNA遺伝子を有する、ジフェニルアルシン酸の分解能を有するシノリゾビウム(Sinorhizobium)属に属する微生物。
[3] ジフェニルアルシン酸の分解能を有するシノリゾビウム(Sinorhizobium)属に属するL2406株(FERM BP−10658)。
[4] ジフェニルアルシン酸の分解能を有するエンシファー(Ensifer)属に属する微生物。
[5] 次の(A)又は(B):
(A) 配列番号2に記載の塩基配列からなるDNA、
(B) 配列番号2に記載の塩基配列と95%以上の同一性を有するDNA、
を含む16SリボゾーマルRNA遺伝子を有する、ジフェニルアルシン酸の分解能を有するエンシファー(Ensifer)属に属する微生物。
[6] ジフェニルアルシン酸の分解能を有するエンシファー(Ensifer)属に属するL2413株(FERM BP−10659)。
[7] [1]〜[6]のいずれかに記載された微生物を用いて、ジフェニルアルシン酸を分解する方法。
[8] [1]〜[6]のいずれかに記載された微生物を用いて、土壌及び/又は汚染地下水を浄化する方法。
[9] 鉄成分の存在下で微生物を用いる、[7]又は[8]に記載の方法。
[10] [1]〜[6]のいずれかに記載された微生物を含んでなる、ジフェニルアルシン酸の分解剤。
[11] 鉄成分を含む、[10]に記載の分解剤。
[12] [1]〜[6]のいずれかに記載された微生物を含んでなる、汚染土壌及び/又は汚染地下水の浄化剤。
[13] 鉄成分を含む、[12]に記載の浄化剤。
[14] [1]〜[6]のいずれかに記載された微生物を用いて、ジフェニルアルシン酸を分解してフェニルアルソン酸を製造する方法。
[15] [1]〜[6]のいずれかに記載された微生物を用いて、汚染された土壌から浄化された土壌を製造する方法。
[16] [1]〜[6]のいずれかに記載された微生物を用いて、汚染された地下水から浄化された地下水を製造する方法。
[17] 鉄成分の存在下で微生物を用いる、[14]〜[16]のいずれかに記載の方法。
[18] ヒ素汚染土壌を湿潤土のままで採取する工程、
該ヒ素汚染土壌をジフェニルアルシン酸の存在下で培養して、培養液を得る工程、
得られた培養液を希釈して希釈系列を作製する工程、
希釈系列である培養液をジフェニルアルシン酸の存在下で培養する工程、
希釈系列のなかから、培養に伴ってジフェニルアルシン酸の濃度減少又は消失の生じる培養液を選択する工程、
を含む、ジフェニルアルシン酸分解能を有する菌株を選抜する方法。
(A) 配列番号1に記載の塩基配列からなるDNA、
(B) 配列番号1に記載の塩基配列と95%以上の同一性を有するDNA、
を含む16SリボゾーマルRNA遺伝子を有する、ジフェニルアルシン酸の分解能を有するシノリゾビウム(Sinorhizobium)属に属する微生物が好ましい。上記の同一性は95%以上が好ましく、より好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上であり、特に99.5%以上、特に99.8%以上、特に99.9%以上の同一性であることが好ましい。このような微生物として、シノリゾビウム(Sinorhizobium)属に属するL2406株(FERM BP−10658)が極めて好ましい。
【0018】
また、本発明はジフェニルアルシン酸の分解能を有するエンシファー(Ensifer)属に属する微生物にある。このような微生物として、次の(A)又は(B):
(A) 配列番号2に記載の塩基配列からなるDNA、
(B) 配列番号2に記載の塩基配列と95%以上の同一性を有するDNA、
を含む16SリボゾーマルRNA遺伝子を有する、ジフェニルアルシン酸の分解能を有するエンシファー(Ensifer)属に属する微生物が好ましい。上記の同一性は95%以上が好ましく、より好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上であり、特に99.5%以上、特に99.8%以上、特に99.9%以上の同一性であることが好ましい。このような微生物として、エンシファー(Ensifer)属に属するL2413株(FERM BP−10659)が極めて好ましい。
ヒ素汚染土壌を湿潤土のままで採取する工程、
該ヒ素汚染土壌をジフェニルアルシン酸の存在下で培養して、培養液を得る工程、
得られた培養液を希釈して希釈系列を作製する工程、
希釈系列である培養液をジフェニルアルシン酸の存在下で培養する工程、
希釈系列のなかから、培養に伴ってジフェニルアルシン酸の濃度減少又は消失の生じる培養液を選択する工程、を含む、ジフェニルアルシン酸分解能を有する菌株を選抜する方法にもある。
[19] [1]〜[6]のいずれかに記載された微生物を用いて、フェニルアルソン酸を分解する方法。
[20] 鉄成分の存在下で微生物を用いる、[19]に記載の方法。
[21] [1]〜[6]のいずれかに記載された微生物を含んでなる、フェニルアルソン酸の分解剤。
[22] 鉄成分を含む、[21]に記載の分解剤。
[23] [1]〜[6]のいずれかに記載された微生物を用いて、フェニルアルソン酸を分解して無機ヒ素化合物を製造する方法。
[24] 鉄成分の存在下で微生物を用いる、[23]に記載の方法。
[25] [1]〜[6]のいずれかに記載された微生物を用いて、ロキサルソンを分解する方法。
[26] 鉄成分の存在下で微生物を用いる、[25]に記載の方法。
[27] [1]〜[6]のいずれかに記載された微生物を含んでなる、ロキサルソンの分解剤。
[28] 鉄成分を含む、[27]に記載の分解剤。
[29] [1]〜[6]のいずれかに記載された微生物を用いて、ロキサルソンを分解して無機ヒ素化合物を製造する方法。
[30] 鉄成分の存在下で微生物を用いる、[29]に記載の方法。
本願の優先権主張の基礎となる特願2006−238350及び特願2007−115920の明細書等に記載された内容は、本明細書の記載の一部として取り込む。
本発明のジフェニルアルシン酸分解能を有する微生物は下記の様にして土壌から分離された細菌である。
【0049】
同様に、105倍希釈液を接種したL字管の培養液を基に希釈と植え継ぎを繰り返して、培養液に含まれる微生物種を安定化させた後、その一部を、表4に示す組成のDPAA20VTE培地に1.5%の寒天を加えて作製したプレートに播種し、30℃にて静置培養した。1週間後、出現したコロニーを釣ってR2A寒天培地(Difco)に画線し、30℃にてさらに静置培養して複数の純粋分離株を得た。これら純粋分離株について、あらかじめDPAA5VTE培地(表4参照)20mlを分注した100ml容三角フラスコに各1白金耳を植菌して、25℃・120rpmにて旋回培養を行った。そして培地中のジフェニルアルシン酸濃度を経時的にHPLCにて測定することにより、ジフェニルアルシン酸分解能を有する菌株の選抜を行った。
ジフェニルアルシン酸分解菌の集積培養は土壌・木炭還流法にて行った。まず表1に示す組成を有するオートクレーブ滅菌(120℃、20分)済の還流液を用意した。ただし、硫酸マグネシウム・七水和物は、それのみで適当な濃度の溶液を調製し、別にオートクレーブ滅菌した後に加えた。
集積培養中、還流液を微量採取してジフェニルアルシン酸の濃度を表3に示す測定条件に設定した高速液体クロマトグラフ(HPLC)にて測定した。その結果を図1に示す。
任意に選んだL字管の培養液を滅菌済生理食塩水で希釈して希釈系列を作製し、104及び105倍希釈液0.1mlを、別のL字管に分注した還流液と同組成の滅菌済液体培地6mlに接種し、25℃にて振とう培養を行った。培養は各希釈系列につき2本ずつ行った。各L字管の培地中ジフェニルアルシン酸濃度を経時的にHPLCにて測定したところ、培養開始から17日後にはいずれのL字管においてもジフェニルアルシン酸がほぼ消失した(図3参照)。
以上の操作により、ジフェニルアルシン酸に対する分解能を有する菌株の選抜を行ったところ、L2406株及びL2413株にジフェニルアルシン酸を分解する能力があることを見出した。それぞれの株についてR2A寒天培地(Difco)にて再度単コロニー分離を行い、各5株についてDPAA5VTE培地6mlを分注したL字管に接種した。これを25℃にて14日間振とう培養し、ジフェニルアルシン酸の残存量をHPLCにて、代謝物であるフェニルアルソン酸の生成量をLC−MSにて測定した結果を表7に示す。なお、LC−MSの分析条件は表8の通りとした。
以上のような手順で見出されたL2406株及びL2413株について、16SリボゾーマルRNA遺伝子の塩基配列に基づいた遺伝子分類学的な検討を実施した。まずそれぞれの菌株をR2A寒天培地(Difco)に植菌し、30℃・暗所にて前培養した。生じたコロニーを1白金耳とって滅菌済生理食塩水1mlに分散させ、ここからDNeasy Tissue Kit(Qiagen)を用いてDNAを抽出した。得られたDNAを鋳型に、既知のD1fとD1rをプライマーとしてPCRを行い、16SリボゾーマルRNA遺伝子を増幅した。このPCR産物をQIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)にて精製後、サイクルシーケンス反応に供し、その反応物をDNAシーケンサー(日立製SQ−5500E)にて解析して塩基配列を決定した。その結果、L2406株については1,101塩基対(配列番号1:SEQ ID No.1)、L2413株については1,276塩基対(配列番号2:SEQ ID No.2)が決定された。
L2406株及びL2413株の単離に用いたDPAA5VTE培地には、微量元素として鉄、亜鉛、マンガン、ホウ素、コバルト、銅、モリブデン及びカルシウムが含まれる。両菌株のジフェニルアルシン酸分解におけるこれら元素の必要性について試験したところ、鉄の添加が非常に重要であることが判明した。そこで、添加する硫酸第一鉄・七水和物の量を変えることによって培地中の鉄濃度を0、0.04、0.2、0.4、1、2及び4mg−Fe/lとしたDPAA5VTE培地を用意し、培地中の鉄濃度がジフェニルアルシン酸分解菌の分解能にどのような影響を与えるかについて検討した。
表7にあるように、L2406株及びL2413株は、ジフェニルアルシン酸を分解してフェニルアルソン酸[(C6H5)AsO(OH)2;構造式を式IIに示す]を生成させる。しかし、いずれの菌株においても、検出されたフェニルアルソン酸の量は、分解されたジフェニルアルシン酸の、ヒ素換算で1/3程度に過ぎず、このことから、これらの菌株がフェニルアルソン酸をさらに分解している可能性が考えられた。そこで次に、フェニルアルソン酸を唯一の炭素源として含む無機塩培地にジフェニルアルシン酸分解菌を植菌し、培地中のフェニルアルソン酸の量を経時的に測定した。
ロキサルソン[{C6H3(NO2)(OH)}AsO(OH)2;構造式を式IIIに示す]は、成長促進剤として家禽に与えられているフェニル化有機ヒ素化合物である。米国では83億羽のブロイラーの約7割に本剤が与えられており(2000年の場合)、そこから出た厩肥には900tのロキサルソンが含まれ、ヒ素に換算すると250tに相当する。近年、この厩肥を農地などに施すことによる、有機ヒ素汚染土壌の発生が懸念されており、その対策が求められている。そこで本研究では、今回単離した分解菌のロキサルソンに対する効果を明らかにするため、ロキサルソンを唯一の炭素源として含む無機塩培地にL2406株を植菌し、培地中のロキサルソンの分解が可能であるか、検討した。
配列番号2:本発明の分解菌L2413株の16SリボゾーマルRNA遺伝子の1276塩基。
Claims (15)
- ジフェニルアルシン酸の分解能を有するシノリゾビウム(Sinorhizobium)属に属するシノリゾビウム sp. L2406株(FERM BP−10658)である微生物。
- ジフェニルアルシン酸の分解能を有するエンシファー(Ensifer)属に属するエンシファー sp. L2413株(FERM BP−10659)である微生物。
- 請求項1又は2のいずれかに記載された微生物の少なくとも1種以上を用いて、ジフェニルアルシン酸を分解する方法。
- 請求項1又は2のいずれかに記載された微生物の少なくとも1種以上を用いて、土壌及び/又は汚染地下水を浄化する方法。
- 鉄成分の存在下で微生物を用いる、請求項3又は4に記載の方法。
- 請求項1又は2のいずれかに記載された微生物の少なくとも1種以上を含んでなる、ジフェニルアルシン酸の分解剤。
- 鉄成分を含む、請求項6に記載の分解剤。
- 請求項1又は2のいずれかに記載された微生物の少なくとも1種以上を含んでなる、汚染土壌及び/又は汚染地下水の浄化剤。
- 鉄成分を含む、請求項8に記載の浄化剤。
- 請求項1又は2のいずれかに記載された微生物の少なくとも1種以上を用いて、フェニルアルソン酸を分解する方法。
- 請求項1又は2のいずれかに記載された微生物の少なくとも1種以上を用いて、ロキサルソンを分解する方法。
- 鉄成分の存在下で微生物を用いる、請求項10又は11に記載の方法。
- 請求項1又は2のいずれかに記載された微生物の少なくとも1種以上を含んでなる、フェニルアルソン酸の分解剤。
- 請求項1又は2のいずれかに記載された微生物の少なくとも1種以上を含んでなる、ロキサルソンの分解剤。
- 鉄成分を含む、請求項13又は14に記載の分解剤。
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