JP2005065578A - アリイナーゼ及びこれを用いるアリシンの製造法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】フザリウム(Fusarium)属に属する微生物が生産し、アリインからアリシ
ンを生成させる活性を有するアリイナーゼ。このアリイナーゼは、FERM P-19485として寄託されたフザリウム エスピー(Fusarium sp.)AMA9394株が生産できる。細菌類が生産し、アリインからアリシンを生成する活性を有するアリイナーゼ。このアリイナーゼは、FERM P-19486として寄託されたエンサイファ アドヘレンス(Ensifer adhaerens)AMA9794株が生産できる。これらのアリイナーゼをアリウム属植物の抽出物またはアリインを含む溶液に作用させ、アリシンを生成させるアリシンの製造法。
【選択図】図7
Description
S.Schwimmer, M.Mazelis, Arch.Biochem. Biophys.,100,66(1963)
すなわち、フザリウム(Fusarium)属に属する微生物が生産し、アリインからアリシンを生成させる活性を有するアリイナーゼを要旨とする。
本明細書において、アリイナーゼは、微生物の培養により得られるアリインからアリシンを生成させる活性を有する粗酵素あるいは精製酵素をいい、粗酵素は菌体、菌体破砕物、菌体で生産され外部に放出されるもの、菌体破砕液など前記活性を有するもののすべてを含む。
(Fusarium sp.)AMA9394株である。また、アリイナーゼは耐熱性を有する。アリイナーゼは下記の理化学的性質を有する。
(1)作用及び基質特異性:(+)アリイン及び/又は(-)アリインに特異的に作用して、アリシンを生成する。
(2)最適pH:最適pHは7.5である。
(3)最適温度:最適温度は37℃である。
(4)温度安定性:2時間の処理条件において、20℃まで安定であるが、35℃で約80%の活性が残存する。
Bacto Potate Dextrose Agar (PDA) (Becton Dickinson, NJ, USA : 以下BD), Bacto
Oatmeal Agar (OA) (BD)および2% Bacto Malt extract (BD) + 1.5% Agar (MEA)の各プレートに接種し、25℃で最長2週間の培養を行い、コロニーの巨視的特徴の観察を行った。
コロニー色調に関する記述は Korncrup & Wanscher (1978)に従った。
(巨視的観察結果)
気中菌糸はビロード状(veltinous)から綿毛状(cottony)で、表面色調はwhite-yellowish white (3A1-2)を示し、OAプレートでは茶褐色の裏面着色(reverse coloration)を示した。
分生子(conidia)の着生によるコロニー表面の色調変化は認められなかった。長期培養後のPDAおよびOAプレートからは透明の滲出液 (exudate)の産生が認められ、OAプレートにおいて茶褐色の可溶性色素 (soluble pigment)の産生が観察された。
(微視的観察)
小分生子 (microconidia)と大分生子 (macroconidia) が観察された。小分生子はフィアロ型 (phialidic)。
分生子柄はほぼ単生、柄 (stipe)の長さは中程度で、分枝 (branching)はほとんど観察されない。
小分生子は、柄先端より塊状 (slimy)となり、形状は紡錘型 (fusiform)や三日月 (luniform)。大分生子は気中菌糸基部を中心に観察され、三日月形で、脚胞 (foot cell)を有していた。大分生子の幅はやや肉厚で長さは比較的短い。
また、長期培養検体から圧壁胞子 (chlamydospore) やテレオモルフ (teleomorph)は確認されない。
形態
形:桿状
大きさ:長さ(1.2〜2.0μ)、直径(0.6〜0.7μ)
配列:単独又は2〜3個連鎖
運動性:有り
胞子:無し
コロニー:ほぼ円形で凸円状の突起を有し白〜黄白色。スライム状をなし表面は滑面である。
下記の各実施例で用いたアリインは、以下のように製造した。
L-アリル-システィン(東京化成工業社製)にH2O2溶液をモル濃度で10倍量になるように混合した。室温で30分反応させた後、アセトンを90%になるように混合し、軽く撹拌した後氷浴で30分放置した。沈殿を確認した後、5000rpmで5分遠心し、上清を捨てた。沈殿に新たに90%アセトンを加え、同様の作業を2, 3 回繰り返した。洗滌した沈殿をデシケーターにて一晩乾燥させた。これにより、異性体を含む(±)アリイン(S(±)-L-システィン スルフォキシド)が合成された。L-アリル-システィンと(±)アリインは、TLC(1-ブタノール:酢酸:H2O=4:1:1)によって分離され、ニンヒドリン反応によって検出した。
下記の各実施例におけるアリイナーゼの酵素活性は、以下のように測定した。
基質として、200 mM (±)アリイン 20μl、100 mM ピリドキサル5'リン酸 20μl、20%グリセロールを含む100 mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 6.5) 40μlにエンサイファ アドヘレンス(Ensifer adhaerens)AMA9794株の無細胞胞抽出液 20μlを加え、全容を100μlとした反応液 100μlを30℃で30分間インキュベートした。反応後、1 mM 2, 4-ジニトロフェニルヒドラゾン(2,4-dinitrophenyl hydrazone )溶液−2 N 塩酸を100μl加え、室温で20分間放置した。その後0.4 NのNaOHを1. 0 ml加え、軽く撹拌したのち、分光光度計にてピルビン酸に由来する505 nmの吸光度を測定し、アリイナーゼ活性を測定した。
ピルビン酸の測定は以下のように測定した。図2にその反応式を示す。
100μlの1 mM 2, 4-ジニトロフェニルヒドラジン(2,4-dinitorophenyl hydorazine)溶液- 2 N 塩酸に100μlの酵素反応液を加えて室温にて20分間放置する。その後、0.4 Nの水酸化ナトリウムを1.0 ml加え、攪拌した後、505 nmの吸収を測定する。その際反応前の反応液も測定しておきUV吸収値は正味の増加量を測定値とする。予め購入しておいたピルビン酸ナトリウムで検量線を引いておき測定値を濃度に換算する。
この測定条件で、1分間に1μMのピルビン酸を生成する酵素量を1単位とした。なお、フザリウム エスピー(Fusarium sp.)AMA9394株が生産するアリイナーゼの酵素活性についても同様の方法で測定した。
L-システイン、S-アリル-L-システイン, N-アセチル-L-システイン、アリインをそれぞれ酵母エキス 1.0 %、ポリペプトン 2.0%、グルコース 2.0 % からなる培地(YPD培地)中に0.5 % 含んだ培養液にてフザリウム エスピー(Fusarium sp.)AMA9394株を37℃、4日間培養し、乾燥重量及びアリイナーゼ活性を測定した。培養はすべて試験管にて行い、5 ml の培地を用いた。
各培養後の菌体を蒸留水で数回洗滌し、60℃の通風乾燥機で2日間乾燥させた後の重量を菌体の乾燥重量とした。なお、活性測定のアリインの終濃度は100 mMで行った。その結果を表1に示す。
YPD培地 5 mlを試験管に入れ、常法にて殺菌後フザリウム エスピー(Fusarium sp.)AMA9394株を接種し、37℃にて4日間培養した。
その結果をYPD培地のみで37℃、5日間培養した場合のそれと比較検討した。
蒸留水で数回洗滌し、60℃の通風乾燥機で2日間乾燥させた後の重量を菌体の乾燥重量とする。なお、活性測定のアリインの終濃度は100 mMで行った。結果を表2に示す。
アリイナーゼの理化学的性質を、実施例2のYPD培地とA培地で培養して得られた菌体破砕液を用いて検討した。対照として、ニンニク断片を破砕し、濾過を行った濾過液(以下、ニンニク破砕液)を用いた。なお、以下の図5〜図8において、フザリウム エスピー(Fusarium sp.)AMA9394株に由来するアリイナーゼをAMA9394、ニンニクに由来するアリイナーゼをニンニクと表示した。
(1)最適温度
各種温度にてアリインに菌体破砕液とニンニク破砕液を各々作用させ、それぞれのアリイナーゼ活性を測定し、その結果を図5に示した。
pH 4〜9のpH条件下で、アリインに菌体破砕液とニンニク破砕液を各々作用させて酵素反応を行い、それぞれのアリイナーゼ活性を測定し、その結果を図6に示した。なお、緩衝液として、10%グリセロールを含む500mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH4〜9)を使用した。
菌体破砕液とニンニク破砕液を0〜55℃の温度下で2時間放置後、それぞれの残存活性を測定し、その結果を図7に示した。
基質である(+)アリイン、(-)アリインの終濃度はいずれも500 mMとして、光学異性体に対する菌体破砕液とニンニク破砕液の作用を検討した。なお、(+)アリイン、(-)アリインをHPLCによって分離した (ODSカラム、流速 1.0 ml/min、10 mM リン酸バッファ (pH 7.5, 5 mM リン酸2水素テトラ n-ブチルアンモニウム)、UV 220 nm 検出)。
反応液を各時間ごとにサンプリングし、HPLC分析を行った。そして、予め作成した検量線を用いて、ピークエリアを濃度に換算した。その結果を図8に示した。
エンサイファ アドヘレンス(Ensifer adhaerens)AMA9794株を3%乾燥ブイヨン(日水製薬社製)にて、30℃で2日間振盪培養し、菌体破砕液を得た。菌体の破砕及び上清の調製は、実施例1と同様に行った。
Claims (17)
- フザリウム(Fusarium)属に属する微生物が生産し、アリインからアリシンを生成させる活性を有するアリイナーゼ。
- 微生物がFERM P-19485として寄託されたフザリウム エスピー(Fusarium sp.)AMA9394株である請求項1に記載のアリイナーゼ。
- 耐熱性を有する請求項1又は請求項2に記載のアリイナーゼ。
- 下記の理化学的性質を有する請求項1〜請求項3のいずれかに記載のアリイナーゼ。
(1)作用及び基質特異性:(+)アリイン及び/又は(-)アリインに特異的に作用して、アリシンを生成する。
(2)最適pH:最適pHは7.5である。
(3)最適温度:最適温度は37℃である。
(4)温度安定性:2時間の処理条件において、20℃まで安定であるが、35℃で約80%の活性が残存する。 - 細菌類が生産し、アリインからアリシンを生成する活性を有するアリイナーゼ。
- 細菌類がFERM P-19486として寄託されたエンサイファ アドヘレンス(Ensifer adhaerens)AMA9794株である請求項5に記載のアリイナーゼ。
- (−)アリインに対して選択的に作用する光学特異性を有する請求項5又は請求項6に記載のアリイナーゼ。
- (−)S-ピリジルエチル-L−システィン スルフォキシド((−)PECS)に対して選択的に作用する光学特異性を有する請求項5又は請求項6に記載のアリイナーゼ。
- アリイナーゼの生産能を有するフザリウム(Fusarium)属に属する微生物を培養し、培養物中にアリイナーゼを産生せしめ、これを採取するアリイナーゼの製造法。
- 培地中にL-システィン、S-アリル L-システィン、N-アセチル L-システィン、アリインから選ばれた誘導物質の少なくとも1種以上を添加して培養する請求項9に記載のアリイナーゼの製造法。
- 誘導物質が添加されない培地で所定期間培養後、アリインのみを誘導物質として添加した培地で更に培養する請求項10に記載のアリイナーゼの製造法。
- アリイナーゼの生産能を有する細菌類に属する微生物を培養し、培養物中にアリイナーゼを産生せしめ、これを採取するアリイナーゼの製造法。
- 寄託番号がFERM P-19485であるアリイナーゼを生産するフザリウム エスピー(Fusarium sp.)AMA9394株。
- 配列表の配列番号1で示す28SrDNAのD2領域と98%以上の相同性を示すD2領域を有する糸状菌でかつアリイナーゼを生産する菌株。
- 寄託番号がFERM P-19486であるアリイナーゼを生産するエンサイファ アドヘレンス
(Ensifer adhaerens)AMA9794株。 - 配列表の配列番号2で示す16SrDNAと97%以上の相同性を示す細菌でかつアリイナーゼを生産する菌株。
- アリウム属植物の抽出物またはアリインを含む溶液に請求項1〜請求項8のいずれかに記載のアリイナーゼを作用させ、アリシンを生成させるアリシンの製造法。
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