CN104928273A

CN104928273A - 一种大蒜蒜氨酸酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN104928273A
Application number: CN201510354253.3A
Authority: CN
Inventors: 唐巧玲; 王志兴; 王旭静
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2015-06-24
Filing date: 2015-06-24
Publication date: 2015-09-23
Anticipated expiration: 2035-06-24
Also published as: CN104928273B

Abstract

本发明公开了一种大蒜蒜氨酸酶及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有大蒜蒜氨酸酶活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明还提供了一种新的大蒜蒜氨酸酶编码基因，并按照酵母细胞的密码子偏好性进行了相应的密码子优化，且通过毕赤酵母表达系统验证了基因功能。本发明为利用基因工程技术表达重组蒜氨酸酶提供了更多的基因资源，也为研究不同蒜氨酸酶基因对大蒜食用品质的影响提供更开阔的思路。

Description

一种大蒜蒜氨酸酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种大蒜蒜氨酸酶及其编码基因与应用。

背景技术

大蒜以其丰富的营养价值和独特的辛香味成为调味佳品，我国年产大蒜近700万吨，出口逾百万吨，遍及140多个国家和地区。联合国粮农组织的资料显示，中国大蒜在全球大蒜贸易中所占的数量份额高达90％。同时，大蒜还具有很高的药用和保健价值，如杀菌、抗病毒、降血脂、抗血栓、防治中风和动脉硬化、抗肿瘤等，近年来医药领域对大蒜的药用价值及其作用机理进行了大量的研究，使大蒜在医药领域显现出广阔的应用前景。

大蒜的风味、医药保健价值要归功于包括蒜素(alliicin)在内的一类巯基化合物。这类巯基化合物是由蒜氨酸酶(Alliinase)催化一种非蛋白氨基酸——蒜氨酸(Alliin)而物形成。在完整的细胞内，蒜氨酸酶和底物是分隔存在的，蒜氨酸存在于细胞质中，而蒜氨酸酶存在于液泡中。当细胞受伤时，蒜氨酸酶就会从液泡中释放出来，与底物蒜氨酸相遇，从而催化蒜氨酸产生丙酮酸、氨以及包括蒜素在内的含硫化合物。蒜素很不稳定，自然条件下就会氧化分解，释放出有臭味的硫化物。

发明内容

本发明的目的是提供一种大蒜蒜氨酸酶及其编码基因与应用。

本发明所提供的大蒜蒜氨酸酶来源于大蒜(Allium sativum L.)，具体是如下(a)或(b)或(c)所示的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)由序列表中序列1的第30-463位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有大蒜蒜氨酸酶活性的由(a)或(b)衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列1由463个氨基酸残基组成，其中第1-29位为信号肽序列。

为了便于所述蛋白质的纯化，可在所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH

FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2或3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

所述核酸分子为编码所述蛋白质的基因，所述基因具体可为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列3所示的DNA分子；

3)序列表中序列2的第88-1392位所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)-3)中任一所限定的DNA分子杂交且所述蛋白质的DNA分子；

5)与1)-4)中任一所限定的DNA分子至少具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

其中，序列2由1392个核苷酸组成，为来自于大蒜中的蒜氨酸酶基因，第1-87位为信号肽的编码基因；序列3由1305个核苷酸组成，为在序列2的第88-1392位的基础上按照酵母细胞密码子偏好性，在不改变氨基酸序列的前提下进行优化后的蒜氨酸酶基因序列。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、重组细胞或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体既可为用于转化受体酵母的重组酵母表达载体，也可为用于转化受体细菌的重组细菌表达载体，还可为用于转化受体植物的重组植物表达载体。

所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因细胞进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入可发光化合物的基因(GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)等。

在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体为用于转化受体酵母的重组酵母表达载体，其中启动所述基因转录的启动子为5'AOX1启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为在pPIC9K载体的多克隆位点处插入所述基因后得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为EcoRI和Not I。

所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，a-factor信号肽序列，Kex2和Ste13信号肽切割位点，所述基因，以及转录终止序列组成。

在本发明中，所述重组细胞具体为含有所述基因的重组酵母细胞；所述酵母具体可为毕赤酵母。

所述蛋白质在作为蒜氨酸酶中的应用也属于本发明的保护范围。

所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组表达载体、重组细胞、表达盒或重组菌在制备具有蒜氨酸酶活性的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

序列表中序列3所示DNA分子在提高酵母细胞中蒜氨酸酶表达量中的应用也属于本发明的保护范围；所述蒜氨酸酶具体为序列表中序列1所示蛋白质。

其中，所述“提高”具体为：与序列表中序列2所示DNA分子(优化前)相比，序列表中序列3所示DNA分子在酵母细胞中表达的蒜氨酸酶的量有所提高。所述酵母具体可为毕赤酵母。

本发明还提供了一种制备蒜氨酸酶的方法。

本发明所提供的制备蒜氨酸酶的方法，具体可包括如下步骤：

1)将所述核酸分子或所述重组载体或表达盒导入受体酵母细胞，得到重组酵母细胞；

2)培养所述重组酵母细胞，进行诱导表达，收集并裂解所述重组酵母细胞，获得蒜氨酸酶；所述蒜氨酸酶为序列表中序列1所示蛋白质；

在步骤2)中，所述诱导表达具体可为：向培养有所述重组酵母细胞的培养液中加入甲醇，维持所述甲醇在所述培养液中的体积百分含量为0.5～1％，28℃-30℃(如28℃)培养24-144小时(如72-108小时，如96小时)；所述酵母具体可为毕赤酵母。

其中，所述培养为振荡培养，转速为260rpm，振幅20mm。

在本发明中，所述毕赤酵母具体为毕赤酵母GS115。

本发明提供了一种新的大蒜蒜氨酸酶编码基因，并按照酵母细胞的密码子偏好性进行了相应的密码子优化，且通过毕赤酵母表达系统验证了基因功能。所得重组酵母细胞培养24h开始有轻微的蒜氨酸酶酶活，96h酶活达到最高，最高酶活力为183.72U，比活力为172.25U/mg。本发明为利用基因工程技术表达重组蒜氨酸酶提供了更多的基因资源，也为研究不同蒜氨酸酶基因对大蒜食用品质的影响提供更开阔的思路。

附图说明

图1为部分pPIC9K-AlliiN1质粒和pPIC9K-AlliiN1-P质粒经核酸内切酶EcoRI和Not I的酶切结果。1-6：pPIC9K-AlliiN1载体的酶切检测；7：DNA marker，从上往下条带大小依次是5000bp,4000bp,3000bp,1500bp,1000bp,800bp,500bp；8-13：pPIC9K-AlliiN1-P载体的酶切检测。目标带为1400bp和9300bp。

图2为部分转入线性化pPIC9K-AlliiN1质粒的阳性毕赤酵母重组子的PCR检测结果。1：DNA marker，从上往下条带大小依次是5kb、4kb、3kb、1.5kb、1kb、800bp、500bp。2-6：转线性化pPIC9K-AlliiN1载体的阳性毕赤酵母重组子的PCR检测。7：pPIC9K-AlliiN1质粒阳性对照。8：未转载体的毕赤酵母。9：蒸馏水阴性对照。目标带为1800bp和2200bp左右。

图3为部分转入线性化pPIC9K-AlliiN1-P质粒的阳性毕赤酵母重组子的PCR检测结果。1：DNA marker，从上往下条带大小依次是5kb、4kb、3kb、1.5kb、1kb、800bp、500bp。2-6：转线性化pPIC9K-AlliiN1-P载体的阳性毕赤酵母重组子的PCR检测。7：未转载体的毕赤酵母。8：pPIC9K-AlliiN1-P质粒阳性对照。9：蒸馏水阴性对照。目标带为1800bp和2200bp左右。

图4为转入线性化pPIC9K-AlliiN1和pPIC9K-AlliiN1-P质粒的重组毕赤酵母样品和空载对照样品的Western blotting鉴定结果。1：蛋白质marker，从上往下条带大小依次是94、66、45、35、26、20、14.4kD。2：转线性化pPIC9K-AlliiN1载体的阳性毕赤酵母重组子。3：转线性化pPIC9K-AlliiN1-P载体的阳性毕赤酵母重组子。4：转线性化pPIC9K载体的阳性毕赤酵母重组子。5：未转载体的毕赤酵母。目标条带为50kD左右。

图5为转入线性化pPIC9K-AlliiN1质粒(优化前)和pPIC9K-AlliiN1-P质粒(优化后)的重组毕赤酵母不同培养时间的上清液中蒜氨酸酶的酶活力测定结果。

图6为转入线性化pPIC9K-AlliiN1质粒(优化前)和pPIC9K-AlliiN1-P质粒(优化后)的重组毕赤酵母不同培养时间的上清液中蒜氨酸酶的比活力测定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

毕赤酵母GS115：Invitrigen公司产品，产品目录号：C181-00。

pPIC9K载体：Invitrigen公司产品，产品目录号：V175-20。

实施例1、大蒜蒜氨酸酶基因AlliiN1的克隆

一、RNA提取和转录组测序

分别取新鲜大蒜(Allium sativum L.)——山东杂交蒜(可从北京海定区金五星菜市场购买获得)的叶片、鳞茎和根组织各100mg，按“RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(天根，北京)”的说明步骤提取总RNA，用微量紫外分光光度计检测其浓度和纯度，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。

加入破碎缓冲液将mRNA随机打断成片段，以其为模板，用随机引物合成cDNA第一链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase Ⅰ合成cDNA第二链。cDNA经试剂盒纯化、末端修复、加poly(A)并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳检测文库插入片段大小，最后进行PCR扩增。制备好的文库用Illumina HiSeq^TM 2000双末端测序(Paired-end，PE)方法进行高通量测序。

共获得61 546 348个reads片段，包含了6 154 634 800bp(6.15Gb)的序列信息，GC％含量平均值为39.85％。在测序质量值统计评估方面，碱基Q30为95.75％。由此可以看出，转录组测序数据量和质量都比较高，可为后续的数据组装提供很好的原始数据。通过Trinity组装软件对reads片段进行组装，获得165 856个Transcript，序列信息达到117 892 680bp(117.89Mb)，平均长度为711bp，N50为1 044bp。其中长度在200～600bp的Transcript有99335个，占总体的59.89％；600～1000bp的Transcript有29614个，占总体的17.85％；≥1 000bp的Transcript有36 907个，占总体的22.25％。

二、保守结构域分析筛选目的基因家族

葱蒜类作物中已发现的蒜氨酸酶都有含有非常保守的两个结构域，即N-末端的类表皮生长因子的结构域(EGF-like domain)和中部的5′-磷酸吡哆醛(PLP)结合域。类表皮生长因子的结构域(EGF-like domain)的特征是：6个半胱氨酸残基以一种非常特殊的方式排列，C-x_18-19-C-x-C-x₂-C-x₅–C–x₆–C；5′-磷酸吡哆醛(PLP)结合域的特征是：DE-x₁-I-x₁-LF-x₂-SK-x₁-TGHSGSRFGWA。以这两个结构域的特征筛选Transcript。获得了含有类表皮生长因子的结构域(EGF-like domain)的转录本15条，含有5′-磷酸吡哆醛(PLP)结合域的转录本6条，两者都含有的转录本3条。通过比对发现其中的一条序列为一种新的蒜氨酸酶编码基因序列，将其命名为AlliiN1基因。

三、AlliiN1基因全长cDNA序列克隆

根据步骤二中筛选出的AlliiN1基因序列设计引物，利用RT-PCR技术从大蒜总RNA中扩增该cDNA序列，并测序验证。

正向引物garllic-alliNF：5′-ATGGTGGAGCAATTGGCcAAc-3′(序列2的第1-21位)；

反向引物garllic-alliNR：5′-TCAAATACTTCTTTCCTCG-3′。

反应体系：基因组总RNA 2μL，2×Reaction Mix 25μL，上下游引物(100ng/μL)各1μL，RT/Platinum Taq Mix 1μl，用超纯水补足至总体积50μL。

反应程序：50℃反转录30min；94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃最终延伸8min。

产物于1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收大小合适的条带并连接到pMD-19载体上进行测序。经测序，扩增产物的序列为序列表中序列2，即为AlliiN1基因的cDNA序列，编码序列表中序列1所示的蛋白质。

实施例2、大蒜蒜氨酸酶基因AlliiN1的密码子优化及全基因合成

采用SignaIP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析出大蒜蒜氨酸酶的蛋白序列(序列1)中的信号肽。发现序列1的第1-29位氨基酸为信号肽序列。根据去掉信号肽编码序列的野生型大蒜蒜氨酸酶基因AlliiN1的cDNA序列(序列2的第88-1392位)，经过设计和反复验证得到适合于在酵母细胞中表达的优化型基因序列，命名为AlliiN1-P，即将不含信号肽编码序列的野生型AlliiN1基因序列在不改变氨基酸序列(序列1的第30-463位)的前提下转变成酵母细胞偏好(高频使用)的密码子优化序列，从而提高大蒜蒜氨酸酶在酵母培养环境中的表达水平。

根据上述方法，最终人工合成获得按酵母细胞偏好设计的优化型AlliiN1基因，命名为AlliiN1-P基因。AlliiN1-P基因序列为序列表中序列3，与优化前相比一共改动了310个核苷酸。所述AlliiN1-P基因编码的蛋白为序列表中序列1的第30-463位氨基酸序列组成的蛋白。

实施例3、优化前后的蒜氨酸酶基因在毕赤酵母中的表达分析

本实施例中所使用的毕赤酵母菌株为GS115，所使用的载体为pPIC9K分泌型表达载体。

一、毕赤酵母表达载体的构建

为了方便AlliiN1-P基因(序列3)插入到pPIC9K载体的正确位置，在基因两端分别加上了核酸内切酶EcoRI和Not I的酶切位点。改造后的基因序列由上海生工合成，插入pUC19上，此中间载体命名为pUC19-AlliiN1-P。

将中间载体pUC19-AlliiN1-P和pIC9K载体都用限制性内切酶EcoRI和Not I进行双酶切，分别回收基因片段和载体片段，用T₄ DNA连接酶将回收产物连接起来，对重组质粒进行双酶切检测验证。将经EcoRI和Not I双酶切初步验证正确(得到大小约为1400bp和9300bp的两个目的条带)的重组质粒送样测序。将经测序表明在pPIC9K载体的酶切位点EcoRI和Not I之间插入了序列表中序列3所示DNA片段的重组质粒命名为pPIC9K-AlliiN1-P。

采用同样的方法将序列表中序列2的第88-1392位所示DNA片段插入到pPIC9K载体的酶切位点EcoRI和Not I之间，得到的重组质粒命名为pPIC9K-AlliiN1。

部分pPIC9K-AlliiN1质粒和pPIC9K-AlliiN1-P质粒经核酸内切酶EcoRI和Not I的酶切检测如图1所示。

二、毕赤酵母转化和高表达重组子的筛选

使用全式金公司的质粒提取试剂盒提取高纯度的重组质粒pPIC9K-AlliiN1和pPIC9K-AlliiN1-P各1～5μg，经Sal I酶切，重组质粒在HIS4基因中部被线性化。

参照Invitrogen公司Pichia操作手册制备毕赤酵母感受态细胞。接种毕赤酵母GS115于含有5mL YPD培养基的锥形瓶中，30℃过夜培养。取0.1mL活化的菌液于500mL新鲜YPD培养基中，30℃培养至OD₆₀₀值为1.3～1.5。4℃，1500g离心5min收集细胞，用500mL冰预冷的无菌水洗涤2次，而后用20mL 1mol/L山梨醇洗涤1次，菌体最终用1.5mL 1mol/L山梨醇重悬，即为酵母感受态细胞。

通过电击转化将线性化的pPIC9K-AlliiN1质粒和线性化的pPIC9K-AlliiN1-P质粒分别转入感受态细胞中。将80μL毕赤酵母GS115感受态细胞与1～5μg线性化质粒混匀，转移至冰预冷的0.2cm电转杯中，冰上放置5min，电压1500V，电击4～10ms，立即加入1mL冰冷1mol/L的山梨醇，涂布在3～4个MD平板上，30℃培养48～72h，筛选阳性转化子。

从MD平板上挑取单克隆接种于10mL YPD培养基中，30℃震摇培养过夜，提取酵母基因组进行PCR，鉴定重组的阳性克隆。

正向引物AOX1F：5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′；

反向引物AOX1R：5′-GGCAAATGGCATTCTGA CATCCT-3′。

反应体系为：基因组DNA 2μL(100ng/μL)，10×EXBuffer(含MgCl₂)5μL，dNTP(2.5mmol/L)3.0μL，上下游引物(100ng/μL)各1.0μL，0.5μL EXTaq酶，用超纯水补足至总体积50μL。

扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃最终延伸10min。

扩增产物于1.0％琼脂糖凝胶电泳分析。

部分转入线性化pPIC9K-AlliiN1质粒或线性化的pPIC9K-AlliiN1-P质粒的阳性毕赤酵母重组子的PCR检测结果如图2和图3所示。以AOX1基因的上下游引物进行PCR检测，阳性克隆应该扩增出两条带，一条约为2.2kb的AOX1基因条带，另一条约为1.8kb的目的基因条带(在酵母基因组上本身还有一个AOX1基因，而pPIC9K质粒上有一个AOX1基因的表达框，包括启动子、分泌信号肽、目的基因和终止子，大小是目的基因+500bp＝1.8kb)。

挑取生长较快的阳性克隆落涂布在含不同浓度G418的YPD平板上。最后从含有4.0mg/mL G418的YPD平板上，针对转入线性化pPIC9K-AlliiN1质粒或线性化的pPIC9K-AlliiN1-P质粒的两种重组毕赤酵母，每种均挑取了20个阳性克隆，进行目的基因的诱导表达和蛋白检测分析。

实验同时设置pPIC9K空载体对照组，为将经Sal I酶切线性化的pPIC9K空载体转入毕赤酵母。

三、蒜氨酸酶在毕赤酵母中的诱导表达

对步骤二获得的转入线性化pPIC9K-AlliiN1质粒或线性化的pPIC9K-AlliiN1-P质粒的两种重组毕赤酵母，每种20个重组子进行诱导表达。具体操作如下：将阳性克隆接种于装有5mL BMGY液体培养基的50mL三角瓶中，260rpm，28℃培养16～18h，至OD₆₀₀＝2～6，获得活化菌体。将活化后的菌体3750rpm常温离心5min，收集菌体，用少量BMMY液体培养基清洗一遍，然后用100mL BMMY液体培养基重悬。260rpm摇床振荡培养，振幅20mm，28℃培养，每隔24h向培养体系中加入甲醇，维持甲醇在培养液中的体积百分含量为0.5～1％。每隔12h取0.5mL培养液，3000g离心5min，取上清液进行Western blotting检测。

实验同时设置转入线性化pPIC9K空载体的重组毕赤酵母克隆的上清为空载对照，设置未转基因的毕赤酵母的上清作为未转基因对照。将不同时间收集的酵母表达上清液进行SDS-PAGE电泳分析。利用半电干转移仪将SDS-PAGE凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维膜上，以5％脱脂奶粉封闭，4℃过夜，加入蒜氨酸酶免疫的兔血清(蒜氨酸酶标准品从新疆埃乐欣药业公司购买，血清由北京赛诺博生物技术中心制备)37℃孵育2h，洗膜，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(上海研卉生物科技有限公司产品，其产品目录号为111-035-003)，37℃孵育1h，经显色后观察蛋白表达情况。目的蛋白(序列表中序列1的第30-463位所示的去除了信号肽的蒜氨酸酶)分子量约为50kD。

Western blotting结果显示，培养96h后，转入线性化pPIC9K-AlliiN1-P质粒的重组毕赤酵母样品出现了明显的与预期结果一致的大小约为50kD的目的蛋白条带；转入线性化pPIC9K-AlliiN1质粒的重组毕赤酵母样品出现了较弱的与预期结果一致的大小约为50kD的目的蛋白条带；而空载对照组和未转基因的毕赤酵母组在相应位置没有条带。图4为转入线性化pPIC9K-AlliiN1和pPIC9K-AlliiN1-P质粒的重组毕赤酵母样品和空载对照样品的Western blotting鉴定结果。

四、重组蒜氨酸酶的酶活测定

1、检测原理

由于蒜氨酸酶每催化1分子蒜氨酸发生反应会产生2分子丙酮酸，因此可以通过测定丙酮酸的浓度来推算蒜氨酸酶的酶活。丙酮酸可与2,4-二硝基苯肼反应，生成丙酮酸-2,4—二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈樱红色，在520nm处测定吸光值。

2、绘制标准曲线

配置120μg/ml丙酮酸母液，分别取丙酮酸母液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于不同的试管中，用蒸馏水补足至总体积2ml，使其终浓度分别为0μg/ml、12μg/ml、24μg/ml、36μg/ml、48μg/ml、60μg/ml，然后每管中加入8％(g/ml，质量体积比)三氯乙酸2mL，混匀，再加入1mL 0.1％(g/ml，质量体积比)2,4-二硝基苯肼，摇匀。加入5mL 1.5mol/L NaOH，摇匀，静置10min显色。取3mL反应液，以丙酮酸浓度为0的反应液为对照，在520nm波长下对其余各管进行比色。

以丙酮酸溶液的浓度为横坐标(x)，以对应的OD520值为纵坐标(y)，绘制标准曲线。得到标准曲线方程式为y＝0.0224X+0.0197，R²＝0.996。

3、定量检测

用无菌的蒸馏水溶液配制30mmol/L的蒜氨酸底物(新疆埃乐欣公司产品)。以步骤三Western blot分析鉴定阳性的两种重组毕赤酵母转化子进行摇瓶培养(具体培养条件参见步骤三)，每隔12h收集酵母表达上清液。

在收集齐的上清液中分别加入1.0mL蒜氨酸底物，30℃下反应5min，而后加入2mL 8％三氯乙酸终止反应。再加入1.0mL 0.1％2,4-二硝基苯肼充分反应，加入5mL 1.5mol/L NaOH溶液摇匀，静置10min显色，用752紫外分光光度计在波长520nm处测定吸收值。根据吸收值及步骤2获得的标准曲线方程算出丙酮酸总浓度及酶活力。进一步以蒜氨酸酶标准品作为对照，用Lowry法测定溶液中蒜氨酸酶蛋白质量，进而求出所测样品中蒜氨酸酶的比活力。所谓比活力为单位重量(mg)蒜氨酸酶蛋白质量所具有的酶活力单位数。实验重复三次，结果取平均值。

实验同时设置转入线性化pPIC9K空载体的重组毕赤酵母克隆的上清为空载体对照，设置未转基因的毕赤酵母作为未转基因对照。

结果显示：

对于转入线性化pPIC9K-AlliiN1-P质粒的重组毕赤酵母而言，诱导培养12h还检测不到蒜氨酸酶活性，24h有轻微的酶活，96h酶活达到最高，最高酶活力为183.72U，比活力为172.25U/mg，108h后酶活开始下降。对于转入线性化pPIC9K-AlliiN1质粒的重组毕赤酵母而言，也是诱导培养12h检测不到蒜氨酸酶活性，24h有轻微的酶活，96h酶活达到最高，最高酶活力为97.26U，比活力为166.52U/mg，108h后酶活开始下降。酶活力和比活力测定结果具体参见图5和图6。而空载体对照组和未转基因的毕赤酵母组直至实验结束也没有检测到蒜氨酸酶活性。

转入线性化pPIC9K-AlliiN1-P质粒的重组毕赤酵母组和转入线性化pPIC9K-AlliiN1质粒的重组毕赤酵母组在不同培养时间的酶活及比活力具体测定结果见表1。从表1可以直观看出，在相同的培养时间，转入线性化pPIC9K-AlliiN1-P质粒的重组毕赤酵母组的酶活显著高于转入线性化pPIC9K-AlliiN1质粒的重组毕赤酵母组的酶活(P<0.05)；但是比活力两组差异不显著。这说明转入线性化pPIC9K-N-AlliiN1质粒的重组毕赤酵母组表达的蒜氨酸酶的量显著高于转入线性化pPIC9K-AlliiN1质粒的重组毕赤酵母组，即与优化前(序列2的第88-1392位)相比，优化后的pPIC9K-AlliiN1-P基因(序列3)显著提高了在毕赤酵母中蒜氨酸酶的表达量。

表1 转入线性化pPIC9K-AlliiN1-P质粒或pPIC9K-AlliiN1质粒的重组毕赤酵母在不同培养时间的酶活及比活力具体测定结果

注：“优化前”表示转入线性化pPIC9K-AlliiN1质粒的重组毕赤酵母；“优化后”表示转入线性化pPIC9K-AlliiN1-P质粒的重组毕赤酵母。不同小写字母之间表示差异显著(P<0.05)。

Claims

1.蛋白质，是如下(a)或(b)或(c)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因为如下1)-5)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列3所示的DNA分子；

3)序列表中序列2的第88-1392位所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)-3)中任一所限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

5)与1)-4)中任一所限定的DNA分子至少具有90％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、重组细胞或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体；

所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为5'AOX1启动子。

6.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于：所述重组细胞为含有权利要求2或3所述核酸分子的重组酵母细胞；

所述酵母具体为毕赤酵母。

7.权利要求1所述的蛋白质在作为蒜氨酸酶中的应用。

8.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4或5或6所述的重组表达载体、重组细胞、表达盒或重组菌在制备具有蒜氨酸酶活性的产品中的应用。

9.序列表中序列3所示DNA分子在提高酵母细胞中蒜氨酸酶表达量中的应用；所述蒜氨酸酶为序列表中序列1所示蛋白质；

所述酵母具体为毕赤酵母。

10.一种制备蒜氨酸酶的方法，包括如下步骤：

1)将权利要求权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4或5所述的重组载体或表达盒导入受体酵母细胞，得到重组酵母细胞；

2)培养所述重组酵母细胞，进行诱导表达，收集并裂解所述重组酵母细胞，获得蒜氨酸酶；

所述蒜氨酸酶为序列表中序列1所示蛋白质；

步骤2)中，所述诱导表达具体为：向培养有所述重组酵母细胞的培养液中加入甲醇，维持所述甲醇在所述培养液中的体积百分含量为0.5～1％，28-30℃培养24-144小时；

所述酵母具体为毕赤酵母。