CN104109679B - 一种甲醛脱氢酶基因CcFALDH及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，特别是涉及一种吊兰甲醛脱氢酶基因及植物表达载体在甲醛净化植物培育方面的应用。本发明通过对吊兰FADLH基因的分离和功能鉴定，确定了CcFALDH基因在植物吸收代谢甲醛方面的应用。本发明公开了甲醛脱氢酶基因核苷酸序列及编码的蛋白质氨基酸序列，CcFALDH基因全长1140bp，编码379个氨基酸残基的蛋白。实验发现该基因能够提高大岩桐吸收甲醛的速率。该基因为基因工程改良观赏植物的净化室内甲醛能力具有广泛的应用前景和极大的经济价值。

Description

一种甲醛脱氢酶基因 CcFALDH 及应用

技术领域

本发明属于分子生物学、植物基因工程技术领域，具体涉及一种在吊兰中表达的，能够提高植物吸收甲醛能力的甲醛脱氢酶基因--CcFALDH基因、含有该基因的重组植物表达载体、含有上述重组植物表达载体的转基因植物转化体以及CcFALDH基因在改良植物吸收和净化甲醛能力上的应用。

背景技术

甲醛是工业制造中必不可少的化学原材料。甲醛制品所排放出的甲醛气体成为常见的装修型室内空气污染物，作为常见的室内环境污染物，甲醛对人体的危害主要体现在刺激毒性、神经系统毒性、免疫和内分泌系统、生殖系统以及遗传毒性和致癌作用，其中遗传毒性和致癌作用是甲醛对人体健康最主要的危害之一。Holmstrom等研究表明，神经和呼吸系统症状是甲醛刺激毒性的主要表现，长期慢性吸入甲醛可导致慢性呼吸道等疾病的增加。试验还表明甲醛能够引起神经系统的病变坏死，使组织内DNA和RNA的合成量减少。对成熟雄性小鼠采取腹腔注射甲醛以及气态甲醛接触，甲醛表现出对小鼠强烈的生殖毒性。Taskinen等调查了1049名从事木材加工的妇女，结果发现接触甲醛者受孕时间明显推迟，并且接触甲醛会增加自发性流产的发生率。

在现代生活中甲醛制品被广泛应用于室内装修，居室内的窗帘、地毯、纸制品、胶合板、粘合剂、香烟等常见的物品向室内环境中释放了大量的甲醛污染。在诸多的室内污染物中，甲醛以其毒性大、来源广、污染水平高、污染时间长等特点，己成为我国最重要的室内空气污染物之一。目前通过物理、化学以及生物等技术净化室内空气中甲醛的效果还不够理想。在生物体内存在多种不同的应对体内环境与外界环境中甲醛的方式，甲醛可以被氧化成为无毒的CO2排入大气；也可以在生物体内通过各种酶促代谢反应，被重新利用参与生物的关键代谢循环，构成生物体自身必须的含碳化合物。在Candida boidinii中，甲醛直接与木酮糖-5-磷酸反应，在磷酸二羟丙酮合成酶（DAS）催化下产生二羟基丙酮和甘油醛-3-磷酸。在甲基营养细菌中存在核酮糖单磷酸途径（RuMP）、丝氨酸途径和核酮糖二磷酸途径（RuBP）等三种不同的甲醛同化途径。在甲醛的代谢途径中，甲醛的脱氢氧化解毒在生物中是普遍存在的过程。在微生物，高等植物以及动物中，甲醛可以与谷胱甘肽等受体结合，通过酶促作用最终使甲醛分解成无毒的CO₂。依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶（FALDH）、S-甲酰谷胱甘肽水解酶（FGH）和依赖NAD⁺的甲酸脱氢酶（FDH）共同完成上述甲醛氧化途径。这个甲醛氧化途径在完成甲醛解毒的同时还能够通过生成NADH产生能量。

居室内摆放绿色植物不仅可以美化环境，还可以净化空气中的甲醛。吊兰是目前公认的吸收甲醛能力较强的植物。Xu等采用动态箱模拟法研究表明吊兰盆栽体系对甲醛具有长期的净化作用，且净化速率白天大于晚上，但是光照的变化对净化速率无显著影响。依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶在植物甲醛代谢中起着重要作用，虽然拟南芥，豌豆、玉米，水稻以及绿萝都有报道，但是吊兰中甲醛脱氢酶基因及相关应用至今尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种吊兰甲醛脱氢酶基因。

同时，本发明的目的还在于提供一种吊兰甲醛脱氢酶基因在培育高效净化甲醛植物新品种方面的应用。

为了实现上述目的，本发明从吊兰中克隆甲醛脱氢酶基因，其全长基因序列包括1140个核苷酸，核苷酸序列的碱基组成为285 A 287 T 331 G 237 C，其序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列具有379个氨基酸残基，其序列如SEQ ID N0.2所示，估计分子量为40.6 kDa，理论等电点（PI）为6.51。将吊兰的甲醛脱氢酶蛋白质序列用ClustalW2分析其同源性，结果显示CcFALDH基因和AtFALDH（拟南芥，NM_123761.3）相比，氨基酸同源性为92%。所述基因序列是一种参与甲醛氧化代谢的甲醛脱氢酶基因。

同时，本发明的技术方案还采用了一种吊兰甲醛脱氢酶基因在培育高效净化甲醛植物新品种方面的应用。

所述的吊兰甲醛脱氢酶CcFALDH基因连接到植物表达载体，获得植物表达载体pBI-35S-FALDH，所述载体含有CcFALDH基因及卡那霉素筛选标记基因NPTII和组成型启动子35S，如图1所示。所述表达载体导入农杆菌菌株EHA105，获得重组农杆菌，最后通过农杆菌介导法导入大岩桐中，使CcFALDH基因稳定遗传，获得相应的转基因植物。在卡那霉素筛选培养基上获得抗性植株，通过基因组PCR扩增检测CcFALDH是否插入植物基因组，通过Northern Blot检测基因在转基因植物中的表达水平（图4）。通过Real-time PCR方法对CcFALDH在转基因大岩桐中的表达量进行了定量分析。结果显示，所获得的转基因植株中CcFALDH的表达量显著提高（图5）。对获得的转基因大岩桐进行FALDH酶活性测定，结果表明转基因植物酶活性比野生型植物提高约6倍左右（图6）。

针对转CcFALDH基因大岩桐甲醛吸收能力的检测，所述驯化后的转基因大岩桐植株放入50cm×50cm×50cm的密封舱中通入甲醛处理，实验结果表明转基因植物吸收气体甲醛的速度明显优于野生型。

本发明首次公开了吊兰甲醛脱氢酶CcFALDH基因，并获得了编码该基因的蛋白氨基酸序列，同时运用分子生物学及基因工程技术证实了吊兰甲醛脱氢酶CcFALDH基因参与植物的甲醛代谢，含有甲醛脱氢酶基因的转基因植物吸收甲醛的速率优于野生型，FALDH蛋白在转基因植物中的过量表达使其代谢气体甲醛的能力大大提高。

附图说明

序列表SEQ ID NO.1是本发明克隆的CcFALDH基因的核苷酸序列，序列长度为1140bp。

序列表SEQ ID NO.2是CcFALDH基因编码的氨基酸序列。序列长度为379个氨基酸残基。

图1是本发明CcFALDH基因克隆及表达载体构建策略图。

图2是本发明CcFALDH基因克隆及表达载体构电泳图。

a-b表示pBI121质粒DNA进行BamH I和Sac I双酶切，回收大片段即pBI121载体骨架；c-d表示将含有CcFALDH基因的克隆载体pMDCcFALDH质粒进行BamH I和Sac I双酶切，回收带有粘性末端的CcFALDH目的片段；e-f表示阳性质粒进行BamH I和Sac I双酶切鉴定，获得约1200bp的片段，证明CcFALDH基因插入到了质粒载体pBI121中。

图3是本发明转FALDH基因大岩桐抗性植株的PCR检测结果。

图4是本发明FALDH在转基因大岩桐中的Northern Blot检测。

WT：野生大岩桐株系；TR：转基因大岩桐株系。

图5是本发明FALDH在转基因大岩桐中的实时荧光定量表达分析。

WT：野生大岩桐株系；TR：转基因大岩桐株系。

图6是本发明FALDH在转基因大岩桐中的酶活性测定分析。

WT：野生大岩桐株系；TR：转基因大岩桐株系。

图7是本发明转基因大岩桐在进行气体甲醛吸收效率检测。

图8是本发明转基因大岩桐中的甲醛吸收速率检测。

WT：野生大岩桐株系；TR：转基因大岩桐株系。

具体实施方式

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、吊兰甲醛脱氢酶基因的克隆

从NCBI数据库中（(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索高等植物的甲醛脱氢酶序列并保存，用数据库中已知的拟南芥，豌豆、玉米，水稻以及绿萝（NM_123761.3、Y11029、AK099733.1、AB618795）甲醛脱氢酶序列进行比对。根据氨基酸保守序列设计简并引物，为了便于重组植物表达载体构建，在上、下游引物的5’端分别引入BamH I和Sac I限制性酶切位点，引物序列如下：

FALDH-F：CGGAATTCATGGCKACHSAGGSHCAGG

FALDH-R：CGAGCTCTYASAYYTGCRTVKCMAG

RNA的提取：利用RNAprep pure Plant Kit试剂盒（TianGen）提取经5mM甲醛处理1小时的吊兰（Chlorophytum comosum）叶片RNA，应用Revertra Ace随机引物（Toyobo）反转录为cDNA。

以合成的吊兰cDNA为模板进行RT-PCR扩增CcFALDH全长序列。

RT-PCR反应：用TaKaRa Ex Taq DNA 聚合酶进行RT-PCR反应，反应程序：94℃预变性4min；94℃变性15sec；56℃退火30sec；68℃延伸60sec；30个循环；72℃延伸10min。PCR反应结束后，将反应液进行2%琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，得到约1200bp的片段，采用Takara公司的MiniBEST Agarose Gel DNA Extract Kit回收目的片段。

将回收的PCR产物片段连接到克隆载体pMD™18-T（Takara）中的EcoRV位点。重组质粒转化到大肠杆菌TOP10中，然后对插入的核苷酸序列进行测序。

连接反应体系：在10 μl反应体系中，Solution I 5 μl，PCR回收产物4 μl，pMD™18-T 1 μl。混匀后16℃反应16h。重组载体的转化：参考《分子克隆实验指南》

最终鉴定得到CcFALDH基因ORF的全长序列。CcFALDH基因cDNA全长为1140bp，其编码的蛋白的氨基酸序列具有379个氨基酸残基，蛋白分子量为40.6 kDa，理论等电点（PI）为6.51。将其氨基酸序列在GeneBank中检索，结果显示CcFALDH基因和AtFALDH基因（拟南芥，NM_123761.3）相比，氨基酸同源性为92%。

实施例2、植物表达载体pBI-35S-FALDH的构建

在基因克隆时分别在引物上引入限制性酶切位点BamH I和Sac I。将含有CcFALDH基因的克隆载体pMDCcFALDH质粒进行BamH I和Sac I双酶切。酶切体系参考Takara公司限制性内切酶双酶切反应说明书，37℃反应12小时。回收带有粘性末端的CcFALDH目的片段。

将双元植物表达载体pBI121质粒DNA进行BamH I和Sac I双酶切，37℃反应12小时，回收大片段即pBI121载体骨架。

将目的片段与母载体连接。连接产物转化TOP10感受态细胞。挑取单菌落进行PCR鉴定。取菌落PCR阳性的菌落提取质粒，进行BamH I和Sac I双酶切鉴定，获得约1200bp的片段，证明CcFALDH基因插入到了质粒载体pBI121中。

实施例3、CcFALDH基因转化植物及转基因植物的检测

将构建成功的植物表达载体pBI-35S-FALDH，用电击法导入农杆菌EHA105中，进行菌落PCR鉴定，结果获得大约1200bp的产物。提取PCR阳性菌落质粒，进行酶切，获得约1200bp的片段，证明转化载体已经转入农杆菌中（图2-f）。

将经过菌落PCR鉴定的农杆菌单菌落分别接种于含有100 μg/ml KM的5ml YEB液体培养基中，于28℃，200 rpm振荡培养过夜，次日，将其转入50ml YEB液体培养基中，于28℃，200 rpm振荡培养至OD60，值在0.4-0.6时，收集菌体，用MS液体培养基悬浮，待用。

将上述得到的重组过表达载体pBI-35S-FALDH经农杆菌介导的叶盘法转入大岩桐中，具体操作步骤：在超净工作台内，将加入100 μM AS重悬后的农杆菌菌液倒入无菌培养皿中，将预培养48h的大岩桐外植体置于菌液中浸泡6 min中，期间不断震荡。取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着菌液，接种于诱导不定芽的培养基MS1，在25±2℃条件下暗培养48 h。然后接种到MS2培养基上进行筛选培养，每20天更换一次诱导培养基。经过侵染的叶片长出不定芽时，转入生根培养基MS3中。使用培养基如下：

MS1： MS + 1.0 mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA

MS2： MS + 1.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA + 25 mg/L KM + 500 mg/L Cef

MS3： MS + 0.5 mg/L NAA + 25 mg/L KM + 500 mg/L Cef

根系发育好后，移入盛有无菌土的花盆中，温室常规管理。

为了确认产生的转基因植株确实含有CcFALDH基因，用PCR方法对筛选的转基因植株进行进一步的鉴定。

首先采用CTAB法提取植物基因组：称取植物叶片100 mg左右置于1.5 ml离心管中，加入液氮用特制研棒研磨至粉末状；加入700 μl预热的2×CTAB缓冲液（100 mM Tris-Hcl pH 8.0，20 mM EDTA pH 8.0，1.4M Nacl，2% CTAB），65℃水浴加热45分钟后取出冷却；离心取上清加入等体积的酚和氯仿，颠倒混匀，4℃离心10 min（12000 rpm）后转移上清至1.5 ml离心管中；再次加入等体积的氯仿-异戊醇混合液（24：1）颠倒混匀，4℃离心10 min（12000 rpm）后转移上清至新的1.5 ml离心管中，加入1/10体积3 M pH 5.2醋酸钠和等体积异丙醇，混匀后至于-20℃冰箱中20 min；4℃离心10 min（12000 rpm）后弃上清，加入70%乙醇500μl，4℃离心10 min（12000rpm）后，干燥，用纯水溶解。

以植物基因组DNA为模板，用CcFALDH基因上下游特异引物作PCR检测，成功转入CcFALDH基因的植株均能扩增出1200bp的条带，经PCR确认的转基因植株用于分子印迹分析。分子印迹分析参考《分子克隆实验指南》。

为了考察目的基因在转基因株系中的转录情况，从转基因植物中提取总RNA，反转录成cDNA后用于RT-PCR分析，检测FALDH基因在转基因植物中的转录水平。采用TianGen公司试剂盒提取RNA。用DEPC处理水溶解RNA，所获得的RNA样品使用ReverTra Ace -α-进行cDNA的合成。以野生型大岩桐为对照进行荧光定量qRT-PCR检测。qRT-PCR体系：荧光定量qRT-PCR利用7300 Biosystem，根据SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)说明书进行操作。反应体系：总体积20µl包括SYBR Premix ExTaq II 10µl；反转录cDNA 2µl；10µM的引物各0.8µl；水6.0µl；ROX Reference Dye (50x) 0.4µl。利用2-△△CT方法计算表达量。结果证明转基因植株均有目的基因的转录物，而野生型植株则没有。结果如图5所示，筛选出CcFALDH表达量较高的阳性植株3个株系分别是TR1，TR5，TR6。

实施例4、转基因大岩桐进甲醛脱氢酶活性测定

从大岩桐叶片中提取可溶性总蛋白，取0.5g大岩桐叶片，加2ml蛋白提取液（100mM Tris-HCl（pH7.5）；10%（V/V）甘油；10mM 巯基乙醇；1mM PMSF）。在研钵中研磨，转移至EP管中，13000rpm，4℃，离心25min，将上清移至新的EP管中，用Bradford方法测定上清液中的植物可溶性蛋白质浓度。

FALDH酶活性在30℃条件下，通过检测NADH的产生量确定，每个酶活力单位对应每分钟催化产生1μM NADH（Kato N. Methods in enzymology.1990）。反应体系为：Sodium phosphate buffer（pH7.5）0.1 M；NAD+ 60mM；谷胱甘肽 120mM；甲醛 60 mM；酶粗提液。结果如图6所示，转FALDH大岩桐植株酶活性比野生型植株提高约六倍。

实施例5、转基因植物吸收甲醛的能力

实验装置如图7所示。在光照培养室内放置50cm×50cm×50cm的密封舱，将驯化后的转基因大岩桐植株置于密封舱中，在密封舱内通入5mM甲醛，利用甲醛分析仪（JSA9-CH20型甲醛分析仪）测定密封舱内甲醛含量变化。结果显示在白天转基因大岩桐吸收甲醛速率比野生植株高3倍，夜间转基因大岩桐吸收甲醛的速率比野生型高约5倍。

<110> 哈尔滨师范大学

<120> 一种甲醛脱氢酶基因CcFALDH及应用

<130>

<160>

<210> 1

<211> 1140

<212> DNA

<213> 吊兰（Chlorophytum comosum）

<400> 1

atggctactc agggtcaggt catcacttgc aaagccgcgg tggcgtggga ggcgaacaag 60

ccgctgtcga tcgaggacgt gcaggtggcg ccgccgcagg ccggcgaggt ccggatcaag 120

atcctcttca ccgctctgtg ccacaccgat gcctatactt ggagcggcaa ggaccctgaa 180

ggtctttttc cctgtatcct tggtcatgag gctgctggga ttgttgaaag tgttggtgaa 240

ggagtaacag aggttcagcc aggagatcat gttattcctt gttaccaggc agaatgcagg 300

gaatgcaagt tctgcaagtc agggaagacc aacctctgtg ggaaagttag agcagctact 360

ggtgttgggg tcgtgatgaa tgaccgaaaa agtcgattct cagtaaatgg aaagccaatc 420

tatcatttca tggggacatc tacatttagt cagtacacgg ttgttcatga cgtcagtgtt 480

gcaaaaattg atccccaagc tcctctggat aaggtctgtc tgctggggtg tggtgttcca 540

acaggtcttg gagcagtttg gaatacagca aaggtagaag caggttcgaa tgttgctgtt 600

tttggccttg gaactgttgg acttgctgtt gcggaggggg ctaaggcagc tggtgcatct 660

cggataattg gtatagatat tgacagcaaa aagtttgata gagctaagaa ttttggtgtc 720

actgaattca tcaacccaaa ggaccatgac aaaccgatac agcaagtcat tgtcgatcaa 780

actgatggtg gagttgacta cagttttgag tgcatcggaa atgtggcagt gatgaggtct 840

gctctagaat gctgccacaa gggctgggga acatcagtta tcgttggtgt tgcggcttca 900

ggtcaggaaa tctctacccg ccccttccag cttgtcactg gccgcgtctg gaagggcact 960

gcctttggtg gcttcaaaag ccgctctcaa gtgccatggc ttgtcgacaa gtacatgaag 1020

aaggaaatca aggtggatga gtatataacc catgcgttga cactaggaga gatcaacaag 1080

gccttcgatc tgatgcatga aggagaatgt cttcgctgtg tccttgatac gcaaatgtaa 1140

<210> 2

<211> 379

<212> PRT

<213> 吊兰（Chlorophytum comosum）

<400> 2

Met Ala Thr Gln Gly Gln Val Ile Thr Cys Lys Ala Ala Val Ala Trp

1 5 10 15

Glu Ala Asn Lys Pro Leu Ser Ile Glu Asp Val Gln Val Ala Pro Pro

20 25 30

Gln Ala Gly Glu Val Arg Ile Lys Ile Leu Phe Thr Ala Leu Cys His

35 40 45

Thr Asp Ala Tyr Thr Trp Ser Gly Lys Asp Pro Glu Gly Leu Phe Pro

50 55 60

Cys Ile Leu Gly His Glu Ala Ala Gly Ile Val Glu Ser Val Gly Glu

65 70 75 80

Gly Val Thr Glu Val Gln Pro Gly Asp His Val Ile Pro Cys Tyr Gln

85 90 95

Ala Glu Cys Arg Glu Cys Lys Phe Cys Lys Ser Gly Lys Thr Asn Leu

100 105 110

Cys Gly Lys Val Arg Ala Ala Thr Gly Val Gly Val Val Met Asn Asp

115 120 125

Arg Lys Ser Arg Phe Ser Val Asn Gly Lys Pro Ile Tyr His Phe Met

130 135 140

Gly Thr Ser Thr Phe Ser Gln Tyr Thr Val Val His Asp Val Ser Val

145 150 155 160

Ala Lys Ile Asp Pro Gln Ala Pro Leu Asp Lys Val Cys Leu Leu Gly

165 170 175

Cys Gly Val Pro Thr Gly Leu Gly Ala Val Trp Asn Thr Ala Lys Val

180 185 190

Glu Ala Gly Ser Asn Val Ala Val Phe Gly Leu Gly Thr Val Gly Leu

195 200 205

Ala Val Ala Glu Gly Ala Lys Ala Ala Gly Ala Ser Arg Ile Ile Gly

210 215 220

Ile Asp Ile Asp Ser Lys Lys Phe Asp Arg Ala Lys Asn Phe Gly Val

225 230 235 240

Thr Glu Phe Ile Asn Pro Lys Asp His Asp Lys Pro Ile Gln Gln Val

245 250 255

Ile Val Asp Gln Thr Asp Gly Gly Val Asp Tyr Ser Phe Glu Cys Ile

260 265 270

Gly Asn Val Ala Val Met Arg Ser Ala Leu Glu Cys Cys His Lys Gly

275 280 285

Trp Gly Thr Ser Val Ile Val Gly Val Ala Ala Ser Gly Gln Glu Ile

290 295 300

Ser Thr Arg Pro Phe Gln Leu Val Thr Gly Arg Val Trp Lys Gly Thr

305 310 315 320

Ala Phe Gly Gly Phe Lys Ser Arg Ser Gln Val Pro Trp Leu Val Asp

325 330 335

Lys Tyr Met Lys Lys Glu Ile Lys Val Asp Glu Tyr Ile Thr His Ala

340 345 350

Leu Thr Leu Gly Glu Ile Asn Lys Ala Phe Asp Leu Met His Glu Gly

355 360 365

Glu Cys Leu Arg Cys Val Leu Asp Thr Gln Met

370 375

Claims (4)

1.一种甲醛脱氢酶CcFALDH基因，其特征在于所述的CcFALDH基因核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示，其序列长度为1140bp。

2.一种由权利要求1所述的CcFALDH基因所编码的蛋白，其特征在于所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ.ID.No.2所示，序列长度为379个氨基酸残基。

3.一种含有权利要求1所述的CcFALDH基因的植物表达载体，其特征在于，所述的植物表达载体为pBI-35S-FALDH，该载体是将所述的CcFALDH基因经酶切位点BamH I和Sac I克隆入载体pBI121构建而成。

4.一种改良观赏植物甲醛吸收能力的方法，是将权利要求3所述的植物表达载体转化到观赏植物中，获得改良观赏植物。